Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phòng trị bệnh do liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae bằng thảo dược trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.) nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:205

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn "Nghiên cứu phòng trị bệnh do liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae bằng thảo dược trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.) nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh" được hoàn thành với mục tiêu nhằm xác định được loại thảo dược và loại dung môi phù hợp để tạo ra cao chiết có khả năng háng hiệu quả với vi khuẩn S. agalactiae ở điều kiện in vitro. Đánh giá hiệu quả bổ sung cao chiết thảo dược vào thức ăn n tăng trưởng, tăng cường một số chỉ tiêu miễn dịch hông đặc hiệu và khả năng háng bệnh do vi khuẩn S.agalactiae gây ra trên cá rô phi giống.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phòng trị bệnh do liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae bằng thảo dược trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.) nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM  NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢC NÂNG CAO KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH DO Streptococcus agalactiae GÂY RA TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis spp.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM  NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢC NÂNG CAO KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH DO Streptococcus agalactiae GÂY RA TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis spp.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh PGS. TS. Từ Thanh Dung Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024
i LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và PGS.TS. Từ Thanh Dung vì sự tận tình hướng dẫn, hỗ trợ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin được chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Ban ch nhiệm c ng tập thể Khoa Khoa học Sinh học và Ph ng Sau đại học thuộc Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo cùng các cán bộ tại Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản Nam Bộ, Phòng Sinh học thực nghiệm, Trại Nghiên cứu Thực nghiệm Th y sản G Vấp thuộc Viện Nghi n cứu Nuôi trồng Th y sản II đã hỗ trợ và tạo mọi điều iện về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu. Đồng thời tôi xin cám ơn anh Đoàn Văn Cường - người đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin được gửi ời cám ơn đến Ban Giám đốc c ng các đồng nghiệp Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai đã ng hộ, tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể học tập và hoàn thành luận án. Xin chân thành cám ơn những Thầy/Cô, anh chị Khoa Th y sản c a Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị em Nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học khóa 2016, các em sinh viên đã hỗ trợ động viên tôi hoàn thành các nội dung c a luận án. Tôi vô cùng biết ơn gia đình Chồng và Các con tôi - những người đã luôn yêu thương ở bên cạnh để động viên, hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện Luận án. Xin chân thành cám ơn. Tác giả luận án
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và một phần kết quả thuộc nhiệm vụ khoa học và công nghệ “Nghi n cứu phòng trị bệnh do liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae bằng thảo dược trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.) nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh” được tài trợ kinh phí bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (thuộc Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh) cho Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản Nam Bộ theo Hợp đồng số 26/2018/HĐ-QKHCN. Những số liệu, kết quả trong luận án được phép công bố với sự đồng ý c a ch nhiệm đề tài, nhóm tác giả, cộng tác vi n và chưa từng được công bố bởi tác giả khác. Tác giả luận án NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN
iii TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 12 năm 2022 với các nội dung gồm: (1) Xác định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Streptococcus agalactiae ở điều kiện in vitro c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng; (2) Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae trong điều kiện phòng thí nghiệm; (3) Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên chỉ tiêu máu, một số chỉ tiêu miễn dịch và hình thái ruột c a cá rô phi; và (4) Khảo sát khả năng kháng khuẩn c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính. Cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng được chiết xuất trong dung môi ethanol 96% và methanol 99,8% được ghi nhận à có khả năng diệt vi khuẩn S. agalactiae ở điều kiện in vitro trong số 6 loại thảo dược được khảo sát. Nghiên cứu trong điều kiện in vivo cho thấy, cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế với các hàm ượng 10 20 và 40 g/kg được bổ sung vào thức ăn trong 8 tuần hông àm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển c a cá rô phi giống. B n cạnh đó với thời gian bổ sung 28 ngày và tiếp tục trong 10 ngày sau hi cá được cảm nhiễm với S. agalactiae, các cao chiết tr n đã cho thấy hiệu quả hỗ trợ nâng cao khả năng háng bệnh do S. agalactiae gây ra; đồng thời cao chiết vỏ quế còn giúp gia tăng hả năng hấp thu chất dinh dưỡng trên cá rô phi giống. Hiệu quả bảo vệ cao nhất với vi huẩn S. agalatiae (RPS đạt 51 4%) trên cá được cho ăn hẩu phần có bổ sung cao chiết vỏ quế với hàm ượng 20 g/ g thức ăn. Nghi n cứu cho thấy, hoạt chất cinnamic aldehyde với hàm ượng 100 µg/g thức ăn và 200 µg/g thức ăn có khả năng háng vi khuẩn S. agalactiae. Ngoài ra, nghiên cứu đã cho thấy sự hiện diện c a vi khuẩn S. agalactiae mang các yếu tố độc lực quan trọng và thuộc CC283, kiểu trình tự ST283 tại huyện C Chi, Thành phố Hồ Chí Minh. Các kết quả trong nghiên cứu này đã giúp hẳng định tiềm năng ứng dụng c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng trong việc nâng cao khả năng háng bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra trên cá rô phi giống.
