Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt sính sinh học của hai loài ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.) và vú bò (Ficus hirta Vahl.)

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:141

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của đề tài là đánh giá một số hoạt tính độc tế bào, hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào tủy xương cấp tính (OCI-AML) của các cao chiết và của một số hợp chất phân lập được nhằm định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt sính sinh học của hai loài ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.) và vú bò (Ficus hirta Vahl.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN ĐỨC ĐẠI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI NGỌC CẨU (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) VÀ VÚ BÒ (FICUS HIRTA VAHL.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN ĐỨC ĐẠI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI NGỌC CẨU (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) VÀ VÚ BÒ (FICUS HIRTA VAHL.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học H c Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trịnh Thị Thủy 2. TS. Ng yễn Q yết Tiến Hà Nội-2018
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Phòng Nghiên cứu Hợp chất thiên nhiên và Phòng Nghiên cứu Hoạt chất sinh học,Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Quyết Tiến - những thầy cô đã dành cho tôi sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các cô chú, anh chị Phòng Hợp chất thiên nhiên và Phòng Hoạt chất sinh học - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ hết sức nhiệt tình của: - Ban lãnh đạo, Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Ban lãnh đạo, các đồng nghiệp Trường Đại học Tân Trào - Tuyên Quang. - Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè. - Quỹ Nafosted; Tôi xin trân trọng cảm n ! Hà Nội, ngày.......tháng.....năm 2018 Tác giả l ận án Trần Đức Đại
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Quyết Tiến. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án này là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Trần Đức Đại
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................3 1.1. Giới thiệ về loài ngọc cẩ (Balanophora laxiflora Hemsl.) .......................... 3 1.1.1. Chi Balanophora..........................................................................................3 1.1.2. Loài ngọc cẩu B. laxiflora ...........................................................................3 1.1.2.1. Tên gọi ....................................................................................................3 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật loài ngọc cẩu (B. laxiflora) ....................................4 1.1.2.3. Công dụng chữa bệnh của loài ngọc cẩu (B. laxiflora) .........................5 1.1.2.4. Tổng quan của loài ngọc cẩu ..................................................................6 1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài th ộc chi Ficus . 15 1.2.1. Chi Ficus ....................................................................................................15 1.2.1.1. Các nghiên cứu quốc tế ........................................................................16 1.2.1.2. Các nghiên cứu trong nước ..................................................................32 1.2.2. Loài vú bò F. hirta .....................................................................................34 1.2.2.1. Mô tả thực vật .......................................................................................34 1.2.2.2. Công dụng .............................................................................................35 1.2.2.3. Thành phần hóa học loài vú bò ............................................................36 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ..............38 2.1. Mẫ nghiên cứ ............................................................................................. 38 2.1.1. Mẫu cây ngọc cẩu ......................................................................................38 2.1.2. Mẫu cây vú bò ............................................................................................38 2.2. Phư ng pháp nghiên cứ .............................................................................. 39 2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật ..............................................................39 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc ................................................................40 2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ........................................................40 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ..............................40 2.2.4.2. Phương pháp gây độc tế bào thự hiện tại Đại học Y Perugia - Đại học tổng hợp Perugia nước Cộng hòa Italy .............................................................42 2.2.4.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide (NOs inhibition) thực hiện tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm và Khoa học Việt Nam43 2.3. Chiết tách và tinh chế các hợp chất từ hai loài nghiên cứ ....................... 45 2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora) .............................45 2.3.1.1.Chiết tách, tạo cao chiết ........................................................................45 2.3.1.2. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane ..........................46 2.3.1.3. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate .................................49
