Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:123

Thêm vào BST

Báo xấu

14
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose" với mục đích tổng hợp được một số vật liệu mới, vật liệu có cấu trúc nano trên cơ sở cacbon (như graphen/graphen oxit, chấm lượng tử cacbon...) kết hợp với các vật liệu hạt nano kim 2 loại/oxit kim loại, có hoạt tính xúc tác tương tự enzym HRP (Enzym Horseradish Peroxidase); thiết kế, cấu trúc cảm biến phát hiện hydrogen peroxit (H2O2) trên cơ sở các vật liệu đã tổng hợp, kết hợp và lựa chọn vật liệu thích hợp để tiến tới chế tạo cảm biến sinh học... Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ------------------------- Nguyễn Đức Nghĩa NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU TRÊN CƠ SỞ NANOCOMPOSITE CARBON ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN GLUCOSE LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC HÀ NỘI – 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nguyễn Đức Nghĩa NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU TRÊN CƠ SỞ NANOCOMPOSITE CARBON ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN GLUCOSE Ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 9520301 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. TRẦN VĨNH HOÀNG 2. PGS.TS. HUỲNH ĐĂNG CHÍNH HÀ NỘI – 2024
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan, luận án này do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của người hướng dẫn khoa học PGS.TS. Trần Vĩnh Hoàng và PGS.TS. Huỳnh Đăng Chính. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được tác giả khác công bố. Hà Nội, ngày 16 tháng 1 năm 2024 Giáo viên hướng dẫn Nghiên cứu sinh PGS. TS. Trần Vĩnh Hoàng PGS. TS. Huỳnh Đăng Chính Nguyễn Đức Nghĩa ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TL. GIÁM ĐỐC TRƯỞNG BAN ĐÀO TẠO i
Lời cảm ơn Luận án này được thực hiện ở phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Vô cơ và Đại cương, Viện Kỹ thuật Hóa học (nay là Trường Hoá và Khoa học sự sống), Đại học Bách Khoa Hà Nội. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trần Vĩnh Hoàng và PGS.TS Huỳnh Đăng Chính, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở Bộ môn Hóa Vô cơ và Đại cương; Viện Kỹ thuật Hóa học (Trường Hoá và Khoa học sự sống), Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi làm thực nghiệm để thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện của lãnh đạo, đồng nghiệp trong Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga nơi tôi đang công tác, các sinh viên nghiên cứu khoa học, học viên cao học và các thầy cô trong phòng thí nghiệm nghiên cứu Vật liệu tiên tiến và Cảm biến sinh học (Laboratory of Advanced Materials and Biosensors-AMB). Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Hà Nội, ngày 16 tháng 01 năm 2024 Nghiên cứu sinh Nguyễn Đức Nghĩa ii
Mục lục Lời cam đoan……………......................................................................................... i Lời cảm ơn……… .................................................................................................. ii Mục lục…………. .................................................................................................. iii DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................ vii DANH MỤC BẢNG............................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ ix CHƯƠNG 1: Tổng quan .................................................................................. 3 1.1 Cảm biến sinh học ......................................................................................................... 3 1.1.1 Định nghĩa và cấu tạo cảm biến sinh học ................................................................... 3 1.1.2 Các thành phần của cảm biến sinh học....................................................................... 4 1.1.2.1 Đầu dò (capture probe) ............................................................................................ 4 1.1.2.2 Bộ phận chuyển đổi (transducer) ............................................................................. 5 1.1.3 Cảm biến so màu ........................................................................................................ 6 1.1.4 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học .................................................................... 7 1.1.4.1. Ứng dụng trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và kiểm soát môi trường ......... 7 1.1.4.2. Ứng dụng trong y sinh học và chẩn đoán lâm sàng................................................ 7 1.1.4.3. Kiểm tra an ninh, phòng chống ma túy, đảm bảo an ninh -quốc phòng ................ 8 1.2. Enzym ........................................................................................................................... 8 1.2.1 Cấu trúc phân tử và đặc tính xúc tác ưu việt của enzym ............................................ 9 1.2.2 Đặc điểm xúc tác của enzym ...................................................................................... 9 1.2.3 Tính đặc hiệu của enzym .......................................................................................... 10 1.2.4 Enzym Horseradish Peroxidase (HRP) .................................................................... 10 1.2.4.1 Cơ chế hoạt động ................................................................................................... 11 1.2.4.2 Cơ chế xúc tác ....................................................................................................... 12 1.3 Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose ............................................................. 13 1.3.1 Các phương pháp xét nghiệm nồng độ glucose ........................................................ 14 1.3.1.1. Phương pháp so màu trên cơ sở sử dụng enzym đặc chủng ................................. 14 1.3.1.2 Xét nghiệm bằng máy đo sử dụng cảm biến sinh học điện hóa sử dụng các enzym đặc chủng ........................................................................................................................... 15 1.3.2 Các xu hướng phát triển cảm biến glucose............................................................... 17 iii
