Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R. & G.forst. ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:264

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Dược học "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R. & G.forst. ở Việt Nam" trình bày xác định chính xác tên khoa học, mô tả đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam; Nghiên cứu thành phần hóa học các loài thu được; Đánh giá một số hoạt tính in vitro của cắn chiết các loài nghiên cứu và lựa chọn một loài có hoạt tính tốt để đánh giá tác dụng kháng viêm, hạ acid uric.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R. & G.forst. ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI Balanophora J.R.&G.FORST. Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI Balanophora J.R.&G.FORST. Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.72.04.06 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Viết Thân 2. TS. Nguyễn Quốc Bình HÀ NỘI, NĂM 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Viết Thân và TS. Nguyễn Quốc Bình. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào của các tác giả khác. Tác giả Nguyễn Thanh Tùng
Mục lục Trang ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Balanophora J.R.&G.Forst. ...................................................................................................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst..................................... 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst. ............................... 4 1.1.3. Các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. và phân bố ................. 5 1.1.4. Một số khóa phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst. ...................... 11 1.2. Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học chi Balanophora J.R.&G.Forst. .................................................................................................... 15 1.2.1. Các tanin thủy phân được..................................................................... 15 1.2.2. Các acid hydroxybenzoic và dẫn chất .................................................. 19 1.2.3. Các Phenylpropanoid đơn giản ............................................................ 20 1.2.4. Các hợp chất lignan.............................................................................. 24 1.2.5. Các coumarin........................................................................................ 27 1.2.6. Các flavonoid ........................................................................................ 28 1.2.7. Các terpenoid........................................................................................ 30 1.2.8. Các steroid ............................................................................................ 32 1.2.9. Các nhóm hợp chất khác ...................................................................... 33 1.3. Tổng quan về công dụng, tác dụng sinh học chi Balanophora J.R.&G.Forst. ........................................................................................................................... 33 1.3.1. Công dụng của các loài thuộc chi Balanophora .................................. 33 1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học chi Balanophora ......... 34 1.3.3. Nghiên cứu tại Việt Nam về tác dụng sinh học chi Balanophora ........ 40 1.4. Tổng quan về một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm thường dùng và một số mô hình liên quan ............................................................................. 42
1.4.1. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vitro ................... 42 1.4.2. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vivo .................... 43 1.4.2.1. Các mô hình gây viêm cấp và bán cấp .............................................. 44 1.4.2.2. Một số mô hình gây viêm mạn tính .................................................... 45 1.4.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase ............................................................................................................. 46 1.4.3.1. Một số mô hình in vitro...................................................................... 47 1.4.3.2. Một số mô hình in vivo ...................................................................... 