iv ABTRACTS The study was conducted from November 2017 to December 2022, with the contents included: (1) Determination of the ability to antagonize pathogenic bacteria S. agalactiae under in vitro conditions of cinnamon bark (Cinnamomum verum) and ginger (Zingiber officinale) extracts; (2) Determination of the effect of extract on growth and ability to protect tilapia against pathogenic bacteria S. agalactiae under experimental conditions; (3) Determination of the effect of the extract on blood and immune parameters, and morphological parameters of tilapia intestine; and (4) Investigation of antibacterial properties of cinnamon bark and ginger extracts based on the content of main active ingredients. Ginger and cinnamon bark extracts in ethanol 96% and methanol 99.8% have ability to against two strains of S. agalatiae under in vitro conditions among 6 tested herbs. The study under in vivo conditions confirmed that, the addition of ginger and cinnamon extracts with concentrations of 10, 20 and 40 g/kg to the feed gave no effect for the growth and development of tilapia at fingerling stage. At the same time, in the period of 28 days and continuing to supplement for 10 days after fish injected intraperitoneally to S. agalactiae, the ginger and cinnamon extracts provided the protective effect in enhancing the fish against to S. agalactiae; besides, cinnamon extract also increased nutrient absorption ability in tilapia fingerlings. The addition of cinnamon extract with the concentration of 20 g/kg of feed had the highest protective effect with S. agalatiae (with the RPS value being 51.4%). The results have determined the S. agalactiae bactericidal ability of cinnamic aldehyde with the content of 100 µg/g feed and 200 µg/g feed. Moreover, this study has shown the presence of bacteria S. agalactiae CC283, ST283 sequence bringing important virulence factors in Cu Chi district, Ho Chi Minh city, Vietnam. The results in the study confirmed the potential of cinnamon and ginger extracts in enhancing the resistance to S. agalactiae in tilapia fingerlings.
v MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN…………………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………….. ii TÓM TẮT…………………………………………………………………........ iii ABSTRACT…………………………………………………………………….. iv MỤC LỤC………………………………………………………………………. v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT…………………………………………........... ix DANH MỤC BẢNG……………………………………………………………. xi DANH MỤC HÌNH……………………………………………………….......... xiii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….... 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN………………………………………………….......... 6 1.1 Tổng quan về cá rô phi…………………………………………………........ 6 1.1.1 Phân loại khoa học và nguồn gốc…………………………………………. 6 1.1.2 Đặc điểm sinh học………………………………………………………… 6 1.1.3 Tình hình sản xuất cá rô phi trên thế giới và ở Việt Nam………………… 7 1.2 Tổng quan về vi huẩn S. agalactiae………………………………………… 8 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa……………………………………………… 8 1.2.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích …………………………………......... 9 1.2.3 Phân nhóm và độc lực c a vi khuẩn S. agalactiae………………………... 10 1.2.3.1 Phân nhóm………………………………………………….................. 10 1.2.3.2 Các yếu tố độc lực……………………………………………………... 11 1.2.4 Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra……………………. 13 1.2.4.1 Đối với động vật thủy sản………………………………………….….. 13 1.2.4.2 Đối với cá rô phi…………………………………………………......... 14 1.3 Sử dụng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. và S. agalactiae gây ra trên th y sản…………………………………………........…… 15 1.3.1 Nghiên cứu khả năng háng Streptococcus sp. c a thảo dược…………… 16 1.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng c a thảo dược n tăng trưởng, sức khỏe
