Luận án tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu công nghệ thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở Việt Nam, ứng dụng trong thực phẩm

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:143

Thêm vào BST

Báo xấu

72
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm đề xuất được quy trình công nghệ tối ưu về chiết xuất và sấy phun dịch chiết từ hai loài nấm thượng hoàng; xây dựng một số quy trình sản xuất một số sản phẩm thực phẩm có bổ sung nấm thượng hoàng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu công nghệ thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở Việt Nam, ứng dụng trong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN TÂN THÀNH NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ THU NHẬN MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ HAI LOÀI NẤM THƯỢNG HOÀNG (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) Ở VIỆT NAM, ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN TÂN THÀNH NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ THU NHẬN MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ HAI LOÀI NẤM THƯỢNG HOÀNG (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) Ở VIỆT NAM, ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM Ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 9540101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. TÔN THẤT MINH 2. GS.TS. TRẦN ĐÌNH THẮNG Hà Nội 2018
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án này là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Tân Thành
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy giáo hướng dẫn khoa học là PGS. TS Tôn Thất Minh và GS.TS. Trần Đình Thắng đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô giáo Bộ môn Quá trình và thiết bị trong CNSH-CNTP, Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm-Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cũng như bạn bè, đồng nghiệp tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ Hóa Sinh và Môi trường, Trường Đại học Vinh đã hết sức giúp đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cám ơn PGS.TS Ngô Anh, Đại học Khoa học Huế đã giúp tôi định danh các mẫu nấm. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn GS.TS Tian-Shung Wu và GS.TS Ping- Chung Kuo, Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan đã giúp tôi đánh giá kết quả. Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, em trong phòng Đào tạo Sau đại học của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và giúp đỡ trong công việc tại phòng để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm thực hành thí nghiệm, Trường đại học Vinh, các NCS, Học viên cao học ngành Hóa hữu cơ, các em sinh viên khóa 51, 52, 53 ngành Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những người bạn đã động viên và khích lệ cho tôi có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấu thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Tân Thành
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT............................................................. vii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................................. ix DANH MỤC HÌNH .................................................................................................................. xi DANH MỤC SƠ ĐỒ ............................................................................................................... xiii MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của luận án ....................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ............................................................................. 2 5. Những điểm mới của luận án.................................................................................................. 3 6. Cấu trúc của luận án ............................................................................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................................................... 4 1.1. NẤM THƯỢNG HOÀNG .................................................................................................. 4 1.1.1. Vị trí nấm thượng hoàng trong phân loại nấm học ........................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái quả thể của nấm thượng hoàng ......................................................... 5 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG ........................................... 5 1.2.1. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng ................................................ 5 1.2.2. Các nhóm chất trao đổi bậc 2 trong nấm thượng hoàng ................................................... 7 1.2.2.1. Polysaccharide và protein-polysaccharide..................................................................... 7 1.2.2.2. Steroid............................................................................................................................ 9 1.2.2.3. Terpenoid ..................................................................................................................... 11 1.2.2.4. Flavone, pyranone and furan ....................................................................................... 16 1.2.2.5. Styrylpyrone ................................................................................................................ 18 1.2.2.6. Polychlorinate .............................................................................................................. 21 1.2.2.7. Một số hợp chất khác................................................................................................... 22 1.2.3. Hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) ............................................. 22 1.2.3.1. Hoạt tính chống ung thư .............................................................................................. 23 1.2.3.2. Hoạt tính chống oxi hóa............................................................................................... 23 1.2.3.3. Hoạt tính miễn dịch ..................................................................................................... 24 1.3. CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT CÁC HOẠT CHẤT TRONG NẤM DƯỢC LIỆU .......... 24 1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng quá trình tách chiết các hoạt chất từ nấm dược liệu ................... 24 1.3.2. Các phương pháp tách chiết phenolic, flavonoid trong nấm dược liệu .......................... 26
