Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa glucose của lá xoài non (Mangifera indica L.) và rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) trên chuột bệnh đái tháo đường

Chia sẻ: Elysale Elysale | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:192

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết toàn phần methanol lá xoài non (Mangifera indica L.) (LXN) và cao chiết toàn phần methanol rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) (RMK) theo hướng hỗ trợ điều trị BĐTĐ in vitro. Đồng thời, ảnh hưởng của LXN và RMK cũng được khảo sát trên chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết và rối loạn lipid huyết do alloxan monohydrate (AM) gây ra.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa glucose của lá xoài non (Mangifera indica L.) và rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) trên chuột bệnh đái tháo đường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ÁI LAN NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ ĐIỀU HÒA ENZYME CHUYỂN HÓA GLUCOSE CỦA LÁ XOÀI NON (Mangifera indica L.) VÀ RỂ ME KEO (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) TRÊN CHUỘT BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 02 01 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ÁI LAN NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ ĐIỀU HÒA ENZYME CHUYỂN HÓA GLUCOSE CỦA LÁ XOÀI NON (Mangifera indica L.) VÀ RỂ ME KEO (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) TRÊN CHUỘT BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 02 01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG 2021
TÓM TẮT TIẾNG VIỆT Xoài (Mangifera indica L.) và me keo (Pithecellobium ducle (Roxb.) Benth) được trồng phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long. Trong nghiên cứu này, khả năng chống oxy hóa, điều hòa hoạt động của các enzyme glucose-6- phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase và lactate dehydrogenase, bảo vệ tế bào min6 tụy tạng của cao chiết methanol lá xoài non và rễ me keo được nghiên cứu in vitro. Độc tính cấp của cao chiết lá xoài non và rễ me keo cũng được khảo sát trên chuột nhắt trắng. Khả năng chống tăng glucose huyết, rối loạn lipid huyết, chống xơ vữa động mạch, điều hòa enzyme glucose-6- phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase và lactate dehydrogenase in vivo của cao chiết lá xoài non và rễ me keo cũng được thực hiện trên mô hình chuột tăng glucose huyết. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lá xoài non và rễ me keo đến cholesterol toàn phần, triglyceride, HDL-Cho, LDL-Cho và các chỉ số tim mạch (AI, CRI, CVRI). Mô hình chuột tăng glucose huyết cảm ứng bởi alloxan monohydrate được tiến hành khảo sát trong 28 ngày. Chuột tăng glucose huyết được chia thành 11 nhóm, mỗi nhóm gồm 6 con chuột có khối lượng và glucose huyết khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nghiệm thức I là nhóm đối chứng sinh lý (chuột bình thường không tiêm alloxan monohydrate hay uống bất kỳ loại thuốc nào). Nghiệm thức II, III là nhóm chuột bình thường uống 450 mg/kg khối lượng cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo. Nghiệm thức IV là nhóm đối chứng bệnh lý (chuột tăng glucose huyết không được điều trị). Nghiệm thức V là nhóm chuột tăng glucose huyết dùng thuốc biệt dược glucophage (108 mg/kg khối lượng). Các nghiệm thức tiếp sau là chuột tăng glucose huyết được điều trị bằng cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo (liều 150, 300, 450 mg/kg thể trọng/ lần x 2 lần/ ngày). Cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo được khảo sát khả năng gây độc tính cấp trên chuột nhắt trắng (Mus musculus L.) ở các nồng độ 1000, 2500 và 5000 mg/kg khối lượng in vivo. Cao chiết lá xoài non và rễ me keo có chứa các hợp chất flavonoid, alkaloid, tannin, triterpenoid, glycoside. Cao chiết lá xoài non còn chứa thêm các chất courmarin và quinon; rễ me keo chứa thêm các chất phenol và saponin. Hàm lượng polyphenol tổng (total polyphenol content, TFC) của lá xoài non (335,06 ± 1,84 mg GAE/g cao chiết) cao hơn rễ me keo (246,5 ± 65,5 mgGAE/g cao chiết). Hàm lượng flavonoid toàn phần (total flavonoide content, TFC) của lá xoài non (432,86 ± 10,01 mg QE/g cao chiết) cũng cao hơn rễ me keo (427,4 ± 4,9 mg QE/g cao chiết). Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng các phương pháp khác nhau như DPPH, ABTS+ và RP. Kết quả i