vi cá…………………………………………………………………..……………… 18 1.4 Đáp ứng miễn dịch trên cá xương và tác động c a thảo dược lên hình thái biểu mô c a cá……………………………………………………………………. 20 1.4.1 Đáp ứng miễn dịch tr n cá xương………………………………………… 20 1.4.2 Tác động c a thảo dược lên hình thái biểu mô c a cá…………………… 20 1.5 Giới thiệu các loại thảo dược sử dụng trong nghiên cứu……………………... 21 1.6 Phương pháp chiết xuất thảo dược dùng trong nghiên cứu………………….. 24 1.6.1 Chiết xuất ngấm kiệt…………………………………………………….. 24 1.6.2 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ cao………………………. 25 1.7 Cơ sở lựa chọn các nội dung nghiên cứu…………………………………… 26 Chƣơng 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………….......... 27 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu……………………………………………… 27 2.1.1 Thời gian……………………………………………………………......... 27 2.1.2 Địa điểm……………………………………………………………......... 27 2.2 Nội dung nghi n cứu……………………………………………………........ 27 2.3 Vật iệu nghi n cứu…………………………………………………………... 27 2.3.1 Thảo dược………………………………………………………………… 28 2.3.2 Nguồn cá bệnh dùng trong nghiên cứu……………………………………. 28 2.3.3 Cá dùng trong thí nghiệm in vivo................................................................. 29 2.3.4 Thức ăn hóa chất, dụng cụ, thiết bị............................................................. 29 2.4 Phương pháp nghi n cứu………………………………………………… …. 30 2.4.1 Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gây bệnh S. agalactiae ở điều kiện in vitro c a một số dịch chiết và cao chiết thảo dược………………… 30 2.4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn S. agalactiae…………………... ... 30 2.4.1.2 Khảo sát khả năng kháng S. agalactiae của cao chiết dạng thô……….. 32 2.4.1.3 Xác định giá trị MIC và MBC của cao chiết dạng thô……………… 36 2.4.2 Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae………………. 37 2.4.2.1 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên tăng trưởng………………… 37
vii 2.4.2.2 Xác định giá trị LD50 và các yếu tố độc lực………………………….. 39 2.4.2.3 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng bảo vệ cá rô phi……. 41 2.4.3 Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, chỉ tiêu miễn dịch và hình thái ruột c a cá rô phi…………………………………… 44 2.4.3.1 Bố trí thí nghiệm…………………………………………………....... 44 2.4.3.2 Thu mẫu……………………………………………………………….. 45 2.4.3.3 Phân tích tế bào máu và các chỉ tiêu miễn dịch…………………….… 46 2.4.3.4 Phân tích chỉ tiêu hình thái mô ruột cá…………………………...... 47 2.4.4 Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và hảo sát tính háng huẩn c a cao chiết thảo dược dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính……………... 48 2.4.4.1 Xác định hàm lượng hoạt chất 6-gingerol và cinnamic aldehyde…… 48 2.4.4.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của các hoạt chất chính………. 51 2.4.4.3 Xác định MIC và MBC của cao chiết theo hàm lượng chất chính……. 51 2.5 Xử lý số liệu………………………………………………………………….. 52 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………… 53 3.1 Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gây bệnh S.agalactiae ở điều kiện in vitro c a một số dịch chiết và cao chiết thảo dược…………….... ……… 53 3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu…………….. 53 3.1.2 Sàng lọc khả năng háng S. agalactiae c a dịch chiết………………….. 