2.3.1.4. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết methanol ......................................52 2.3.2. Phân lập các hợp chất từ rễ cây vú bò (F. hirta) .....................................54 2.3.2.1. Chiết mẫu, tạo cao chiết .......................................................................54 2.3.2.2. Thử hoạt tính các cao chiết...................................................................55 2.3.2.3. Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate ..........................................56 2.3.2.4. Phân lập các hợp chất từ cao n-butanol...............................................58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................................62 3.1. Cây ngọc cẩ (B. laxiflora) ............................................................................ 62 3.1.1. Hợp chất BL-1 (4-Hydroxy-3-methoxycinnamandehid) ..........................62 3.1.2. Hợp chất BL-2 (methyl 4-hydroxycinnamate)..........................................63 3.1.3. Hợp chất BL-3 (pinoresinol) .....................................................................63 3.1.4. Hợp chất BL-4 (methyl 3,4-dihydroxycinnamate) ....................................64 3.1.5. Hợp chất BL-5 (7-hydroxy-6-methoxycoumarin), scopoletin. .................65 3.1.6. Hợp chất BL-6 (+)-lariciresinol) ...............................................................66 3.1.7. Hợp chất BL-7 (+)-isolariciresinol ...........................................................68 3.1.8. Hợp chất BL-8 (quercetin) ........................................................................68 3.1.9. Hợp chất BL-9 (methyl gallate).................................................................70 3.1.10. Hợp chất BL-10 (chất mới)- balanochalcone. ........................................70 3.1.11. Hợp chất BL-11 (β-hydroxydihydrochalcone) .......................................74 3.1.12. Hợp chất BL-12, dimethyl 6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2- dicarboxylate. .......................................................................................................76 3.1.13. Hợp chất BL-13 (p-cumaric acid) ..........................................................77 3.1.14. Hợp chất BL-14 (isolariciresinol 4-O-β-D-glucopyranoside) ................78 3.1.15. Hợp chất BL-15 (Daucosterol) ................................................................78 3.1.16. Hợp chất BL-16 (5-Hydroxymethylfurfural) ..........................................79 3.1.17. Hợp chất BL-17 (methyl β-D-glucopyranoside) .....................................80 3.1.18. Hợp chất BL-18 (methyl 4-O-β-D-glucopyranosylconiferyl ether) .......81 3.1.19. Hợp chất BL-19, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl glucopyranoside. ..82 3.1.20. Hợp chất BL-20 (lariciresinol 4-O-β-D-glucopyranoside) ....................84 3.2. Các hợp chất phân lập từ loài vú bò ........................................................... .87 3.2.1. Hợp chất F-1 (6,7-Furano-hydrocoumaric acid ethyl ester) ...................87 3.2.2. Hợp chất F-2 (umbelliferon) 7-hydroxycoumarin ...................................90 3.2.3. Hợp chất F-3 (bergapten) ..........................................................................92 3.2.4. Hợp chất F-4 (ethyl β-D-fructofuranoside) ..............................................94 3.2.5. Hợp chất F-5 (ethyl β-D-glucopyranoside) ..............................................94 3.2.6. Hợp chất F-6, 5-O-[β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosyl]bergaptol (chất mới) ..................................................................95
3.2.7. Hợp chất F-7 (adenosine)........................................................................101 3.2.8. Hợp chất F-8 (6-carboxy-umbelliferon) .................................................104 3.2.9. Hợp chất F-9 (picraquassioside A) .........................................................104 3.2.10. Hợp chất F-10 (rutin) ............................................................................105 3.2.11. Hợp chất F-11 (acid aspartic) ...............................................................107 3.3. Kết q ả thử hoạt tính sinh học ................................................................... 109 3.3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào loài ngọc cẩu (B. laxiflora) ........109 3.3.1.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào thực hiện thử nghiệm tại viện Hóa học ............................................................................................................109 3.3.1.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào thực hiện thử nghiệm ở Đại học y Perugia - Đại học tổng hợp Perugia nước Cộng hòa Italy .............................109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................113 1. Thành phần hóa học cây ngọc cẩ B. laxiflora ............................................ 113 2. Thành phần hóa học cây vú bò F. hirta ........................................................ 113 3. Đánh giá bước đầ về hoạt tính sinh học ..................................................... 114 3.1. Hoạt tính sinh học loài ngọc cẩu B. laxifloraError! Bookmark not defined. 3.2. Hoạt tính sinh học loài vú bò F. hirta ......... Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ........................................................................................................116 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................1162