cho thấy lá xoài non và rễ me keo đều có hiệu quả chống oxy hóa nhưng đều thấp hơn chất chống oxy hóa chuẩn. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH của lá xoài non (EC50= 27,6 ± 0,88 µg/mL) cao hơn rễ me keo (28,9 ± 0,80 µg/mL) và thấp hơn chất chuẩn trolox (4,26 µg/mL). Ngược lại, rễ me keo có khả năng khử sắt (69,3 ± 1,34 µg/mL) và trung hòa gốc tự do ABTS+ (23,8 ± 2,4 µg/mL) cao hơn lá xoài non ở cả hai phương pháp lần lượt là 321,4 ± 6,63 µg/mL và 45,7 ± 0,5 µg/mL; nhưng thấp hơn chất chuẩn BHA (30,1 µg/mL) trong phương pháp khử sắt và trolox (0,037 µg/mL) trong phương pháp ABTS+. Kết quả thực nghiệm khảo sát hiệu quả điều hòa hoạt động các enzyme chuyển hóa glucose cho thấy, LXN ức chế hoạt động G6Pase (IC50 = 80,4 µg/mL), G6PDH (IC50= 82,6 µg/mL) tốt hơn so với RMK (IC50 = 26,8 µg/mL, IC50 = 92,7 µg/mL). LXN (IC50 = 117,9 µg/mL) ức chế hoạt động enzyme LDH tốt hơn so với RMK (IC50 = 122,4 µg/mL). Nồng độ và thời gian tối ưu của tunicamycin để gây chết tế bào min6 tụy tạng là 5 µg/mL ở thời điểm 24 và 48 giờ. Cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo không gây độc tế bào đối với tế bào min6 trong 48 giờ ở tất cả nồng độ khảo sát từ 50-500 µg/mL. Nồng độ cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo có khả năng bảo vệ tế bào min6 khỏi sự chết do tác động của tunicamycin là 50 và 100 µg/mL khi khảo sát lần lượt ở thời gian 24 và 48 giờ. Cao chiết lá xoài non (450 mg/kg) hoặc rễ me keo (150 mg/kg) được kết luận là có khả năng hạ glucose huyết, điều hòa lipid huyết và chống huyết khối ở chuột tăng glucose huyết. Kết quả quan sát cấu trúc mô bệnh học gan và thận chuột cho thấy, lá xoài non (450 mg/kg) hoặc rễ me keo (150 mg/kg) có khả năng cải thiện mô gan và thận của chuột tăng glucose huyết trở về tương đương với gan và thận ở chuột bình thường. Sau 14 ngày theo dõi, cao chiết lá xoài non và rễ me keo được chứng minh không gây ảnh hưởng bất thường nào đến các hành vi như lãnh cảm, tăng động, hệ hô hấp, nhịp tim và thông số AST, ALT của chuột trong suốt thời gian thí nghiệm. Bên cạnh đó, kết quả cho thấy lá xoài non hoặc rễ me keo ở các liều khảo sát không ảnh hưởng đến hành vi, sự tăng trọng bình thường của chuột. Các chỉ số về glucose huyết, huyết học, chức năng gan và thận ở nhóm chuột uống cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo ở các liều khảo sát đều tương đương với chuột bình thường. Điều này cho thấy lá xoài non hoặc rễ me keo không gây độc tính cấp trên chuột ở nồng độ khảo sát 5000 mg/kg. Cấu trúc mô học của gan và thận ở nhóm chuột uống cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo liều cao có ảnh hưởng đến cấu trúc mô gan và thận chuột bình thường. Tóm lại, cao chiết lá xoài non (450 mg/kg) và rễ me keo (150 mg/kg) có khả năng chống tăng glucose huyết, rối loạn chuyển hóa lipid, chống xơ vữa động mạch tốt nhất. Cao chiết lá xoài ii
non hoặc rễ me keo có thể được sử dụng như một loại dược liệu hữu dụng trong điều trị tăng glucose huyết và ngăn ngừa biến chứng do sự tăng glucose huyết kéo dài gây ra. Từ khóa: glucose-6-phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, Mangifera indica L., min6 cell, Pithecellobium ducle (Roxb.) Benth. iii
ABSTRACT Mangifera indica L. and Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth. are popular in Mekong delta. So in this research, the antioxidant role, regulating glucose-6-phosphatase (G6Pase), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and lactate dehydrogenase (LDH), protective effect min6 pancreatic β-cells, antidyslipidemic of Mangifera indica L. young leaves and Pithecellobium ducle (Roxb.) Benth. root were investigated in vitro. Acute toxicity studies with MIL or PDR were performed in experimental mice. The present study was also conducted to elucidate the anti-hyperglycemic, anti- dyslipidemia, anti- atherosclerosis. The activities of key carbohydrate metabolism enzyme comprising G6Pase, G6PDH and LDH in liver and muscle of diabetic mice were determined. The in vivo experiment, mice were orally treated with three different single doses 1000, 2500, 5000 mg/kg of the MIL or DPR extract and screened for signs of acute toxicity. This study was assessed by determining its effect on blood glucose, body weight, total cholesterol, triglyceride, HDL- Cho, LDL- Cho, atherogenic index (AI, CRI, CVRI) incompared with those of controls. Alloxan