54 3.1.3 Khảo sát khả năng háng S. agalactiae c a các cao chiết dạng thô……… 57 3.1.4 Xác định giá trị MIC và MBC c a cao chiết gừng và quế………………. 61 3.1.5 Xác định loại thảo dược và dung môi phù hợp…………………………... 63 3.2 Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae…………………….. 64 3.2.1 Xác định ảnh hưởng c a cao chiết n tăng trưởng c a cá…………......... 64 3.2.2 Xác định giá trị LD50 và các yếu tố độc lực……………………………… 68 3.2.2.1 Xác định giá trị LD50……………………….…………………………… 68 3.2.2.2 Xác định các yếu tố độc lực... ……………………………………………… 70 3.2.3 Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên khả năng bảo vệ cá …………........ 77
viii 3.2.3.1 Tỷ lệ sống và các chỉ tiêu tăng trưởng………………………………… 77 3.2.3.2 Biểu hiện bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm…………………............. 78 3.3 Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, miễn dịch và hình thái ruột c a cá rô phi………………………………………………. 84 3.3.1 Xác định ảnh hưởng lên chỉ tiêu máu và các chỉ tiêu miễn dịch………… 84 3.3.1.1 Mật độ hồng cầu và bạch cầu………………………………………… 84 3.3.1.2 Hoạt tính thực bào…………………………………………………….. 93 3.3.2 Xác định ảnh hưởng lên hình thái mô ruột cá…………………………….. 95 3.4 Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và khảo sát tính kháng khuẩn c a cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính……………………………………………………………………………… 105 3.4.1 Xác định hàm ượng hoạt chất chính……………………………………... 105 3.4.1.1 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong cao chiết gừng…………… 106 3.4.1.2 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong cao chiết vỏ quế………. 109 3.4.1.3 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong thức ăn thí nghiệm……….. 113 3.4.2 Khả năng háng S. agalactiae c a cao chiết theo hoạt chất chính……… 114 3.5 Hiệu quả nâng cao khả năng háng S. agalactiae c a cao chiết....................... 116 Chƣơng 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………. 121 4.1 Kết luận………………………………………………………………………. 121 4.2 Đề nghị……………………………………………………………………….. 122 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ………………………………………………………………………. 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… 124 PHỤ LỤC
ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BHIA Brain Heart Infusion Agar BHIB Brain Heart Infusion Broth CAMP Christie–Atkins–Munch-Peterson CC Clonal complex CFU Co ony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) CPS Capsular polysaccharide DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide DO Hàm ượng oxy hòa tan DWG Tăng trọng khối ượng theo ngày ĐC Đối chứng ĐVT Đơn vị tính EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ FAO chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc) FCR Feed Conversion Ratio (hệ số biến đổi thức ăn) HBSS Hank's Balanced Salt Solution Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% vật thí nghiệm, liều vi LD50 khuẩn gây chết cá) Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tối MBC thiểu) MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MLST Multi-locus sequence typing (Giải trình tự gen đa điểm)
x Muscularis propria/ Muscu aris externa (Độ dày lớp đệm niêm MP/ME mạc) NT Nghiệm thức PA Phagocytic activity (Hoạt tính thực bào) PBS Phosphate Buffered Saline (Nước muối đệm photphat) RBC Red Blood Cell (Tế bào hồng cầu) RES Respiratory burst (Hoạt tính chống oxy hóa) RPMI Roswell Park Memorial Institute RPS Relative percentage survival (Tỷ lệ sống tương đối) Specific Growth Rate (Tốc độ tăng trưởng tương đối theo khối SGR ượng) ST Sequence Types (Loại trình tự) Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers (Hiệp VASEP hội Chế biến và Xuất khẩu Th y sản Việt Nam) VH Villus height (Chiều cao nhung mao) VW Villus width (Chiều rộng nhung mao) WBC White Blood Cell (Tế bào bạch cầu) WG Weight Gain (Tăng trọng khối ượng)