47 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 48 2.1. Nguyên vật liệu ......................................................................................... 48 2.1.1. Mẫu nghiên cứu .................................................................................... 48 2.1.1.1. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về hóa học ............................. 48 2.1.1.2. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về tác dụng sinh học và độc tính ................................................................................................................... 49 2.1.2. Hóa chất, dung môi............................................................................... 50 2.1.3. Động vật thí nghiệm ............................................................................. 51 2.2. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 51 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 53 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu thực vật........................................................ 53 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học..................................... 54 2.3.2.1. Định tính các nhóm chất trong các loài nghiên cứu ......................... 54 2.3.2.2. Phân lập hợp chất từ các loài nghiên cứu......................................... 54 2.3.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất được phân lập ................. 55 2.3.2.4. Triển khai sắc ký lớp mỏng một số loài nghiên cứu .......................... 55 2.3.2.5. Phân tích thành phần hóa học sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ .................................................................................................................... 56
2.3.2.6. Phân tích thành phần triterpenoid trong phân đoạn n-hexan của các loài nghiên cứu sử dụng sắc ký khí kết nối khối phổ ....................................... 56 2.3.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần ................ 56 2.3.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng in vitro .................................. 58 2.3.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO ............................................................................................................ 59 2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase in vitro .................................................................................................................. 60 2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học in vivo ................................ 61 2.3.4.1. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonat ........................................................................ 61 2.3.4.2. Đánh giá tác dụng kháng viêm cấp trên mô hình gây phù bằng carrageenan ..................................................................................................... 63 2.3.4.3. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat ........................................... 65 2.3.4.4. Đánh giá độc tính cấp ....................................................................... 67 2.4. Xử lý số liệu .............................................................................................. 68 2.5. Địa điểm thực hiện .................................................................................... 69 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 70 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật ................................................................ 70 3.1.1. Kết quả nghiên cứu về hình thái thực vật và xác định tên khoa học các mẫu nghiên cứu ................................................................................................ 70 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BFI .................... 70 3.1.1.2. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BFG................... 72 3.1.1.3. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BS ...................... 74 3.1.1.4. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BT ...................... 76 3.1.2. Kết quả nghiên cứu về hình thái hạt phấn các loài nghiên cứu ........... 78 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học................................................................. 85
