Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hướng tạo vacxin thế hệ mới

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:204

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hướng tạo vacxin thế hệ mới" trình bày các nội dung chính sau: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a; Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam; Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COES1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hướng tạo vacxin thế hệ mới

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Hồ Thị Thƣơng NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN S CỦA VIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PEDV) TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA CÓ TÍNH SINH MIỄN DỊCH ĐỊNH HƢỚNG TẠO VACXIN THẾ HỆ MỚI LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. xi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. xii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5 1.1. Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn ............................................................................. 5 1.1.1. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới ........................................................ 5 1.1.2. Tình hình dịch bệnh PED tại Việt Nam ....................................................... 6 1.2. Tác nhân gây bệnh của PED ....................................................................... 7 1.2.1. Phân loại PEDV ........................................................................................... 7 1.2.2. Đặc điểm hình thái của PEDV ..................................................................... 7 1.2.3. Đặc điểm cấu trúc hệ gen và chức năng của các protein PEDV.................. 8 1.2.4. Protein S của PEDV..................................................................................... 9 1.2.5. Dịch tễ học phân tử các chủng PEDV trên thế giới ................................... 11 1.2.6. Dịch tễ học phân tử của các chủng PEDV tại Việt Nam ............................ 13 1.3. Vacxin phòng PEDV .................................................................................. 15 1.3.1. Vacxin bất hoạt và vacxin nhược độc ........................................................ 16 1.3.2. Vacxin tiểu đơn vị...................................................................................... 19 1.3.3. Vacxin axit nucleic .................................................................................... 22 1.3.4. Các vấn đề tồn tại trong phát triển vacxin phòng PEDV........................... 22 1.4. Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật ........................................... 24 1.4.1. Hệ thống biểu hiện tạm thời trên thực vật ................................................. 24 1.4.2. Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phòng PEDV trên thế giới ............................................................................................................. 25 1.4.3. Motif GCN4-pII và motif tp của IgM ....................................................... 27 1.4.4. Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phòng các bệnh động vật tại Việt Nam ......................................................................................... 30 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 32
iv 2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 32 2.1.1. Chủng vi sinh vật, tế bào và plasmid ......................................................... 32 2.1.2. Mồi ............................................................................................................. 33 2.1.3. Nguồn vật liệu thực vật .............................................................................. 34 2.1.4. Nguồn vật liệu động vật ............................................................................. 34 2.1.5. Hóa chất ..................................................................................................... 34 2.1.6. Thiết bị và vật tư ........................................................................................ 36 2.2. Phƣơng pháp .............................................................................................. 37 2.2.1. Thu thập thông tin, tách dòng, tối ưu mã biểu hiện và tổng hợp nhân tạo đoạn gen mã hóa protein S ................................................................... 