iv 1.3.2.1. Phương pháp chiết tách bằng cồn. ............................................................................... 27 1.3.2.2. Phương pháp chiết tách bằng nước. ............................................................................. 28 1.3.2.3. Phương pháp chiết tách bằng methanol ....................................................................... 29 1.4. CÔNG NGHỆ SẤY NGUYÊN LIỆU VÀ DỊCH CHIẾT TỪ NẤM DƯỢC LIỆU ......... 29 1.4.1. Các phương pháp sấy...................................................................................................... 29 1.4.1.1. Phương pháp sấy nóng ..................................................................................... 29 1.4.1.2. Phương pháp sấy lạnh....................................................................................... 29 1.4.2. Một số phương pháp để sấy nguyên liệu và dịch chiết từ nấm dược liệu ...................... 30 1.5. ỨNG DỤNG CỦA NẤM DƯỢC LIỆU TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG....................................................................................................................................... 31 1.5.1. Thực phẩm chức năng .................................................................................................... 31 1.5.2. Thực phẩm chức năng từ nấm dược liệu ........................................................................ 32 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 34 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ....................................................................................................... 34 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 34 2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................................... 35 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ....................................................................................... 35 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 36 2.2.1. Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học ........................ 36 2.2.1.1. Xác định hàm lượng cellulose trong nguyên liệu ........................................................ 36 2.2.1.2. Phương pháp xác định acid amin trong nấm ............................................................... 36 2.2.1.3. Phương pháp xác định các vitamin trong nấm thượng hoàng ..................................... 38 2.2.1.4. Xác định hàm lượng khoáng và kim loại trong nguyên liệu bằng phương pháp AAS 42 2.2.1.5. Xác định tổng hàm lượng phenolic ............................................................................. 43 2.2.1.6. Xác định tổng hàm lượng flavonoid ............................................................................ 45 2.2.1.7. Xác định thành phần hóa học của nấm bằng phương pháp LC/MS ............................ 45 2.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập các hợp chất ............................................................. 46 2.2.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ......................................................................... 46 2.2.2.2. Sắc ký cột (CC) ........................................................................................................... 46 2.2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High Perfomance Liquid Chromatography) ........ 46 2.2.3.4. Phân lập các hợp chất .................................................................................................. 46 2.2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất .................................................................. 48 2.2.3.1. Phổ tử ngoại (UV) ....................................................................................................... 48 2.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ........................................................................... 48 2.2.3.4. Dữ kiện vật lý của các hợp chất................................................................................... 48 2.2.4. Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học ................................................................ 49 2.2.4.1. Xác định hoạt tính chống oxy hóa ............................................................................... 49 2.2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư ........................................ 49 2.2.5. Quy hoạch thực nghiệm .................................................................................................. 50
v 2.2.6. Phương pháp tiến hành quá trình chiết xuất dịch nấm thượng hoàng ............................ 51 2.2.7. Phương pháp tiến hành quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng hoàng ................ 51 2.2.6. Đánh giá cảm quan cho theo phương pháp cho điểm thị hiếu........................................ 52 2.2.7. Phương pháp thống kê xử lý số liệu ............................................................................... 52 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................ 53 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG .................................................................................... 53 3.1.1. Hàm lượng cellulose trong nguyên liệu.......................................................................... 53 3.1.2. Hàm lượng acid amin ..................................................................................................... 53 3.1.3. Hàm lượng các loại vitamin trong nấm thượng hoàng ................................................... 55 3.1.3.1. Hàm lượng vitamin E .................................................................................................. 55 3.1.3.2. Hàm lượng vitamin D2 ................................................................................................ 55 3.1.3.3. Hàm lượng vitamin B3 ................................................................................................ 56 3.1.4. Hàm lượng khoáng và kim loại trong nấm thượng hoàng .............................................. 57 3.1.5. Hàm lượng tổng phenolic và flavonoid .......................................................................... 