3.2.1. Định tính các nhóm chất ....................................................................... 85 3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ một số loài nghiên cứu ................... 87 3.2.2.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica) ..................................................................................... 87 3.2.2.2. Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Dó đất sần (Balanophora fungosa var. globosa) ............................................................... 93 3.2.2.3. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora tobiracola ......................................................................................................... 87 3.2.2.4. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora subcupularis ................................................................................................... 103 3.2.3. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ .................... 105 3.2.5. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký khí ghép nối khối phổ ................... 121 3.3. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học ............................................... 125 3.3.1. Kết quả sàng lọc một số tác dụng in vitro của cắn methanol các loài nghiên cứu ...................................................................................................... 125 3.3.1.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid của cắn methanol các loài nghiên cứu ........................................................................ 125 3.3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn methanol các loài nghiên cứu ........................................................................ 127 3.3.2. Kết quả đánh giá một số tác dụng trên in vivo cao chiết Dó đất ....... 129 3.3.2.1. Tác dụng hạ acid uric huyết thanh .................................................. 129 3.3.2.2. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan ................................................................................................... 130 3.3.2.3. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat ............................................................................ 131 3.3.3. Kết quả đánh giá độc tính cấp cao chiết Dó đất ................................ 132 3.3.3.1. Thử nghiệm thăm dò ........................................................................ 132 3.3.3.2. Thử nghiệm chính thức .................................................................... 133
Chương 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 135 4.1. Về kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật ............................................... 135 4.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học .................................... 135 4.1.2. Đặc điểm hiển vi ................................................................................. 138 4.2. Về kết quả nghiên cứu thành phần hóa học............................................ 139 4.2.1. Kết quả định tính sơ bộ ....................................................................... 139 4.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ...................................... 139 4.2.3. Sử dụng các phương pháp sắc ký trong nghiên cứu........................... 140 4.2.3.1. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................... 141 4.2.3.2. Sắc ký khí ......................................................................................... 142 4.2.3.3. Sắc ký lỏng kết nối khối phổ ............................................................ 145 4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng sinh học và độc tính cấp ......................... 147 4.3.1. Về tác dụng sinh học của cao chiết dược liệu .................................... 147 4.3.2. Về độc tính cấp ................................................................................... 148 4.3.3. Về tác dụng sinh học của một số hợp chất được xác định trong các loài nghiên cứu ...................................................................................................... 148 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 151
