Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:150

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được thực hiện với các mục tiêu như sau: Đánh giá vai trò của gen A20 đối với việc điều hoà bốn chức năng sinh lý gồm sự trưởng thành, tiết cytokine, di cư và quá trình apoptosis của tế bào tua; đánh giá ảnh hưởng của gen A20 đối với việc điều hòa ba tín hiệu phân tử NF-κB, STAT1 và STAT3 liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NCS. Nguyễn Thu Thuỷ NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NCS. Nguyễn Thu Thuỷ NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Thị Xuân - Viện nghiên cứu hệ gen 2. TS. Hoàng Văn Tổng - Học viện quân y Hà Nội – Năm 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi là chủ yếu. Nghiên cứu được thực hiện trong khuôn khổ đề tài Nafosted mã số 108.06-2017.16, “Nghiên cứu vai trò điều hòa của gen mã hóa cho protein A20 với bệnh bạch cầu cấp tính và các cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào”, thời gian thực hiện 2017-2019 do TS. Nguyễn Thị Xuân làm chủ nhiệm đề tài. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả. Những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Thuỷ
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Xuân, Phòng Hệ gen học miễn dịch, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Đó là nền tảng, hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Hoàng Văn Tổng, Phòng An toàn sinh học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, thầy không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen và các thầy cô, các anh chị ở Viện đã luôn hướng dẫn tận tình cho tôi trong các môn học cũng như phương pháp thực nghiệm và trình bày kết quả. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Ngân, đã luôn động viên và dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong trong suốt thời gian qua. Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn trong Phòng Hệ gen học miễn dịch đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ nhiệt tình để tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các anh chị ở phòng Đào tạo nói riêng và Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam nói chung, đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo các cấp và đồng nghiệp ở Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, đã tạo điều kiện và động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập, nghiên cứu của mình. Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong suốt thời gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. Nghiên cứu sinh
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ APC Antigen-presenting cell – tế bào trình diện kháng nguyên bp Base pairs – cặp Nucleotide DISC Death-inducing signaling complex – phức hợp tín hiệu gây chết ELISA Enzym - Linked Immunosorbent Assay FLT3 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor IL Interleukin IFN Interferon IκB-α Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells inhibitor, alpha LPS Lipopolysaccharide MHC Major histocompatipility complex – phức hệ phù hợp tổ chức chính NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NK cell Natural killer cell – tế bào giết tự nhiên pDC Plasmacytoid DC – tế bào tua dòng lympho STAT Signal transducer and activator of transcription - yếu tố truyền tín hiệu và hoạt hoá phiên mã TBT Tế bào tua
TgPRF Profilin từ Toxoplasma gondii T. gondii Toxoplasma gondii Th1 T helper cell type 1 - tế bào T hỗ trợ loại 1 T-reg T regular - tế bào T điều hoà TLR Toll-like receptor TNFAIP3 Tumor necrosis factor α-induced protein 3 – Protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 TNF Tumor necrosis factor – yếu tố hoại tử u
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các bộ kit tách chiết, các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Các thiết bị chính được sử dụng cho nghiên cứu 36 Bảng 2.3 Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn 45 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.1 52 bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.2 54 bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.3 56 bào pDC khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.4 59 bào CD8+DC sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.5 61 bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.6 62 bào pDC sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.7 65 bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của các nhóm tế Bảng 3.8 67 bào tua sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào Bảng 3.9 69 CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự apoptosis của tế bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS và một số cytokine, Bảng 3.10 72 khảo sát bằng tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Annexin V, âm tính với 7-AAD Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự apoptosis của tế bào Bảng 3.11 CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS và một số cytokine, 74 khảo sát bằng tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Caspase-3
Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.12 bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm 84 profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.13 bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm 86 profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào pDC Bảng 3.14 89 thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.15 90 bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào Bảng 3.16 92 CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc gen A20 và protein A20 4 Hình 1.2 Vai trò của protein A20 trong các tế bào miễn dịch 5 Hình 1.3 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong con đường tín hiệu 10 TNFR1 Hình 1.4 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong các đường hiệu IL- 11 1R/TLR4 Hình 1.5 Tế bào tua chuột phân lập từ lách 17 Hình 1.6 Vòng đời của các tế bào tua 18 Hình 1.7 Tế bào tua và chức năng điều hòa miễn dịch 20 Hình 1.8 Sự biệt hóa đa dạng của tế bào tua 23 Hình 1.9 TLR điều hoà hoạt động hệ thống miễn dịch 29 Hình 2.1 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ nhất - các tế bào tua biệt hóa bằng 38 FLT3 và phơi nhiễm với profilin Hình 2.2 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ hai - các tế bào tua biệt hóa bằng 39 GM-CSF và phơi nhiễm với LPS Hình 2.3 Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn 46 Hình 3.1 Kết quả biểu hiện protein A20 sau khi đưa A20-siRNA vào tế 50 bào tua Hình 3.2 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế 53 bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.3 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của 55 CD11bDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.4 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế 57 bào pDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.5 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 60 CD8+DC khi phơi nhiễm profilin
Hình 3.6 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 61 CD11bDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.7 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 64 pDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.8 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 66 CD11b+DC khi phơi nhiễm với LPS Hình 3.9 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của các nhóm tế 68 bào tua khi biệt hoá bởi FLT3 và phơi nhiễm profilin Hình 3.10 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của nhóm tế bào 70 CD11b+DC khi biệt hoá bởi GM-CSF và phơi nhiễm LPS Hình 3.11 Ảnh hưởng của protein A20 đối với apoptosis thông qua số 73 lượng tế bào CD11b+DC dương tính với marker Annexin V và âm tính với 7-AAD Hình 3.12 Ảnh hưởng của protein A20 đối với apoptosis thông qua tỷ lệ 75 tế bào CD11b+DC dương tính với marker Caspase-3 Hình 3.13 Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, 77 STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.14 Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, 79 STAT1 và STAT3 ở tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.15 Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, 82 STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm LPS Hình 3.16 Ảnh hưởng của protein A20 lên biểu hiện của marker trưởng 84 thành của tế bào pDC thông qua con đường tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.17 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 87 pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.18 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển tế bào pDC 89 thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.19 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế 91 bào CD11b+DC thông qua con đường tín hiệu STAT1
Hình 3.20 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di chuyển của tế bào 92 CD11bDC thông qua con đường tín hiệu STAT1 Hình 4.1 Hình dot blot của những tế bào tua được nhuộm cùng kháng 124 thể FITC-Annexin V và PE-CD11c Hình 4.2 Hình ảnh tế bào tua nhuộm màu huỳnh quang 125 Hình dot blot của những TBT được nhuộm cùng kháng thể 126 Hình 4.3 FITC-CD11c và PE-CD86/ MHC II/ CD40 Nồng độ TNF-α trong dịch huyền phù CD11bDC xác định 128 Hình 4.4 bằng ELISA Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V dưới tác động 130 Hình 4.5 của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ Tỷ lệ TBT dương tính với marker Caspase-3 dưới tác động 131 Hình 4.6 của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ Phân tích tín hiệu hoạt động STAT1 trong tế bào CD11b+DC 132 Hình 4.7 khi phơi nhiễm với IL-10 Phân tích tín hiệu hoạt động STAT3 trong CD11b+DC khi 133 Hình 4.8 phơi nhiễm với IL-10
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................................... 3 1.1. Protein A20....................................................................................................... 3 1.1.1. Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20 ........................................ 3 1.1.2. Cấu trúc gen A20 và protein A20 ............................................................... 3 1.1.3. Vai trò của protein A20 điều hòa một số loại tế bào miễn dịch................... 5 1.1.2.1. Vai trò của protein A20 trong tế bào T .................................................... 6 1.1.2.2. Vai trò của protein A20 trong tế bào B.................................................... 6 1.1.2.3. Vai trò của protein A20 trong tế bào tua ................................................. 7 1.1.4. Vai trò của protein A20 đối với sự chết theo chương trình apoptosis.......... 7 1.1.5. Cơ chế điều hoà hoạt động của protein A20 ............................................... 8 1.1.6. Một số dòng tín hiệu phân tử hoạt động điều hoà bởi A20 ......................... 9 1.1.6.1. Protein A20 điều hoà tín hiệu NF-кB ...................................................... 9 1.1.6.2. Protein A20 điều hoà tín hiệu STATs.................................................... 11 1.1.7. Vai trò của protein A20 đối với một số bệnh tự miễn và ung thư ............. 13 1.1.8. Tình hình nghiên cứu về protein A20 trên thế giới và ở Việt Nam ........... 14 1.2. Tế bào tua ....................................................................................................... 