monohydrate (AM) - induced diabetic male Mus musculus L. mice were used as experimental models for a period of 28 days. The experiment was designed to determine effect of MIL or PDR extract on diabetic mice. The mice were allowed to acclimated to the laboratory environment for 48 hours, dictributed into eleven groups according to the similar weights and glucose blood with six animals in each group (n=6). Group I normal control consisted of normal mice that neither injected AM nor any drug. Group II and III were taken MIL or PDR extract (450 mg/kg body weight). Group IV served as negative control (diabetic control). Group V was given standard drug, glucophage (170 mg/ kg body weight as possitive control. Next groups, diabetic mice were treated with extract of MIL or PDR (150, 300, 450 mg/kg body weight/ twice a day). Hyperglycermia was resulted in the generation of free radicals. So the in vitro studies including phytochemical screening of methanol extracts of MIL and PDR were examined the presence of bioactive compounds. The antioxidant activities of MIL and PDR were demonstrated by employing established in vitro systems, which included radical scavenging DPPH, ABTS·+ and ferric reducing. Pancreatic beta cell line closely associated with to diabetes mellitus. So they become weak or die, insulin secretion will be affected immediately. Protective effect of MIL or PDR extract against endoplasmic reticulum (ER) stress was conducted in min6 pancreatic β-cells in iv
vitro. The min6 cell line was cultured with 5 µg/mL tunicamycin added in 24 hours of exposure and 5% CO2 to induce ER stress and cell death. Cytotoxicity effect of MIL or PDR extract on min6 cells was observed concentration from 50 to 500 µg/mL. To investigate the effect of MIL or PDR extract on ER stress, min6 cell were treatment tunicamycin with extract (50 - 500 µg/mL) for 48 hours at 37oC in a 5% CO2 humidified incubator. The first result show that phytochemical investigation on the MIL and PDR methanol extracts revealed the presence of various phytoconstituents such as flavonoids, alkaloids, tannins, triterpenoids and glycosides. MIL also contains phenols, coumarins and quinons while PDR contains saponins. The total polyphenol of MIL extract (335.06 ± 0.05 mg GAE/g extract) is higher than amount of total polyphenols of PDR (246.5 ± 65.5 mg GAE/g extract). Total flavonoid content of MIL (432.86 ± 10.01 mg QE/g extract) is also higher than TFC of PDR (427.4 ± 4.9 mg QE/g extract). In addition, the antioxidant effects of the MIL and PDR indicate that both MIL and PDR extract against oxidation effect but there are lower than standard. In DPPH assay, the anti-oxidation of MIL (EC50= 27.6 µg/mL) is higher than PDR (EC50= 67.9 µg/mL) and lower than Trolox standard (EC50= 4.26 µg/mL). In Fe2+ chelating and ABTS assay, the anti-oxidation of PDR extract (67.9 µg/mL, 7.03 µg/mL), is higher than MIL extract (45.7±0.50 µg/mL; 12.11±1.15 µg/mL, respectively) but lower than BHA standard (30.1 µg/mL) and Trolox standard (0.037 µg/mL). Addition, the second result indicate that at concentration 5 µg/mL, tunicamycin had significant induced apoptosis after 24 hours. MIL and PDR did not cause min6 cell to die for 48 hours. The extract of MIL (50 µg/mL) or PDR (100 µg/mL) can protect min6 cells against cell death with ER stress respectively in 24 and 48 hours. Next, the result screening of controlling glucose enzyme metabolism activities of extracts depicted the effect of MIL on G6Pase (IC50 = 42.9 µg/mL), G6PDH (IC50 = 82.6 µg/mL) activities is better than PDR (IC50 = 56 µg/mL, 92.7 µg/mL). In contrast, the effect of PDR extract on LDH(IC50 = 122.6 µg/mL) activity is higher than MIL (IC50 = 142.6 µg/mL, respectively). The results showed that the methanol extract of MIL or PDR showed significantly antidiabetic and antihyperlipidemic activities as evidenced by significant decrease in plasma glucose, TC, TG, LDL- Cho levels with elevation of HDL- Cho level and diminution of atherogenic index in diabetic mice. Observation of the microscopic cross section of liver tissues revealed that mice treated with MIL or PDR extract had significantly improvement in liver tissues compared to those of the non-treated control group. Futher more, throughout the 14 days observation acute period, no abnormal changes v