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ/ký Chữ đầy đủ, giải nghĩa hiệu viết tắt AA Acid arachidonic Angiosperm Phenology Group (Nhóm phát sinh chủng loài thực APG vật hạt kín) Anisaldehyd – acid sulphuric (thuốc thử hiện màu dùng cho sắc AS ký lớp mỏng) B. Balanophora (viết tắt tên chi) CC Column chromatography (Sắc ký cột) COX Cyclooxygenase DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium DMSO Dimethylsulfosid FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) Gas chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký khí kết nối GC-MS khối phổ) HHDP Hexahydroxydiphenoyl- High performance Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng HPTLC hiệu năng cao) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng HPLC cao) Inhibitation concentration at 50% IC50 (Nồng độ ức chế tối đa 50%) KO Kali oxonat Lethal dose 50% LD50 (Liều gây chết trung bình) LOD Limit of detection (giới hạn phát hiện)
LOQ Limit of quantification (giới hạn định lượng) LOX 5-lipooxygenase LPS Lipopolysaccharid MS Mass spectrometry (phổi khối lượng phân tử) National Institute of Standard and Technology (Viện tiêu chuẩn NIST và công nghệ quốc gia - Hoa Kỳ) NMR Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NO Nitric oxid Natural products-polyethylene glycol reagent (thuốc thử sử dụng NP/PEG cho sắc ký lớp mỏng, tạo ra huỳnh quang sáng ở UV 365 nm) Organization for Economic Cooperation and Development (Tổ OECD chức hợp tác và phát triển kinh tế) Preparative Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng điều PTLC chế) Rf Retention factor (hệ số lưu giữ trong sắc ký lớp mỏng) RI rentention indices Scavenging concentration at 50% SC50 (Nồng độ trung hoà được 50% gốc tự do) SKĐ Sắc ký đồ subsp./ssp. subspecies (phân loài/loài phụ) subgen. subgenus (phân chi) TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TVC Thực vật chí var. varietas (thứ) (tiếng latin) VQG Vườn quốc gia XOD xanthin oxidase
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Ký hiệu Tên bảng Trang Các loài thuộc chi Balanophora trên thế giới và khu vực Bảng 1.1 5 phân bố Bảng 1.2 Phân bố của các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam 10 Danh sách các các loài thuộc chi Balanophora trong một Bảng 1.3 13 số khóa phân loại Các hợp chất tanin thủy phân được phân lập từ chi Bảng 1.4 16 Balanophora Các acid hydroxybenzoic và dẫn chất phân lập từ chi Bảng 1.5 20 Balanophora Các phenylpropanoid đơn giản phân lập từ chi Bảng 1.6 21 Balanophora Bảng 1.7 Các lignan phân lập từ chi Balanophora 24 Bảng 1.8 Các coumarin phân lập từ chi Balanophora 27 Bảng 1.9 Các flavonoid phân lập từ chi Balanophora 28 Bảng 1.10 Các terpenoid phân lập từ chi Balanophora 30 Bảng 1.11 Các steroid phân lập từ chi Balanophora 32 Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các loài thuộc chi Bảng 1.12 36 Balanophora Bảng 1.13 Một số mô hình in vitro nghiên cứu tác dụng kháng viêm 42 Bảng 1.14 Các mô hình gây viêm cấp và bán cấp 44 Bảng 1.15 Một số mô hình gây viêm mạn tính 45 Bảng 1.16 Một số mô hình đánh giá tác dụng hạ acid uric in vivo 47 Khối lượng mẫu nghiên cứu và cắn toàn phần, cắn phân Bảng 2.1 49 đoạn dùng trong nghiên cứu
Thang điểm đánh giá mức độ viêm khớp dựa trên triệu Bảng 2.2 66 chứng Bảng 3.1 Dữ liệu về hạt phấn các mẫu nghiên cứu 73 Bảng 3.2 Kết quả định tính thành phần hóa học các mẫu nghiên cứu 86 Các hợp chất được xác định trong phân đoạn ethyl acetat Bảng 3.3 111 các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ Các hợp chất triterpenoid được xác định trong phân đoạn Bảng 3.4 123 n-hexan của các mẫu nghiên cứu sử dụng GC-MS Bảng 3.5 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO của cắn 125 methanol các mẫu nghiên cứu Bảng 3.6 Giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid (NO) trên 126 tế bào RAW của các mẫu nghiên cứu Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn methanol Bảng 3.7 118 các mẫu nghiên cứu Ảnh hưởng của cao chiết Dó đất đến nồng độ acid uric Bảng 3.8 huyết thanh chuột trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng 128 kali oxonat Ảnh hưởng của cao chiết Dó đất lên mức độ phù bàn chân Bảng 3.9 chuột trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng 129 carrageenan Tác dụng kháng viêm của cao chiết Dó đất trên mô hình Bảng 3.10 gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 131 trên chuột cống trắng Bảng 3.11 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ 132 Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng và giá trị LD50 của Cao chiết Dó Bảng 3.12 133 đất So sánh đặc điểm thực vật mẫu các loài thuộc chi Bảng 4.1 136 Balanophora trong luận án Thống kê về việc phân lập các hợp chất từ các loài thuộc Bảng 4.2 139 chi Balanophora Thống kê kết quả phân lập 6 hợp chất triterpenoid Bảng 4.3 142 pentacyclic từ các loài thuộc chi Balanophora