38 2.2.2. Thiết kế các vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp......... 39 2.2.3. Biến nạp các cấu trúc mang gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp vào cây thuốc lá N. benthamiana ..................................................................... 41 2.2.4. Phân tích mức độ biểu hiện của các kháng nguyên tái tổ hợp bằng SDS-PAGE và Western blot ...................................................................... 42 2.2.5. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của các kháng nguyên tái tổ hợp ......................................................................................................... 43 2.2.6. Nhân nuôi và tinh sạch PEDV từ tế bào nuôi cấy ..................................... 45 2.2.7. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ............................................................. 46 2.2.8. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG, IgA, IgM đặc hiệu PEDV trong huyết thanh chuột bằng ELISA ........................................................ 47 2.2.9. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trong huyết thanh chuột bằng Western blot .................................................................. 47 2.2.10. Phân tích khả năng kích thích sinh cytokine trong huyết thanh chuột............ 48 2.2.11. Phân tích khả năng trung hòa PEDV của huyết thanh chuột .................... 48 2.2.12. Gây đáp ứng miễn dịch trên lợn mẹ và công cường độc trên lợn con ...... 48 2.2.13. Gây đáp ứng miễn dịch trên lợn con với kháng nguyên COE–S1D /G2a-pII...................................................................................................... 49 2.2.14. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG và IgA đặc hiệu PEDV trong huyết thanh lợn bằng ELISA ..................................................................... 50 2.2.15. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trong huyết thanh lợn bằng Western blot ...................................................................... 50 2.2.16. Phân tích khả năng kích thích sinh cytokine trong huyết thanh lợn ......... 51
v 2.2.17. Phân tích khả năng trung hòa PEDV của huyết thanh lợn ....................... 51 2.2.18. Phương pháp xử lý thống kê ..................................................................... 51 Chƣơng 3. KẾT QUẢ ......................................................................................... 52 3.1. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a- pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a ..................................... 52 3.1.1. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G1a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng ......... 52 3.1.2. Biểu hiện kháng nguyên COE/G1a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. benthamiana .............................................................................................. 54 3.1.3. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G1a-pII.............................................................................................. 55 3.1.4. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp trên chuột ............................................................................................ 57 3.2. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a- pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam ............................................................................................................. 62 3.2.1. Thu thập thông tin, lựa chọn và tách dòng gen mã hóa protein S của chủng PEDV gây bệnh tại Việt Nam ......................................................... 62 3.2.2. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng ......... 63 3.2.3. Biểu hiện kháng nguyên COE/G2a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. benthamiana .............................................................................................. 65 3.2.4. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII.............................................................................................. 69 3.2.4.2. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII bằng SEC và phản ứng liên kết chéo .................................. 71 3.2.5. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII trên lợn ............................................................................................................. 72 3.3. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COE– S1D /G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam ...................................... 82 3.3.1. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa các kháng nguyên COE–S1D /G2a-pII, COE/G2a-pII-tp, S2/G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng .......................................... 82