58 3.1.6. Thành phần hóa học trong nấm thượng hoàng (P. igniarius)......................................... 59 3.2. PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CHẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT NẤM THƯỢNG HOÀNG .................................. 60 3.2.1. Chiết các phân đoạn........................................................................................................ 60 3.2.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất ................................................................................ 61 3.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH CỦA CAO CHIẾT VÀ HỢP CHẤT SẠCH................... 84 3.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ P. iganirius .............................. 84 3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) ............................................................................................................................ 85 3.3.3. Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết từ nấm thượng hoàng ........................................ 86 3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TRÍCH LY DỊCH CHIẾT TỪ NẤM THƯỢNG HOÀNG.. 86 3.4.1. Khảo sát các phương pháp chiết ..................................................................................... 87 3.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dịch nấm thượng hoàng (P. igniarius) .................................................................................................................................. 88 3.4.2.1. Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ........................................................................... 88 3.4.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất ........................................................................................ 89 3.4.2.3. Khảo sát thời gian chiết xuất ....................................................................................... 91 3.4.2.4. Khảo sát nồng độ dung môi ......................................................................................... 92 3.4.3. Tối ưu hóa quá trình tách chiết một số hợp chất trong nấm thượng hoàng . .................. 93 3.4.3.1. Thiết lập mô hình......................................................................................................... 93 3.4.3.2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất nấm thượng hoàng (P. igniarius) .............................. 97 3.4.3.3. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa ................................................................................... 98 3.4.4. Tối ưu hóa quy trình tách chiết một số hợp chất trong nấm thượng hoàng (P. nilgheriensis). ........................................................................................................................... 98
vi 3.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẤY PHUN DỊCH CHIẾT DỊCH CHIẾT TỪ NẤM THƯỢNG HOÀNG.................................................................................................................. 99 3.5.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy dịch nấm thượng hoàng ................... 99 3.5.1.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung maltodextrin ................................................................. 99 3.5.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy ...................................................................................... 100 3.5.1.3. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch. .............................................................................. 101 3.5.2. Tối ưu hóa quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng hoàng (P. gniarius)............. 102 3.5.2.1. Thiết lập mô hình....................................................................................................... 102 3.5.2.2. Tối ưu hoá quá trình sấy phun ................................................................................... 104 3.5.2.3. Kiểm tra lại mô hình .................................................................................................. 105 3.6. ỨNG DỤNG NẤM THƯỢNG HOÀNG (P. IGNIARIUS) TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM..................................................................................................................................... 107 3.6.1. Quy trình sản xuất bánh quy ......................................................................................... 107 3.6.2. Quy trình sản xuất cà phê hòa tan ................................................................................ 109 3.6.3. Quy trình sản xuất Trà nấm thượng hoàng ................................................................... 111 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN .................................. 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 116 TIẾNG VIỆT .......................................................................................................................... 116 TIẾNG ANH .......................................................................................................................... 117 PHỤ LỤC
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt 13 Carbon-13 Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR Spectroscopy carbon-13 1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy proton AAS Atomic Absorption Spectrophotometric Phổ hấp thụ nguyên tử AES Atomic emission spectrocopy Quang phổ phát xạ nguyên tử CC Column Chromatography Sắc kí cột CTPT Molecular formula Công thức phân tử Đ.n.c. Melting point Điểm nóng chảy Distortionless Enhancement by Phổ DEPT DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethyl Sulfoxide Dimethyl Sulfoxit DW Dry weight Khối lượng khô EI-MS Electron Impact-Mass Spectroscopy Phổ khối va chạm electron Electron Spray Ionzation-Mass Phổ khối lượng phun mù electron ESI-MS Spectroscopy FBS Fetal bovine serum Huyết thanh phôi bò FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh GAE Gallic acid equivalent Acid glilic tương đương HepG2 Human hepatocyte carcinoma cell line Dòng tế bào ung thư gan Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở HIV Human Immuno-deficiency Virus người Phổ tương tác dị hạt nhân qua HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation nhiều liên kết H→C HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Relution-Electron Spray Impact Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS Mass Spectroscopy phun mù electron Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation H→C Nồng độ ức chế 50% đối tượng IC50 Inhibitory concentration at 50% thử nghiệm IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại
viii J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz KLPT Molecular weight Khối lượng phân tử MeOH Methanol metanol MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng PBMCs Peripheral blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu ngoại vi ppm parts per million Phần triệu RT retention time Thời gian lưu SC Scavenging capacity Khả năng trung hòa các gốc tự do TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TLTK Reference Tài liệu tham khảo TMS Tetramethylsilan Tetramethylsilan Độ chuyển dịch hóa học của δC Carbon chemical shift carbon Độ chuyển dịch hóa học của δ*C Carbon chemical shift carbon theo tài liệu tham khảo Độ chuyển dịch hóa học của δH Proton chemical shift proton Độ chuyển dịch hóa học của δ*H Proton chemical shift proton theo tài liệu tham khảo
ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm thượng hoàng P. igniarius và P. linteus . 6 Bảng 1.2. Thành phần và hàm lượng acid amin trong quả thể nấm thượng hoàng .................. 6 Bảng 1.3. Thành phần khoáng và kim loại trong quả thể nấm thượng hoàng P. linteus........... 7 Bảng 1.4. Các hợp chất styrylpyrone từ các loài Phellinus và hoạt tính sinh học .................. 18 Bảng 1.5. Phân loại các hợp chất phenolic dựa trên số lượng nguyên tử cacbon ................. 26 Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu phân tích hàm lượng acid amin ................................................... 38 Bảng 2.2. Ký hiệu các mẫu mang đi phân tích hàm lượng vitamin B3 .................................... 41 Bảng 2.3. Chương trình vô cơ hóa mẫu trong lò vi sóng. ....................................................... 43 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ................................................................................... 50 Bảng 3.1. Hàm lượng cellulose trong nấm thượng hoàng ....................................................... 53 Bảng 3.2. Hàm lượng acid amin trong nấm thượng hoàng ..................................................... 53 Bảng 3.3. Hàm lượng acid amin trong mẫu nấm P. igniarius theo các phương pháp sấy khác nhau .......................................................................................................................................... 54 Bảng 3.4. Hàm lượng vitamin E trong nấm thượng hoàng ..................................................... 55 Bảng 3.5. Hàm lượng vitamin D2 trong nguyên liệu nấm thượng hoàng ................................ 56 Bảng 3.6. Hàm lượng vitamin D2 trong bột nấm thượng hoàng sau khi sấy đông khô........... 56 Bảng 3.7. Hàm lượng vitamin B3 trong nấm thượng hoàng .................................................... 56 Bảng 3.8. Hàm lượng viatamin B3 trong nấm thượng hoàng sau khi chiết với các nồng độ ethanol khác nhau ..................................................................................................................... 57 Bảng 3.9. Hàm lượng một số kim loại trong nấm thượng hoàng ............................................ 57 Bảng 3.10. Hàm lượng tổng phenolic và flavonoid trong nấm thượng hoàng ........................ 58 Bảng 3.11. Nhận dạng các hợp chất polyphenol từ dịch chiết nấm P. igniarius..................... 59 Bảng 3.12. Các hợp chất phân lập từ nấm thượng hoàng (P. igniarius)................................. 61 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PIE-1 (400 MHz, DMSO-d6) .......... 62 Bảng 3.14. Quy gán giá trị phổ NMR của hợp chất PIE-2 và PIE-3....................................... 73 Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất PIE-4 .................................................................... 75 Bảng 3.16. Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất PIE-5 .......................................................... 77 Bảng 3.17. Số liệu phổ1H-NMR và 13C- NMR của hợp chất Inoscavin A ................................ 79 Bảng 3.18. Số liệu phổ 13C- NMR của hợp chất Daidzin ......................................................... 81 Bảng 3.19. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C- NMR của hợp chất Pterocarpin............................... 82 Bảng 3.20. Kế t quả phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của hợp chấ t 5-hydroxy-7- methoxyflavone ......................................................................................................................... 83 Bảng 3.21. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dòng ung thư của hợp chất phân lập từ loài P. iganirius ........................................................................................................................ 85 Bảng 3.22. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ nấm thượng hoàng ....................... 85 Bảng 3.23. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dòng ung thư của dịch chiết từ nấm thượng hoàng ........................................................................................................................................ 86
x Bảng 3.24. Kết quả khảo sát các phương pháp tách chiết ảnh hưởng đến hàm lượng tổng Phenolic và hàm lượng chất khô thu nhận từ 2 loài nấm thượng hoàng. ................................ 87 Bảng 3.25. Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tách chiết ........................................ 89 Bảng 3.26. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất .................................................................................. 90 Bảng 3.27. Khảo sát thời gian chiết xuất ................................................................................. 91 Bảng 3.28. Khảo sát nồng độ dung môi ................................................................................... 92 Bảng 3.29. Mức ảnh hưởng của các yếu tố .............................................................................. 94 Bảng 3.30. Kết quả thí nghiệm tối ưu quy trình tách chiết các hợp chất từ loài P. igniarius . 