Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:153

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV) TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT THUèC TRõ S¢U SINH HäC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIÓN SINH KhèI VIrus NH¢N §A DIÖN (NPV) TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT THUèC TRõ S¢U SINH HäC Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Hoàng Đình Hoà PGS.TS. Lê Văn Trịnh Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án này là trung thực, không trùng lặp với các đề tài luận án nào khác và chưa được tác giả khác công bố. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả i
MỤC LỤC Diễn giải Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1 2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4 5. Những đóng góp mới của luận án 4 CHƯƠNG 1. CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 5 1.2. Tổng quan tài liệu 6 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 6 1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 6 1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 8 1.2.1.3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng 12 1.2.1.4. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng 18 1.2.1.5. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 28 1.2.1.6. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV 32 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 35 1.2.2.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 35 1.2.2.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 36 1.2.2.3. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng 37 ii
1.2.2.4. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV 38 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 43 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 43 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 43 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 44 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 44 2.3. Nội dung nghiên cứu 44 2.4. Phương pháp nghiên cứu 44 2.4.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang 44 2.4.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân 48 2.4.2. 1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang 50 2.4.2.2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi 54 2.4.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 60 2.4.3.1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào 60 2.4.3.2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 61 2.4.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 2.4.4. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu 65 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu khoang 66 3.1.1. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện (NPV) ngoài đồng ruộng 66 3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao 70 3.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 77 3.2.1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78 iii
3.2.1.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78 3.2.1.2. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm 88 3.2.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân 92 3.2.2.1. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV) 93 3.2.2.2. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) 101 3.2.2.3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế bào và trên sâu 105 3.2.2.4. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào 107 3.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm nước 109 3.3.1. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang 109 3.3.2. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước 114 3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 117 3.3.3.1. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm 117 3.3.3.2. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới 117 3.3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng 120 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 126 2. Đề nghị 127 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 PHỤ LỤC iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Diễn giải chữ viết tắt ADN Axit Deroxyribo Nucleic CT Công thức CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) FBS Fetal Bovin Serum (Huyết thanh) et al. Những người khác MOI Multiplicity of Infection (Chỉ số lây nhiễm) nnk. Những người khác NSNN Ngày sau nuôi nhân NSLN Ngày sau lây nhiễm NPV Nuclear Polyhedrosis Virus (Virus nhân đa diện) OB Occlusion Bodies (Thể vùi) PBS Photphatse Buffer Saline PIB Polyhedral shaped inclusion Bodies (Thể vùi nhân đa diện) QCVN Qui chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam SDS Sodium Dodecyl Sulfate TB Trung bình v