vi 3.3.2. Biểu hiện các kháng nguyên tái tổ hợp COE–S1D /G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. benthamiana .............................................................................................. 87 3.3.3. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của các kháng nguyên COE–S1D /G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp ............... 91 3.3.4. Đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp COE– S1D /G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII trên chuột ........................ 97 3.3.5. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE–S1D /G2a-pII trên lợn ..................................................................................................... 105 Chƣơng 4. THẢO LUẬN.................................................................................. 116 4.1. Mức độ biểu hiện và khả năng thu hồi của các kháng nguyên tái tổ hợp từ lá thuốc lá N. benthamiana .......................................................... 116 4.2. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII trên chuột ........ 119 4.3. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a pII trên lợn nái và khả năng bảo hộ lợn con chống lại chủng PEDV G2a độc lực cao .............................................................................................................. 120 4.4. Tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp COE–S1D /G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII trên động vật thí nghiệm ....................................................................................................... 123 4.4.1. Tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp COE–S1D /G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII trên chuột .............................. 105 4.4.2. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp COE–S1D /G2a-pII trên lợn con .............................................................................................. 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 130 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ... 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 132
vii DANH MỤC VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên nguyên gốc tiếng anh Tên tiếng việt aa amino acid axit amin A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Act1-I Rice actin 1 gene - I Gen mã hóa actin lúa 1-I bp Base pair Cặp base Bis[sulfosuccinimidyl] Bis[sulfosuccinimidyl] BS3 suberate suberate CaMV Cauliflower mosaic virus Virus khảm súp lơ Phối tử nhắm mục tiêu tế Co1 M cell-targeting ligand bào M COE CO-26K equivalent CO-26K tương đương CTB Cholera toxin B subunit Tiểu đơn vị độc tố tả B DAB Diaminobenzidine Diaminobenzidine DCpep Dendritic cell peptide Tín hiệu tế bào tua DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribo nucleotide Deoxyribo nucleotit dNTP triphosphate triphotphat E. coli Escherichia coli Escherichia coli E Elute Dịch chứa protein tinh sạch Enzyme-linked Xét nghiệm hấp thụ miễn ELISA immunosorbent assay dịch liên kết với enzyme ELP Elastin-like polypeptide Polypeptit giống Elastin Fc Fragment crystallizable Mảnh kết tinh Dịch chảy qua cột sau khi FT Flow through đưa hỗn hợp dịch chiết thô trộn Ni-sepharose lên cột HA Hemagglutinin Hemagglutinin HR1 Heptad repeat region 1 Vùng lặp lại Heptad 1 HRP Horseradish peroxidase Peroxidaza cải ngựa HR2 Heptad repeat region 2 Vùng lặp lại Heptad 2