xi DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm gen độc lực c a vi khuẩn S. agalactiae…………………... 12 Bảng 2.1 Các loại thảo dược được dùng trong nghiên cứu.................................. 28 Bảng 2.2 Các ch ng vi khuẩn S. agalactiae dùng trong nghiên cứu.................... 29 Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng c a thức ăn d ng trong thí nghiệm ………... 29 Bảng 2.4 Hàm ượng ẩm (%) c a các loại bột thảo dược thí nghiệm………….. 33 Bảng 2.5 Các nghiệm thức c a thí nghiệm xác định ảnh hưởng c a việc bổ sung cao chiết vào thức ăn n tăng trưởng c a cá rô phi………………………. 39 Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định liều gây chết LD50……………………… 40 Bảng 2.7 Số ượng và thời điểm thu mẫu ruột cá làm tiêu bản mô học………... 47 Bảng 2.8 Ti u chuẩn hóa nguy n iệu gừng và quế……………………………. 49 Bảng 3.1 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các giếng tẩm dịch chiết thảo dược sau 48 giờ tiếp xúc với vi khuẩn SA-12.1 và SA-26.1…………………………………………………………………………. 55 Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo dược sau 48 giờ tiếp xúc với vi khuẩn............................ 58 Bảng 3.3 Kết quả xác định giá trị MIC và MBC c a cao chiết gừng và vỏ quế dạng thô đối với các ch ng vi khuẩn trong dung môi ethanol và methanol……. 62 Bảng 3.4 Các giá trị chất ượng nước trong thí nghiệm xác định tính an toàn c a cao chiết thảo dược hi bổ sung vào thức ăn………………………………. 64 Bảng 3.5 Tăng trưởng c a cá trong thí nghiệm……………………………….... 65 Bảng 3.6 Kết quả xác định LD50 c a các ch ng vi huẩn…................................ 69 Bảng 3.7 Trình tự gen các ocus để xác định iểu trình tự c a ch ng SA-2.1- CC………………………………………………………………………………. 71 Bảng 3.8 Các gen độc lực tìm thấy trong ch ng S. agalactiae SA-2.1-CC…… 76 Bảng 3.9 Các giá trị chất ượng nước trong thí nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ cá rô phi c a cao chiết thảo dược hi bổ sung vào thức ăn………………….. 77
xii Bảng 3.10 Khối ượng và tỷ ệ sống c a cá sau 28 ngày thí nghiệm ………….. 78 Bảng 3.11 Tỷ ệ chết tích ũy c a cá sau hi cảm nhiễm với vi huẩn S. agalctiae………………………………………………………………………… 81 Bảng 3.12 Hiệu quả bảo vệ c a cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế với cá rô phi hi được cảm nhiễm vi khuẩn S. agalactiae……………………………….. 82 Bảng 3.13 Diện tích nhung mao (103 µm2) c a ruột cá cho ăn thức ăn bổ sung cao chiết vỏ quế………………………………………………………………… 103 Bảng 3.14 Kết quả ti u chuẩn hóa nguy n iệu gừng………………….......... 106 Bảng 3.15 Kết quả phân tích hàm ượng 6-Gingero …………………………... 109 Bảng 3.16 Kết quả tiêu chuẩn hóa nguyên liệu quế……………………………. 110 Bảng 3.17 Kết quả phân tích hàm ượng cinnamic a dehyde………………….. 112 Bảng 3.18 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo dược theo hàm ượng hợp chất chính sau 48 giờ tiếp xúc với vi khuẩn SA-2.1-CC…………………………………………………… 115