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR Resonance Spectrocopy proton 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR Resonance Spectrocopy carbon 13 Distortionless Enhancement by DEPT Phổ DEPT Polarisation Transfer Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị nhân đa liên HMBC Coherence kết Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị nhân đơn liên HSQC Coherence kết COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương quan proton-proton Electron Spray Ionization Mass Phổ khối ion hóa bằng phun mù ESI-MS Spectrocopy điện tử High Resolution Electron Spray Phổ khối phân giải cao ion hóa HR-ESI-MS Ionization- Mass Spectrocopy bằng phun mù điện tử Nuclear Overhauser Effect NOESY Hiệu ứng NOE Spectrocopy IR Infrared Spectrocopy Phổ hồng ngoại Nồng độ ức chế 50% tế bào thử IC50 Inhibitory concentration 50% nghiệm KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô ở người HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi ở người MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú ở người MKN7 Human gastric cancer Ung thư dạ dày ở người LNCaP Human prostate edenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở người SK-Mel2 Human malignant melanoma Ung thư da ở người SW626 Human ovarian adenocarcinoma Ung thư buồng trứng ở người SW480 Human colon adenocarcinoma Ung thư đại tràng ở người RD Human rhabdomyosarcoma Ung thư cơ vân ở người IL-6 Interleukin 6 Pleiotropic cytokine TNF-α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u Acid 4-(2-hydroxyethyl)-1- HEPES piperazineethanesulfonic 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- MTT diphenyltetrazolium bromide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
LPS Lipopolysaccharides L-NMMA NG-methyl-L-arginine acetate American Type Culture ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ Collection SRB Sulforhodamine B s Singlet br s Broad singlet d Doublet t Triplet m Multiplet dd Doublet of doublet J Coupling constant Hằng số tương tác (Hz) Độ dịch chuyển hóa học, thang δ δ ((ppm)) H n-hexane D Dichloromethane EtOAc Ethyl acetate MeOH Methanol DMSO Dimethyl sulfoxide n-BuOH n-butanol H:E n-hexane : ethyl acetate D:M Dichloromethane : Methanol
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Bảng thử hoạt tính của các dịch chiết loài B.laxiflora [29] .........................6 Bảng 1.2. Các hợp chất hóa học thuộc nhóm tanin được tách ra từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora) .................................................................................................................8 Bảng 1.3. Các hợp chất hóa học thuộc nhóm (C6 - C3)n (phenylpropanoid) được tách ra từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl) ...............................................................9 Bảng 1.4. Các hợp chất hóa học thuộc nhóm (C6 - C3)n (phenylpropanoid) được tách ra từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl) .............................................................10 Bảng 1.5. Bảng thử hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết loài B.laxiflora bằng các phương pháp khử gốc tự do DPPH, superoxyd, ngăn chặn sự tạo phức của ion sắt [35] ...........................................................................................................12 Bảng 1.6. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH của 19 chất tách ra từ loài B.laxiflora [30]. .....................................................13 Bảng 1.7. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của loài B. laxiflora [32] .................13 Bảng 1.8. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của một số chất được tách ra từ loài loài B. laxiflora [33] ...................................................................................................15 Bảng 1.9. Các hợp chất (46-51) phân lập từ quả của một số loài thuộc chi Ficus .....18 Bảng 1.10. Các hợp chất (52-61) phân lập từ quả của một số loài thuộc chi Ficus ...19 Bảng 1.11. Các hợp chất (62-65) phân lập từ quả của một số loài thuộc chi Ficus ...20 Bảng 1.12. Các hợp chất (66-75) thuộc nhóm chất alkaloid phân lập từ lá của một số loài thuộc chi Ficus ................................................ Error! Bookmark not defined. Bảng 1.13. Các hợp chất cumarin phân lập từ lá của một số loài thuộc chi Ficus .............22 Bảng 1.14. Các hợp chất flavonoid phân lập từ thân của một số loài thuộc chi Ficus ...........................................................................................................................25 Bảng 1.15. Các hợp chất sterol phân lập từ rễ của một số loài thuộc chi Ficus.........29 Bảng 1.16. Các hợp chất phân lập từ rễ của loài F. hirta Hemsl ...............................37 Bảng 2.1. Khả năng ức chế sản sinh NO của các mẫu nghiên cứu ............................56 Bảng 2.2. Tác động của các mẫu nghiên cứu đến khả năng ức chế sự phát triển của tế bào RAW 264,7................................................................................................55 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất BL-5 và của scopoletin [131a] ...............65 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của BL-6, BL-7 và các hợp chất tham khảo [CD3OD, δ ((ppm)), J (Hz)]...............................................................................67 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất BL-8 và quercetin [129a] .......................69 Bảng 3.4. So sánh số liệu phổ của hợp chất BL-12 với hợp chất dimethyl 6,9,10- trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2-dicarboxylate…………………………………….86 Bảng 3.5. So sánh số liệu phổ của hợp chất BLM-16 với hợp chất 5- hydroxymethylfurfural [123a] ....................................................................................80
Bảng 3.6. So sánh số liệu phổ của hợp chất BL-18 với hợp chất methyl 4-O-β-D- glucopyranosylconiferyl ether [125] ..........................................................................81 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất BL-14, BL-20 và các hợp chất tham khảo [CD3OD; DMSO-d6, δ((ppm)), J (Hz)].............................................83 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất F-1 và hợp chất tham khảo [132] ...........90 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất F-2 và hợp chất tham khảo [130] ...........92 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất F-3 và hợp chất tham khảo [132]........103 Bảng 3.11. Dữ liệu 1H-, 13C-NMR (500 và 125 MHz, δ/(ppm), J/Hz, trong DMSO-d6) và 1H, 13C, HMBC các tương tác xa tiêu biểu của hợp chất F-6.................................... Bảng 3.12. So sánh tương quan phổ NMR của hợp chất F-7 với β-adenosine ........102 Bảng 3.13. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tách ra từ loài ngọc cẩu ......109 Bảng 3.14. Các hợp chất phân lập từ loài ngọc cẩu ... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.15. Các hợp chất phân lập từ loài vú bò ......... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cây ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl.) ..............................................................4 Hình 1.2. Cây vú bò (F. hirta Vahl.) ..........................................................................34 Hình 2.1. Hình ảnh cây ngọc cẩu cái (B. laxiflora Hemsl.).......................................41 Hình 2.2. Hình ảnh cây vú bò (Ficus hirta Vahl.).......................................................41 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các cao chiết từ cây ngọc cẩu.......................................................48 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane.........................50 Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate.....................................53 Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết methanol..........................................56 Hình 2.7. Sơ đồ tổng quan phân lập các cặn chiết từ rễ cây vú bò..............................58 Hình 2.8. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc rễ cây vú bò....................60 Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-butanol..........................................62 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-1 .................................................................62 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-2 .................................................................63 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-3 .................................................................63 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-4 .................................................................64 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-5 .................................................................65 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-6 .................................................................66 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-7 .................................................................68 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-8 .................................................................68 Hình 3.9. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-9 .................................................................70 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-10............................................................70 Hình 3.11. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất BL-10 .......................71 Hình 3.12. Phổ 1H-NMR/CD3OD của hợp chất BL-10..............................................72 Hình 3.13. Phổ 1H-, 13C-NMR của hợp chất BL-10 (chất mới) .................................72 Hình 3.14. Các tương tác HMBC chính (H →C) của hợp chất BL-10 ......................72 Hình 3.15. Phổ HSQC của hợp chất BL-10 (chất mới) .............................................73 Hình 3.16. Phổ HMBC-NMR của hợp chất BL-10 (chất mới) .................................73 Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-11 ......................................................75 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-12 .....................................................76 Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-13 ......................................................77 Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-14 ......................................................78 Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-15 ......................................................78 Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-16 ......................................................79
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-17 ......................................................80 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-18 ......................................................81 Hình 3.25. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-19 ......................................................82 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất BL-20 .....................................................84 Hình 3.27. Cấu trúc hợp hóa học chất F-1 và các tương tác chính (H -> C) HMBC.97 Hình 3.28. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS [M+Na]+ của hợp chất F-1 .............87 Hình 3.29. Phổ FT-IR hợp chất F-1……………………………………….………..98 Hình 3.30. Phổ 1H-NMR/CDCl3 của hợp chất F-1 ....................................................88 Hình 3.31. Phổ 13C-NMR/CDCl3 của hợp chất F-1 ...................................................88 Hình 3.32. Phổ HSQC của hợp chất F-1 ....................................................................89 Hình 3.33. Phổ HMBC của hợp chất F-1………………………………………….100 Hình 3.34. Cấu trúc hóa học hợp chất F-2..................................................................91 Hình 3.35. Cấu trúc hóa học hợp chất F-3..................................................................92 Hình 3.36. Cấu trúc hóa học hợp chất F-4..................................................................94 Hình 3.37. Cấu trúc hóa học hợp chất F-5..................................................................94 Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất F-6 và các tương tác (H -> C) HMBC chính ...........................................................................................................................95 Hình 3.39. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS hợp chất F-6 ...................................95 Hình 3.40. Phổ FT-IR/KBr hợp chất F-6....................................................................96 Hình 3.41. Phổ 1H-NMR/(DMSO-d6) của hợp chất F-6 ............................................97 Hình 3.42. Phổ 13C-NMR của hợp chất F-6 ...............................................................97 Hình 3.43. Phổ HSQC của hợp chất F-6 ....................................................................98 Hình 3.44. Các tương tác HMBC của hợp chất BL-6 ................................................98 Hình 3.45. Các tương tác HMBC của hợp chất BL-6 ..............................................100 Hình 3.46. Cấu trúc hóa học của hợp chất F-7 .........................................................101 Hình 3.47. Cấu trúc hóa học của hợp chất F-8 .........................................................104 Hình 3.48. Cấu trúc hóa học của hợp chất F-9 .........................................................104 Hình 3.49. Cấu trúc hóa học của hợp chất F-10 .......................................................105 Hình 3.50. Cấu trúc hóa học của hợp chất F-11 .......................................................107 Biểu đồ 3.1. Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với các thanh đen (các thanh trắng là MeOH làm đối chứng) ........................................110 Biểu đồ 3.2. Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau 24 giờ khi thử nghiệm với các thanh đen (các thanh trắng là MeOH làm đối chứng). .............................................................................................110 Biểu đồ 3.3. Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi được xử ở các nồng độ khác nhau thanh đen (thanh trắng là chất đối chứng) .......................................................................................................................111
1 MỞ ĐẦU Tài nguyên cây thuốc đóng vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khoẻ, chữa bệnh cho con người, đặc biệt ở các nước nghèo, đang phát triển và có truyền thống sử dụng cây cỏ làm thuốc. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ngày nay có khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển với dân số khoảng 4,5 đến 5 tỉ người trên thế giới có nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ban đầu phụ thuộc vào nền y học cổ truyền. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới, có nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú và đa dạng. Theo kết quả điều tra nguồn tài nguyên dược liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001-2005 của Viện Dược liệu Việt Nam, hiện Việt Nam có khoảng 10.500 loài thực vật bậc cao, nằm trong 2.275 chi, 305 họ trong đó có 3.950 loài được dùng làm thuốc (17% số cây thuốc của thế giới), không kể cây thuốc dân tộc (Ethno- medicinal plants) còn ít biết [1]. Y dược cổ truyền Việt Nam có nhiều loại cây thuốc quý, nhiều bài thuốc hay được sử dụng từ hàng ngàn năm trước đến nay vẫn còn nguyên giá trị chữa bệnh, cứu người. Đặc biệt, những bài thuốc bồi bổ cơ thể được nhiều người sử dụng, đã góp phần nâng cao thể trạng, phát triển giống nòi người Việt Nam. Trong nhiều năm qua, Việt Nam đã từng bước lồng ghép Y dược cổ truyền vào hệ thống Y tế quốc gia, phát huy được vai trò to lớn của Y dược cổ truyền. Đường lối phát triển Y dược học cổ truyền Việt Nam đã được khẳng định nhất quán trong nhiều năm qua là: kế thừa, phát huy, phát triển y dược học cổ truyền, kết hợp với y học hiện đại, xây dựng nền y dược học cổ truyền Việt Nam khoa học dân tộc và đại chúng. Hiện đại hóa y dược cổ truyền và kết hợp y dược cổ truyền với y dược hiện đại đang là mục tiêu và yêu cầu phát triển của thời đại. Thực hiện tốt công việc này sẽ góp phần đưa sự nghiệp chăm sóc sức khỏe nhân dân lên tầm cao mới. Với mục tiêu hiện đại hóa y học cổ truyền và kết hợp y học cổ truyền với y học hiện đại thì việc phát hiện các vị thuốc mới, các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, các hợp chất mới trong các cây thuốc truyền thống là nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học. Việt Nam có khoảng 54 dân tộc cùng sinh sống như dân tộc Kinh, Tầy, Dao, Sán Chay, Mông, Nùng, Sán Dìu, Ê đe.... Một số dân tộc có những cây thuốc quý, những bài thuốc gia truyền có giá trị chữa, trị bệnh có hiệu quả được người dân tin dùng và được hội Đông Y Việt Nam công nhận tuy nhiên những bài thuốc của người dân ít được chứng minh bằng khoa học. Cây ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.), cây vú bò (Ficus
2 hirta Vahl.) là những cây thuốc quý trong kho tàng cây thuốc, vị thuốc Việt Nam, hai loài này đã được người dân dùng trị, chữa bệnh thông thường và trị nhiều chứng bệnh nan y có hiệu quả như: bổ máu, phục hồi sức khỏe phụ nữ sau sinh, kích thích ngon miệng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay….[1, 10, 11, 12]. Trên thế giới đã công bố những chất được tách ra từ hai loài trên có hoạt tính sinh học tốt như hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư, chống oxi hóa .... Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của loài ngọc cẩu và loài vú bò góp phần làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng chiến lược quản lý, bảo tồn, phát triển bền vững tính đa dạng sinh học của rừng đặc dụng của Việt Nam, làm sáng tỏ những công dụng loài vú bò và loài ngọc cẩu mà nhân dân vẫn đang sử dụng. Do đó tôi chọn đối tượng đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt sính sinh học của hai loài ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.) và vú bò (Ficus hirta Vahl.)” Theo hướng nghiên cứu này, luận án có các nội dung sau: 1. Nghiên cứu được thành phần hóa học của hai loài: loài ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl.) và loài vú bò (F. hirta Vahl.). 2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ IR, MS, 1D-NMR, 2D-NMR. 3. Đánh giá một số hoạt tính độc tế bào, hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào tủy xương cấp tính (OCI-AML) của các cao chiết và của một số hợp chất phân lập được nhằm định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của loài ngọc cẩu và loài vú bò làm sáng tỏ những công dụng dân gian đã dùng và tìm ra những chất mới, hoạt chất mới góp phần làm phong phú thêm những nghiên cứu về loài ngọc cẩu và loài vú bò.