viii IFN-γ Interferon gama Interferon gama IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch A IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch G IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch M Immobilized metal ion Sắc ký ái lực kim loại cố IMAC chromatography định INDEL Insertion deletion Chèn thêm, mất Kb Kilobase Kilobase kDa Kilodalton Kilodalton LB Luria and Bertani Luria và Bertani Enterotoxin B tiểu đơn vị Heat-labile enterotoxin B LTB không bền nhiệt ở subunit Escherichia Escherichia M Membrane Màng mARN Messenger ribonucleic acid Axit ribonucleic thông tin N. benthamiana Nicotiana benthamiana Nicotiana benthamiana NTD N‐terminal domain Miền tận cùng đầu N N Nucleocapsid Vỏ bọc nhân OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate-buffered saline Đệm muối phosphat PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PED Porcine epidemic diarrhea Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn Porcine epidemic diarrhea Virus gây bệnh tiêu chảy PEDV virus cấp ở lợn pII GCN4pII GCN4pII PIGS Polymer immunoglobulin G Polymer immunoglobulin G PLGA Poly-lactic-co-glycolic-acid Axit poly-lactic-co-glycolic Vùng gen khởi động alpha- RAmy3D Promoter rice a-amylase 3D amylase 3D lúa RE Raw extract Dịch thô RT-PCR Reverse transcript polymerase Phản ứng sao chép chuỗi
ix chain reaction polymerase ngược S Spike Spike Tiểu phần S1 của protein S1 S1 subunit of spike protein Spike Tiểu phần S1 của protein S2 S2 subunit of spike protein Spike Size exclusion SEC Sắc ký lọc gel chromatography Sodium dodecyl sulfate Điện di gel polyacrylamide SDS-PAGE polyacrylamide gel sodium dodecyl sulfat electrophoresis Median tissue culture TCID50 Liều gây nhiễm 50% tế bào infectious dose Transmissible gastroenteritis Virus gây bệnh viêm dạ dày TGEV virus ruột truyền nhiễm trên lợn 3,3‘,5,5‘ TMB 3,3‘,5,5‘ tetramethylbenzidine tetramethylbenzidine TMV Tobacco mosaic virus Virus khảm thuốc lá Trình tự đầu 5‘ chưa được TOL TMV omega-prime leader dịch mã của virus khảm thuốc lá TSP Total soluble protein Protein tan tổng số tp tailpiece Mảnh đuôi VLP Virus-like particle Hạt giả virus Dịch rửa chảy qua cột sau W Wash khi bổ sung đệm rửa WT Wild type Loài hoang dã
xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tóm tắt về chức năng của các protein PEDV ...................................... 9 Bảng 1.2. Các loại vacxin phòng PEDV đã được thương mại hóa và cấp phép có điều kiện .............................................................................. 17 Bảng 1.3. Các nghiên cứu về vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV ......................... 21 Bảng 1.4. Các nghiên cứu phát triển vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phòng PEDV ....................................................................... 25 Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi sinh vật, tế bào và plasmid ......................... 32 Bảng 2.2. Danh sách các mồi được sử dụng trong nghiên cứu .......................... 33 Bảng 2.3. Danh sách các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu................... 35 Bảng 2.4. Danh sách các thiết bị, vật tư được sử dụng trong nghiên cứu.......... 36 Bảng 3.1. Mức độ tích lũy của các kháng nguyên tái tổ hợp từ trong lá thuốc lá N. benthamiana ................................................................... 91 Bảng 3.2. Độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi sau tinh sạch các kháng nguyên tái tổ hợp từ lá thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp IMAC ....................................................................................... 96
xii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hạt PEDV được quan sát dưới kính hiển vi điện tử ............................. 7 Hình 1.2. Cấu trúc hệ gen và cấu trúc hạt PEDV.................................................. 8 Hình 1.3. Cấu trúc mô hình của protein S ............................................................. 9 Hình 1.4. Cấu trúc protein S của PEDV và các vùng chứa yếu tố quyết định kháng nguyên tương tác với kháng thể trung hòa ...................... 10 Hình 1.5. Con đường lan truyền tiềm năng của PEDV trên toàn thế giới .......... 12 Hình 1.6. Tạo đáp ứng miễn dịch khi tiêm vacxin tiểu đơn vị ........................... 20 Hình 1.7. Cấu trúc tinh thể của GCN4-pII .......................................................... 28 Hình 1.8. Sơ đồ cấu trúc của IgM dạng monomer (bên trái) và dạng pentamer ............................................................................................. 29 Hình 2.1. Sơ đồ mô tả tóm tắt các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong luận án ..................................................................................... 36 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng.......................................................................................... 39 Hình 3.1. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G1a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector pCB301 tái tổ hợp tương ứng .................................................. 