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Ký hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Trang Cấu trúc hóa học các nhóm thế trong các tanin thủy phân Hình 1.1 16 được phân lập từ chi Balanophora Một số acid hydroxybenzoic và dẫn chất phân lập từ chi Hình 1.2 19 Balanophora Một số phenyl propanoid đơn giản phân lập từ chi Hình 1.3 21 Balanophora Hình 1.4 Một số lignan phân lập từ chi Balanophora 25 Hình 1.5 Một số coumarin phân lập từ chi Balanophora 27 Khung cấu trúc các flavonoid phân lập từ chi Hình 1.6 30 Balanophora Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế XOD in Hình 2.1 60 vitro Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu Hình 2.2 62 trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng kháng Hình 2.3 viêm cấp in vivo trên mô hình gây phù bàn chân chuột 64 bằng carrageenan Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng kháng Hình 2.4 66 viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối Sơ đồ tóm tắt các nội dung và phương pháp nghiên cứu Hình 2.5 69 của luận án Hình 3.1 Hình thái mẫu BFI (Balanophora fungosa subsp. indica 71 (Arn.) B.Hansen) Hình vẽ mẫu Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) Hình 3.2 71 B. Hansen Hình 3.3 Hình thái mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa 73 (Jungh.) B.Hansen)
Hình vẽ mẫu Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) Hình 3.4 74 B. Hansen Hình 3.5 Hình thái mẫu BS (Balanophora subcupularis P.C. Tam) 75 Hình 3.6 Hình vẽ mẫu Balanophora subcupularis P.C.Tam 75 Hình 3.7 Hình thái mẫu BT (Balanophora tobiracola Makino) 77 Hình 3.8 Hình vẽ mẫu Balanophora tobiracola Makino 77 Hình 3.9 Hình thái hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora 73 Hình 3.10 Vi phẫu “củ” mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 80 Vi phẫu “củ” mẫu BFG (Balanophora fungosa var. Hình 3.11 80 globosa) Hình 3.12 Vi phẫu “củ” mẫu BS (B. subcupularis) 81 Hình 3.13 Vi phẫu “củ” mẫu BT (B. tobiracola) 81 Hình 3.14 Vi phẫu lá mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 82 Vi phẫu lá mẫu BFG (Balanophora fungosa var. Hình 3.15 82 globosa) Hình 3.16 Vi phẫu lá mẫu BS (B. subcupularis) 83 Hình 3.17 Vi phẫu lá mẫu BT (B. tobiracola) 83 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFI (B. fungosa 83 Hình 3.18 subsp. indica) Hình 3.19 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFG (B. fungosa var. 84 globosa) Hình 3.20 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BS (B. subcupularis) 85 Hình 3.21 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BT (B. tobiracola) 85 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BFI (Balanophora Hình 3.22 88 fungosa subsp. indica) Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BFG (Balanophora Hình 3.23 94 fungosa var. globosa) Hình 3.24 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BT (B. tobiracola) 101 Hình 3.25 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BS (B. subcupularis) 103
Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn n-hexan của các Hình 3.26 116 loài nghiên cứu Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các loài nghiên cứu triển khai với hệ dung môi cloroform–toluen–methanol–amoniac Hình 3.27 25 % (10:3:6:1) quan sát ở: a. λ = 254 nm, b. Ánh sáng 117 thường sau khi phun thuốc thử AS, c. λ = 366 nm sau khi phun thuốc thử AS Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các loài nghiên cứu triển khai với hệ dung môi toluen – ethyl acetat – acid formic Hình 3.28 (14:10:1) quan sát ở a. λ = 254 nm, b. λ = 366 nm sau khi 119 triển khai, c. λ = 366 nm sau khi hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG Sắc ký đồ GC-MS phân đoạn n-hexan của các loài thuộc Hình 3.29 122 chi Balanophora Hình 4.1 Cơ chế phân mảnh một số mảnh ion đặc trưng của lupeol 143 Cơ chế phân mảnh một số mảnh ion đặc trưng của lupeol Hình 4.2 143 acetat
