Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:199

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử" trình bày các nội dung chính sau: Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thị trường; Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phan Thị Thanh Hà NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ VI RÚT CÓ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Lê Quang Hòa 2. PGS. TS. Trương Tuyết Mai Hà Nội - 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố. TM. Tập thể hướng dẫn Tác giả của luận án TS. Lê Quang Hòa Phan Thị Thanh Hà i
LỜI CẢM ƠN Từ năm 2005 đến nay, trong những năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ và luận án Tiến sĩ tại Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, tôi đã thu nhận được rất nhiều kiến thức quý báu về lý thuyết cũng như thực hành nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm. Tôi vô cùng biết ơn các Thầy Cô giáo, Ban Giám hiệu, các cán bộ tại Phòng thí nghiệm, Ban Đào tạo, Ban Tài chính – Kế hoạch …đã dạy dỗ, bảo ban giúp đỡ tôi về mọi mặt. Hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dành nhiều thời gian trao đổi, định hướng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu cũng như viết Luận án. Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Ban Đào tạo đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện và báo cáo đề tài Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo và các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học phân tử đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành công việc chuyên môn được phân công. Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè luôn chia sẻ khó khăn, động viên khích lệ tôi vượt qua mọi trở ngại để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu và học tập! Hà Nội ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Hà ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................II MỤC LỤC ............................................................................................................... III DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... VI DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... VI DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT...................................................... X MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 3 5. Tính mới của đề tài ............................................................................................. 4 1. TỔNG QUAN ........................................................................................................ 5 1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm ................................................................................................................... 5 1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ............................ 5 1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......................................................................................................... 6 1.2. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ................................................................................................................ 8 1.2.1. Norovirus ................................................................................................... 8 1.2.2. Hepatitis A virus ...................................................................................... 10 1.2.3. Hepatitis E virus ...................................................................................... 11 1.2.4. Astrovirus ................................................................................................ 12 1.3. Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......... 13 1.3.1. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút ................................................. 13 1.3.2. Các phương pháp xác định vi rút ............................................................. 17 1.4. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR .............................................................................. 21 1.5. Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi, mẫu dò trong phản ứng Real – time RT - PCR ........................................................ 25 1.5.1. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) ............................................. 26 1.5.2. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) ............................................... 27 iii
1.6. Phương pháp xác định kiểu gen vi rút ............................................................... 28 1.6.1. Kỹ thuật Nested RT - PCR ...................................................................... 28 1.6.2. Kỹ thuật giải trình tự Sanger ................................................................... 30 1.7. Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV trên thế giới và tại Việt Nam .................................................................................... 32 1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 32 1.7.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ......................................................... 35 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 39 2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................ 39 2.1.1. Vật liệu kiểm soát .................................................................................... 39 2.1.2. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................. 39 2.1.3. Oligonucleotide ....................................................................................... 39 2.1.4. Hóa chất ................................................................................................... 43 2.1.5. Thiết bị ..................................................................................................... 43 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 44 2.2.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ....................................................... 44 2.2.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ........................................ 52 2.2.3. Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ................................................... 56 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................................... 59 3.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ....................................................................................... 59 3.1.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT- PCR phát hiện HEV ........................................................................................... 59 3.1.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro........................................................................................................... 64 3.1.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 ................................................... 67 3.1.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này ................................ 72 3.1.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013............................................................................... 74 iv
3.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ........................................................................... 84 3.2.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT- PCR phát hiện HAstV ........................................................................................ 84 3.2.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro ................................................................................................. 88 3.2.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 ................................................... 89 3.2.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này ............................. 93 3.2.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013............................................................................... 94 3.3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................................. 100 3.3.1. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 ..................................................................................... 100 3.3.2. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2022 ..................................................................................... 107 3.3.3. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022 ............................................. 113 3.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ......................................................................... 117 3.4.1. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.................................................................................... 117 3.4.2. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.................................................................................... 126 3.4.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......................................................................... 129 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 133 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............. 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 136 PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ BỔ TRỢ CỦA LUẬN ÁN............................................... 1 PHỤ LỤC 2 SẢN PHẨM CỦA LUẬN ÁN .......................................................... 13 v
