Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật môi trường: Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ Dioxin của vi sinh vật sinh Enzyme Laccase

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:146

Thêm vào BST

Báo xấu

67
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án nhằm phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase và laccase-like có tiềm năng cao; lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like cao; chiết tách và tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm; nghiên cứu đặc tính hóa-lý, hóa-sinh cơ bản của laccase, laccase-like tinh sạch; đánh giá hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính; đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ; đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại. Để nẵm rõ hơn về nội dung các nghiên cứu, mời các bạn cùng tham khảo luận án.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật môi trường: Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ Dioxin của vi sinh vật sinh Enzyme Laccase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHÙNG KHẮC HUY CHÚ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Hà Nội, 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHÙNG KHẮC HUY CHÚ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường Mã số: 9.52.03.20 LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS Đặng Thị Cẩm Hà Hà Nội, 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án tiến sỹ “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase” là công trình nghiên cứu do chính tôi tự thực hiện. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Các trích dẫn sử dụng trong luận án đã được ghi rõ tên tác giả tài liệu tham khảo. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 TÁC GIẢ LUẬN ÁN NCS Phùng Khắc Huy Chú
Lời cảm ơn Để hoàn thành được luận án, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy đã tận tâm, tận tình và nhiệt thành đã hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện thuận lợi và kịp thời trong những lúc khó khăn, vất vả để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi chân thành cảm ơn các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy Binh chủng Hóa học; các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy, các đồng chí, đồng nghiệp công tác tại Phòng Khoa học quân sự và Viện Hóa học - Môi trường quân sự, Bộ Tư lệnh Hóa học đã hết sức giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và tối đa về mặt tinh thần và một phần vật chất cho tôi khi tôi tham gia học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Bên cạnh đó, để có thể hoàn thành được luận án này, tôi chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Ngọc Ánh, ThS Lê Việt Hưng, ThS Nguyễn Hải Vân cùng toàn thể các đồng nghiệp trong phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường,Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, làm việc nhóm một cách có hiệu quả để thực hiện một số nội dung liên quan đến luận án. Để hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh đến được đích cuối cùng, tôi chân thành cảm ơn lãnh đạo, các thầy, các cô và các anh chị phụ trách đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là lãnh đạo, các thầy, cô của Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt, chỉ dạy những kiến thức, kinh nghiệm và chia sẽ những khó khăn của bản thân tôi trong những năm tháng đã qua. Hoàn thành được luận án nghiên cứu này, tôi đã liên tục nhận được sự động viên to lớn của gia đình, dòng họ và đặc biệt là của “đồng chí vợ” đã luôn ở bên, chủ động khắc phục mọi khó khăn của gia đình nhỏ bé của tôi để động viên và tạo điểu kiện thuận lợi nhất để tôi yên tâm hoàn thành chương trình đào tạo tiến sỹ này. Tôi rất cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài đơn vị đã dành cho tôi. Luận án được thực hiện với sự tài trợ về kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước: "Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, các enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin", Mã số DTDLCN.13/14 do PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà làm chủ nhiệm Đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 NGHIÊN CỨU SINH Phùng Khắc Huy Chú
MỤC LỤC Mục lục Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 4 1.1.1. Giới thiệu chung về laccase 4 1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase 4 1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase 5 1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase 6 1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase 7 1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ 8 1.1.1.6. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ có clo 12 1.1.2. Giới thiệu về laccase-like 13 1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và công nghệ xử lý 17 1.2.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm 17 1.2.1.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm 17 1.2.1.2. Đặc điểm chủng của nước thải dệt nhuộm 18 1.2.2. Các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm 19 1.2.2.1. Phương pháp hóa lý 19 1.2.2.2. Phương pháp oxy hóa nâng cao 20 1.2.2.3. Phương pháp sinh học 21 1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý 26 1.3.1. Hiện trạng ô nhiễm 26 1.3.2. Công nghệ xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm 28 1.3.3. Phương pháp phân hủy sinh học xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ 30 1.3.3.1. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi laccase 31 1.3.3.2. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi nấm sinh 33 tổng hợp enzym ngoại bào CHƯƠNG 2 40 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 40 2.1.1. Vật liệu để phân lập vi sinh vật và các chủng nấm kế thừa 40 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu xử lý 40 2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 41 2.1.4. Thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật 43 2.2.1.1. Phân lập chủng nấm 43 2.2.1.2. Phân lập xạ khuẩn 43 2.2.1.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao 43