16 1.2.1. Khái niệm và lịch sử phát hiện tế bào tua ................................................. 16 1.2.2. Đặc điểm sinh học của tế bào tua ............................................................. 16 1.2.3. Chức năng tế bào tua ............................................................................... 19 1.2.4. Phân loại tế bào tua .................................................................................. 20 1.2.5. Các quá trình sinh lý tế bào tua ................................................................ 22 1.2.5.1. Sự biệt hoá của tế bào tua ..................................................................... 22 1.2.5.2. Sự trưởng thành của tế bào tua .............................................................. 23 1.2.5.3. Sự di cư của tế bào tua .......................................................................... 24 1.2.5.4. Sự thực bào của tế bào tua .................................................................... 25 1.2.5.5. Sự tiết cytokine của tế bào tua............................................................... 26 1.2.5.6. Sự chết theo chương trình của tế bào tua ............................................... 26 1.2.6. Một số thụ thể Toll - like receptors kích hoạt hoạt động tế bào tua........... 29
Kháng nguyên Lipopolysaccharide .................................................................... 30 Kháng nguyên Profilin từ Toxoplasma gondii .................................................... 30 1.2.7. Một số nghiên cứu ứng dụng về tế bào tua trong điều trị ung thư ............. 31 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................34 2.1. Vật liệu nguyên liệu ........................................................................................ 34 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 34 2.1.2. Các hoá chất ............................................................................................ 34 2.2. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................... 35 2.3. Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................................. 36 2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 40 2.4.1. Phương pháp nuôi cấy và biệt hoá tế bào tua............................................ 40 2.4.2. Phương pháp đưa phân tử siRNA vào trong các tế bào tua ....................... 41 2.4.3. Kỹ thuật Western blot đo mức độ biểu hiện protein ................................. 41 2.4.4. Kỹ thuật ELISA đo nồng độ các cytokine tiết ra bởi tế bào tua ................ 44 2.4.5. Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry analysis) ........ 47 2.4.6. Phương pháp xác định sự di cư tế bào (transwell migration assay) ........... 48 2.4.7. Phương pháp phân tích số liệu ................................................................. 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ...................................50 3.1. Vai trò của protein A20 điều hoà các chức năng sinh lý tế bào tua .................. 50 3.1.1. Kết quả bất hoạt gen A20 trong tế bào tua ................................................ 50 3.1.2. Vai trò của protein A20 điều hòa sự trưởng thành tế bào tua .................... 51 3.1.3. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua................. 59 3.1.3.1. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3 .................................................................................. 59 3.1.3.2. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng GM-CSF............................................................................. 65 3.1.4. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua ............................ 67 3.1.4.1. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3 ............................................................................................ 67 3.1.4.2. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi phơi niễm với GM-CSF và phơi nhiễm LPS ....................................................................... 69 3.1.5. Vai trò của protein A20 đối quá trình apoptosis của tế bào tua ................. 70
3.2. Nghiên cứu một số tín hiệu phân tử liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua dưới vai trò điều hòa của protein A20 .................................................................... 76 3.2.1. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong tế bào tua nhóm CD11b+DC khi phơi nhiễm với profilin ................................... 77 3.2.2. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong tế bào tua pDC khi phơi nhiễm với profilin........................................................ 79 3.2.3. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa STAT1 và STAT3 trong tế bào tua nhóm CD11b+DC khi xử lý với LPS ............................................................ 81 3.2.4. Vai trò của protein A20 đối với một số chức năng sinh lý của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 .......................................................... 83 3.2.4.1. Vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 ............................................................................ 84 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilin ..................... 84 3.2.4.2. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 ............................................................................ 86 3.2.4.3.Vai trò của protein A20 đối với sự di chuyển của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 ................................................................................... 89 3.2.5. Vai trò của protein A20 đối với chức năng của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 ........................................................................................... 