3 Chư ng 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệ về loài ngọc cẩ (B. laxiflora Hemsl.) 1.1.1. Chi Balanophora Chi Balanophora có khoảng 120 loài thuộc họ Balanophoraceae phân bố trên khắp thế giới. Nhiều loài trong số chúng phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Đại Dương và gần 20 loài được phân bố rộng rãi ở Tây Nam Trung Quốc [2, 3]. Những loài thuộc chi Balanophora thường sống ký sinh trên rễ cây lá rộng thường xanh, đặc biệt là trong họ Leguminosae, Ericaceae, Urticaceae, và Fagaceae [2,4-5]. Ở Việt Nam hiện có khoảng 6 loài thuộc chi Balanophora: B.laxiflora Hemsl, B.latisepala Tiegh, B.fungosa J.R. Foster & G. Foster, B.polyandra Griff, B. cucphuongensis, B.abbreviata trong đó loài B. cucphuongensis là loài đặc hữu chỉ có ở Khu Bảo tồn Thiên nhiên Quốc gia Cúc Phương [6-10]. Những nghiên cứu về thực vật các loài thuộc họ Balanophoraceae cho thấy trong chi Balanophora có thành phần hóa học rất đa dạng, bao gồm các hợp chất lignan, phenylpropanoid, tanin, flavonoid, terpenoid, acid amin... Chi Balanophora có rất nhiều loại tanin thủy phân (tanin pyrogallic), đặc biệt là chất ellagitannin. Thành phần cấu tạo đặc trưng của các tanin này là các dẫn xuất của acid cinamic và có thêm một dẫn xuất của acid phenylacrylic [caffeoyl, coumaroyl, feruloyl hoặc cinnamoyl), trong đó ở vị trí C-1 liên kết glucosid dưới dạng R–O–glycosidic (R: galloyl, caffeoyl và hexahydroxydiphenoyl (HHDP)], ở các vị trí C-3, C-4 hoặc C-6 liên kết theo kiểu ester R-CO-O-glycosidic [11]. Các hợp chất được tách ra từ chi Balanophora có hoạt tính chống oxy hóa [2, 5, 12], ức chế HIV [13], hạ đường huyết [14, 15], chống viêm, giảm đau [16, 17], kháng ung thư [18]. Các loài thuộc chi Balanophora được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Nepan, Thái Lan, Việt Nam làm thuốc bổ sinh lý nam nữ, giải độc rượu, chữa bệnh trĩ, đau dạ dày, ho gà, bệnh lậu, giang mai…[5-10, 19, 21-22]. 1.1.2. Loài ngọc cẩu (B. laxiflora) 1.1.2.1. Tên gọi Tên khoa học: Balanophora laxiflora Tên thông thường: ngọc cẩu, tỏa dương, củ gió đất, củ ngọt núi, hoa đất, cu chó, xà cô, nấm đất, dó đất hoa thưa, dương đài hoa thưa [6-10].
4 Phân loại khoa học [2-10]. Giới thực vật: Plantae Ngành Mộc lan: Magnoliophyta Lớp Mộc lan: Magnoliopsida Bộ Dương đài: Balanophorales Họ Dó đất: Balanophoraceae Chi: Balanophora Loài: Balanophora laxiflora 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật loài ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl) Ngọc cẩu là loại cây cỏ mập, trông như một cây nấm, sống ký sinh trên rễ cây lá rộng thường xanh, đặc biệt là trong họ Leguminosae, Ericaceae,Urticaceae, và Fagaceae, màu đỏ nâu sẫm, không diệp lục. Cấu tạo bởi một cán hoa lớn, trên mang hoa dày đặc, có mô bao bọc, màu tím, mùi hôi. Cán hoa nạc và mềm, dạng thay đổi, sần sùi, không có lá. Củ hình trứng, đường kính 2 - 2,5 cm, bề mặt sần sùi và có mụn hình sao nổi rõ. Thân ký sinh (là cuống cụm hoa) mang năm đến mười lá dạng vảy ở phía gốc; phiến lá hình mũi mác, cỡ 2 - 2,5 x 1 - 1,5 cm [2-10]. Hoa đơn tính khác gốc, hợp thành nột cụm hoa dạng bông nạc. Hoa đực và hoa cái riêng. Cụm hoa đực hình trụ, gồm những hoa gần như không cuống, dài từ 10 - 15 cm, bao gồm sáu mảnh, trong đó hai mảnh giữa (đối diện nhau) lớn hơn và cụt đầu, các mảnh bên hình trái xoan tròn đầu, khối phấn bị ép ngang. Cụm hoa cái hình bầu dục thuôn, dài từ 2-3 cm không có bao hoa, mọc ở quanh chân của vảy bảo bệ. Vảy hình trứng lõm ở đỉnh, một vòi nhụy [2-10]. Cây đực (♂) Cây cái (♀) Hình 1.1. Cây ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl.)