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 ................................................. 6 Hình 1.3 Cấu tạo khung đọc mở NoV ........................................................................ 9 Hình 1.4 Cấu trúc virion Hepatitis A virus .............................................................. 10 Hình 1.5 Cấu trúc hệ gen Hepatitis A virus ............................................................. 10 Hình 1.6 Cấu trúc virion Hepatitis E virus ............................................................... 11 Hình 1.7 Cấu trúc hệ gen Hepatitis E virus ............................................................. 11 Hình 1.8 Cấu trúc virion HAstV............................................................................... 12 Hình 1.9 Cấu trúc hệ gen HAstV.............................................................................. 12 Hình 1.10 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP ...................................................... 18 Hình 1.11 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR ..................................................... 19 Hình 1.12 Vị trí gắn của MGB trên mẫu dò và cấu trúc hóa học của MGB ............ 26 Hình 1.13 Cấu trúc của nucleotide thông thường và của nucleotidd LNA (B) ........ 27 Hình 1.14 Nguyên lý kỹ thuật Nested RT - PCR ..................................................... 28 Hình 1.15 Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự Sanger ............................................ 30 Hình 2.1. Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV và HAstV .......................................................... 44 Hình 2.2. Quy trình tách dòng trình tự gen đại diện của HEV và HAstV................ 45 Hình 2.3. Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA................................. 47 Hình 2.4. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV ...................................................................................................................... 48 Hình 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV ......................................................................................................... 49 Hình 2.6. Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV ................................................................................................ 52 Hình 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 .......... 54 Hình 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR với mồi ngoài khuếch đại RNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV..................................................... 57 Hình 2.9. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV..................................................... 57 Hình 3.1. Cấu trúc hệ gen chuẩn HEV của WHO (mã số AB630970) .................... 59 vi
Hình 3.2. Đặc điểm bộ mồi của Schlosser và của Jothikumar trên trình tự gen HEV chuẩn của WHO (mã số AB630970) ........................................................................ 60 Hình 3.3. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser và Jothikumar với các hệ gen HEV công bố trên GenBank......................................... 61 Hình 3.4. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A trên gel agarose ........ 65 Hình 3.5. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose 2,5%. ............................ 65 Hình 3.6. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.A .................................................................................................. 66 Hình 3.7. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B trên gel agarose ....... 66 Hình 3.8. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose....................................... 67 Hình 3.9. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B ........ 67 Hình 3.10. Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV ............................................................................................................... 74 Hình 3.11. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV ........................................................... 78 Hình 3.12. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV .......................................................... 82 Hình 3.14. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộng sự............................................................................................................................... 85 Hình 3.15. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV trên gel agarose ...... 88 Hình 3.16. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích HAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose ....................................... 88 Hình 3.17. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV .................................................................................................................................. 89 Hình 3.18. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử dụng chu trình nhiệt theo ISO .................................................................................. 96 Hình 3.19. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử dụng quy trình ISO ................................................................................................... 98 Hình 3.20. Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện vii
và định lượng HAstV trong NTHMV. Sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; Sử dụng chu trình nhiệt theo ISO .................................................................................................. 98 Hình 3.21. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2016............................................. 101 Hình 3.22. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 .............. 105 Hình 3.23. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2016 ................................................ 106 Hình 3.24. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2016 .................................................................................. 106 Hình 3.25. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2022............................................. 108 Hình 3.26. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2022 .............. 112 Hình 3.27. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2022 ................................................ 112 Hình 3.28. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2022 .................................................................................. 113 Hình 3.29. So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 và năm 2022 ........................................................................................... 114 Hình 3.30. So sánh sự phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 và năm 2022............................................................................................................ 114 Hình 3.31. Kết quả đánh giá mối tương quan giữa các yếu tố (loại mẫu, địa điểm lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, dịch Covid-19) đến tình trạng nhiễm vi rút trong NTHMV bằng phần mềm SPSS ............................................................................................. 116 Hình 3.32. Kết quả đánh giá mối tương quan giữa các yếu tố (loại mẫu, địa điểm lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, năm lấy mẫu) đến mức nhiễm NoV GI và NoV GII trong NTHMV bằng phần mềm SPSS ............................................................................. 116 Hình 3.33. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại vùng gen ORF1-ORF2 của NoV GI và NoV GII trên gel agarose 1,5%. .................................................... 118 Hình 3.34. Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GI phát hiện được trong nghiên cứu với các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự. ................................................ 120 Hình 3.35. Phân bố kiểu gen Norovirus GI của các mẫu phát hiện được trong nghiên cứu .......................................................................................................................... 121 viii