attributable to the treatment tunicamycin were noticed in behavior such as apathy, hyperactivities, morbidity, respirations and hear rate etc. Besides, the body weight, blood glucose, AST and ALT were not significant changed after the period of experiment. Observation of the microscopic cross section of liver and tissues revealed that mice treated with high extracts had not change when compared in those of the control group. In conclution, the MIL or PDR hold anti diabetic, antihyperlipidemic activity and antiatherogenicity in diabetic mice. They can be utilized as useful remedy for alleviation of diabetes and its complication. Keywords: glucose-6-phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, Mangifera indica L., min6 cell, Pithecellobium ducle (Roxb.) Benth. vi
vii
MỤC LỤC TÓM TẮT TIẾNG VIỆT i ABSTRACT iv LỜI CAM ĐOAN Error! Bookmark not defined. MỤC LỤC viii DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BẢNG xiv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT xvi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 3 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 3 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 4 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 6 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 6 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 6 1.4 Ý nghĩa của nghiên cứu 6 1.5 Tính mới của luận án 6 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 2.1 Giới thiệu về thực vật nghiên cứu 8 2.1.1 Cây xoài (Mangifera indica L.) 8 2.1.2 Cây me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth) 11 2.2 Giới thiệu về bệnh đái tháo đường 12 2.2.1 Khái niệm về bệnh đái tháo đường 12 2.2.2 Triệu chứng của bệnh đái tháo đường 12 2.2.3 Phân loại bệnh đái tháo đường 13 2.3 Mối quan hệ giữa tụy tạng và bệnh đái tháo đường 14 2.3.1 Vai trò của tụy tạng đối với bệnh đái tháo đường 14 2.3.2 Tế bào beta tụy tạng và bệnh đái tháo đường 18 2.4 Hoạt động của các enzyme chìa khóa trong chuyển hóa glucose ở người bình thường và người bệnh đái tháo đường 19 viii
2.4.1 Enzyme glucose-6-phosphatase 19 2.4.2 Enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase 20 2.4.3 Enzyme lactate dehydrogenase 21 2.4.4 Vai trò của hoạt động enzyme trong kiểm soát glucose huyết và bệnh đái tháo đường 22 2.5 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa, sự tổn thương cơ quan và bệnh đái tháo đường 24 2.5.1 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh đái tháo đường 24 2.5.2 Vai trò của gan trong kiểm soát glucose huyết và bệnh đái tháo đường 25 2.5.3 Ảnh hưởng của bệnh đái tháo đường đối với thận 28 2.6 Các hóa chất được sử dụng để xây dựng mô hình stress mạng nội chất trên tế bào cô lập từ mô hình động vật 30 2.7 Mô hình gây bệnh đái tháo đường 31 2.7.1 Các phương pháp tạo động vật bệnh đái tháo đường 31 2.7.2 Hóa chất gây bệnh đái tháo đường 31 2.7.3 Mô hình phẫu thuật gây bệnh đái tháo đường 32 2.8 Mối quan hệ giữa bệnh đái tháo đường với rối loạn chuyển hóa lipid huyết và các bệnh tim mạch 32 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN 34 3.1 Định tính và định lượng thành phần hóa học của LXN và RMK in vitro 34 3.1.1 Ly trích cao chiết toàn phần methanol lá xoài non và rễ me keo bằng phương pháp ngâm dầm 34 3.1.2 Định tính thành phần hóa học của cao chiết lá xoài non và rễ me keo 35 3.1.3 Định lượng 37 3.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của LXN và RMK in vitro 38 3.2.1 Khảo sát khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 38 3.2.2 Khảo sát khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp khử sắt 38 3.2.3 Khảo sát khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS•+ 39 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến hoạt động của enzyme chuyển hóa carbohydrate in vitro 40 3.3.1 Glucose-6-phosphatase 40 3.3.2 Glucose-6-phosphate dehydrogenase 41 ix