90 3.2.5.1. Vai trò của protein A20 đối với quá trình sản xuất cytokine của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 .............................................................. 90 3.2.5.2. Vai trò của protein A20 trong điều hoà sự di chuyển của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 .............................................................. 92 BÀN LUẬN .......................................................................................................... 94 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................................................................................................110 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................111 PHỤ LỤC ............................................................................................................125 Phụ lục 1: Kết quả nuôi cấy tế bào tua ................................................................. 125
Phụ lục 1.1. Khả năng sống sót và biệt hóa của tế bào tua sau nuôi cấy ........... 125 Phụ lục 1.2. Hình ảnh tế bào tua sau nuôi cấy .................................................. 125 Phụ lục 1.3. Tế bào tua trưởng thành sau phơi nhiễm bởi Lipopolysaccharide . 127 Phụ lục 2: Sự tiết TNF-α của tế bào tua ............................................................... 129 Phụ lục 3: Ảnh hưởng của một số cytokine đối với quá trình apoptosis của tế bào CD11b+DC .......................................................................................................... 131 Phụ lục 3.1. Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V dưới tác động của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và INF-γ............................................................. 131 Phụ lục 3.2. Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 dưới tác động của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ............................................................. 132 Phụ lục 4: Vai trò điều hòa của IL-10 đối với sự phosphoryl hóa STAT1 và STAT3 trong tế bào tua ....................................................................................... 133 Phụ lục 4.1. Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT1 ..... 133 Phụ lục 4.2. Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT3 ..... 134
1 MỞ ĐẦU Protein A20 là protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 (tumor necrosis factor α-induced protein 3 - TNFAIP3) có đặc tính chống viêm và điều hòa ngược hoạt động sinh lý của tế bào miễn dịch, thông qua việc ngăn chặn sự phosphoryl hóa một số tín hiệu phân tử như: nhân tố phiên mã NF-κB và tín hiệu STAT (signal transducer and activator of transcription). Các nghiên cứu di truyền cho thấy đột biến gen A20 làm thay đổi chức năng sinh học của protein A20 và là một trong những nguyên nhân gây ra các loại bệnh lý như bệnh tự miễn, viêm nhiễm và ung thư. Chuột bị bất hoạt gen A20 thường biểu hiện tình trạng suy nhược, mắc các bệnh tự miễn, viêm toàn bộ các cơ quan, bộ phận cơ thể và không sống sót được quá 2 tuần tuổi. Ở người, bất hoạt gen A20 đã được ghi nhận liên quan đến bệnh tự miễn và ung thư như các loại bệnh ung thư máu. Tuy nhiên ảnh hưởng của protein A20 đến cơ chế bệnh sinh của các bệnh này vẫn chưa được tìm hiểu đầy đủ. Tế bào tua (TBT) là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp cho các tế bào lympho, có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Chỉ có các TBT mới có khả năng kích thích hình thành phản ứng miễn dịch ở tế bào lympho T trong trạng thái không hoạt động. TBT cũng đóng góp vào các chức năng của các tế bào lympho B và giúp duy trì trí nhớ miễn dịch của các tế bào này. TBT sản xuất các cytokine và các yếu tố khác thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B. Các tế bào tua có mặt trong hầu hết các cơ quan lympho như lách và hạch bạch huyết, biểu mô da, các ống tiêu hóa và ống hô hấp, chính vì thế chúng dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh. TBT được chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dòng lympho có nguồn gốc từ cơ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC) và TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC). Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thành hai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức độ biểu hiện các loại thụ thể toll- like (toll-like receptor - TLR) khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khả năng tương tác với mầm bệnh. Một số nghiên cứu trước đây trên tế bào tua đã chỉ ra rằng protein A20 có khả năng ức chế khả năng sản xuất một số các cytokine. Tuy nhiên đến nay, chưa có công bố khoa học nào về vai trò, cơ chế phân tử của gen A20 trong điều hòa các
2 chức năng sinh lý TBT khi phơi nhiễm với kháng nguyên có nguồn gốc ký sinh trùng và ảnh hưởng của protein A20 đến hoạt động apoptosis của TBT khi bị kích thích bởi một số cytokine. Do đó, các thí nghiệm được tiến hành để nghiên cứu vai trò điều hoà của protein A20 đối với TBT khi được kích hoạt bởi một số kháng nguyên như profilin từ Toxoplasma gondii hay lipopolysaccharide (LPS) và một số cytokine, với tên đề tài: “Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua”. Luận án được thực hiện với các mục tiêu như sau: 1. Đánh giá vai trò của gen A20 đối với việc điều hoà bốn chức năng sinh lý gồm sự trưởng thành, tiết cytokine, di cư và quá trình apoptosis của tế bào tua. 2. Đánh giá ảnh hưởng của gen A20 đối với việc điều hòa ba tín hiệu phân tử NF-κB, STAT1 và STAT3 liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua.