1.3.2.1 Tổng hợp và ứng dụng các vật liệu thay thế enzym glucose oxidase (GOx) trong chế tạo cảm biến ................................................................................................................ 17 1.3.2.2 Tổng hợp và sử dụng các vật liệu có hoạt tính xúc tác thay thế enzym peroxidase (POD)................................................................................................................................. 17 1.4 Các vật liệu nano tiên tiến trên nền carbon được nghiên cứu trong luận án ............... 21 1.4.1 Vật liệu nano bạc (silver nanoparticles-AgNPs) ...................................................... 21 1.4.2 Hạt nano Fe3O4 bọc carbon (cấu trúc lõi/vỏ) (core-shell) ........................................ 22 1.4.3 Vật liệu FeOOH/ chấm carbon lượng tử pha tạp nitơ .............................................. 25 1.4.3.1 Sắt oxy – hydroxit (FeOOH) ................................................................................. 25 1.4.3.2 Chấm cacbon lượng tử pha tạp nitơ (N-CQDs)..................................................... 26 CHƯƠNG 2: Thực nghiệm ........................................................................... 30 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị ............................................................ 30 2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất ......................................................................................... 30 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................................... 30 2.2 Tổng hợp vật liệu AgNPs/CQDs và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học ........ 31 2.2.1 Tổng hợp vật liệu AgNPs/CQDs .............................................................................. 31 2.2.1.1 Tổng hợp carbon dots bằng phương pháp từ dưới lên (bottom-up) ...................... 31 2.2.1.2 Chế tạo vật liệu nano Ag/Carbon dots (AgNPs/CQDs) ........................................ 31 2.2.2 Chế tạo cảm biến phát hiện hydrogen peroxide (H2O2) trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs..................................................................................................................... 32 2.2.3 Chế tạo cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs ................................... 32 2.2.4 Ứng dụng cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs cho mẫu thực ......... 33 2.2.5 Chế tạo hệ thống xét nghiệm hàng loạt, ứng dụng để phát hiện hydrogen peroxide (H2O2) trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs sử dụng phần mền ImageJ................................ 33 2.3 Tổng hợp vật liệu Fe3O4 bọc carbon (Fe@C) và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học ..................................................................................................................................... 35 2.3.1. Tổng hợp vật liệu Fe@C ......................................................................................... 35 2.3.2. Chế tạo cảm biến phát hiện hydrogen peroxide (H2O2) trên cơ sở vật liệu Fe@C . 37 2.3.2.1 Chế tạo cảm biến phát hiện H2O2 trên cơ sở vật liệu Fe@C ................................. 37 2.3.2.2 Chế tạo cảm biến xác định nồng độ glucose trên cơ sở vật liệu Fe@C ................ 37 2.3.2.3 Ứng dụng vật liệu Fe@C trong chế tạo cảm biến xác định glucose trong dung dịch và mẫu thực ....................................................................................................................... 37 iv
2.4 Tổng hợp vật liệu FeOOH/ chấm carbon lượng tử pha tạp nitơ (FN-CQDs) ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học ........................................................................................ 38 2.4.1 Tổng hợp vật liệu FN-CQDs .................................................................................... 39 2.4.2 Chế tạo cảm biến phát hiện hydrogen peroxide (H2O2) trên cơ sở vật liệu FN-CQDs ........................................................................................................................................... 40 2.4.2.1 Chế tạo cảm biến phát hiện H2O2 trên cơ sở vật liệu FN-CQDs ........................... 40 2.4.2.2 Chế tạo cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu FN-CQDs ....................................... 40 2.5 Khảo sát hoạt tính của các nanozyme (Fe@C, FN-CQDs) ......................................... 41 2.6 Các phương pháp xử lý số liệu .................................................................................... 41 2.6.1 Độ nhạy..................................................................................................................... 41 2.6.2 Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) ........................................................................................ 42 2.6.3 Giới hạn phát hiện (LOD) ........................................................................................ 42 CHƯƠNG 3: Kết quả và thảo luận ............................................................... 44 3.1 Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu AgNPs/CQDs trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose ............................................................................................ 44 3.1.1 Tổng hợp và đặc trưng vật liệu AgNPs/CQDs ......................................................... 44 3.1.1.1 Tổng hợp CQDs và AgNPs/CQDs ........................................................................ 44 3.1.1.2 Đặc trưng vật liệu AgNPs/CQDs .......................................................................... 49 3.1.2 Cảm biến xác định nồng độ H2O2 trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs ....................... 52 3.1.2.1 Khảo sát hoạt tính tương tự enzym hydrogen peroxide của vật liệu AgNPs/CQDs ........................................................................................................................................... 52 3.1.2.2 Cảm biến xác định nồng độ H2O2.......................................................................... 57 3.1.3 Ứng dụng vật liệu AgNPs/CQDs trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose bằng phương pháp so màu ................................................................................................. 59 3.1.3.1 Cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs ............................................. 59 3.1.3.2 Ứng dụng vật liệu AgNPs/CQDs trong chế tạo cảm biến xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu ........................................................................................................... 63 3.1.4 Chế tạo cảm biến phát hiện hydrogen peroxide (H2O2) trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs sử dụng phần mền ImageJ ......................................................................... 64 3.1.4.1 Tính toán độ tin cậy của bộ cảm biến .................................................................... 65 3.2 Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu Fe3O4 bọc carbon (Fe@C) trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose ............................................................................ 70 v