3.3.3 Lactate dehydrogenase 41 3.4 Khảo sát hiệu quả bảo vệ tế bào tụy tạng min6 in vitro 42 3.4.1 Nuôi cấy tế bào tụy tạng min6 43 3.4.2 Phương pháp đếm tế bào sống 44 3.4.3 Ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến sự sinh trưởng và phát triển của tế bào tụy tạng min6 45 3.4.4 Khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng min6 khỏi sự chết 45 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của lá xoài non và rễ me keo đến chuột tăng glucose huyết 46 3.5.1 Xây dựng mô hình chuột nhắt trắng tăng glucose huyết 47 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của lá xoài non và rễ me keo đến chuột tăng glucose huyết do alloxan monohydrate. 47 3.5.3 Hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa carbohydrate ở các mô của chuột tăng glucose huyết 48 3.5.4 Khảo sát mô bệnh học gan và thận ở chuột thí nghiệm 48 3.6 Khảo sát độc tính cấp của cao chiết thực vật trên chuột nhắt trắng 49 3.7 Xử lý số liệu và thống kê 51 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 4.1 Định tính và định lượng thành phần hóa học của lá xoài non và rễ me keo 52 4.1.1 Ly trích cao chiết toàn phần methanol lá xoài non và rễ me keo bằng phương pháp ngâm dầm 52 4.1.2 Định tính thành phần hóa học 53 4.1.3 Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng 53 4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết thực vật in vitro 54 4.2.1 Khảo sát khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 54 4.2.2 Khảo sát khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp khử sắt 56 4.2.3 Hiệu quả trung hòa gốc tự do ABTS•+ của LXN và RMK 58 4.3 Khảo sát ảnh hưởng của LXN và RMK đến hoạt động của các enzyme glucose-6-phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase và lactate dehydrogenase in vitro 59 4.3.1 Enzyme glucose-6-phosphatase (G6Pase) 59 4.3.2 Enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) 62 4.3.3 Enzyme lactate dehydrogenase (LDH) 64 4.4 Khảo sát hiệu quả bảo vệ tế bào tụy tạng min6 in vitro 66 x
4.4.1 Nuôi cấy tế bào tụy tạng min6 66 4.4.2 Ảnh hưởng của tunicamycin đến sự sinh trưởng và phát triển của tế bào tụy tạng min6 67 4.4.3 Ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến sự sinh trưởng và phát triển của tế bào tụy tạng min6 69 4.4.4 Khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng min6 khỏi sự chết của cao chiết thực vật 70 4.5 Khảo sát ảnh hưởng của lá xoài non và rễ me keo đến chuột gây tăng glucose huyết. 73 4.5.1 Xây dựng mô hình chuột nhắt trắng tăng glucose huyết 73 4.5.2 Hiệu quả chống sự tăng glucose huyết của LXN và RMK 74 4.5.3 Hiệu quả chống sự rối loạn lipid huyết trên chuột gây tăng glucose huyết của LXN và RMK 79 4.5.4 Hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa glucose in vivo 85 4.5.5 Khảo sát mô bệnh học gan và thận ở chuột tăng glucose huyết 94 4.6 Khảo sát độc tính cấp của LXN và RMK 105 4.6.1 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến trạng thái sinh lý chuột nhắt trắng 105 4.6.2 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến khối lượng và glucose huyết của chuột thí nghiệm 106 4.6.3 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến các thông số sinh hóa và huyết học 107 4.6.4 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến cấu trúc mô học gan và thận109 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 115 5.1 Kết luận 115 5.2 Kiến nghị 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 135 PHỤ LỤC 136 xi
DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cây xoài ............................................................................................. 9 Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của mangiferin. .................................................... 10 Hình 2.3. Cây (A), lá (B), hoa (C) và trái (D) của me keo. ............................. 11 Hình 2.4. Sơ đồ minh họa cấu trúc tụy tạng. ................................................... 15 Hình 2.5. Ảnh hưởng của sự thiếu insulin và dư glucagon. ............................ 17 Hình 2.6. Vai trò của enzyme G6Pase trong sự chuyển hóa glucose ở gan. ... 20 Hình 2.7. Vai trò của enzyme G6PDH ở BĐTĐ. ............................................ 21 Hình 2.8 Lactate dehydrogenase và sự chuyển hóa glucose. .......................... 22 Hình 2.9. Sự kiểm soát glucose huyết và BĐTĐ. ............................................ 24 Hình 2.10. Tiến triển của tổn thương gan ở bệnh nhân BĐTĐ. ...................... 28 Hình 3.1. Quá trình chuyển hóa G6P được xúc tác bởi enzyme G6Pase. ....... 40 Hình 3.2. Quá trình chuyển hóa G6P được xúc tác bởi enzyme G6PDH. ...... 41 Hình 3.3. Quá trình chuyển hóa pyruvate được xúc tác bởi LDH. .................. 42 Hình 3.4. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của cao chiết LXN/ RMK đến hoạt động của enzyme G6Pase, G6PDH, LDH in vitro. .................................................. 42 Hình 3.5. Sơ đồ quá trình nuôi cấy tế bào tụy tạng min6. ............................... 