53 Hình 3.2. Biểu hiện protein COE/G1a-pII tạm thời trên cây thuốc lá N. benthamiana ....................................................................................... 54 Hình 3.3. Kết quả điện di SDS-PAGE, nhuộm Coomassie blue (A) và Western blot (B) kiểm tra quá trình tinh sạch kháng nguyên COE/G1a-pII bằng IMAC. ................................................................. 55 Hình 3.4. Xác định đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G1a-pII dựa vào phản ứng liên kết chéo (A) và điện di không biến tính (B) và Western blot (C). ..................................................................... 56 Hình 3.5. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột với kháng nguyên COE/G1a ............................................................................................. 57 Hình 3.6. Phân tích đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV ở chuột được tiêm bằng phản ứng Western blot (A) và ELISA (B). .......................................................................................... 58 Hình 3.7. Xác định mức độ đáp ứng sinh kháng thể IgA (A) và IgM (B) đặc hiệu với PEDV thông qua phản ứng ELISA ................................ 59 Hình 3.8. Kết quả đánh giá khả năng sinh các kháng thể trung hòa PEDV ở các nhóm chuột được tiêm bằng phản ứng trung hòa virus trên tế bào ........................................................................................... 61
xiii Hình 3.9. Kết quả tách dòng gen mã hóa protein S của chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 ................................................................ 63 Hình 3.10. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G2a-pII và tạo chủng khuẩn A. tumefaciens mang vector pCB301 tương ứng .................................. 64 Hình 3.11. Kết quả tối ưu tuổi cây thuốc lá N. benthamiana thủy canh được sử dụng cho biểu hiện của protein COE/G2a-pII. ................... 66 Hình 3.12. Kết quả tối ưu giá trị OD600 của dịch khuẩn dùng để biểu hiện kháng nguyên COE/G2a-pII trên cây thuốc lá N. benthamiana thủy canh. ......................................................................................... 67 Hình 3.13. Kết quả tối ưu số ngày thu lá sau biến nạp để biểu hiện protein COE/G2a-pII trên cây thuốc lá N. benthamiana thủy canh. ............ 68 Hình 3.14. Kiểm tra sự tích lũy của protein COE/G2a-pII bằng Western blot sau khi biến nạp vào lá thuốc lá N. benthamiana ở điều kiện tối ưu ......................................................................................... 69 Hình 3.15. Kết quả điện di SDS-PAGE, nhuộm Coomassie blue (A, C) và Western blot (B, D) kiểm tra quá trình tinh sạch kháng nguyên COE/G2a-pII sử dụng phương pháp IMAC với đệm rửa có nồng độ imidazole 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM. ..................... 70 Hình 3.16. Kết quả tinh sạch, phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII bằng phương pháp sắc ký lọc gel SEC và phản ứng liên kết chéo ................................................................. 72 Hình 3.17. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên lợn nái và công cường độc trên lợn con với kháng nguyên COE/G2a-pII .................................. 73 Hình 3.18. Đáp ứng sinh kháng thể IgG và IgA đặc hiệu PEDV trong huyết thanh của lợn nái mang thai sau tiêm ..................................... 74 Hình 3.19. Đáp ứng miễn dịch sinh các kháng thể có khả năng trung hòa PEDV trong huyết thanh của lợn nái mang thai sau khi tiêm .......... 75 Hình 3.20. Đáp ứng sinh cytokine IFN-γ trong huyết thanh của lợn nái mang thai sau khi gây đáp ứng miễn dịch ........................................ 76 Hình 3.21. Đáp ứng sinh kháng thể IgG và IgA đặc hiệu PEDV trong huyết thanh của các lợn con được sinh ra từ các lợn nái đã tiêm chủng trước và sau công cường độc ......................................... 77 Hình 3.22. Đáp ứng sinh các kháng thể có khả năng trung hòa PEDV trong các huyết thanh lợn con được sinh ra từ các lợn nái đã tiêm chủng trước và sau công cường độc ......................................... 78