3.2.1. Tổng hợp, đặc trưng vật liệu Fe@C ........................................................................ 70 3.2.2 Cảm biến xác định nồng độ H2O2 trên cơ sở vật liệu Fe@C ................................... 74 3.2.2.1 Khảo sát hoạt tính xúc tác tương tự enzym hydrogen peroxidase của vật liệu Fe@C ........................................................................................................................................... 74 3.2.2.2 Khảo sát động học hoạt tính xúc tác tương tự enzym peroxidase của vật liệu Fe@C ........................................................................................................................................... 77 3.2.2.3 Cảm biến xác định nồng độ H2O2.......................................................................... 79 3.2.3 Ứng dụng vật liệu Fe@C trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose ........ 82 3.2.3.1 Cảm biến sinh học phát hiện glucose trên cơ sở vật liệu Fe@C ........................... 82 3.2.3.1 Ứng dụng vật liệu Fe@C trong chế tạo cảm biến xác định glucose trong dung dịch và mẫu thực ....................................................................................................................... 84 3.3 Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu FN-CQDs trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose ................................................................................................... 86 3.3.1 Tổng hợp, đặc trưng của vật liệu FN-CQDs ............................................................ 86 3.3.2 Cảm biến xác định nồng độ H2O2 trên cơ sở vật liệu FN-CQDs ............................. 89 3.3.2.1 Hoạt tính xúc tác của FN-CQDs và tối ưu hóa điều kiện phản ứng ...................... 89 3.3.2.2 Cảm biến xác định nồng độ H2O2 trên cơ sở vật liệu FN-CQDs .......................... 92 3.3.3 Ứng dụng vật liệu FN-CQDs trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose... 95 3.3.3.1 Cảm biến sinh học xác định glucose trong dung dịch trên cơ sở vật liệu FN-CQDs và so sánh với vật liệu Fe@C, AgNPs/CQDs trong luận án ............................................. 95 3.3.3.2 Ứng dụng vật liệu FN-CQDs trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose trong nước tiểu ................................................................................................................... 98 3.3.3.3 So sánh vật liệu FN-CQDs, AgNPs/CQDs, Fe@C với các vật liệu trước đây trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose ................................................................... 100 Kết luận……………........................................................................................... 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 104 vi
DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy dủ bằng tiếng Anh Dịch ra tiếng Việt DNA Deoxyribonucleic Acid ADN RNA Ribonucleic Acid RNA Enzym - Linked Immunosorbent ELISA Xét nghiệm miễn dịch ELISA Assay LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện ODNs Oligo Deoxyribonucleotides Chuỗi deoxyribonucleotides tổng hợp GOx Enzym Glucose Oxidase Enzym oxi hoá glucose ChOx Enzym Cholesterol Oxidase Enzym oxi hoá cholesterol Enzym Horseradish Peroxidase (một HRP Enzym Horseradish Peroxidase loại enzym phân huỷ hydroperoxit - H2O2) HIV Human Immunodeficiency Viruses Virus gây suy giảm miễn dịch ở người SI International Standard Tiêu chuẩn quốc tế International Union of Pure and IUPAC Hiệp hội quốc tế về Hóa học ứng dụng Applied Chemistry POD Enzym Peroxidase Enzym phân huỷ hydroperoxit (H2O2) TMB 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine 4-AAP 4 – Aminophenzon 4 – Aminophenzon Chấm lượng tử cacbon (các hạt nano CQDs Carbon quantum dots carbon có kích thước nhỏ hơn 10 nm) N-CQDs N-CQDs Chấm lượng tử cacbon pha tạp nitơ XRD X-ray Diffraction Quang phổ nhiễu xạ tia x TEM Transmission Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét Fourier Transform Infrared FT-IR Phổ hồng ngoại Spectroscopy PL Photoluminescence Quang phổ phát quang Hạt nano oxit sắt có hoạt tính như IONzyme Iron oxide nanozyme enzym AgNPs Silver nanoparticles Hạt nano bạc AgNPs/CQ Silver nanoparticles carbon quantum Hạt nano bạc lai với chấm lượng tử Ds dots cacbon Fe@C Fe@C Fe3O4 bọc carbon Vật liệu FeOOH/ chấm lượng tử cacbon FN-CQDs FN-CQDs pha tạp nitơ vii
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần chế tạo mẫu ................................................................................................36 Bảng 3.1 So sánh các cảm biến glucose trên cơ sở phương pháp so màu .....................................62 Bảng 3.2 Giá trị đo cường độ hấp thụ trung bình giữa các lần đo .................................................66 Bảng 3.3 Kết quả đo ......................................................................................................................67 Bảng 3.4 Bảng kết quả đo của mẫu trắng trong khay Elisa ...........................................................67 Bảng 3.5 Sai số phép đo phân tích H2O2 có nồng độ 200 mM .....................................................68 Bảng 3.6 Bảng so sánh độ tin cậy khi phân tích xác định H2O2 ở các nồng độ khác nhau ...........69 Bảng 3.7 Điều kiện tối ưu của phản ứng .......................................................................................77 Bảng 3.8 Các thông số Km đối với TMB và H2O2 của các mẫu xúc tác Fe@C và một số xúc tác đã công bố ..........................................................................................................................................79 Bảng 3.9 Sai số của phép đo ..........................................................................................................80 Bảng 3.10 Giới hạn tìm kiếm H2O2 nhỏ nhất của một số báo cáo trước đây ................................82 Bảng 3.11 So