44 Hình 3.6. Mô hình thể hiện sự bắt màu của tế bào chết khi nhuộm bằng trypan-blue. ...................................................................................................... 44 Hình 3.7.Sơ đồ biểu hiện sự bắt màu của WST-8 với tế bào sống. ................. 45 Hình 3.8. Sơ đồ thí nghiệm khả năng bảo vệ tế bào mĩn khỏi sự chết gây ra bởi tunicamycin ...................................................................................................... 46 Hình 3.9. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cao chiết LXN/RMK trên chuột gây tăng glucose huyết. .......................................................................... 49 Hình 3.10. Sơ đồ khảo sát độc tính cấp của cao chiết LXN và RMK. ............ 51 Hình 4.1. Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ enzyme G6Pase đến hiệu suất phản ứng........................................................................................................... 60 Hình 4.2. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến hoạt động của enzyme G6Pase in vitro. ................................................................................................................. 61 Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ enzyme G6PDH đến hiệu suất phản ứng........................................................................................................... 62 Hình 4.4. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến hoạt động của enzyme G6PDH in vitro. ............................................................................................................. 63 xii
Hình 4.5. Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ enzyme G6PDH đến hiệu suất phản ứng........................................................................................................... 65 Hình 4.6. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến hoạt động LDH in vitro. .......... 66 Hình 4.7. Ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển của tế bào min6. .......... 67 Hình 4.8. Ảnh hưởng của LXN đến sự phát triển của tế bào tụy tạng min6. . 69 Hình 4.9. Ảnh hưởng của RMK đến sự phát triển của tế bào tụy tạng min6. 69 Hình 4.10. Khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng min6 khỏi quá trình chết của LXN. ................................................................................................................ 70 Hình 4.11. Khả năng bảo vệ min6 khỏi quá trình chết của RMK. .................. 72 Hình 4.12. Ảnh hưởng của AM lên glucose huyết (A) và khối lượng (B) chuột nhắt trắng. ........................................................................................................ 74 Hình 4.13. Hiệu suất gây tăng glucose huyết ở chuột Mus musculus L. ......... 74 Hình 4.14. Khối lượng chuột thí nghiệm sau 28 ngày điều trị. ....................... 78 Hình 4.15. Cấu trúc tiểu thùy gan cổ điển ở nhóm đối chứng sinh lý. ............ 95 Hình 4.16. Ảnh hưởng của AM đến gan chuột gây tăng glucose huyết. ......... 96 Hình 4.17. Ảnh hưởng của glucophage đến gan chuột tăng glucose huyết..... 97 Hình 4.18. Ảnh hưởng của LXN (450 mg/kg) đến gan chuột tăng glucose huyết................................................................................................................. 98 Hình 4.19. Ảnh hưởng của rễ me keo (150 mg/kg) đến gan chuột tăng glucose huyết................................................................................................................. 99 Hình 4.20. Cấu trúc mô học thận của nghiệm thức đối chứng sinh lý .......... 100 Hình 4.21. Ảnh hưởng của alloxan monohydrate đến cấu trúc mô thận. ...... 101 Hình 4.22. Cấu trúc mô thận chuột tăng glucose huyết được điều trị bằng glucophage. .................................................................................................... 102 Hình 4.23. Ảnh hưởng LXN liều 450 mg/kg đến cấu trúc mô thận chuột gây tăng glucose huyết. ........................................................................................ 103 Hình 4.24. Cấu trúc mô thận chuột tăng glucose huyết được điều trị bằng rễ me keo liều 150 mg/kg................................................................................... 104 Hình 4.25. Độc tính cấp của LXN trên mô gan chuột thí nghiệm. ................ 110 Hình 4.26. Độc tính liều 1000 mg/kg của RMK trên mô gan chuột thí nghiệm. ........................................................................................................................ 111 Hình 4.27. Ảnh hưởng độc tính liều 1000 mg/kg của LXN trên mô thận chuột thí nghiệm. ..................................................................................................... 112 Hình 4.28. Ảnh hưởng độc tính liều 1000 mg/kg của RMK trên mô thận chuột thí nghiệm. ..................................................................................................... 113 xiii