ĐẶT VẤN ĐỀ Họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) là một họ thực vật bậc cao với 16 chi, khoảng hơn 40 loài cây thảo, sống ký sinh [132]. Ở Việt Nam có 2 chi bao gồm chi Sơn dương (Rhopalocnemis Jungh.) với duy nhất một loài (R. phalloides Jungh.) và chi Dó đất (Balanophora J.R. & G. Forst.) với 7 loài, 1 phân loài và 1 thứ [4], [12]. Ở Trung Quốc, các loài trong chi Balanophora đã được sử dụng làm dược liệu từ hàng ngàn năm nay với các tác dụng chủ yếu như bổ thận, cầm máu, điều trị viêm gan [137]. Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Balanophora thường được gọi với tên Dó đất, Nấm ngọc cẩu, hay Tỏa dương và cũng được sử dụng với mục đích khác nhau [6]. Trong ba loài được ghi nhận sử dụng làm thuốc ở Việt Nam, Dó đất hoa thưa (Balanophora laxiflora Hemsl.) là loài được tập trung nghiên cứu nhiều cả về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học, trong đó đáng chú ý là tác dụng kháng viêm [1] được đánh giá trên các mô hình in vitro và in vivo. Phân đoạn ethyl acetat và cao toàn phần loài B. laxiflora thể hiện tác dụng kháng viêm in vivo trên các mô hình gây phù chân chuột và mô hình tạo u hạt ở cả 2 mức liều 150 mg/kg và 300 mg/kg. Một số hợp chất phân lập từ loài này cũng thể hiện tác dụng kháng viêm in vitro đáng chú ý. Bên cạnh đó, loài B. laxiflora cũng thể hiện tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase và hạ acid uric [2],[9]. Như đã biết, nồng độ acid uric trong máu tăng cao thời gian dài có thể dẫn tới tình trạng kết tinh và lắng đọng tinh thể urat tại khớp và gây ra bệnh gút cấp với triệu chứng điển hình là viêm, sưng, nóng, đỏ, đau. Ngoài ra, theo các nghiên cứu trên thế giới, một số loài cũng thể hiện tác dụng kháng viêm khá tốt như: B. spicata [32], B. polyandra [52]. Như vậy, có thể thấy các loài thuộc chi Balanophora có tiềm năng kháng viêm đáng chú ý, trong đó có cả khả năng ngăn chặn nguy cơ xảy ra viêm do bệnh gút. 1
Kết hợp khảo sát ban đầu và tham khảo tài liệu cho thấy chi Balanophora ở Việt Nam khá đa dạng về loài, dưới loài; có những loài chưa được ghi nhận ở Việt Nam. Do những sự tương đồng nhất định về hình thái, thực tế thường có sự nhẫm lẫn khi thu hái hoặc sử dụng trộn lẫn các loài thuộc chi Balanophora, bao gồm cả các loài đã được ghi nhận dùng làm thuốc và các loài cùng chi khác. Do đó, cần một nghiên cứu tương đối có tính hệ thống về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học cũng như một số tác dụng sinh học của các loài này để làm rõ hơn sự đa dạng về loài, tiềm năng phát triển và sử dụng hợp lý. Đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. ở Việt Nam” là cần thiết. Đề tài được tiến hành với các mục tiêu như sau: 1. Xác định chính xác tên khoa học, mô tả đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam. 2. Nghiên cứu thành phần hóa học các loài thu được. 3. Đánh giá một số hoạt tính in vitro của cắn chiết các loài nghiên cứu và lựa chọn một loài có hoạt tính tốt để đánh giá tác dụng kháng viêm, hạ acid uric. Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung: - Nghiên cứu đặc điểm hình thái một số loài thuộc chi Dó đất ở Việt Nam, giám định tên khoa học các mẫu nghiên cứu. Nghiên cứu đặc điểm hiển vi bao gồm vi phẫu củ, vi phẫu lá và đặc điểm bột, hình thái hạt phấn. - Nghiên cứu thành phần hóa học các loài thu được: chiết xuất cao chiết tổng, phân đoạn với các dung môi n-hexan và ethyl acetat. Nghiên cứu thành phần hóa học của cao chiết tổng và các phân đoạn sử dụng các phương pháp: phân lập và xác định cấu trúc, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng ghép nối khối phổ, sắc ký khí kết nối khối phổ. - Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid trên tế bào RAW264.7 và tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao chiết tổng. Trên cơ sở đó, lựa chọn một loài có hoạt tính tốt để nghiên cứu trên các mô hình in vivo và độc tính cấp. 2
Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Balanophora J.R.&G.Forst. 1.1.1. Vị trí phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst. Chi Dó đất (Balanophora J.R. & G. Forst.) là một trong 16 chi của họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) [73]. Với số lượng loài đã được ghi nhận là khoảng 21 loài, 1 phân loài và 3 thứ, đây là chi có số lượng loài lớn nhất trong họ Dó đất (gồm khoảng 40 loài). Đã có một số nghiên cứu phân loại họ Dó đất dựa trên cơ sở đặc điểm hình thái đề cập đến vị trí phân loại của họ Dó đất. Trong đó, 2 công trình được nhiều nhà nghiên cứu thực vật sử dụng là Flowering plants của Armen Takhtajan (2009) [108] và The Families and Genena of Vascular Plants của K. Kubitzki (Vol. XII - 2014) [73]. Theo đó, vị trí phân loại họ Dó đất như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Liên bộ Dó đất (Balanophoranae) Bộ Dó đất (Balanophorales) Họ Dó đất (Balanophoraceae) Trong khi đó, theo hệ thống phân loại APG IV (2016) của Nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín (Angiosperm Phenology Group - APG), họ Balanophoraceae Rich. được đặt trong bộ Đàn hương (Santalales), thuộc Superasterids, Eudicots (Hai lá mầm), Angiosperms [30]. Do những bằng chứng mà hệ thống APG IV đưa ra chưa thuyết phục, chưa xác định được chính xác vị trí của họ Dó đất trong bộ Đàn hương. Vì vậy, quan điểm họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) thuộc bộ Dó đất (Balanophorales) theo A. Takhtajan (2009) và K. Kubitzki (2014) là phù hợp cho việc xác định vị trí họ 3
Dó đất ở Việt Nam. Tuy nhiên cũng không phủ nhận mối quan hệ của họ này với bộ Đàn hương (Santalales). 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst. a, Đặc điểm hình thái thực vật Cây màu đỏ, nâu hoặc vàng đến trắng ngà, cao tới 30 cm, thường ký sinh trên rễ của cây gỗ, thân rễ dạng củ, mặt ngoài sù sì, dạng hình gần cầu hoặc hình trụ, thường phân nhánh; cuống cụm hoa mang lá; 2 – 20 lá, lá dạng vảy, mọc vòng, đối, mọc cách, thành hai hàng hoặc hình xoắn ốc; phần lớn các loài có hoa đơn tính khác gốc, một số ít là đơn tính cùng gốc, đài hoa tiêu giảm hoặc không rõ. Hoa tập trung thành bông nạc, hình trứng hay hình cầu; ở những loài hoa đơn tính cùng gốc, các hoa đực mọc lẫn với hoa cái hoặc mọc ở phía dưới hoặc trên các hoa cái. Các hoa đực mọc đối xứng tỏa tia, ít khi đối xứng hai bên, đối diện với những lá bắc ngắn, cụt bao hoa 3, 4-5 hoặc 6 (-14) thùy; bao phấn đối diện với các thùy bao hoa, chỉ nhị dính với nhau (mà trong đó các bao phấn đã được hợp nhất); hạt phấn hình gần cầu; hoa cái rất nhỏ, không có bao hoa, bộ nhuỵ gồm 2-3 lá noãn hợp thành bầu thượng 1 ô, bầu hình thuôn hay hình thoi và một vòi nhụy thon dài. Quả bế 1 hạt [73]. b, Hình thái hạt phấn Hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora có kích thước nhỏ với kích thước hạt phấn các loài dao động trong khoảng từ 10 – 25 µm. Dựa trên cấu trúc hạt phấn, B. Hansen chia các loài thuộc chi Balanophora thành 2 phân chi: 1) phân chi (subgen.) Balania gồm các loài có hạt phấn không có rãnh lỗ: B. involucrata, B. harlandii, B. wrightii, 2) phân chi (subgen.) Balanophora gồm các loài có hạt phấn có 3-4 đến nhiều cửa: B. fungosa subsp. fungosa, B. fungosa subsp. indica, B. dioica, B. elongata, B. papuana, B. lowii, B. reflexa, B. abbreviata, B. laxiflora [55]. c, Nhiễm sắc thể 4
Các nghiên cứu về số lượng nhiễm sắc thể của các loài thuộc chi Balanophora được tiến hành khá sớm. Năm 1913, Ernst đưa ra số lượng nhiễm sắc thể ở loài B. elongata là n = 16. Đến năm 1928, Kuwada nghiên cứu loài B. japonica với kết quả số lượng nhiễm sắc thể 2n dao động từ 94–112. Rao (1932) công bố loài B. fungosa subsp. indica có số lượng nhiễm sắc thể n = 16. Zweifel (1939) quan sát thấy số lượng nhiễm sắc thể n = 16 trên loài B. abbreviata. Đến năm 1942, Wanatabe tiến hành nghiên cứu trên loài B. japonica và cho rằng loài này có số lượng nhiễm sắc thể là 2n = 56, thay vì 2n = 112 như dữ liệu Ernst đã công bố năm 1913 [55]. Các nghiên cứu trên cho thấy, nhiễm sắc thể ở mỗi loài trong chi Balanophora có thể tương đồng hay khác nhau. 1.1.3. Các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. và phân bố Cho tới thời điểm hiện tại, chi Balanophora được ghi nhận gồm 21 loài, 1 phân loài và 3 thứ chủ yếu ở châu Phi, châu Úc, từ vùng ôn đới đến nhiệt đới châu Á và các đảo Thái Bình Dương. Tại Trung Quốc có khoảng 12 loài [120]. Danh sách các loài bao gồm tên khoa học, tác giả, tên đồng nghĩa và khu vực phân bố được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Balanophora trên thế giới và khu vực phân bố TT Tên khoa học Tên đồng nghĩa Phân bố Ấn Độ, Trung Quốc, Balanophora laosensis Đông Nam Á, Châu Balanophora 1 Lecomte, Balanophora Phi, Madagascar, abbreviata Blume zollingeri Fawc. Quần đảo Thái Bình Dương [120] Balanophora affinis Griff., Đông Bắc Ấn Độ, Balanophora Balanophora alveolata Nêpal, Bhutan, 2 dioica Griff., Balanophora Myanma, Trung R.Brown ex Royle. hookeriana Hemsl. Quốc, [120] 5