Hình 3.36. Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GII phát hiện được trong nghiên cứu với các trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự..................................... 124 Hình 3.37. Phân bố kiểu gen Norovirus GII của các mẫu phát hiện được trong nghiên cứu .............................................................................................................. 125 Hình 3.38. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV trên gel agarose 1,5% ........................................................................................................................ 127 Hình 3.39. Cây phát sinh loài của các mẫu HEV phát hiện được trong nghiên cứu với các trình tự HEV tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự. ...................................................... 128 Hình 3.40. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV trên gel agarose 1,5% ........................................................................................................................ 129 Hình 3.41. Cây phát sinh loài của bốn chủng HAstV phát hiện được trong .......... 131 nghiên cứu với các trình tự HAstV tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự....................... 131 ix
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV .................. 16 Bảng 1.2 Nhận xét các phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm ............. 20 Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu phát hiện NoV, HAV, HEV và HAstV ............................................................................................. 22 Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện NoV, HAV, HEV, HAstV ................................................................................................. 23 Bảng 1.5 Tổng hợp một số nghiên cứu về vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm tại Việt Nam................................................................................................................... 36 Bảng 2.1. Trình tự mồi, mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu xây dựng quy trình Real- time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA vi rút từ NTHMV .............................. 40 Bảng 2.2. Tổng hợp các bộ mồi sử dụng trong phản ứng Nested RT-PCR xác định kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV .............................. 41 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng RNA vi rút sử dụng SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit............................................ 49 Bảng 2.4. Thông tin các biến được phân tích bằng phần mềm SPSS ...................... 55 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV .............................................................................................. 56 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ..................................................................... 57 Bảng 3.1. Đặc điểm kỹ thuật của tổ hợp mồi Schlosser và Jothikumar ................... 60 Bảng 3.2. Đặc điểm kỹ thuật của các tổ hợp mồi sau khi hiệu chỉnh và ứng dụng công nghệ MGB, LNA ............................................................................................. 63 Bảng 3.3. Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ đối với hai tổ hợp mồi A và B........... 68 Bảng 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi đối với hai tổ hợp mồi A và B .................... 70 Bảng 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò đối với hai tổ hợp mồi A và B ............... 71 Bảng 3.6. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV .... 71 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ................................................. 72 Bảng 3.8. Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn .......................... 73 x
Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV trong NTHMV.................................................................................................................... 75 Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real- time RT-PCR xác định HEV .................................................................................... 79 Bảng 3.11. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV .......................................................... 80 Bảng 3.12. Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV trong NTHMV với các tác nhân nhân virus gây bệnh đường ruột thường gặp trong NTHMV.................................................................................................................... 83 Bảng 3.13. Vị trí trình tự gen HAstV tham chiếu (mã số NC_001943.1) và giá trị nhiệt trên độ nóng chảy (Tm) của của bộ mồi, mẫu dò của Cann ............................ 85 Bảng 3.14. Đặc điểm kỹ thuật của trình tự mồi phát hiện HAstV sau khi hiệu chỉnh và ứng dụng công nghệ LNA ................................................................................... 87 Bảng 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV ............................................................................................................... 90 Bảng 3.16. Kết quả tối ưu nồng độ mồi HAstV ....................................................... 91 Bảng 3.17. Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò HAstV ................................................. 92 Bảng 3.18. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HAstV .................................................................................................................................. 92 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ...................................... 93 Bảng 3.20. Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ....................... 94 Bảng 3.21. Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV trong NTHMV .......................................................................................................... 95 Bảng 3.22. Giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real- time RT-PCR xác định HAstV ................................................................................. 97 Bảng 3.23. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV....................................................... 97 Bảng 3.24. Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV trong NTHMV với các tác nhân nhân virus gây bệnh đường ruột thường gặp trong NTHMV .......................................................................................................... 99 xi
Bảng 3.25. Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 102 Bảng 3.26. Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 103 Bảng 3.27. Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 109 Bảng 3.28. Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 110 Bảng 3.29. Kết quả xác định kiểu gen các mẫu NoV GI đã phát hiện ................... 118 Bảng 3.30. Kết quả xác định kiểu gen các mẫu NoV GII đã phát hiện ................. 122 Bảng 3.31. Kết quả xác định kiểu gen các mẫu HAstV đã phát hiện .................... 130 xii