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Tóm tắt thí nghiệm khảo sát thành phần hòa học có trong cao chiết LXN và RMK. ................................................................................................. 37 Bảng 4.1. Kết quả điều chế cao chiết toàn phần methanol lá xoài non và rễ me keo. ................................................................................................................... 52 Bảng 4.2. Thành phần hóa học hợp chất có trong LXN và RMK ................... 53 Bảng 4.3. Kết quả định lượng polyphenol và flavonoid của LXN và RMK. .. 54 Bảng 4.4. Hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương trolox của LXN và RMK. ............................................................................................................... 55 Bảng 4.5 . Nồng độ đạt giá trị EC50 của trolox, LXN và RMK. ...................... 55 Bảng 4.6. Hàm lượng chất chống oxy hóa có trong LXN. .............................. 56 Bảng 4.7. Hàm lượng chất chống oxy hóa có trong RMK. ............................. 57 Bảng 4.8. Nồng độ đạt giá trị EC50 của BHA, lá xoài non và rễ me keo. ....... 57 Bảng 4.9. Hàm lượng chất chống oxy hóa của LXN. ...................................... 58 Bảng 4.10. Hàm lượng chất chống oxy hóa của RMK. ................................... 58 Bảng 4.11. Nồng độ đạt giá trị EC50 của trolox, LXN và RMK. ..................... 59 Bảng 4.12. Nồng độ đạt giá trị IC 50 của LXN và RMK. ................................. 62 Bảng 4.13. Giá trị IC 50 của LXN và RMK. ..................................................... 64 Bảng 4.14. Giá trị EC50 của LXN và RMK. .................................................... 66 Bảng 4.15. Tỷ lệ sống của tế bào khi ủ với tunicamycin. ................................ 67 Bảng 4.16. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến glucose huyết và tỷ lệ sốngcủa chuột thí nghiệm sau 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày. ........................... 76 Bảng 4.17. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến lipid huyết ở chuột gây tăng glucose huyết sau 28 ngày thí nghiệm. ............................................................ 82 Bảng 4.18. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến chỉ số tim mạch chuột sau 28 ngày thí nghiệm ............................................................................................... 85 Bảng 4.19. Kết quả điều hòa enzyme G6Pase trên gan chuột sau 28 ngày thí nghiệm. ............................................................................................................ 86 Bảng 4.20. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến hoạt động enzyme G6PDH ở gan chuột sau 28 ngày thí nghiệm ................................................................... 89 Bảng 4.21. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến hoạt động enzyme lactate dehydrogenase ở cơ xương chuột thí nghiệm. ................................................. 93 Bảng 4.22. Kết quả đánh giá các hành vi chuột trong 14 ngày khảo sát sau khi uống cao chiết lá xoài non hoặc rễ me keo liều cao duy nhất. ...................... 106 xiv
Bảng 4.23 Ảnh hưởng độc tính cấp của LXN và RMK trên chuột thí nghiệm ........................................................................................................................ 107 Bảng 4.24. Ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến chức năng gan và thông số huyết học của chuột thí nghiệm. .................................................................... 108 xv