5 1.1.2.3. Công dụng chữa bệnh của loài ngọc cẩu (B. laxiflora) * Theo Y học cổ truyền. Cây ngọc cẩu dùng làm thuốc bổ máu, phục hồi sức khỏe phụ nữ sau sinh, kích thích ngon miệng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay…. Ở Trung Quốc, toàn cây ngọc cẩu dùng trị hư lao, xuất huyết, chữa đau lưng, lở trĩ, giải độc rượu, thuốc bổ sinh lý nam nữ… [2-10]. * Một số bài thuốc dân gian dùng cây ngọc cẩu chữa bệnh: + Bài thuốc giúp phục hồi sức khỏe phụ nữ sau sinh Ngọc cẩu 15 - 20 g, ích mẫu thảo khô 30 g, cho vào 3 bát nước sắc còn 1 bát. Sau đó sắc nước 2, nước 3. Đổ lẫn 3 bát thuốc của 3 lần, sắc lại còn 1 bát, chia 2 - 3 lần uống sau khi ăn trong ngày. Cần uống liền 30 ngày sẽ cho kết quả rất tốt. + Bài thuốc chữa nam sinh lý yếu Ngọc cẩu 100g, rễ đinh lăng 100g, ba kích 80g, dâm dương hoắc (sao với mỡ dê) 50g, đương quy 50g, hà thủ ô đỏ 50g, câu kỷ tử 50g, thục địa 50g, bạch truật 50g, trần bì 30g. Tất cả ngâm với 5 lít rượu gạo có độ cao, sau 20 ngày là sử dụng. Ngày uống 2 lần vào trước hoặc sau bữa ăn hay trước lúc ngủ, mỗi lần 30 ml. + Bài thuốc chữa liệt dương Ngọc cẩu 12g, thục địa 15g, sơn thù 15g, sơn dược 15g, phục linh 12g, câu kỷ tử 15g, nhục thung dung 12g, dâm dương hoắc 30g, ba kích 12g, bạch nhân sâm 12g, lộc nhung 6g, táo nhân (sao) 12g, thỏ ty tử 12g, thiên môn đông 9g, cam thảo 9g. Tán bột mịn, làm hoàn, ngày uống 3 lần, mỗi lần 1 hoàn 9g, chiêu với nước trắng, kiêng ăn các thức tanh lạnh trong thời gian sử dụng thuốc. + Bài thuốc bổ thận tráng dương Ngọc cẩu 15 g, nhân sâm 12 g, hoàng kỳ 16 g, đỗ trọng 16 g, nhục thung dung 8 g, thỏ ty tử 12 g, xa sàng tử 12 g, phúc bồn tử 12 g, đương quy 12 g, bạch truật 12 g, thục địa 16 g, ba kích 12 g, dâm dương hoắc 12 g, lộc nhung 12 g, câu kỷ tử 12 g, đại táo 5 quả, long nhãn 10 g, cam thảo 6 g, xuyên khung 8 g, hà thủ ô đỏ 12 g. Sắc ngày 1 thang lấy 3 lần nước thuốc rồi làm lại còn 250 ml, chia 3 lần uống trong ngày. Cần uống liền 7 thang. Nếu uống được rượu thì có thể dùng phương trên nhưng mỗi vị cần gấp 5 lần cho cả thang thuốc, ngâm với 5 lít rượu trong 30 ngày rồi mới gạn rượu và cho vào 500 ml mật ong trộn đều để uống dần. Ngày uống 3 lần trước bữa ăn, mỗi lần 25 - 30 ml.