94 Bảng 3.31. Bảng phân tích hồi quy của 3 hàm mục tiêu: Hàm lượng tổng phenolic (Y1), hàm lượng tổng flavonoid (Y2) và hiệu suất chất chiết thu nhận(Y3) ............................................... 95 Bảng 3.32. Điều kiện và hệ số quan trọng của các hàm mục tiêu ........................................... 97 Bảng 3.33. Kết quả chiết xuất hàm lượng tổng phenolic, hàm lượng tổng flavonoid và lượng chất chiết thu nhận theo điều kiện tối ưu (P. igniarius) ........................................................... 98 Bảng 3.34. Kết quả chiết xuất hàm lượng tổng phenolic, hàm lượng tổng flavonoid và lượng chất chiết thu nhận theo điều kiện tối ưu (P. nilgheriensis) ..................................................... 98 Bảng 3.35. Mã hóa của các biến độc lập ............................................................................... 102 Bảng 3.36. Thiết kế thí nghiệm và kết quả ............................................................................. 102 Bảng 3.37. Kết quả phân tích hồi quy hàm lượng tổng phenolic và độ ẩm sản phẩm........... 103 Bảng 3.38. Điều kiện và hệ số quan trọng của các hàm mục tiêu ......................................... 105 Bảng 3.39. Kết quả sấy phun dịch chiết nấm thượng hoàng theo điều kiện tối ưu................ 105 Bảng 3.40. Công thức sản xuất bánh quy bổ sung nấm thượng hoàng ................................. 108 Bảng 3.41. Công thức sản xuất cà phê hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng......................... 110 Bảng 3.42. Công thức sản xuất trà hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng .............................. 111
xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Quả thể nấm thượng hoàng (P. igniarius) ................................................................. 5 Hình 2.1. Nấm thượng hoàng Phellinus igniarius .................................................................. 34 Hình 2.2. Nấm thượng hoàng Phellinus nilgheriensis ............................................................. 34 Hình 2.3. Khảo sát bước sóng của chất chuẩn vitamin E........................................................ 38 Hình 2.4. Đồ thị đường chuẩn vitamin E ................................................................................. 39 Hình 2.5. Đồ thị đường chuẩn vitamin D2 .............................................................................. 40 Hình 2.6. Đồ thị đường chuẩn vitamin B3 ............................................................................... 42 Hình 2.7. Đồ thị đường chuẩn acid gallic ............................................................................... 44 Hình 2.8. Đồ thị đường chuẩn flavonoid ................................................................................. 45 Hình 3.1. Sắc ký đồ LC-MS của dịch chiết ethanol nấm P. igniarius ở Việt Nam .................. 59 Hình 3.2. Các hợp chất polyphenol từ dịch chiết P. igniarius ................................................ 60 Hình 3.3. Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 .............................................................................. 62 Hình 3.4. Phổ khối lượng (HR-ESI-MS) của hợp chất PIE-1 .................................................. 63 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất PIE-1 ............................................................................ 64 Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất PIE-1 ............................................................................ 64 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất PIE-1 ............................................................................ 65 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 ..................................................... 65 Hình 3.9. Phổ 13C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 ..................................................... 66 Hình 3.10. Phổ 13C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 ................................................... 66 Hình 3.11. Phổ 13C-NMR và DEPT135 của hợp chất PIE-1 ................................................... 67 Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 (igniarine) .......................................................... 67 Hình 3.13. Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 (igniarine) .......................................................... 68 Hình 3.14. Phổ HMBC của hợp chất PIE-1 (igniarine) .......................................................... 68 Hình 3.15. Phổ HSQC của hợp chất PIE-1 (igniarine) ........................................................... 69 Hình 3.16. Phổ HSQC của hợp chất PIE-1 (igniarine) ........................................................... 69 Hình 3.17. Phổ HSQC của hợp chất PIE-1 (igniarine) ........................................................... 70 Hình 3.18. Phổ NOESY của hợp chất PIE-1 (igniarine) ......................................................... 70 Hình 3.19. Phổ NOESY của hợp chất PIE-1 (igniarine) ......................................................... 71 Hình 3.20. Phổ COSY của hợp chất PIE-1 (igniarine)............................................................ 71 Hình 3.21. Phổ COSY của hợp chất PIE-1 (igniarine)............................................................ 72 Hình 3.22. Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất đến hàm lượng phenolic và hàm lượng chất chiết thu nhận ................................................................................................................... 88 Hình 3.23. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng tổng phenolic............ 89 Hình 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng hàm lượng phenolic, flavonoid và lượng chất chiết thu nhận ........................................................................................................................... 90 Hình 3.25. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tổng phenolic, flavonoid và lượng chất chiết thu nhận ................................................................................................................... 92