sánh hoạt tính xúc tác của Fe@C với các xúc tác khác ..........................................84 Bảng 3.12 Kết quả tính lượng glucose trong mẫu thực theo mẫu chuẩn .......................................85 Bảng 3.13 So sánh kết quả phân tích glucose trong mẫu huyết thanh giữa cảm biến Fe@C13 và trung tâm y tế .................................................................................................................................86 Bảng 3.14 Điều kiện tối ưu của phản ứng .....................................................................................92 Bảng 3.15 Giới hạn tìm kiếm H2O2 nhỏ nhất của một số báo cáo trước đây ................................93 Bảng 3.16 So sánh hằng số động học Km của FN-CQDs với các xúc tác khác.............................95 Bảng 3.17 So sánh LOD của một số cảm biến glucose đã công bố trước đây ..............................98 Bảng 3.18 So sánh vật liệu FN-CQDs, AgNPs/CQDs, Fe@C với các vật liệu trước đây trong chế tạo cảm biến sinh học phát hiện glucose .....................................................................................100 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[1] ....................................................................3 Hình 1.2 Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[2] .................................5 Hình 1.3 Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10 thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai. ..................................................................................................................................6 Hình 1.4 (a) Bộ kit cảm biến sinh học để xác định phân tử nấm aflatoxin B1 trong thực phẩm theo nguyên lý cảm biến miễn dịch ELISA [33]và (b) Bộ kit xét nghiệm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong nước [34].........................................................................................................7 Hình 1.5 (a) Bộ xét nghiệm virus HIV tuýp 1,2 dựa trên cảm biến sinh học kiểu ELISA [33] và (b) máy đo đường huyết cá nhân theo dõi nồng độ glucose trong máu .......................................8 Hình 1.6 Biểu diễn cấu trúc ba chiều của tinh thể peroxidase isoenzym C của cây cải ngựa (mã truy cập Brookhaven 1H5A) sử dụng nhiễu xạ tia X. Nhóm heme (có màu đỏ) nằm giữa miền xa và miền gần, mỗi miền chứa một nguyên tử canxi (được hiển thị dưới dạng hình cầu màu xanh lam). α-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzym lần lượt có màu tím và vàng. Các xoắn (α-Helica) F’ và F’’ xuất hiện ở góc phần tư phía dưới bên phải của phân tử.[35] ...................................................................................................................11 Hình 1.7 Các gốc axit amin chính trong vùng liên kết heme của HRP C. Nhóm heme và nguyên tử sắt heme được hiển thị bằng màu đỏ, các gốc còn lại có màu nguyên tử. His170, dư lượng histidine gần nhất, được kết hợp với nguyên tử sắt heme trong khi vị trí phối trí xa tương ứng phía trên mặt phẳng của hemelà trống rỗng[35] ...........................................................11 Hình 1.8 Chu trình xúc tác của peroxidase củ cải ngựa (HRP) với ferulate là chất khử. Các hằng số tốc độ k1, k2 và k3 lần lượt thể hiện tốc độ hình thành hợp chất I, tốc độ khử hợp chất I và tốc độ khử hợp chất II tương ứng.[37] .................................................................................13 Hình 1.9 (a) Cơ chế hoạt động của các enzym trong hệ cảm biến 2 enzym phát hiện glucose bằng phương pháp so màu (trắc quang); .......................................................................................14 Hình 1.10 (a) Một bộ dụng cụ và thiết bị của máy đo đường huyết gồm: (1) Máy phân tích và đọc kết quả; (2) Dụng cụ lấy máu; (3) Que thử; (4) Hộp đựng que thử và (5) Hộp đựng thiết bị. (b) Cấu tạo của que thử; (c) Nguyên tắc hoạt động của điện cực làm việc và (d) Nguyên lý truyền và xử lý tín hiệu của thiết bị......................................................................................16 Hình 1.11 Bộ que thử glucose trong nước tiểu Uriscan và bảng màu chuẩn để so sánh[38]. .......16 Hình 1.12 Nguyên lý phát hiện glucose bằng phương pháp so màu không sử dụng enzym [39] .17 Hình 1.13 Nguyên lý phát hiện glucose sử dụng enzym GOx kết hợp với sử dụng C60-carboxy- fullerenes thay thế enzym HRP [50] ....................................................................................18 Hình 1.14 Cấu tạo điện cực làm việc để phát hiện glucose trên cơ sở sử dụng kết hợp enzym GOx với vật liệu lai tạo Pt/sợi helical carbon và cơ chế phản ứng khi điện cực làm việc[58] .....19 Hình 1.15 Cấu trúc cảm biến phát hiện nồng độ glucose trong nước bọt, nước mắt và nước tiểu trên cơ sở các tấm graphen/hạt nano Pd [59] .......................................................................20 Hình 1.16 Sơ đồ của cảm biến phát hiện H2O2 và glucose theo phương pháp điện hóa sử dụng hệ vi lưu làm từ giấy (paper-based microfluidic devices) [60] .................................................20 Hình 1.17 (a) Khẩu trang chứa nano bạc; (b) các dược phẩm sử dụng nano bạc; (c) bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc; (d) ảnh SEM của các hạt nano bạc kết hợp với film polyolefin; (e) bàn chải đánh răng có chứa nano bạc...........................................................21 Hình 1.18 Các dạng nanoshell: (a) Hạt nano chứa nhiều nhân giống nhau, (b) Hạt nano chứa nhiều nhân khác nhau, (c) Hạt nano chứa một lõi đồng nhất, (d) Hạt nano được bao quanh bởi nhiều lớp vỏ..........................................................................................................................24 Hình 1.19 Cấu trúc tinh thể của γ-FeOOH [63] ............................................................................26 Hình 1.20 Sơ đồ cấu trúc của các vật liệu họ cacbon ....................................................................27 Hình 1.21 (a) Mô hình hóa học của N-CQDs, (b) ảnh TEM của N-CQDs được nhóm nghiên cứu tổng hợp theo phương pháp “bottom-up”[65] ......................................................................28 ix