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt %I Percent Inhibitor Phần trăm nồng độ ức chế ABTS 2,2’-Azinobis (3ethylbenzothiazoline-6- sulfonate ADA American Dietetic Association Hiệp hội đái tháo đường của Mỹ AI Atherogenic Index Chỉ số xơ vữa ALT Alanine Transaminase AM Alloxan Monohydrate AST Aspartate Transamine BĐTĐ Bệnh Đái Tháo Đường BLAST Basic Local Alignment Search Công cụ tìm kiếm các vị trí Tool tương đồng cục bộ BT Bình thường CRI Coronary Risk Index Chỉ số nguy cơ mạch vành CVRI Cardiovascular Risk Index Chỉ số nguy cơ tim mạch DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid eIF Eukaryotic Initiation Factor Yếu tố khởi đầu ER Endoplasmic Reticulum Mạng nội chất FBS Feval Bovine Serum Dung dịch huyết thanh G Glucophage G6P Glucose-6-phosphate G6Pase Glucose-6-Phosphatase G6PDH Glucose-6-phosphate Dehydrogenase Glu glucose glucose HCT Hematocrit Dung tích hồng cầu HDL High Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao HGB Hemoglobin Huyết sắc tố IC50 Inhibitory Concentration of 50% Nồng độ ức chế 50% xvi
IRE1 Inositol-Requiring Protein 1 ITS Internal Transcribed Spacer Vùng đệm trong được sao mã LDH Lactate Dehydrogenase LDL Low Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp LXN MIL Cao chiết methanol tổng lá xoài non MCH Mean Corpuscular Hemoglobin Lượng Hemoglobin trung bình của hồng cầu MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Nồng độ Hemoglobin trung bình Concentration của hồng cầu MCV Mean Corpuscular Volume Thể tích trung bình của hồng cầu NADP Nicotinamide adenine NCBI National Center for Trung tâm quốc tế về dữ liệu Biotechnology Information công nghệ sinh học OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối phosphate PEPCK Phosphoenolpyruvate RMK PDR Cao chiết methanol tổng rễ me keo Rpm Revolution per minute Vòng trên 1 phút SZT streptozocin, streptocitocin tunicamyci Tunicamycin n URP Unfolded Protein Response UV-vis Ultra violet-Visible Phổ tử ngoại-khả kiến WBC White Blood Cell tế bào bạch cầu xvii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Đồng bằng sông Cửu Long nói chung và Trà Vinh nói riêng, đây là vùng đất có điều kiện khí hậu và địa hình phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại thực vật. Hiện nay, các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp các loại thực phẩm chức năng và thuốc mới để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe của con người với giá thành rẻ hơn so với thuốc hóa học (Rai et al., 2008; Srinivasan and Subramaniyan, 2014; Watal et al., 2014). Việt Nam là nước có bề dày lịch sử về sự tồn tại và phát triển của thuốc cổ truyền. Thuốc cổ truyền là thuốc có nguồn gốc từ động vật, thực vật và khoáng vật. Nhiều thực vật hiện đang được sử dụng rộng rãi nhưng chưa được khoa học kiểm định, chứng minh tác dụng thật sự cũng như liều lượng phù hợp để sử dụng. Trong đó, cây xoài được trồng phổ biến và là nguồn thu nhập chính của nhiều hộ gia đình. Mặt khác, trong quá trình canh tác việc cắt tỉa cành sau mỗi vụ thải ra một lượng lớn lá xoài không được sử dụng. Vì vậy, nếu có thể tận dụng nguồn lá xoài để ly trích các hợp chất có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường (BĐTĐ) sẽ nâng cao giá trị và hình thành chuỗi giá trị liên hoàn của cây xoài. Bên cạnh đó, cây me keo đang là loại thực vật được trồng khá phổ biến trong mỗi hộ dân cư đồng bào Khmer ở Trà Vinh. Cây me keo hoàn toàn không mang lại giá trị kinh tế cho người dân. Theo kinh nghiệm dân gian, lá xoài non và rễ me keo đang được người dân sử dụng như một nguồn thuốc chữa BĐTĐ chính. Vì vậy, việc nghiên cứu liều lượng và tác dụng của các loại thực vật này dựa trên nền tảng khoa học là cần thiết. Từ kết quả nghiên cứu, liều lượng hiệu quả cũng như liều gây độc của loại thực vật sẽ được đưa ra khuyến cáo cho người dân. Kết quả của nghiên cứu về loài thực vật có hiệu quả tốt sẽ là nền tảng cho những nghiên cứu dược liệu tiếp theo nhằm tạo ra dược phẩm điều trị BĐTĐ và mang lại lợi ích kinh tế từ lá xoài và rễ me keo cho người dân. Ở giai đoạn xã hội phát triển và hiện đại, chất lượng cuộc sống được nâng cao, con người có xu hướng tiêu thụ nhiều thức ăn dư thừa dinh dưỡng và ít vận động. Đó là một trong những nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ các bệnh rối loạn chuyển hóa carbohydrate tăng cao như béo phì, gan nhiễm mỡ, rối loạn chuyển hóa lipid huyết, gout, BĐTĐ. Bệnh đái tháo đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa, đặc trưng bởi glucose huyết tăng cao do sự thiếu hụt insulin, kháng insulin ở tế bào đích hoặc cả hai (Abraham et al., 2017). Nồng độ glucose huyết tăng cao là nguyên nhân dẫn đến biến chứng của BĐTĐ, đây chính là nguyên nhân làm tăng tỷ lệ bệnh tật và tử vong cao của BĐTĐ. Theo 1