xii Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng tổng phenolic, flavonoid và lượng chất chiết thu nhận ......................................................................................................... 93 Hình 3.27. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tổng phenolic, hàm lượng tổng flavonoid và hiệu suất chất chiết thu nhận ............................................................................... 96 Hình 3.28. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng tổng phenolic, tổng flavonoid và hàm lượng chất chiết thu nhận ........................................................................................................................... 96 Hình 3.29. Mức độ đáp ứng sự mong đợi của quá trình chiết xuất dịch nấm thượng hoàng (P. igniarius) .................................................................................................................................. 97 Hình 3.30. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung maltodextrin đến hàm lượng tổng phenolic và độ ẩm sản phẩm ................................................................................................................................. 100 Hình 3.31. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng tổng phenolic và độ ẩm sản phẩm ....... 100 Hình 3.32. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến hàm lượng tổng phenolic và độ ẩm........... 101 Hình 3.33. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng tổng phenolic (A) và độ ẩm sản phẩm (B) của quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm Thượng hoàng (P. igniarius) ............................................. 104 Hình 3.34. Ảnh hưởng đơn yếu tố đến hàm lượng tổng phenolic và độ ẩm sản phẩm .......... 104 Hình 3.35. Mức độ đáp ứng sự mong đợi của quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng hoàng (P. igniarius)................................................................................................................ 105 Hình 3.36. Kết quả đánh giá thị hiếu sản phẩm bánh quy bổ sung bột nấm thượng hoàng . 107 Hình 3.37. Sản phẩm bánh quy bổ sung bột nấm thượng hoàng ........................................... 109 Hình 3.38. Kết quả đánh giá thị hiếu sản phẩm cà phê hòa tan bổ sung bột nấm thượng hoàng ...................................................................................................................................... 109 Hình 3.39. Sản phẩm cà phê hòa tan bổ sung nấm Thượng hoàng ....................................... 110 Hình 3.40. Kết quả đánh giá thị hiếu sản phẩm trà hòa tan bổ sung bột nấm thượng hoàng111 Hình 3.41. Sản phẩm trà hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng .............................................. 112
xiii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình chuẩn bị chạy sắc ký HPLC............................................................... 37 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm P. igniarius.............................................. 47 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất bột nấm thượng hoàng ............................................. 106 Sơ đồ 3.2. Quy trình sản xuất bánh quy bổ sung nấm thượng hoàng ............................... 106 Sơ đồ 3.3. Quy trình sản xuất cà phê sữa hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................................................... 110 Sơ đồ 3.4. Quy trình sản xuất trà hòa tan bổ sung bột nấm thượng hoàng quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................................................... 112
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Nấm Thượng hoàng (hay còn gọi là nấm Hoàng sơn) tên chỉ các loài trong chi Phellinus, thuộc họ Hymenochaetaceae (ở Trung Quốc gọi là Songgen, Hàn Quốc gọi là Sang Hwang, Nhật Bản gọi là Meshima). Đây là một loại nấm quý trong tự nhiên đã được người Nhật Bản, Hàn Quốc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị, tăng cường khả năng của hệ thống miễn dịch, giúp giảm lượng cholesterol và đường trong máu ...Trong nấm thượng hoàng có chứa nhiều thành phần hóa học như acid amin, vitamin, khoáng, carbonhydrat và một số hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharid, protein-polysaccharide, steroid, terpenoid, flavone, styrylpyrone, furane và polychlorinat...[81]. Các loại nấm này cũng hiệu quả đối với nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa và điều trị bệnh tim, tăng khả năng giải độc và bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng và tiểu đường, giảm căng thẳng. Nấm có chức năng chống ung thư mạnh và ngăn ngừa sự phát triển của khối u. Năm 1976, nhóm nghiên cứu của TS Chihara tại Trung tâm nghiên cứu ung thư Nhật Bản kiểm tra và so sánh tỷ lệ kháng ung thư trên chuột của dịch chiết nước nóng 27 loại nấm thuốc thì nấm Phellinus linteus đã được xếp hạng số 1 với một tỷ lệ ức chế tế bào u báng (Sarcoma 180) ở chuột là 96,7%. Phellinus igniarius được xếp thứ 3 với tỷ lệ là 87,4%.[28] Ngày nay, ngày càng nhiều các nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm nhằm phát hiện các hoạt chất có dược tính mạnh đối với các căn bệnh nan y như viêm gan, kháng viêm ung thư, HIV, tăng hệ miễn dịch, chống oxy hóa… Việc đưa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm được tách chiết từ nấm sẽ giúp con người khỏe mạnh, phòng chống được nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm [4], [9], [10]. Hiện nay, tổng sản lượng của các loài phellinus trên thế giới chỉ khoảng 30 tấn/năm, chủ yếu từ thu hái hoang dại. Trên thế giới cũng chỉ có 4 nước trồng loài nấm này là Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan. Ở Việt Nam, Trung tâm linh chi và nấm dược liệu TPHCM đã bước đầu nghiên cứu và nuôi trồng thành công loài nấm thượng hoàng P. linteus trong bịch mạt cưa gỗ cao su, năng suất khoảng 140 kg/năm, sản phẩm nấm sau khi thu hoạch được bảo quản bằng cách sấy khô để đưa bán ra thị trường trong nước và xuất khẩu thô ra nước ngoài. Việc khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học, các thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng bằng các công nghệ chế biến hiện đại, tạo ra được các sản phẩm giàu hoạt chất để ứng dụng sản xuất các loại thực phẩm chức năng có khả năng hỗ trợ, nâng cao sức khỏa là hướng đi đúng và cần thiết. Xuất phát từ thực tế nghiên cứu và sự cấp thiết trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu công nghệ thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở Việt Nam, ứng dụng trong thực phẩm”.