xiii DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Cá rô phi vằn (O. niloticus)………………………………………… 7 Hình 1.2 Vi huẩn Streptococcus agalactiae………………………………… 9 Hình 1.3 Quá trình tách chiết thảo dược bằng phương pháp ngấm iệt ……... 25 Hình 2.1 Quy trình chiết xuất thảo dược thí nghiệm in vitro…………………. 31 Hình 2.2 Dịch chiết gốc thu được sau quá trình tách chiết…………………… 33 Hình 2.3 Cao chiết thảo dược sử dụng trong thí nghiệm……………………... 33 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng bảo vệ cá rô phi ……….. 42 Hình 2.5 Các giai đoạn c a thí nghiệm xác định khả năng bảo vệ cá rô phi….. 43 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉ tiêu miễn dịch và mô học ruột….. 44 Hình 2.7 Các chỉ tiêu khảo sát hình thái mô học ruột c a cá thí nghiệm……... 48 Hình 2.8 Quy trình chiết xuất thảo dược để khảo sát tỷ lệ dung môi chiết xuất tối ưu…………………………………………………………………………... 50 Hình 3.1 Xác định đặc tính sinh hóa c a ch ng SA-12.1 với test kit API 32 Strep……………………………………………………………………………... 54 Hình 3.2 Vòng kháng khuẩn tạo ra bởi các dịch chiết đối với ch ng SA-12.1 56 Hình 3.3 V ng háng huẩn tạo ra bởi cao chiết vỏ quế trong methanol và bởi kháng sinh Doxycycline đối với ch ng SA-12.1………………………… 59 Hình 3.4 Tăng trưởng hối ượng c a cá sau 8 tuần thí nghiệm……………... 66 Hình 3.5 Cá bình thường và cá có biểu hiện bệnh ý ………………………… 79 Hình 3.6 Tỷ ệ cá chết tích ũy theo ngày sau cảm nhiễm……………………. 80 Hình 3.7 Mật độ hồng cầu và bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……………………………. 85 Hình 3.8 Tỷ lệ các loại bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau………………………………………… 86
xiv Hình 3.9 Mật độ hồng cầu và bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau………………………………….. 88 Hình 3.10 Tỷ lệ các loại bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác………………………………………… 89 Hình 3.11 Chỉ số hoạt tính thực bào c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau…………… 93 Hình 3.12 Diện tích nhung mao ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau………………………………….. 97 Hình 3.13 Độ dày ớp cơ ni m mạc ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……………………………………. 98 Hình 3.14 Diện tích nhung mao ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……………………………………. 99 Hình 3.15 Độ dày ớp cơ ni m mạc ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau…………………………………. 100 Hình 3.16 Hình ảnh mô học ruột cá trong nghiên cứu……………………….... 102 Hình 3.17 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính các cao ỏng gừng với tỷ ệ hác nhau đối chiếu nguy n iệu và chuẩn 6- gingero ………………………… 107 Hình 3.18 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính cao đặc gừng tỷ ệ 1:20……… 108 Hình 3.19 Sắc í đồ dịch chiết cao gừng tỷ lệ 1:20 bằng HPLC……………….. 109 Hình 3.20 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính các cao ỏng vỏ quế với tỷ ệ hác nhau đối chiếu nguy n iệu và chuẩn cinnamic a dehyde…………….... 111 Hình 3.21 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính cao đặc vỏ quế tỷ ệ 1:30…… 112 Hình 3.22 Sắc ý đồ dịch chiết cao quế và dịch chiết thức ăn bằng HPLC…... 112
-1- MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Nuôi trồng th y sản được xác định à một trong những ĩnh vực phát triển nhanh nhất trong ngành sản xuất thực phẩm (Bondad-Reantaso và ctv, 2005). Việt Nam cũng đã xác định th y sản là ngành kinh tế mũi nhọn từ những năm đầu thập niên 90 và trong giai đoạn 2015-2022, mặc d đối mặt với hông ít hó hăn thách thức nhưng sản ượng nuôi th y sản vẫn không ngừng tăng n, từ 3,53 triệu tấn (năm 2015) lên 5,19 triệu tấn (năm 2022) (VASEP, 2023a). Trong các oài cá nước ngọt, cá rô phi (Oreochromis spp.) à oài được nuôi phổ biến thứ hai trên thế giới, chỉ sau những loài cá chép (Fitzsimmons, 2005). Cá rô phi được nuôi thương mại tr n hơn 100 quốc gia và trở thành loài mang lại giá trị kinh tế cao trong nuôi trồng th y sản (Webster và Lim, 2006). Sản ượng cá rô phi nuôi trên thế giới tăng từ 5,67 triệu tấn năm 2015 (FAO 2017) lên 6,4 triệu tấn vào