Hình 2.1 Cơ chế hình thành hạt CQDs dots theo phương pháp từ dưới lên (bottom-up) .............31 Hình 2.2 Cơ chế tạo thành vật liệu AgNPs/CQDs ........................................................................32 Hình 2.3 (a) Hệ thống phân tích được chế tạo, (b) Top-view và (c) Sơ đồ bố trí của thiết phân tích nồng độ H2O2 trong giếng Elisa bằng điện thoại qua phần mềm ImageJ ............................34 Hình 2.4 Sơ đồ xử lý tín hiệu đo từ hệ thống ................................................................................34 Hình 2.5 Sơ đồ tổng hợp vật liệu Fe@C .......................................................................................35 Hình 2.6 Sơ đồ tổng hợp vật liệu FN-CQDs .................................................................................39 Hình 3.1 (A) Phổ UV-Vis của CQDs và (B) phổ PL của CQDs với các bước sóng kích thích khác nhau; (C) Ảnh TEM of CQDs; và (D) Màu sắc dung dịch CQDs và mẫu nước ở dưới ánh sáng thường (trái) và dưới tia UV (phải) .............................................................................44 Hình 3.2 (A) Phổ UV-vis của (a) dung dịch CQD; đường cong (b) đến (e) dung dịch AgNP/CQD sau khi khử ở các độ pH khác nhau; (B) Ảnh hưởng của pH đến vị trí đỉnh plasmon của AgNP (cực đại hấp thụ, λmax) và cường độ cực đại (mật độ quang-OD) (chèn: ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng từ (A)). .......................................................................................46 Hình 3.3 (A) Phổ UV-vis của dung dịch AgNP/CQD được tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau: (a) 26°C; (b) 40°C; (c) 60°C; (d) 80°C và (e) 90°C tương ứng; (B) Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến vị trí đỉnh plasmon của AgNP (λ max ) và cường độ cực đại (OD) (chèn: ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng từ (A)); (C) Phân bố kích thước hạt của AgNP/CQD theo phương pháp DLS của các mẫu tương ứng từ (A). ...........................................................................47 Hình 3.4 (A) Phổ UV-vis của dung dịch AgNP/CQD được tổng hợp ở 90°C trong các thời gian phản ứng khác nhau: (a) 60 phút; (b) 80 phút; (c) 100 phút; (d) tương ứng là 120 phút và (e) 180 phút; (B) Phân tích DLS của các mẫu tương ứng từ (A); (C) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến kích thước hạt trung bình của AgNP/CQD (chèn: ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng từ (A)). ................................................................................................................48 Hình 3.5 (A) Phổ UV-vis của các dung dịch AgNP/CQD được tổng hợp ở 90°C trong 120 phút với các tỷ lệ dung dịch AgNO 3 /CQD khác nhau. Điều kiện phản ứng đã được mô tả trong văn bản. (B) Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích của dung dịch AgNO 3 và CQD đến vị trí đỉnh plasmon của AgNP (λ max ) và cường độ cực đại (OD) (chèn: ảnh kỹ thuật số của các mẫu tương ứng từ (A)); (C) Phân tích DLS của các mẫu tương ứng từ (A), tương ứng. ............49 Hình 3.6 (A) Phổ UV-Vis của (a) CQDs, và (b) AgNPs/CQDs; (B) Phổ XRD của (a) CQDs và (b) AgNPs/CQDs. ......................................................................................................................50 Hình 3.7 (A) Ảnh TEM của AgNPs/CQDs; (B) Màu của dung dịch CQDs và dung dịch AgNPs/CDQs; (C) Phân bố kích thước hạt phân tích theo phương pháp tán xạ laser (DLS) của mẫu AgNPs/CQDs) .......................................................................................................51 Hình 3.8 (A) Phổ tán xạ năng lượng (EDX) của (a) CQDs và (b) AgNPs/CQDs; (B) Phổ FT-IR của a) CQDs và (b) AgNPs/CQDs .......................................................................................51 Hình 3.9 (A) phổ hấp thụ UV-vis của AgNPs/CQDs (a) trước và (b) sau khi thêm 100 μM dung dịch H2O2; (B) Biến đổi A/A (%) theo thời gian ..............................................................52 Hình 3.10 Cơ chế phản ứng của cảm biến phát hiện H2O2............................................................53 Hình 3.11 Ảnh TEM của dung dịch AgNPs/CQDs (a,b) khi không có mặt H2O2 và (c,d) khi có mặt H2O2 với nồng độ 0,8 mM ...................................................................................................54 Hình 3.12 Phổ UV-Vis của dung dịch AgNPs/CQDs trước (đường i) và sau khi phản ứng với 20 mM H2O2 ở các pH khác nhau: (a) pH =11; (b) pH = 9; (c) pH = 7,5; (d) pH = 7; (e) pH = 5; (f) pH = 4; (g) pH = 3 và (h) Biến đổi tín hiệu A/A0 (%) của cảm biến H2O2 với nồng độ H2O2 là 20 mM tại các pH khác nhau. .................................................................................56 Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả làm việc của cảm biến phát hiện H2O2. Nồng độ H2O2 sử dụng là 20, 40, 60, 80 và 100 µM. pH =7 ..............................................................57 Hình 3.14 (A) Phổ UV-Vis của cảm biến H2O2 với các nồng đô H2O2 khác nhau từ 0.5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 50 và 100 μM H2O2;(B) Đường chuẩn của cảm biến để xác định nồng độ H2O2 (hình chèn: màu sắc của các cảm biến tương ứng với các nồng độ H2O2) ..........................58 x
Hình 3.15 (A) Phổ UV-Vis của dung dịch cảm biến khi có mặt: (a) mẫu trắng, (b) 0,5 mM glucose, (c) 0,5 mM axit ascorbic, (d) 0,5 mM H2O2, (e) 0,5 mM axit Saccarose; (B) A/Ao (%) của các mẫu ở hình A .................................................................................................................59 Hình 3.16 Cơ chế hoạt động của cảm biến glucose trên cơ sở AgNPs/CQDs ..............................60 Hình 3.17 (A) Phổ UV-Vis của cảm biến với sự có mặt của các saccharide khác nhau ở nồng độ 4 mM và (B) Độ thay đổi tín hiệu cường độ pic A/A0 of ứng với các saccharide ở hình (A). ..............................................................................................................................................61 Hình 3.18 (A) Phổ UV-vis của cảm biến glucose với nồng độ glucose khác nhau (hình chèn: màu sắc của các dung dịch cảm biến tương tứng); (B) Đường chuẩn xác định nồng độ glucose trong dung dịch ....................................................................................................................61 Hình 3.19 Phương pháp thêm chuẩn để xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu người: (A) Phổ UV-Vis của cảm biến với: (a) mẫu trắng (không có nước tiểu; (b) mẫu nước tiểu pha loãng (1:4); (c)-(e) mẫu nước tiểu pha loãng bổ sung 1mM, 2mM và 3mM glucose; (B) Đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn của cảm biến xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu .......................................................................................................................63 