DANH MỤC BẢNG Diễn giải Trang Bảng 3.1. Mật độ sâu khoang phát sinh và tỷ lệ sâu chết do NPV trên các cây trồng ngoài đồng ruộng (2014- 2015) 68 Bảng 3.2. Mức độ phổ biến của NPV ký sinh sâu khoang trên các cây trồng ngoài đồng ruộng (2014- 2105) 69 Bảng 3.3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang ở các ngày sau lây nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 1 72 Bảng 3.4. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau lây nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 2 74 Bảng 3.5. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng NPV điển hình sau phân lập lần thứ 4 75 Bảng 3.6. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng NPV đã được lựa chọn 76 Bảng 3.7. Mật độ tế bào sâu khoang ở các ngày sau nuôi nhân trên các môi trường khác nhau 79 Bảng 3.8. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau 81 Bảng 3.9. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức pH môi trường khác nhau 83 Bảng 3.10. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân trên môi trường có bổ sung huyết thanh FBS với tỷ lệ khác nhau 85 Bảng 3.11. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân in vitro ở điều kiện thích hợp 86 Bảng 3.12. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình lọc khuẩn 250ml 89 Bảng 3.13. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân với lượng 750ml môi trường trên bình lọc khuẩn 1000ml theo phương pháp tĩnh và lắc 91 Bảng 3.14. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào có mật độ khác nhau 94 vi
Bảng 3.15. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào theo chỉ số MOI khác nhau 95 Bảng 3.16. Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác nhau 97 Bảng 3.17. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang với các loại môi trường khác nhau 98 Bảng 3.18. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang ở nhiệt độ khác nhau 99 Bảng 3.19. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang ở các mức pH môi trường khác nhau 101 Bảng 3.20. Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành sau các ngày lây nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau 104 Bảng 3.21. Hiệu lực trừ sâu khoang của các nguồn NPV được tạo ra từ lây nhiễm trên tế bào và trên sâu khoang 105 Bảng 3.22. Số lượng thể vùi hình thành từ các nguồn NPV tạo ra từ lây nhiễm trên tế bào và trên sâu khoang 106 Bảng 3.23. Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế bào và trên sâu khoang 108 Bảng 3.24. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các phương pháp khác nhau 111 Bảng 3.25. Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ 113 Bảng 3.26. Thành phần phụ gia, chất lượng và liều lượng sử dụng chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 116 Bảng 3.27. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV sau 6 ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm 117 Bảng 3.28. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải của chế phẩm NPV trong điều kiện nhà lưới 118 Bảng 3.29. Số lượng thể vùi hình thành trên sâu khoang trên bắp cải sau khi sử dụng chế phẩm NPV ngoài nhà lưới 119 vii
Bảng 3.30. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) 121 Bảng 3.31. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều lượng khác nhau trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) 122 Bảng 3.32. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều lượng khác nhau trên đậu tương ngoài đồng ruộng tại Mỹ Thành (Hà Nội) 124 Bảng 3.33. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên đậu tương tại Mỹ Thành (Hà Nội) 124 viii