2 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng được cơ sở dữ liệu về thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học của hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở khu vực Bắc trung bộ, Việt Nam. - Đề xuất được quy trình công nghệ tối ưu về chiết xuất và sấy phun dịch chiết từ hai loài nấm thượng hoàng; xây dựng một số quy trình sản xuất một số sản phẩm thực phẩm có bổ sung nấm thượng hoàng. 3. Nội dung nghiên cứu - Thu mẫu và xác định tên khoa học của 2 loài nấm thượng hoàng ở Việt Nam (P. igniarius và P. nilgheriensis) - Nghiên cứu thành phần hóa học (các vitamin, acid amin, các kim loại, hàm lượng tổng phenolic, flavonoid) từ nấm thượng hoàng thu hái từ tự nhiên. - Phân lập, xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học các hợp chất thu được từ nấm thượng hoàng (P. igniarius) ở Việt Nam - Xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất và sấy phun dịch nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) - Nghiên cứu ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bổ sung nấm thượng hoàng. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học trong hai loài nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) là đóng góp khoa học có độ tin cậy cao, góp phần làm phong phú thêm về cơ sở dữ liệu về chất lượng nguyên liệu, thành phần hóa học của các loài nấm lớn ở Việt Nam - Đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất trong nấm thượng hoàng (P. igniarius) trong đó đã tìm ra một chất mới thuộc nhóm chất triterpenoid. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7, Lu và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết và hợp chất sạch, kết quả cho thấy các hợp chất sạch có khả năng kháng các dùng tế bào ung thư trên. - Đã đề xuất được công nghệ (chiết xuất và sấy phun) thu nhận một số hợp chất từ hai loài nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) ở Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn: - Các kết quả nghiên cứu của đề tài về công nghệ thu nhận một số hợp chất sinh học từ nấm thượng hoàng sẽ tạo nên các sản phẩm có giá trị kinh tế cao, có tác dụng chống oxy hóa, có khả năng ngăn chặn và chữa bệnh. Đây là việc làm cần thiết, phù hợp với xu thế của thời đại, đóng góp cho sự phát triển của kinh tế - xã hội và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. - Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị; là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này.
3 5. Những điểm mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần dinh dưỡng (acid amin; vitamin E, D2, B3; kim loại…) từ hai loài nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) thu hái ở Việt Nam. - Đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất trong nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius) là: igniarine (PIE-1), meshimakobnol B (PIE-3), inoscavin A (PIE- 6), daidzin (PIE-7), ergosterol (PIE-4), pterocarpin (PIE-8), ergosterol peroxit (PIE-5), meshimakobnol A (PIE-2) và 5-hydroxy-7-methoxyflavone (PIE-9). Trong đó hợp chất igniarine (PIE-1) là hợp chất mới. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7, Lu và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết và hợp chất sạch. - Tối ưu hóa quy trình công nghệ chiết xuất và sấy phun dịch nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis). Đề xuất quy trình chế biến một số sản phẩm thực phẩm bổ sung nấm thượng hoàng như: bánh quy, trà nấm và cà phê hòa tan có tính chất cảm quan hấp dẫn người dùng. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 127 trang với 51 bảng số liệu, 50 hình và 06 sơ đồ với 155 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (03 trang), tổng quan (30 trang), nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (19 trang), kết quả và thảo luận (60 trang), kết luận và đề xuất nghiên cứu tiếp tục (02 trang), danh mục công trình công bố (01 trang), tài liệu tham khảo (12 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục.