xiv Hình 3.23. Đáp ứng sinh cytokine IFN-γ trong huyết thanh của các lợn con được đẻ ra từ lợn nái đã tiêm chủng trước và sau công cường độc ......................................................................................... 79 Hình 3.24. Điểm phân và khối lượng cơ thể của các lợn con được đẻ ra từ lợn nái đã tiêm trước và sau công cường độc ................................... 80 Hình 3.25. Điểm lâm sàng và tỷ lệ sống sót của các lợn con được đẻ ra từ lợn nái đã tiêm chủng trước và sau công cường độc ........................ 81 Hình 3.26. Kết quả thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa protein COE–S1D /G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector pCB301 tái tổ hợp tương ứng ........................................................... 83 Hình 3.27. Kết quả thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G2a-pII-tp và tạo chủng A. tumefaciens mang vector pCB301 tái tổ hợp tương ứng ................................................ 85 Hình 3.28. Kết quả thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa protein S2/G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector pCB301 tái tổ hợp tương ứng ......................................................................... 86 Hình 3.29. Biểu hiện protein COE–S1D /G2a-pII tạm thời trên cây thuốc lá N. benthamiana. ............................................................................ 87 Hình 3.30. Biểu hiện protein COE/G2a-pII-tp tạm thời trên cây thuốc lá N. benthamiana................................................................................. 89 Hình 3.31. Biểu hiện protein S2/G2a-pII tái tổ hợp tạm thời trên thuốc lá N. benthamiana................................................................................. 90 Hình 3.32. Kết quả điện di SDS-PAGE, nhuộm Coomassie blue (A) và Western blot (B) kiểm tra quá trình tinh sạch kháng nguyên COE–S1D /G2a-pII sử dụng phương pháp IMAC. .......................... 92 Hình 3.33. Kết quả tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE–S1D /G2a-pII bằng phương pháp sắc ký lọc gel SEC và phản ứng liên kết chéo......................................................... 93 Hình 3.34. Kết quả điện di SDS-PAGE, nhuộm Coomassie blue (A) và Western blot (B) kiểm tra quá trình tinh sạch kháng nguyên COE/G2a-pII-tp sử dụng phương pháp IMAC................................. 94 Hình 3.35. Kết quả tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII-tp bằng phương pháp sắc ký lọc gel SEC và phản ứng liên kết chéo......................................................... 94 Hình 3.36. Kết quả điện di SDS-PAGE, Western blot (A) và nhuộm Coomassie blue (B) kiểm tra quá trình tinh sạch kháng nguyên S2/G2a-pII sử dụng phương pháp IMAC. ........................................ 95
xv Hình 3.37. Kết quả tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên S2/G2a-pII bằng phương pháp sắc ký lọc gel SEC và phản ứng liên kết chéo ...................................................................... 96 Hình 3.38. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột với các kháng nguyên PEDV G2a tái tổ hợp ........................................................................ 97 Hình 3.39. Phân tích đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể IgG đặc hiệu của PEDV trong huyết thanh của các nhóm chuột sử dụng ELISA ....... 98 Hình 3.40. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trong huyết thanh các nhóm chuột sau 2 lần tiêm bằng Western blot ....... 99 Hình 3.41. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV trong huyết thanh của các nhóm chuột bằng ELISA. .............................. 100 Hình 3.42. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgM đặc hiệu PEDV trong huyết thanh ở các nhóm chuột bằng ELISA ................................... 102 Hình 3.43. Phân tích đáp ứng trung hòa PEDV của huyết thanh ở nhóm chuột bằng thí nghiệm trung hòa virus trên tế bào. ........................ 103 Hình 3.44. Nồng độ IFN-γ trong huyết thanh của các nhóm chuột thí nghiệm bằng bộ kit ELISA ............................................................. 104 Hình 3.45. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch protein COE–S1D /G2a-pII trên lợn con lần 1 ................................................................................... 105 Hình 3.46. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trên các nhóm lợn thí nghiệm bằng ELISA. ................................................ 106 Hình 3.47. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng nguyên PEDV trên các nhóm lợn thí nghiệm bằng Western blot. .............. 107 Hình 3.48. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV trên các nhóm lợn thí nghiệm bằng ELISA ................................................. 