DANH MỤC HÌNH Diễn giải Trang Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang 7 Hình 1.2. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D) 8 Hình 2.3. Buồng đếm hồng cầu Neubauer 54 Hình 3.1. Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải 67 Hình 3.2. Thể vùi NPV màu trắng đục hình thành và lắng đọng 69 Hình 3.3. Lây nhiễm NPV trên sâu non sâu khoang trong phòng thí nghiệm 72 Hình 3.4. Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a 77 Hình 3.5. Thí nghiệm xác định môi trường nuôi nhân tế bào thích hợp A: Ban đầu; B: Sau nuôi nhân 3 ngày 80 Hình 3.6. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau. A: 240C; B: 260C, C: 280C và D: 290C 81 Hình 3.7. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày đã nuôi nhân đợt tháng 11/2016 quan sát dưới kính với độ phóng đại 100X 86 Hình 3.8. Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 600X và 200X 87 Hình 3.9. Nhân tế bào theo phương pháp lắc (A) và theo phương pháp tĩnh (B) 90 Hình 3.10. Thể vùi NPV sâu khoang sau khi tinh sạch khi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200X và 600X 111 Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV trên tế bào và trên sâu 112 Hình 3.12. Thể vùi sau tinh sạch (A), được đưa vào lọ bảo quản (B) 113 Hình 3.13. Cây phả hệ dựng theo phương pháp Neighbor-joining. 114 Hình 3.14. Đóng gói chế phẩm NPV sau khi tạo dạng sử dụng 116 ix
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là loài sâu ăn tạp thường gây hại trên các đối tượng cây trồng cạn, phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới. Theo Kumari và Singh (2009); Hong (2002), sâu khoang có thể sống và gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau [1, 2]. Ở Việt Nam, sâu khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như các loại rau họ Thập tự, nho, đậu đỗ, cà chua, dưa chuột, rau muống, khoai sọ, thuốc lá, đậu tương, lạc, bông, đay, v.v. (Viện Bảo vệ thực vật, 2003, 2006) [3, 98]. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001), để bảo vệ cây trồng khỏi tác hại do sâu khoang, nông dân thường phải sử dụng nhiều loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật với liều lượng cao [4]. Sự lệ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã làm tăng mức độ kháng thuốc của sâu khoang, gây khó khăn cho công tác phòng trừ và gây nhiễm bẩn thực phẩm, gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường và làm tổn hại đến quần thể các loài sinh vật có ích trên đồng ruộng . Trên đồng ruộng, cũng như các loài côn trùng thuộc bộ Cánh phấn khác, sâu khoang thường bị chết do nhiễm NPV. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001), khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu chết do bị nhiễm NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu tương và 0,3- 1,9% trên lạc [4]. Rohrmann và George (2011), Kitajima (1989); Kamakoff và Ward (2007) đã xác định NPV lây nhiễm, gây chết trên sâu khoang là loài vi rút nhân đa diện (Nuclear Polyhedrosis Virus- NPV) thuộc họ Baculoviridae và thuộc nhóm vi rút sinh thể vùi (Oclusion Bodies - OB), mỗi thể vùi có thể chứa tới 200 thể vi rút hoạt động (virion) hình que có vỏ ngoài protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng vòng xoắn kép. Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kích thước từ 0,15- 15µm. NPV sâu khoang rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của nó [5, 6, 7]. 1
Vì vậy, việc khai thác sử dụng và nghiên cứu khả năng phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học NPV là cần thiết, nhằm đáp ứng yêu cầu phòng trừ sâu khoang hại trên các cây trồng nông nghiệp. Sử dụng chế phẩm sinh học NPV còn góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng. Đồng thời, thông qua việc sử dụng chế phẩm sinh học này trong việc phòng trừ sâu khoang, sẽ góp phần bổ sung nguồn vi sinh vật có ích NPV vào đồng ruộng. Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủ công với qui mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Nguyễn Văn Cảm et al., 1996) [8]. Theo cách này, việc sản xuất chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại khó thực hiện với qui mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn cá thể của một loài sâu hại phục vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn, phải có đủ nhà xưởng, trang thiết bị và việc nuôi sâu phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV của các sâu hại với qui mô công nghiệp, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng thành công kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp (Granados et al., 2007; Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009) [9, 10, 11]. Đến nay, nhiều nước như: Mỹ, Hà Lan, Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v. đã và đang ứng dụng để sản xuất, cung cấp cho thị trường nhiều loại chế phẩm NPV có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển sinh khối NPV trên cơ sở ứng dụng kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề còn rất mới, kết quả thu được mới dừng lại ở bước khởi đầu và còn rất hạn chế. Việc thực hiện đề tài: ”Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học”được tiến hành nhằm đóng góp tư liệu khoa học về tiềm năng của NPV và khả năng lây nhiễm, phát triển sinh khối virus trên tế bào sâu khoang nhân nuôi, làm cơ sở cho việc phát triển chế phẩm sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ 2
sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng. 2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài 2.1. Mục đích - Trên cơ sở đánh giá tiềm năng ký sinh tự nhiên, tiến hành tuyển chọn chủng vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao trong phòng chống sâu khoang. - Xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại. 2.2. Yêu cầu cần đạt - Đánh giá được khả năng gây chết sâu khoang ngoài tự nhiên, thu thập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang. - Nghiên cứu xác định được điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân. - Thử nghiệm phát triển chế phẩm virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang dạng bột thấm nước có hiệu quả cao phòng trừ sâu khoang hại cây trồng. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học - Các dẫn liệu đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên đồng ruộng và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao có ý nghĩa to lớn trong định hướng khai thác, sử dụng NPV để quản lý sâu hại cây trồng nông nghiệp. - Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sẽ góp phần làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng trong phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học. - Kết quả nghiên cứu tinh sạch thể vùi (OB) của NPV sâu khoang, thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng làm cơ sở định hướng tiêu chuẩn hoá chất lượng chế phẩm sinh học dựa trên số lượng thể vùi sau khi sản xuất. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả điều tra, thu thập và tuyển chọn 3 chủng NPV có tiềm năng cao trong phát sinh thể vùi và gây chết sâu khoang phục vụ phát triển chế phẩm sinh học. Với kết quả phát triển được 2 chế phẩm NPV có hiệu lực trừ sâu cao sẽ góp phần định hướng xây dựng qui trình sản xuất và sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu 3
khoang, nhằm hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn và bảo vệ môi trường đồng ruộng. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu - Virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang: Được thu thập ngoài đồng ruộng và được phân lập tại phòng thí nghiệm Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật). - Tế bào sâu khoang: Nguồn thực liệu tế bào sâu khoang sử dụng trong nghiên cứu do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, là dòng tế bào phát triển từ tế bào gốc của mô phôi sâu khoang và đã được phân lập nuôi nhân, chọn lọc qua 135 chu kỳ, hiện đang được lưu giữ bảo quản tại Viện Bảo vệ thực vật. - Sâu non sâu khoang: Được nhân nuôi trong các lồng nuôi sâu chuyên dụng với thức ăn bằng lá bắp cải thu hái hàng ngày và xử lý vô trùng bằng cồn 700. 4.2. Phạm vi nghiên cứu - Đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ ngoài đồng ruộng. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang. - Xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang - Điều kiện lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào sâu khoang. - Kỹ thuật tinh sạch thể vùi, tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước. 5. Những đóng góp mới của luận án - Lần đầu tiên cung cấp các dẫn liệu khoa học có hệ thống về khả năng phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tại Việt Nam. - Bổ sung các dẫn liệu khoa học mới về mức độ phổ biến của NPV trên sâu khoang hại bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ. Phân lập, tuyển chọn được 3 chủng NPV có tiềm năng (TL.1a; TL.2a; TL.3a), trong số đó TL.1a có hoạt lực gây chết sâu khoang cao nhất (80%) và số thể vùi hình thành nhiều (2,6 x 108 OB/10 sâu). - Bước đầu xác định được kỹ thuật tinh sạch thể vùi NPV phục vụ tạo dạng sử dụng chế phẩm. Phát triển được 2 chế phẩm NPV dạng bột thấm nước (NPV-1 WP và NPV-2 WP) có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang hại trên cây bắp cải (80,51- 82,29%) và đậu tương (96,92%). 4