Hình 3.20 Ảnh chụp từ hệ phân tích, (A) ảnh chụp mẫu trắng không có mặt H2O2, (B) mẫu có mặt H2O2 .....................................................................................................................................64 Hình 3.21 Hình ảnh kết quả xử lý bằng phần mền ImageJ ...........................................................64 Hình 3.22 (A) GTTB các khay trong các lần đo; (B) GTTB hàng trong các lần đo .....................66 Hình 3.23 (A) Độ lặp lại của giếng 28; (B) Độ lặp lại giếng 54 ...................................................67 Hình 3.24 (A) Ảnh chụp phân tích mẫu H2O2 (500 mM; 300 mM; 200 mM, 100 mM và 50 mM); (B) Ảnh chụp phân tích mẫu H2O2 (50 mM; 20 mM; 10 mM, 5 mM và 1 mM);................68 Hình 3.25 (A) Độ lặp lại của thí nghiệm với mẫu H2O2 nồng độ 50 mM; (B) Đường chuẩn xác định nồng độ H2O2 ...............................................................................................................68 Hình 3.26 (A) Phổ XRD của các mẫu vật liệu Fe@C (1-0), Fe@C (1-3), Fe@C (1-5), Fe@C (1- 10); (B) Phổ FT-IR của các mẫu vật liệu Fe@C (1-0), Fe@C (1-3), Fe@C (1-5), Fe@C (1- 10). .......................................................................................................................................70 Hình 3.27 Phổ VSM của Fe3O4 và Fe3O4/C:(a) Fe@C(1-0), (b) Fe@C(1-2), (c) Fe@C(1-3), (d) Fe@C(1-5), (e) Fe@C(1-7), (f) Fe@C(1-10) .....................................................................71 Hình 3.28 Ảnh SEM các mẫu Fe@C (1-0), Fe@C (1-1), Fe@C (1-10) .......................................73 Hình 3.29 Ảnh TEM của các mẫu vật liệu Fe@C (1-0), Fe@C (1-0,5) Fe@C (1-3)Fe@C (1-5), Fe@C (1-7) ..........................................................................................................................73 Hình 3.30 Phổ UV-Vis thí nghiệm control ....................................................................................74 Hình 3.31 Phổ UV-Vis thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng và độ hấp thụ A652 của các mẫu tương ứng ...............................................................................................................75 Hình 3.32 Phổ UV-Vis khảo sát thời gian phản ứng và độ hấp thụ A652 của các mẫu tương ứng 75 Hình 3.33 Phổ UV-Vis khảo sát môi trường (pH) của phản ứng và độ hấp thụ A652 của các mẫu tương ứng .............................................................................................................................76 Hình 3.34 Phổ UV-Vis khảo sát thể tích xúc tác và độ hấp thụ quang A652 của các mẫu ............76 Hình 3.35 Đồ thị biểu diễn động học của Fe@C theo phương trình Michaelis-Menten (A, B) và phương trình Lineweaver-Burk (C, D). Nồng độ H2O2 là 0.174 mM và nồng độ TMB thay đổi (A, C). Nồng độ TMB là 0.347 mM và nồng độ H2O2 thay đổi (B, D) .........................78 Hình 3.36 (A) Độ chọn lọc H2O2 của cảm biến với các mẫu thử glucose, ascorbic acid, galactose, saccarose, fructose; (B) Độ hấp thụ A652 của các mẫu tương ứng trong thí nghiệm độ lặp lại ..............................................................................................................................................80 Hình 3.37 Phổ UV-vis đường chuẩn H2O2 và đường chuẩn H2O2 ................................................81 Hình 3.38 Cơ chế của cảm biến glucose sử dụng Fe@C thay thế enzym HRP ...........................82 Hình 3.39 (A) Phổ Uv-Vis của mẫu (a) glucose + Fe@C13+GOx; (b) GOx+Fe@C13 và (c) glucose + Gox; (B) Cường độ A652 của các cảm biến khi mẫu chứa: (a) glucose; (b) acid ascobic; (c) galactose; (d) sacarose và (e) saccarose. Nồng độ các mẫu là 0,2 mM ...........83 Hình 3.40 Độ hấp thụ A652 của các mẫu tương ứng trong thí nghiệm control; Phổ UV-vis đường chuẩn Glucose; Đường chuẩn glucose .................................................................................83 xi
Hình 3.41 Phổ UV-Vis đo mẫu thực .............................................................................................85 Hình 3.42 Đặc trưng vật liệu FN-CQDs: (A) phổ nhiễu xạ tia X (XRD); (B) phổ từ kế mẫu rung (VSM); (C) ảnh SEM độ phóng đại nhỏ (kèm phổ EDX); (D) ảnh SEM độ phóng đại lớn; (E) ảnh TEM; (F) phổ phát huỳnh quang; (G) phổ quang hấp thụ; (I) phổ hồng ngoại của FN-CQDs .............................................................................................................................87 Hình 3.43 Hoạt tính xúc tác của FN-CQDs trong mô hình peroxidase: (A) Kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính FN-CQDs; phổ UV-Vis khảo sát thời gian phản ứng của (B) TMB + H2O2; (C) TMB + FN-CQDs và (D) TMB + FN-CQDs + H2O2 ..........................................................89 Hình 3.44 Kết quả các thí nghiệm tối ưu: (a) pH, (b) nhiệt độ, (c) thể tích xúc tác, (d) thể tích TMB sử dụng .................................................................................................................................91 Hình 3.45 Đường chuẩn H2O2 (hình chèn: cơ chế của phản ứng) .................................................92 Hình 3.46 Đồ thị biểu diễn động học của FN-CQDs theo phương trình Michaelis-Menten (A, B) và phương trình Lineweaver-Burk (C, D). Nồng độ H2O2 là 0.174 mM và nồng độ TMB thay đổi (A, C). Nồng độ TMB là 0.347 mM và nồng độ H2O2 thay đổi (B, D) .................94 Hình 3.47 Cơ chế của cảm biến glucose sử dụng FN-CQDs thay thế enzym HRP ......................96 Hình 3.48 So sánh giá trị độ hấp thụ quang A652 của các mẫu chọn lọc với (a) 0,7 mM glucose; (b) 0,7 mM galactose; (c) 0,7 mM fructose; (d) 0,7 mM axit ascorbic; (e) 0,7 mM saccharose, (f) hỗn hợp 0,7 mM fructose + 0,7 mM saccharose; (g) hỗn hợp 0,7 mM galactose + 0,7 mM fructose + 0,7 mM saccharose; (h) hỗn hợp 0,7 mM glucose + 0,7 mM galactose + 0,7 mM fructose + 0,7 mM saccharose; (i) hỗn hợp 0,7 mM axit ascorbic + 0,7 mM galactose; (k) hỗn hợp 0,7 mM glucose + 0,7 mM axit ascorbic + 0,7 mM saccharose; (l) hỗn hợp 0,7 mM glucose + 0,7 mM axit ascorbic + 0,7 mM galactose + 0,7 mM saccharose...............96 Hình 3.49 (A) Phổ UV-Vis của các mẫu có nồng độ glucose khác nhau; (B) Đường chuẩn glucose ..............................................................................................................................................97 Hình 3.50 Phương pháp thêm chuẩn sử dụng cảm biến định lượng