3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Protein A20 1.1.1. Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20 Protein A20 (hay còn được gọi là TNFAIP3 - tumor necrosis factor alpha- induced protein 3 - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3) là protein ức chế phản ứng viêm chống lại các tác nhân gây viêm. Protein A20 có chiều dài 790 axit amin và khối lượng phân tử 89,6 kDa. Protein này đóng vai trò là chất điều hoà của phản ứng miễn dịch trung gian thông qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclear factor kappa B - NF-κB) [1]. Các nghiên cứu ban đầu cho thấy, A20 là một protein bảo vệ các tế bào khỏi quá trình apoptosis do TNF gây ra. Đến nay, A20 đã được công nhận rộng rãi là một protein kháng viêm, nó không chỉ chất ức chế con đường tín hiệu NF-κB phụ thuộc TNF, mà còn ức chế kích hoạt NF-κB để đáp ứng với Interleukin 1 (IL-1), CD40 và tín hiệu thông qua các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors - PRRs) và kích hoạt thụ thể kháng nguyên tế bào T và tế bào B [2]. Nghiên cứu in vivo đầu tiên về vai trò của protein A20 trong sinh lý mô là nghiên cứu trên mô hình chuột thiếu hụt A20 [3]. Chuột bị bất hoạt gen A20 biểu hiện quá mẫn cảm với TNF, chết sớm do viêm đa cơ quan nghiêm trọng và suy nhược cơ thể do tín hiệu thụ thể TLR phản ứng với vi khuẩn bội nhiễm [4]. Ngoài ra, protein A20 đã được chứng minh là có vai trò điều hòa các dòng tín hiệu tế bào khác, như con đường tín hiệu Wnt, con đường điều hòa interferon (interferon regulatory factor - IRF) và phản ứng tự miễn [5-7]. 1.1.2. Cấu trúc gen A20 và protein A20 Protein A20 được mã hóa bởi gen A20, gen này được đặt tên theo số bản sao cDNA, và được xác định là gen cảm ứng với TNF trong các tế bào nội mô [8]. Gen A20 nằm tại vị trí 6q23.3 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 6 (forward strand) (Hình 1.1.A). Gen A20 chứa 15.869 bp bao gồm 9 exon và 8 intron (Hình 1.1.B). Trong đó, exon 1, đầu 5’ của exon 2 và đầu 3’ của exon 9 không mã hoá protein. Độ dài
4 của mRNA là 4.446 bp, trình tự mã hóa (coding sequence - CDS) từ vị trí 67 đến 2439. mRNA của A20 được biểu hiện ở mức cao trong các hạch bạch huyết, ống tiêu hoá, đường hô hấp, thanh quản, khí quản và thận [2]. Hình 1.1. Cấu trúc gen A20 và protein A20 [9] A. Vị trí gen A20 trên vai dài của NST số 6 B. Cấu trúc gen A20 gồm 8 exon và 9 intron C. Cấu trúc protein A20 gồm 1 miền OTU đầu N và 7 vùng ZnF đầu C D. Cấu trúc 3D của protein A20 Protein A20 có chiều dài 790 acid amin và khối lượng phân tử là 89.614 Da. A20 là protein zinc finger, cấu trúc của nó bao gồm 7 vùng E3 ubiquitin ligase (ZnF) trong đầu C của nó và 1 termed ovarian tumor (OTU) domain trong đầu N của nó (Hình 1.1.C). Protein A20 thuộc họ C64 peptidase và tồn tại trong tế bào chất và nhân tế bào [9].
5 1.1.3. Vai trò của protein A20 điều hòa một số loại tế bào miễn dịch Protein A20 có vai trò rất quan trọng trong điều hoà hệ thống miễn dịch thông qua tác động đến các tế bào miễn dịch như tế bào tua, tế bào B, tế bào T và các đại thực bào (Hình 1.2). Hình 1.2. Vai trò của protein A20 trong các tế bào miễn dịch [10] Khi phơi nhiễm với một số tác nhân như LPS, Endotoxin, protein A20 tham gia điều hoà ức chế chức năng các tế bào miễn dịch như tế bào tua, tế bào B, tế bào T và các đại thực bào. Trong TBT, sau khi phơi nhiễm với LPS, protein A20 ức chế sự tiết một số cytokine ví dụ như TNF-α, IL-6, IL-10, ức chế biểu hiện của marker trưởng thành CD40, ức chế sự phosphoryl hoá NF-кB và tăng cường IкBα. Trong tế bào B, sau khi kích thích bởi LPS, protein A20 làm tăng cường biểu hiện kháng thể IgG1 và IgG3, ức chế biểu hiện kháng thể IgM và IgA, ức chế hiểu hiện của marker bề mặt CD69 và CD80, ức chế sự phosphoryl hoá NF-кB và tăng cường IкBα. Tương tự như vậy, đối với tế bào T và đại thực bào, khi phơi nhiễm với LPS, protein A20 ức chế sự phosphoryl hoá phân tử tín hiệu NF-кB và tăng cường tín hiệu IкBα.