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Tên đầy đủ tiếng Việt CRE Cis-reactive element DNA Deoxyribonucleic acid Phương pháp hấp phụ miễn dịch gắn ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay enzyme EU European Union Liên minh châu Âu Food and Agriculture Organization of Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp FAO the Unated Nation Liên hợp Quốc Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược FDA Food and Drug Administration phẩm Mỹ HAV Hepatitis A virus Vi rút viêm gan A HAstV Human Astrovirus Astro vi rút người HEV Hepatitis E virus Vi rút viêm gan E International Organization for ISO Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Standardization LNA Locked Nucleic Acids LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện MGB Minor Groove Binders Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm NAFIQAD sản và Thủy sản – Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn NoV Norovirus NTP Nucleoside triphosphatase NTHMV Nhuyễn thể hai mảnh vỏ Netherlands Food and Consumer Cơ quan An toàn Sản phẩm Tiêu dùng NVWA Product Safety Authority và Thực phẩm Hà Lan xiii
PEG Polyethylene glycol RNA Acid ribonucleic Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Reverse transcription loop-mediated RT-LAMP thông qua cấu trúc vòng phiên mã isothermal amplification ngược Reverse Trancription Polymerase Chain Phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi RT-PCR Reaction polymerase phiên mã ngược Hệ thống cảnh báo nhanh về thực RASFF Rapid Alert System for Food and Feed phẩm và thức ăn chăn nuôi TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLTK Tài liệu tham khảo Vietnam Association of Seafood Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ VASEP Exporters and Producers sản Việt Nam VFA Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới xiv
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 [1]. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, xuất khẩu NTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020; trong đó, ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minh châu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3]. Tuy nhiên, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu, gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam. Tháng 4 năm 2022, trong “Diễn đàn phát triển thủy sản bền vững”, lãnh đạo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã khẳng định việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trò quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra, trong đó việc bảo đảm kiểm soát chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuất ban đầu đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4]. Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụ NTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xác định được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ô nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV [5]. Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm [6-8]. Trước tình hình ô nhiễm thực phẩm do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao, cùng với những kết quả về tình trạng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển quy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết [7]. Hiện nay, trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và HAV trong thực phẩm [9-12] thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và HEV còn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong công tác kiểm nghiệm. Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm bảo độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản ứng Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc cả bốn tác nhân NoV, HAV, 1
HEV và HAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 sẽ góp phần rút ngắn thời gian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho công tác điều trị. Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, việc xác định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) là công đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởi các tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV, hướng tới đề xuất biện pháp ứng phó kịp thời, ngăn chặn sự lây lan vi rút trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về sức khỏe, kinh tế và xã hội. Do vậy, luận án nghiên cứu sinh “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử” đã được thực hiện. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV trong NTHMV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013. - Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV trên thị trường - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 3.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 2
3.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV - Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 - Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này - Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 3.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 - Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2022 - So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 và năm 2022 3.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong NTHMV - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong NTHMV 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học - Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu dò có độ bao phủ cao với các trình tự HEV và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank. - Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để có thể phát hiện được RNA của HEV và HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013; từ đó mở ra khả năng phát hiện được đồng thời 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và HAstV trong một lần chạy Real - time RT-PCR. 3
- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV và HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút này - Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV và HAstV nhiễm tạp trong NTHMV, góp phần đánh giá nguy cơ bùng phát dịch bệnh. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp một quy trình phân tích đồng thời cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV với tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ chạy đồng thời với cùng một chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mẫu thực phẩm, bệnh phẩm, môi trường nói chung để các cơ sở xét nghiệm có thể ứng dụng trong phân tích. - Góp phần nâng cao năng lực kiểm soát an toàn thực phẩm, tăng tính cạnh tranh của NTHMV và các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị trường quốc tế. 5. Tính mới của đề tài - Thiết kế, hiệu chỉnh được tổ hợp mồi, mẫu dò phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV có độ bao phủ cao với các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ liệu Genbank. - Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013. - Xác định được tỷ lệ và mức nhiễm tạp của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV trong năm 2016 và 2022 tại Việt Nam. - Xác định được kiểu gen của NoV, HAV, HEV và HAstV lưu hành trong NTHMV trong năm 2016 tại Việt Nam. 4
1. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm 1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ Theo FAO, nhu cầu đối với các mặt hàng NTHMV (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 do các hạn chế về COVID-19 đã giảm bớt ở các quốc gia tiêu thụ chính những mặt hàng này. Trong năm 2021, khoảng 71.000 tấn hàu đã được nhập khẩu trên toàn thế giới, cao hơn 15.000 tấn so với năm 2020 và thậm chí cao hơn 6.000 tấn so với năm 2019. Cũng trong năm 2021, tổng thương mại ngao trên toàn thế giới tăng, khoảng 287.000 tấn đã được nhập khẩu, nhiều hơn 20.000 tấn so với năm 2020 [1]. Việt Nam có đặc điểm địa lý thuận lợi để phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng các loài nhuyễn thể nhờ vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000km2 nằm bên bờ Tây của Biển Đông - là một biển lớn của Thái Bình Dương, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 cùng hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền [13]. Năm 2021, diện tích nhuyễn thể của Việt Nam đạt trên 35.000 ha, sản lượng 471.000 tấn; trong đó, diện tích và sản lượng nuôi ngao chiếm khoảng 50%; cụ thể, năm 2021, diện tích nuôi trên 17.000 ha, sản lượng đạt trên 236.000 tấn [2]. Đến nay, nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu NTHMV của Việt Nam năm 2021 đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020. Trong đó, ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Số liệu của Trung tâm Thương mại Thế giới (ITC) cho thấy các thị trường nhập khẩu chính NTHMV của Việt Nam là: Liên minh châu Âu EU (Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Italy), Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc. Trong đó, EU là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm tỷ trọng 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3]. 5