glucose: (A, C) phổ UV-vis của mẫu thí nghiệm từ nước tiểu của (A) người bình thường và (C) người bệnh tiểu đường; (B, D) đường chuẩn từ phương pháp thêm chuẩn của (B) mẫu người bình thường và (D) mẫu người bệnh tiểu đường .........................................................................................................99 xii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài Cảm biến sinh học đang là một trong những lĩnh vực nghiên cứu nhận được sự quan tâm, lựa chọn đặc biệt của các nhà khoa học cũng các hãng chế tạo thiết bị phân tích sinh hóa vì triển vọng ứng dụng rất lớn của chúng trong phân tích, kiểm tra các chỉ dấu sinh học trong chăm sóc sức khỏe, theo dõi, phát hiện sớm bệnh tật, quan trắc và kiểm soát môi trường, kiểm nghiệm an toàn thực phẩm... với những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống như phân tích nhanh, đơn giản, tiện lợi và độ chính xác cao. Xu hướng chính hiện nay là ứng dụng các vật liệu nano, vật liệu lai tạo và tích hợp được các tính chất lý-hóa và sinh học của các vật liệu (hoạt tính xúc tác, tính chất quang/từ/điện) vào trong cảm biến sinh học để tăng độ nhạy, giảm thời gian xét nghiệm, tăng độ chọn lọc, nâng cao giới hạn phát hiện...Ngoài ra, nếu sử dụng các vật liệu nói trên thay thế các phần tử sinh học thì sẽ kéo dài được thời gian sử dụng của cảm biến sinh học vì các phần tử sinh học (như enzym) có thời gian sống không dài, lại yêu cầu hoạt động trong những điều kiện khá nghiêm ngặt (pH, nhiệt độ…). Việc nghiên cứu chế tạo các vật liệu carbon có cấu trúc nano có hoạt tính xúc tác ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học (thiết bị y tế, que thử, bộ kít thử) nhằm phục vụ theo dõi, kiểm tra sức khỏe tại nhà có nhu cầu ngày càng lớn, chẳng hạn các cảm biến đo đường huyết (glucose trong máu), đo hàm lượng cholesterol trong máu, xác định nồng độ axit uric…để sớm phát hiện ra các bệnh tật tương ứng là tiểu đường, mỡ máu, bệnh gust...nhằm chữa trị kịp thời, giảm đau đớn cho người bệnh, giảm chi phí chữa trị vì đã được phát hiện sớm. Hiện tại, công tác xét nghiệm này được tiến hành chủ yếu ở bệnh viện, với chi phí tương đối cao, tốn nhiều thời gian làm các thủ tục, thời gian chờ đợi, trong khi đó bệnh viện cũng trở nên quá tải vì số lượng mẫu quá lớn. Việc phát triển các bộ xét nghiệm dạng que thử kiểm tra nhanh các chỉ dấu sinh học (glucose trong máu, cholestero, axit uric là những nhu cầu rất rõ ràng trong bối cảnh hiện nay ở Việt Nam nói riêng cũng như các nước đang phát triển nói chung. Do đó, nghiên cứu chế tạo một số loại vật liệu carbon có cấu trúc nano ứng dụng trong các cảm biến sinh học có độ nhạy cao, phát hiện nhanh, có thể tiến hành xét nghiệm hàng loạt là hướng nghiên cứu mới không chỉ ở Việt Nam mà là hướng nghiên cứu của rất nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới để chế tạo các vật liệu mới, vật liệu lai tạo đa tính chất. Ngoài ra, hướng nghiên cứu này sẽ mang lại giá trị trong y tế cũng như đời sống giúp nâng cao chất lượng cuộc sống. Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chế tạo vật liệu trên cơ sở nanocomposite carbon ứng dụng trong cảm biến glucose ” là đề tài nghiên cứu sinh. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tổng hợp được một số vật liệu mới, vật liệu có cấu trúc nano trên cơ sở cacbon (như graphen/graphen oxit, chấm lượng tử cacbon...) kết hợp với các vật liệu hạt nano kim 1
loại/oxit kim loại, có hoạt tính xúc tác tương tự enzym HRP (Enzym Horseradish Peroxidase). - Thiết kế, cấu trúc cảm biến phát hiện hydrogen peroxit (H2O2) trên cơ sở các vật liệu đã tổng hợp, kết hợp và lựa chọn vật liệu thích hợp để tiến tới chế tạo cảm biến sinh học. - Thiết kế, chế tạo cảm biến sinh học trên cơ sở các vật liệu đã tổng hợp kết hợp với các enzym đặc chủng để xác định nồng độ glucose trong dung dịch và mẫu thực (Mẫu máu…). 2. Nội dung nghiên cứu - Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu AgNPs/CQDs trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose. - Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu Fe3O4 bọc carbon (Fe@C) trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose. - Tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng vật liệu FN-CQDs trong chế tạo cảm biến sinh học so màu phát hiện glucose. 3. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các loại vật liệu mới trên cơ sở cacbon kết hợp với các kim loại/ oxit kim loại để ứng dụng trong cảm biến sinh học. Dựa trên các đặc tính vật lý, hóa lý và hóa học của vật liệu, đặc biệt là các thuộc tính mới ở kích thước nano (như phổ plasmon bề mặt của nano bạc (AgNPs), phổ này sẽ khác nhau nếu hình dạng hạt AgNPs khác nhau). Ngoài ra việc kết hợp các nano kim loại/oxít kim loại có hoạt tính xúc tác tương tự như ezym HRP với CQDs ( carbon quantum dots-chấm lượng tử carbon) giúp cho vật liệu này có thể phân tán tốt trong dung môi, giảm độc tố và bảo vệ tốt kim loại/oxit kim loại, dễ dàng chức năng hóa bằng việc gắn các phân tử có đặc tính sinh học khác nhau. Các loại nano kim loại/oxít kim loại sau khi được kết hợp với cacbon đều cho thấy khả năng xúc tác, độ chọn lọc, tính bền cao hơn hẳn so với vật liệu không có cacbon. Việc nghiên cứu, chế tạo thành công các loại vật liệu mới trên cơ sở cacbon kết hợp với kim loại/ oxit kim loại có hoạt tính xúc tác và ứng dụng chúng trong chế tạo cảm biến sinh học có ý nghĩa không chỉ trong y học mà còn làm tiên đề trong ứng dụng chuẩn đoán nhanh các độc tố trong thực phẩm, trong nước uống, nước sinh hoạt…Nghiên cứu này tiến tới áp dụng trong y tế sẽ giúp việc chuẩn đoán một số chỉ số của bệnh nhân trở lên nhanh chóng, thuận tiện. Người bệnh có thể dễ dàng kiểm soát các chỉ số sinh học trong máu (glucose, cholestero, axit uric) mà không phải đến bệnh viện qua đó có biện pháp ngăn ngừa, phòng bệnh sớm. 2
CHƯƠNG 1: Tổng quan 1.1 Cảm biến sinh học 1.1.1 Định nghĩa và cấu tạo cảm biến sinh học Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer). Chất được gắn trên bộ phận chuyển đổi được gọi là “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu được gọi là “phần tử đích”. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên/kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA-DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym/cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò dò tìm đối tượng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo (hình 1.1). Hình 1.1 Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[1] Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng y sinh vì độ nhạy tốt và có thể vi cấu trúc hóa để chuyển đổi thành các thiết bị cầm tay. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa phần tử nhận biết sinh học và phần 3
tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu được nhận biết bởi kỹ thuật điện hóa. Các kỹ thuật điện hóa có thể được sử dụng để đánh giá một cách định lượng (theo nồng độ) hoặc định tính (âm tính/dương tính) sự có mặt của các thành phần sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trong dung dịch. Có nhiều phương pháp để đo tín hiệu điện hóa khi có sự tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích như đo dòng, đo thế, đo độ dẫn và đo phổ tổng trở…[54]. Tuy nhiên, bên cạnh đó cảm biến sinh học điện hóa cũng có nhiều nhược điểm như (1) cần thiết bị nghiên cứu đắt tiền (máy đo), các điện cực để nghiên cứu cũng có chi phí cao, gia công phức tạp. So với cảm biến điện hóa thì cảm biến so màu có một số lợi thế như có thể quan sát bằng mắt thường nhờ sự chuyển màu của các chất chỉ thị, dụng cụ tiến hành đơn giản, gia công dễ dàng…Do đó cảm biến sinh học so màu đang được dùng nhiều trong thực tế và khẳng định được sự tin cậy như phép xét nghiệm ELISA trong xét nghiệm bệnh ung thư, cảm cúm, các bệnh do virus, ở bệnh viện [1, 2]. 1.1.2 Các thành phần của cảm biến sinh học 1.1.2.1 Đầu dò (capture probe) Cảm biến sinh học là khái niệm chỉ cảm biến mà có đầu dò là các phần tử sinh học (bioreceptors) như là enzym, kháng thể (antibody), các chuỗi DNA hoặc RNA hoặc các chuỗi peptit hoặc protein dùng để phát hiện các chất cần phân tích. Quan hệ giữa đầu dò (probe) và đối tượng cần phát hiện (hay còn gọi là đích- target) có thể tóm lược thành 3 nhóm chính như sau: (1) Nếu đầu dò là các đoạn DNA hay RNA hoặc axit nucleic peptide sẽ ứng dụng trong chế tạo các bộ cảm biến DNA hay RNA nhằm phát hiện ra các đoạn DNA hoặc RNA dùng trong các nghiên cứu sinh học xét nghiệm huyết thống bệnh tật, trong chuyển đổi gen. Nguyên tắc hoạt động là các chuỗi này có quan hệ bổ sung (ghép cặp) rất nhạy và rất chọn lọc nên cảm biến loại này có độ nhạy cao và tính chọn lọc [3-17]. Ngày nay, chủ yếu là oligodeoxyribo- nucleotides tổng hợp (ODNs) được sử dụng làm đầu dò trong cảm biến DNA. (2) Với đầu dò là kháng thể (antibody) thì sẽ dùng để phát hiện kháng nguyên (antigen) tạo ra cảm biến miễn dịch (immunosensor). Một kháng thể (antibody) sẽ liên kết một cách đặc hiệu với một đối tượng kháng nguyên (antigen) [7, 18-22], tạo ra độ chọn lọc cao (tính đặc hiệu tốt) cho phép phân tích. Cảm biến kiểu này dùng rất phổ biến với nhiều 4
bộ kit được phát triển để phân tích các mẫu thực phẩm, nước uống, bệnh phẩm…với tên gọi chung là bộ kit ELISA. Ví dụ bộ kit xét nghiệm là các chất độc hại như 2,4-D (chất độc màu da cam); các phụ gia trong sản xuất giấy gói có ảnh hưởng đến sức khỏe như bisphenol A; các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu như atrazine hoặc các loại protein bệnh như virus cúm, bệnh ung thư. (3) Với đầu dò là enzym có cảm biến enzym dùng để phát hiện các phân tử đích (target) đặc trưng của chúng (hay còn gọi là cơ chất của enzym). Một số cảm biến enzym đã được phát triển và ứng dụng [23-29]. Ví dụ với đầu dò là enzym thì sẽ dùng để phát hiện các cơ chất tương ứng với enzym đó, ví dụ enzym glucose oxidase (GOx) dùng để phát hiện glucose; enzym cholesterol oxidase dùng để phát hiện cholesterol….Ngoài ra, do cảm biến enzym rất nhạy, phản ứng nhanh và chọn lọc nên cảm biến enzym còn được dùng trong việc khuếch đại tín hiệu để nâng cao giói hạn phát hiện cho các loại cảm biến khác. Trong Luận án này sử dụng đầu dò enzym GOx để nhận biết cơ chất tương ứng là glucose, một trong các chỉ số sinh hóa quan trọng của máu. GOx sẽ oxy hóa glucose thành gluconic và giải phóng H2O2 theo phản ứng (PT 1.1). GOx 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 + O2 + H2 O → Gluconic + H2 O2 (PT 1.1) Có nhiều cách khác nhau để đo nồng độ H2O2 giải phóng ra theo (PT 1.1) và nồng độ H2O2 sẽ phản ánh nồng độ glucose trong mẫu. Ngày nay, phân tích glucose bằng GOx tích hợp thêm enzym Horseradish peroxidase (HRP) một loại enzym phân hủy H2O2 tạo gốc OH tự do và giải phóng electron qua đó có thể đo nồng độ H2O2 bằng phương pháp điện hóa hoặc so màu trở thành một cấu trúc cảm biến sinh học kinh điển. 1.1.2.2 Bộ phận chuyển đổi (transducer) Hình 1.2 Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[2] Bộ phận chuyển đổi trong các cảm biến sinh học là bộ phận chuyển đổi tín hiệu của việc bắt cặp nhau giữa đầu dò và đích thành các tín hiệu có thể đo được [30-32]. Tùy vào 5
tín hiệu đầu ra (output signal) mà chúng ta có thể gọi tên là cảm biến điện hóa hay cảm biến quang…Như tóm tắt ở hình 1.2, hầu hết các loại cảm biến sinh học có thể phân thành 5 loại bộ phận chuyển đổi tín hiệu khi có phản ứng (bắt cặp giữa đầu dò và đích) thành tín hiệu đo đạc được, gồm tín hiệu điện hóa (electrochemical), điện (electrical), quang (optical), cơ hoặc áp điện (piezoelectric) hoặc nhiệt (thermal). Trong luận án này chúng tôi sử dụng bộ phận chuyển đổi quang học hay còn gọi là cảm biến quang với sự đổi màu của chất chỉ thị nên còn có thể gọi là cảm biến so màu. 1.1.3 Cảm biến so màu Từ khi ngành hóa học phát triển đã sử dụng các chất chỉ thị, chất chỉ thị màu để phát hiện môi trường các chất một cách nhanh chóng và đến nay các chất chỉ thị vẫn được sử dụng rộng dãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Để nâng cao độ tiện dụng cũng như để ứng dụng rộng rãi trong đời sống người ta đã chế tạo ra các bộ kit so màu để xác định nồng độ một số chất thậm chí để xác định tình trạng bệnh tật. Chẳng hạn, bộ so màu đơn giản và hay dùng nhất là giấy pH (hình 1.3a), sau đó là các que thử như thử 10 chỉ tiêu trong nước tiểu (gồm pH, tỷ trọng) (hình 1.3b và 1.3c), giấy thử hàn the trong thực phẩm như chả, bún, phở (hình 1.3d); bộ kit xét nghiệm sự có mặt của methanol trong rượu (hình 1.3e) và cao cấp là que thử thai (hình 1.3f). Hình 1.3 Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10 thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai. Nguyên tắc hoạt động của cảm biến so màu ở dạng giấy chỉ thị khá đơn giản, đó là trên cơ sở giấy có độ tro thấp, người ta sẽ tẩm các hóa chất đóng vai trò là chất chỉ thị lên. Khi thử, gặp các tác nhân cần kiểm tra ở trong mẫu thì chỉ thị sẽ biến đổi màu, tùy thuộc 6