108 Hình 3.49. Phân tích đáp ứng trung hòa PEDV trong huyết thanh của các nhóm lợn thí nghiệm bằng thí nghiệm trung hòa virus. ................. 109 Hình 3.50. Phân tích đáp ứng sinh IFN-γ trên các nhóm lợn thí nghiệm bằng bộ kit ELISA. ......................................................................... 110 Hình 3.51. Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch protein COE–S1D /G2a-pII trên lợn con lần 2 ................................................................................... 111 Hình 3.52. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trên các nhóm lợn thí nghiệm bằng ELISA. ................................................ 111 Hình 3.53. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng nguyên COE–S1D /G2a-pII của PEDV trên các nhóm lợn thí nghiệm bằng phản ứng Western blot. .......................................................... 112
xvi Hình 3.54. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgA đặc hiệu PEDV trên các nhóm lợn thí nghiệm bằng phản ứng ELISA. ................................ 113 Hình 3.55. Phân tích khả năng trung hòa PEDV của huyết thanh ở các nhóm lợn thí nghiệm bằng thí nghiệm trung hòa virus. ................. 114
1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Tiêu chảy cấp ở lợn hay tiêu chảy thành dịch (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) là một bệnh nguy hiểm và có khả năng lây lan trên lợn ở tất cả các độ tuổi. Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV), một loại virus thuộc họ Coronaviridae, là tác nhân gây ra bệnh PED. Tỷ lệ tử vong ở lợn cao, lên đến 80–100% sau khi mắc bệnh PED, đặc biệt ở lợn con mới sinh dưới 7 ngày tuổi [1]. Dịch PED đã bùng phát và gây ra tổn thất kinh tế nghiêm trọng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là Châu Á và Châu Mỹ [2]. Tại Việt Nam, dịch PED đã có mặt ở nhiều tỉnh thành khắp cả nước [3]. Các chủng PEDV được phát hiện tại ba miền Bắc, Trung, Nam từ năm 2015 đến năm 2016 thuộc về nhóm gen G1b, G2a và G2b [4]. Các chủng PEDV G2 đã gây ảnh hưởng đến kinh tế nghiêm trọng, làm giảm năng suất đàn lợn nái và lợn giống ở nhiều tỉnh thành [5]. Hiện nay, hầu hết các vacxin phòng PEDV được sử dụng ở Việt Nam là vacxin truyền thống có nguồn gốc ngoại nhập hoặc sử dụng các chủng nhập khẩu thuộc nhóm G1a cổ điển để sản xuất vacxin. Sự khác biệt trong trình tự bộ gen của các chủng PEDV mới bùng phát và các chủng PEDV trong vacxin, đặc biệt là ở các thụ thể trung hòa, dẫn đến vacxin hiện tại có hiệu quả bảo hộ thấp chống lại các chủng PEDV trên thực địa [3]. Vì vậy, để đảm bảo an toàn cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam, cần có những nghiên cứu phát triển vacxin phòng PEDV, đặc biệt là các chủng virus thuộc nhóm G2 gây bệnh thực địa. Vacxin tiểu đơn vị được tạo ra nhờ sử dụng hệ thống thực vật có nhiều lợi thế bao gồm mức đầu tư sản xuất thấp, dễ dàng nhân rộng, độ ổn định cao và thời hạn sử dụng lâu dài [6]. Phương pháp biểu hiện tạm thời dựa trên agro-infiltration có lợi thế trong việc sản xuất các protein tái tổ hợp nhanh chóng với số lượng lớn, điều này cho phép phản ứng kịp thời khi xảy ra các dịch bệnh [7]. Protein S của PEDV tồn tại ở dạng homotrimer. Protein S là nhân tố không thể thiếu trong tương tác của virus với các thụ thể tế bào [8] và được xem là mục tiêu chính để phát triển vacxin [9]. Vùng CO-26K equivalent (COE) (aa 499–638) là một vùng quyết định kháng nguyên trên protein S của PEDV phản ứng với kháng thể trung hòa [8] và được nhận diện bởi kháng thể đơn dòng 2C10 ở đầu C của protein S [10]. Kháng nguyên COE được xem là mục tiêu chính để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV [11]. Vùng COE đã được nghiên cứu biểu hiện trên hệ thống thực vật trong nhiều công bố trước đây [12, 13]. Protein COE tái tổ hợp ở dạng monomer có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên chuột. Dạng cấu trúc pentamer của COE đã được biểu hiện thành công nhưng chưa có các đánh giá về khả năng gây miễn dịch [12].