CHƯƠNG 1 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) thuộc giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae là một trong số ít vi rút có thể tồn tại ở dạng thể vùi (Occlusion Bodies- OB) nên dễ dàng phân lập, lưu giữ và tạo dạng thành chế phẩm sinh học. Trên đồng ruộng, NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm ngoài tự nhiên và chỉ bị tiêu diệt khi thể vùi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc dính bám trên thân cây, lá cây, tàn dư cây trồng khi phơi nhiễm dưới ánh sáng trực xạ mạnh hoặc tia cực tím (Kitajima, 1989; Grzywacz et al.,1996; Erayya, 2013) [6, 12, 13]. Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp pH cao (> 9,0) của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạt động (virion) và các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa. Sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng. Sau 2-3 ngày, sâu ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al., 2000) [14]. Khi sâu non chết, cơ thể căng mọng rất dễ bị vỡ khi có va chạm nhẹ và sau khi vỡ, thân sâu dính bám vào lá hoặc thân cây và treo ngược cơ thể. Khi sâu chết, các thể hoạt động của NPV tập hợp lại trong vỏ bọc protein thành thể vùi, thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại trong đất, trên tàn dư cây trồng. Một sâu non chết bệnh NPV có thể chứa tới 24.553 thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và có thể tồn tại từ 20-30 năm. Trong quá trình canh tác cây trồng, làm đất hoặc do mưa gió, các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tục chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000) [15]. Như vậy, việc phun chế phẩm NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinh học để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa có tác dụng bổ sung nguồn virus hữu ích, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái trên đồng ruộng. Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các tế bào sống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, như vậy việc phát triển 5
sinh khối NPV phải được thực hiện trên cơ thể sâu còn sống như phương pháp nuôi sâu truyền thống hoặc lây nhiễm trên các mô, tế bào được nuôi nhân (Kalmakoff và Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007, Rohrmann và George, 2011) [6, 11, 9, 16]. Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu để có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện phát triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân trên cơ sở sử dụng các chủng NPV có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khối NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại. 1.2. Tổng quan tài liệu 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng Các nhà khoa học trên thế giới đều xác định sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là loài sâu đa thực, phá hại trên trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau và được coi là đối tượng sâu hại quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và Singh, 2009; Hong, 2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al.,2000) [1, 2, 20]. Theo tổng hợp của Kuldeep et al. (2018) [17], sâu khoang phân bố rộng khắp ở khu vực Đông Nam châu Á, gây hại trên 63 loại cây thuộc 22 họ, là sâu hại nguy hiểm gây thiệt hại nặng trên các loại rau màu, đậu tương và bông, đay, v.v. Riêng tại Ấn độ, theo Alfred và Samiayyan (2017) [18] đã thống kê và xác định sâu khoang phá hại trên 140 loài cây thuộc 40 họ thực vật khác nhau, chủ yếu trên các cây trồng nông nghiệp. Sâu khoang có thời gian qua các giai đoạn phát dục khá dài, nhất là giai đoạn sâu non là thời gian sâu phá hại trên cây trồng, nên mức hại do sâu gây ra lớn. Nghiên cứu sự phát triển của sâu khoang trên cà chua, Nagamandla và Shantanu (2018) [19] xác định ở nhiệt độ 200C thời gian sâu non kéo dài tới 41,8 ± 3,56 ngày và thời gian hoàn thành vòng đời là 60,4 ± 3,13 ngày; ở nhiệt độ 250C, thời gian tương ứng là 25,8 ± 0,67 và 41,6 ± 1,08 ngày, nhưng ở nhiệt độ 300C thời gian phát dục của sâu khoang rút ngắn, còn 16,3 ± 0,83 và 30,1 ± 1,29 ngày (tương ứng). Kết quả nghiên cứu của Jadhav et al. (2015) chỉ rõ, khi sinh sống trên cây nho ở điều kiện nhiệt đới, vòng đời của sâu từ 52- 56 ngày, trong đó thời gian phát 6