4 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. NẤM THƯỢNG HOÀNG Chi Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và Đông Á (đặc biệt là Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc), ở Việt Nam có khoảng 26 loài. Chúng được sử dụng để phòng và chữa rối loạn chức năng tiêu hóa, tiêu chảy, xuất huyết, dị ứng, bệnh tiểu đường và ung thư [155]. Trong các nghiên cứu nhằm sử dụng nấm Phellinus vào phương pháp điều trị trong Tây y, nhiều nhà nghiên cứu đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ quả thể (hoặc sợi nấm) của nấm Phellinus ở in vitro và in vivo [155]. Nhiều báo cáo khoa học đã tập trung vào hoạt tính sinh học của các loài nấm này [114], [115], [133] trong khi các phân đoạn và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học, chức năng chống ung thư, và các cơ chế dược lý của P. linteus đã được báo cáo tổng kết năm 2008 [155]. Đây là tổng quan đầy đủ các tài liệu tham khảo từ năm 1999 đến tháng 6 năm 2011 về tinh chế các sản phẩm tự nhiên và khả năng ứng dụng chữa bệnh của loài P. linteus, đặc biệt là hợp chất có phân tử lượng nhỏ có hoạt tính sinh học, cũng như các tác dụng dược lý chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, chống oxy hóa, kháng viêm, chống tiểu đường và hoạt tính kháng khuẩn. Chi Phellinus có một số loài (P. linteus, P. ribis, P. igniarius) đã được dùng trong việc chữa bệnh ung thư, tiểu đường, nhiễm trùng do vi khuẩn và virus, và viêm loét [80], [81]. P. linteus được sử dụng như một thành phần bổ sung vào các loại thực phẩm ở khu vực Đông Á [155]. Các nghiên cứu về sự phân lập các hợp chất polysaccharide và protein- polysaccharide, steroid, terpenoid, flavone, styrylpyrone, furane và polychlorinat...[80], [81], [155]. Trong vài thập kỷ qua, một số lượng lớn các hợp chất hóa học đã được phân lập nấm Phellinus. Thành phần chính của chúng là các polysaccharide - thành phần chính gây ra hoạt động chống ung thư của nấm Phellinus. Ngoài ra còn có các thành phần khác như flavones, coumarins, ergosterols, acid agaricic, acid béo, triterpenes, acid aromatic, acid amin, oxidase xylose, urease, catalase, esterase, sucrase, men lactase cellulase ... [54], [112]. 1.1.1. Vị trí nấm thượng hoàng trong phân loại nấm học Theo tác giả Trịnh Tam Kiệt (2011) [15], nấm Thượng hoàng thuộc: Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomycetes Bộ: Hymenochaetales Họ: Hymenochaetaceae Chi: Phellinus
5 Theo thống kê thì có hơn 150 loài nấm thuộc chi Phellinus như: P. linteus, P. igniarius, P. nilghenriensis, P. baumii, P. pini, P. andinus, P. gilvus, P. nigricans, P. rhabarnarinus, P. ribis, P. rimosus, P. merrilii… 1.1.2. Đặc điểm hình thái quả thể của nấm thượng hoàng Quả thể của các loại nấm này thường có kích thước khoảng 7-10 x 11-15 x 5-8 cm, nhiều năm, không cuống, dạng quạt đến thon dài, gỗ cứng. Mặt trên có màu nâu hạt dẻ, có khi có lông mịn, mờ. Nấm thượng hoàng thường mọc ở những vùng rừng sâu núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm. Loài nấm này thường phát triển trên thân hoặc gốc cây dâu tằm. Hình 1.1. Quả thể nấm Phellinus igniarius (Nguồn http://www.amanitacesarea.com/phellinus-igniarius.html) Theo y học phương Đông, nấm thượng hoàng có khả năng điều hòa miễn dịch mạnh và tăng chức năng miễn dịch. Nấm cũng hiệu quả đối với nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa và điều trị bệnh tim, tăng khả năng giải độc và bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng và tiểu đường, giảm căng thẳng. Đặc biệt, nấm thượng hoàng có công dụng chống ung thư mạnh và ngăn ngừa sự phát triển của khối u [155]. Dịch chiết nước nóng của 27 loài nấm thì nấm thượng hoàng cho tỉ lệ ức chế các khối u là cao nhất 96,7% so với nấm mèo là 42,6%, nấm vân chi là 77,5%, nấm linh chi là 64,9% [28]. 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG 1.2.1. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm thượng hoàng Các nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng của nấm Thượng hoàng cho thấy đây là một loại nấm có giá trị dinh dưỡng và có nhiều hợp chất có chứa hoạt tính sinh học. Tuy