năm 2022 (VASEP, 2023b). Ở Việt Nam, cá rô phi là một trong những đối tượng nuôi phổ biến và đã được xác định là sản phẩm th y sản ch lực c a nước ta sau tôm nước mặn, lợ và cá tra (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2016). Theo đó định hướng đến năm 2030, diện tích nuôi cá rô phi cả nước đạt 33.000 ha (tăng 1 5 ần so với năm 2015 à 21.000 ha), sản ượng đạt 300.000 tấn (tăng gấp 2 lần so với năm 2015 trong đó 50 - 60% sản ượng đ tiêu chuẩn xuất khẩu). Trong nuôi trồng th y sản, dịch bệnh là kết quả c a một quá trình tương tác phức tạp giữa mầm bệnh, các yếu tố môi trường điều kiện vật ch , thói quen chăm sóc vật nuôi … (Boerlage và ctv, 2017). Bệnh do Streptococcus sp. gây ra được báo cáo lần đầu tiên trên cá hồi nuôi tại Nhật Bản vào năm 1958 (Hoshina và ctv 1958) và là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế đáng ể cho ngành nuôi trồng th y sản (Abraham và ctv, 2019). Cá rô phi có thể bị nhiễm Streptococcus sp. do một số lý do, bao gồm cả tình trạng căng thẳng (stress) (Liao và ctv, 2020). Vi khuẩn Streptococcus agalactiae là tác nhân gây ra bệnh lồi mắt, xuất huyết trên cá
-2- rô phi - một bệnh gây chết nhanh, tỷ lệ chết cao ở tất cả các giai đoạn phát triển c a cá, gây thiệt hại kinh tế rất nghiêm trọng cho người nuôi; và là một trong hai loài vi khuẩn chính ảnh hưởng đến việc sản xuất cá rô phi trên thế giới (loài còn lại là S. iniae) (Lingam và ctv, 2021). Sử dụng kháng sinh là giải pháp phổ biến để kiểm soát bệnh do S. agalactiae gây trên cá rô phi, tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh có thể dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh c a các ch ng vi khuẩn (Zhang và ctv, 2018, 2020) àm tăng tỷ lệ mầm bệnh kháng kháng sinh. Bên cạnh đó do vi khuẩn có thể phát triển khả năng đề kháng với bất kỳ loại kháng sinh nào nên điều quan trọng là phải sử dụng kháng sinh và các chất thay thế đúng phương pháp. Mặt khác, tình trạng sử dụng kháng sinh hông chính xác ( hông ph hợp với ch ng vi huẩn gây bệnh hoặc hông đúng iều ượng iệu trình) có thể ảnh hưởng xấu đến chất ượng và an toàn thực phẩm (Zhang, 2021). Do đó hiện nay, một trong những xu hướng được xem là bền vững và hợp lý về mặt kinh tế (Maulu và ctv, 2021) trong việc kiểm soát dịch bệnh trên th y sản là sử dụng thảo dược có nguồn gốc từ thiên nhiên để phòng trị bệnh do vi khuẩn trong đó có vi khuẩn S. agalactiae trên cá rô phi. Việc bổ sung 0 5% tỏi vào hẩu phần ăn cho cá rô phi ai trong 4 tuần có tác dụng nâng cao miễn dịch c a cá thí nghiệm (Ndong và ctv 2007). Tr n cá rô phi vằn thực hiện bổ sung kim ngân và nấm linh chi vào chế độ ăn trong vòng ba tuần, với ba khẩu phần gồm: 1% kim ngân, 1% nấm linh chi và hỗn hợp chứa 0,5% mỗi loại cho thấy giúp cải thiện tình trạng miễn dịch và khả năng háng bệnh c a cá thí nghiệm khi tiếp xúc với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Yin và ctv, 2008); tinh dầu c a hương nhu trắng (Ocimum gratissimum) and gừng (Zingiber officinale) giúp cải thiện phản ứng miễn dịch chống ại S. agalactiae (Brum và ctv, 2017). Các loại thảo dược hứa hẹn tiềm năng trở thành nguồn cung cấp các liệu pháp chữa bệnh trong nuôi trồng th y sản do có nhiều ưu điểm như: phổ biến, giá thành thấp, hoạt tính kháng khuẩn cao, có khả năng ích thích hệ miễn dịch tự nhiên c a vật ch (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2009), khả năng phân h y sinh học và an toàn hơn so với kháng sinh, thân thiện với môi trường và không gây nên hiện tượng đề kháng thuốc (Jeney và ctv, 2015). Trong các phương pháp sử dụng