2 Ngoài vùng COE thuộc protein S của PEDV, vùng S1D (aa 636–789) có 2 vùng được nhận biết bởi thụ thể tế bào lympho B là SS2 (aa 748–755) và vùng SS6 (aa 764–771) cũng là các vùng kháng nguyên quan trọng tương tác với các kháng thể có khả năng trung hòa [14]. Thêm vào đó, tiểu phần S2 có chứa các vùng kháng nguyên tương tác với các kháng thể có khả năng trung hòa virus bao gồm các aa 744–759, các aa 747–774, các aa 756–771 và các aa 1371–1377 [15]. Tiểu phần S2 đã được biểu hiện dưới dạng từng phần hoặc đầy đủ trong E. coli [16, 17]. Chuột được tiêm tiểu phần S2 có sự hiện diện của các kháng thể có khả năng trung hòa PEDV [16]. Protein S đã được phát hiện có sự biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá Nicotiana benthamiana ở mức độ thấp [18] hoặc không biểu hiện [19]. Với mục đích tạo protein S1 tái tổ hợp dạng trimer, toàn bộ protein S1 dung hợp motif GCN4pII (pII) được biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá N. benthamiana, tuy nhiên, mức độ biểu hiện của protein S1-pII chỉ đạt 0,005% protein hòa tan tổng số (TSP) [20]. Trong nghiên cứu này, với mục đích tạo ra các protein S tái tổ hợp có cấu trúc tương tự protein S dạng trimer tự nhiên hoặc dạng oligomer, các vùng COE (aa 499–638), COE–S1D (aa 499–789) hoặc S2 (aa 730–1324) thuộc protein S được dung hợp motif GCN4pII hoặc dung hợp motif GCN4pII-tp. Tính đến nay, chưa có công bố nào ở trong và ngoài nước nghiên cứu về việc biểu hiện các protein tái tổ hợp này trên hệ thống cây thuốc lá N. benthamiana cũng như chứng minh được tính sinh miễn dịch của chúng trên động vật. Chính vì vậy, một số câu hỏi nghiên cứu lần lượt được đặt ra trong khuôn khổ của luận án bao gồm: i). Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G1a dung hợp motif GCN4pII (viết tắt COE/G1a-pII) trên cây thuốc lá N. benthamiana có tính sinh miễn dịch tương đương với vacxin thương mại sẵn có chứa chủng PEDV thuộc nhóm G1a hay không? ii). Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (viết tắt là COE/G2a-pII) trên cây thuốc lá N. benthamiana có tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ tốt hay không? iii). Liệu có tạo ra được các kháng nguyên tái tổ hợp khác như kháng nguyên COE–S1D, S2 từ chủng PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (lần lượt viết tắt là COE–S1D/G2a-pII và S2/G2a- pII) và kháng nguyên COE từ PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII-tp (viết tắt là COE/G2a-pII-tp) trên cây thuốc lá N. benthamiana có mức độ biểu hiện và tính sinh miễn dịch tốt hơn kháng nguyên COE/G2a-pII hay không? Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‗Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn
3 (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hƣớng tạo vacxin thế hệ mới‘. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Tạo được kháng nguyên S tái tổ hợp của PEDV từ cây thuốc lá N. benthamiana và đánh giá tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm phục vụ phát triển vacxin. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nội dung 1: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a Nội dung 2: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam Nội dung 3: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COE- S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Các chủng PEDV thuộc nhóm G2 đang là tác nhân gây bệnh chính trong các đợt dịch PED tại Việt Nam. Việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả phòng các chủng PEDV thuộc nhóm G2 gây bệnh ở Việt Nam là điều vô cùng cần thiết. Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy các protein tái tổ hợp được tạo ra trên cây thuốc lá N. benthamiana sử dụng công nghệ biểu hiện tạm thời như COE/G2a-pII, COE–S1D/G2a-pII và COE/G2a-pII-tp đều tính kháng nguyên cao, tính sinh miễn dịch tốt và có thể là các ứng viên vacxin đầy triển vọng định hướng ứng dụng trong công tác phòng chống PED tại Việt Nam. Những đóng góp mới của luận án - Luận án đã nghiên cứu một cách hệ thống về tạo kháng nguyên COE tái tổ hợp từ chủng PEDV DR13 nhược độc thuộc nhóm G1a và các kháng nguyên COE, COE-S1D và S2 tái tổ hợp từ chủng PEDV NAVET/PS6/2010 độc lực cao thuộc nhóm G2a gây bệnh thực địa tại Việt Nam dung hợp motif pII hoặc motif pII-tp trên cây thuốc lá N. benthamiana bằng công nghệ biểu hiện tạm thời; và đã đánh giá được đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp tạo ra trên động vật thử nghiệm. - Kháng nguyên COE/G2a-pII tiêm cho lợn nái (100µg/liều) có khả năng bảo vệ lợn con sinh ra chống lại PEDV sau công cường độc. Kháng nguyên COE- S1D/G2a-pII (50 µg/liều) kèm chất bổ trợ Emulsigen-D đã kích thích sinh đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu PEDV mạnh hơn, đồng thời sinh đáp ứng kháng thể IgA và kháng thể trung hòa PEDV tương đương vacxin thương mại Corning (Wuhan