6 1.1.2.4. Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài ngọc cẩu a. Tình hình nghiên cứu trong nước Năm 2014, tác giả Cầm Thị Ính và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất pinoresinol (1), daucosterol (2), từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora) [23]. Năm 2015, tác giả Nguyễn Thanh Hương và cộng sự nghiên cứu về tác dụng androgen (Androgen là hormon sinh dục nam, đóng vai trò quan trọng trong chức năng sinh sản của nam giới), nó cần thiết để hình thành và duy trì các đặc tính sinh dục nam thứ phát, ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và hoạt tính tình dục của nam giới) của cao lỏng ngọc cẩu (B. laxiflora) trên chuột cống đực non thiến và chuột cống đực trưởng thành. Kết quả cho thấy cao lỏng tỏa dương thể hiện hoạt tính androgen rõ rệt thông qua việc tăng nồng độ testosteron máu và khối lượng các cơ quan sinh dục phụ. Tác dụng androgen của cao lỏng tỏa dương phụ thuộc liều, liều thấp (0,28 g/kg) làm tăng khối lượng tinh hoàn và nồng độ testosteron trên chuột cống đực trưởng thành, nhưng không làm tăng khối lượng các cơ quan sinh dục phụ trên chuột cống đực non thiến. Ở liều cao (1,4 g/kg) cao lỏng tỏa dương làm tăng cả khối lượng tinh hoàn và bao quy đầu trên chuột cống đực trưởng thành và cả cả khối lượng túi tinh, tuyến cowper, cơ nâng hậu môn trong chuột cống đực non thiến [24]. Năm 2016, tác giả Nguyễn Thanh Hương và cộng sự nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết nước tỏa dương (B. laxiflora) lên hành vi tình dục của chuột cống đực thực nghiệm với liều ngọc cẩu 0,28 g/kg; 1,4 g/kg; 2,8 g/kg trọng lượng cơ thể chuột. Kết quả cho thấy đã có một sự thay đổi đáng kể trong các hành vi tình dục của chuột cống đực thực nghiện, như tăng thời gian và số lần xâm nhập, tăng tỉ lệ xuất tinh và rút ngắn thời gian nhảy lại. Các tác dụng quan sát được giống như hiệu ứng của testosteron [25]. Bảng 1.2. Kết quả thử hoạt tính của các dịch chiết loài B.laxiflora [26]
7 Chống oxi hóa Ức chế tyrosinase Kháng ung thư Dịch IC50 IC50 IC50 Dịch chiết Dịch chiết chiết (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) n-Hexane 75,89 n-Hexane 31,81 n-Hexane 3,45 EtOAc 22,81 EtOAc 7,90 EtOAc >128 n-BuOH 60,71 n-BuOH 15,12 n-BuOH >128 Nước 2037,4 Nước 128,42 Nước >128 Acid 18,53 Acid kojic 2,6 Ellipticine 0,31 ascorbic Năm 2016, tác giả Trần Thị Hằng cùng cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính của các cao chiết cây ngọc cẩu B. laxiflora và nhận thấy các cao chiết B. laxiflora có hoạt tính chống oxy hóa cao tương đương với acid ascorbic và quercetin, cao ethyl acetate có hoạt tính mạnh nhất. Cao ethyl acetate có hoạt tính ức chế mạnh phản ứng tyrosinase trong tổng hợp melanin, hoạt tính mức độ trung bình đối với vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và dòng tế bào ung thư phổi Lu-1. Các kết quả cho thấy ứng dụng mới của chiết xuất từ B. laxiflora trong chăm sóc sức khoẻ và chăm sóc da. Với đặc tính độc tính cấp trên chuột, B. laxiflora trích xuất sẽ là tiềm năng lớn cho sản xuất các thực phẩm bổ sung (Bảng 1.2)[26]. b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới * Những kết quả nghiên cứu thành phần hóa học Loài B. laxiflora có thành phần hóa học rất đa dạng, bao gồm các hợp chất lignan, phenylpropanoid, tanin, flavonoid, terpenoid, các acid amin.... Ngọc cẩu đã được nghiên cứu khá và được nghiên cứu nhiều ở châu Á đặc biệt là Trung Quốc nhiều trên thế giới đến nay có khoảng trên năm mươi chất được tìm thấy ở loài này. - Các hợp chất tanin Các dẫn xuất acid cinnamic là thành phần đặc trưng của loài B.laxiflora. Chúng thường có một nhóm caffeoyl, feruloyl, coumaroyl hoặc cinnamoyl liên kết ở vị trí C-1 trong nhóm glucosyl bằng liên kết acyl O-glycosidic trong khi vị trí C-3 và C-4 trong nhóm glucosyl thường gắn với galloyl, cùng với nhóm HHDP (hexahydroxydiphenoyl) thường liên kết với các vị trí C-4 và C-6 và C-2 thường có một nhóm hydroxyl (OH) không thế. Ngoài các kiểu liên kết nêu trên, các hợp chất 1,