-3- thảo dược trên th y sản gồm bổ sung vào thức ăn ngâm cá trong dịch chiết, tiêm dịch chiết vào xoang bụng cá (Stratev và ctv, 2018) thì phương pháp bổ sung chiết xuất thảo dược vào thức ăn cho cá có nhiều ưu điểm (tính kinh tế cao, không gây stress cho th y sản nuôi, sử dụng được trên bất kỳ giai đoạn nuôi nào c a th y sản …) và là cách hiệu quả nhất (Galindo-Villegas và Hosokawa, 2004; Isnani và ctv, 2021). Tuy nhiên không phải lúc nào việc bổ sung này cũng giúp đối tượng nuôi nâng cao hệ miễn dịch hoặc đạt được sự tăng trưởng tốt nhất (Galindo-Villegas và Hosokawa, 2004; Ndong và ctv, 2007). Tại Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng thảo dược để phòng trị bệnh nói chung và do vi khuẩn S. agalactiae nói ri ng đang dần được quan tâm, tuy nhiên công trình nghiên cứu sử dụng thảo dược như à một giải pháp để nâng cao sức đề kháng, khả năng ph ng bệnh trên cá rô phi ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốn về số ượng. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm chọn ra loại cao chiết thảo dược có hiệu quả kháng vi khuẩn S. agalactiae gây bệnh trên cá rô phi và đánh giá ảnh hưởng c a thảo dược n tăng trưởng, khả năng nâng cao miễn dịch … hi được bổ sung vào khẩu phần ăn c a cá. Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu giải pháp sử dụng cao chiết từ thảo dược bổ sung vào thức ăn như là giải pháp hiệu quả phòng, trị bệnh trên cá rô phi, thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh. Mục tiêu cụ thể Xác định được loại thảo dược và loại dung môi phù hợp để tạo ra cao chiết có khả năng háng hiệu quả với vi khuẩn S. agalactiae ở điều kiện in vitro. Đánh giá hiệu quả bổ sung cao chiết thảo dược vào thức ăn n tăng trưởng, tăng cường một số chỉ tiêu miễn dịch hông đặc hiệu và khả năng háng bệnh do vi khuẩn S.agalactiae gây ra trên cá rô phi giống. Nội dung nghiên cứu
-4- Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gây bệnh S. agalactiae ở điều kiện in vitro c a một số dịch chiết và cao chiết thảo dược. Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S. agalactiae ở điều kiện in vivo. Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, chỉ tiêu miễn dịch và hình thái biểu mô ruột c a cá rô phi. Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và khảo sát tính kháng khuẩn c a cao chiết thảo dược dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính. Ý nghĩa Kết quả c a nghiên cứu đóng góp thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho hướng nghiên cứu sử dụng thảo dược trong phòng trị bệnh cho động vật th y sản. Nghiên cứu có tính ứng dụng thực tiễn cao, cung cấp một giải pháp phòng trị bệnh trên cá rô phi hiệu quả thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh. Đối tƣợng nghiên cứu Dịch chiết và cao chiết từ các loại thảo dược gồm: cây diếp cá (Houttuynia cordata), c hành tím (Allium ascalonicum), lá kinh giới (Elsholtzia ciliata), vỏ thân quế (Cinnamomum verum), c gừng (Z. officinale) và c riềng (Alpinia officinarum). Ch ng vi khuẩn S. agalactiae được phân lập từ cá rô phi (Oreochromis spp.) có dấu hiệu bệnh lý thu tại huyện Định Quán, tỉnh Đồng Nai và huyện C Chi, thành phố Hồ Chí Minh (được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng th y sản II). Những đóng góp mới của luận án Nghiên cứu đã hẳng định được hiệu quả c a hai loại nguyên liệu thảo dược gồm vỏ quế (C. verum) và gừng (Z. officinale) khi bổ sung vào thức ăn dưới dạng cao chiết trong việc hỗ trợ nâng cao khả năng kháng bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra trên cá rô phi giống.