dục của trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành sâu khoang là 5- 7 ngày; 20- 23 ngày; 4- 6 ngày và 9- 12 ngày (tương ứng), một trưởng thành cái đẻ trung bình 499,2 trứng/con cái. Tác giả cũng xác định tỷ lệ trứng nở của sâu khoang và khả năng sống sót của sâu non tuổi lớn khá cao, vì vậy tác hại do sâu khoang gây ra trên cây trồng thường rất lớn [20]. Theo nghiên cứu của Patil et al., (2014), sâu khoang có tiềm năng sinh sản rất cao, một trưởng thành cái có thể đẻ từ 500- 1.263 trứng và khi trứng nở với thời gian sống của sâu non tới 24,5- 28,2 ngày thì mức gây hại của chúng là rất lớn [21]. Nghiên cứu của Alfred và Samiayyan (2017) chỉ rõ sức ăn của sâu khoang trên cây đậu triều ở mức cao nhất với chỉ số tiêu thụ thức ăn tới 3,889 trên đậu đỗ, trong khi với các cây trồng khác ở mức từ 2,825- 3,343 [22]. Theo Liu et al. (1995) xác định điều kiện thích hợp cho sâu khoang phát triển số lượng là 28- 300C và độ ẩm không khí từ 85- 95% [23]. Kết quả nghiên cứu của Muniappan và Marutani (1992) xác định số lượng quần thể sâu khoang phát triển mạnh ở nhiệt độ không khí 29- 300C và độ ẩm trên 90%. Các tác giả chỉ rõ sâu khoang phát triển nhanh với mật độ cao trên bắp cải (185,7 con/10 cây), cải dưa và cải cuốn (169,0 con/10 cây) [24]. Trứng Sâu non Trưởng thành Nhộng Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang 7
Kết quả nghiên cứu Jat et al. (2017) [25] và Srivastava et al. (2018) [26] xác định NPV là tác nhân vi sinh vật gây chết sâu khoang rất phổ biến, được coi là nhân tố quan trọng và có hiệu quả cao trong điều hoà số lượng quần thể sâu hại trên đồng ruộng. Hiện nay, các nhà bảo vệ thực vật rất quan tâm đến việc phát triển, ứng dụng các chế phẩm NPV trong hệ thống quản lý tổng hợp (IPM) sâu hại nói chung và sâu khoang nói riêng. Tại Quảng Đông (Trung Quốc), Liu et al., (1995) xác định yếu tố hạn chế đáng kể sự phát triển số lượng quần thể sâu khoang ngoài đồng ruộng là các tác nhân ký sinh trên sâu non, đặc biệt NPV có thể làm sâu chết từ 7,2- 30,5%. Mặt khác, do sâu hoá nhộng trong đất nên khi mưa kéo dài làm đất ngập nước thì nhộng có thể chết tới 100% [23]. 1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại Theo Evans (1986), Summer và Smith (1987), Rohman và George (2011) chỉ rõ vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae, lớp Virus, bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus- NPV) và vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) [27, 28]. NPV là tác nhân gây chết cao đối với các loài côn trùng thuộc các Bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Neuroptera, Coleoptera, Trichoptera và nhện. Theo Arayya et al. (2013) NPV phát sinh và tồn tại phổ biến trong tự nhiên, rất chuyên tính với ký chủ, không lây nhiễm trên động vật máu nóng, an toàn với thiên địch và môi trường [29]. Hình 1.2. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D) (Nguồn: Rohrmann và George, 2011) 8
Theo Arayya et al. (2013), NPV có dạng hình gậy, có kích thước 40- 70 x 250 - 400nm bao gồm lớp vỏ lipoprotein bao quanh nhân (capsid) chứa thể DNA- protein (core) và được gọi là nucleo- capsid. NPV tồn tại dưới dạng các hạt tinh thể sáng, góc cạnh gọi là thể vùi (OB) hay còn gọi là polyhedra hoặc thể nhân đa diện (PIB). Khi quan sát dưới kính hiển vi phản pha, thể vùi có kích thước 1-7µm. Tinh thể này có nhiều cạnh và tạo thành 1 protein có khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa. Các hạt virus có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsit (virion) và NPV có một đặc tính hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào vật chủ với kích thước 0,5 - 15 nm [13]. Theo Hong et al. (2002), Rohrmann và George (2011) [2, 5], cấu tạo của NPV gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ capsid và lõi axit nucleic. - Vỏ ngoài: là một lớp màng lipoprotein ngoài cùng còn gọi là protein ngoài. Protein ngoài mang tính kháng nguyên và có tác dụng kích thích vào hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ. - Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp dịch. Protein tạo nên vỏ capsid được gọi là protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên, có tác dụng làm tăng khả năng gây bệnh của virus. - Genom: Genom của NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch xoắn kép. Khi nhiễm vào tế bào vật chủ virus đưa lõi ADN vào tế bào vật chủ, ADN của virus sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của ADN. Mặt khác, khi tế bào bị nhiễm virus, ADN của virus sinh ra men Azenaza ức chế ADN của tế bào vật chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN thì NPV tạo thành thể virus mới. Theo Lynn (2002), vỏ của polyhedrin (thể vùi) được bao bọc là protein. Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm. Do đó trong dịch ruột giữa của sâu khoang với pH là 9-10 các thể đa diện bị phá vỡ, giải phóng các hạt virus tự do (virion). Các hạt virus xâm nhập vào tế bào máu đến tế bào da, tế bào biểu mô khí quản và tế bào mỡ để gây bệnh [30]. 9