2.2.1.4. Nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trên các nguồn chất hữu cơ 43 vòng thơm khác nhau 2.2.2. Phân loại vi sinh vật 44 2.2.2.1. Phân loại VSV theo hình thái khuẩn lạc 44 2.2.2.2. Phân loại VSV theo phương pháp sinh học phân tử 44 2.2.3. Phương pháp hóa - sinh 45 2.2.3.1. Xác định hoạt tính laccase, laccase-like sử dụng ABTS 45 2.2.3.2. Tinh sạch, nhận diện protein của laccase, laccase-like 46 2.2.3.3. Xác định đặc tính protein của laccase, laccase-like tinh sạch 48 2.2.4. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm 49 2.2.4.1. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 49 2.2.4.2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi chủng nấm 51 2.2.5. Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 52 2.2.5.1. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng laccase thô 52 2.2.5.2. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng chủng nấm sinh tổng hợp 54 laccase 2.2.5.3. Phương pháp phân tích để xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 55 2.3. Phương pháp xử lý số liệu 55 CHƯƠNG 3 57 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm và xạ khuẩn có khả năng 57 sinh tổng hợp laccase, laccase-like 3.1.1. Phân lập và lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt tính laccase cao 57 3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trên môi trường 60 chứa chất diệt cỏ/dioxin và sinh tổng hợp laccase-like 3.1.2.1. Phân lập xạ khuẩn 60 3.1.2.2. Phân loại chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929 61 3.1.3. Môi trường để chủng nấm, chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase, laccase-like 64 3.1.3.1. Môi trường thích hợp để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase 64 3.1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like của XKBHN1 và XKBiR929 trên môi 65 trường chứa các chất hữu cơ clo khác nhau 3.2. Đặc điểm hóa-lý của laccase, laccase-like tinh sạch 68 3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 68 3.2.2. Tinh sạch laccase-like của xạ khuẩn Streptomycese sp. XKBiR929 70 3.2.3. Đặc tính hóa-lý của laccase và laccase-like tinh sạch 71 3.2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến laccase tinh sạch 71 3.2.3.2. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch 78 3.2.3.3. Đặc tính hóa-lý của laccase thô 79 3.2.3.4. Đặc tính hóa - lý của laccase-like tinh sạch 81 3.3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin 84 3.3.1. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 84 3.3.1.1. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô của chủng nấm FBV40 84 3.3.1.2. Loại màu hoạt tính sử dụng trong quân đội bởi laccase thô 89 3.3.1.3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1 tinh sạch 96 3.3.1.4. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase-like tinh sạch của 97 chủng xạ khuẩn XKBiR929 3.3.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi Rigidoporus sp.FBV40 98
3.3.2.1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải 98 may quân trang 3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau 101 3.3.2.3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose 102 3.3.2.4. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại đường khác nhau 103 3.3.2.5. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các nguồn nitơ khác nhau 106 3.3.3. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh tổng hợp laccase 108 3.3.3.1. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô 108 3.3.3.2. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase 112 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN 123 ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC
Danh mục các chữ viết tắt 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-TCP 2,4,5-trichlorophenol 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4-DCP 2,4-dichlorophenol ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) BH Sân bay Biên Hòa CDD Chất diệt cỏ chứa dioxin CGK Chất gắn kết DBF Dibenzofuran DCĐ Dịch chiết đất DD Dibenzo-p-dioxin DBP Dibromophenol đtg Đồng tác giả HBT 1-Hydroxybenzotriazole HCHC Hợp chất hữu cơ LiP Lignin peroxidase LMCO Laccase multicopper oxidase MN.FBN Megafix navy FBN MnP Mangan peroxidase MR.EBR Megafix red EBR MT.BES Megafix turquoise BES MY.BES Megafix yellow BES MY.EG Megafix yellow EG MCDD Mono chlorodibenzo-p-dioxin NN.SG Nova navy SG NY.FN2R Nova yellow RN2R NY.S3R Nova yellow S3R NY1 acid red 299 NY5 acid blue 281 NY7 acid red 266 PAH Polycyclic Aromatic Hydrocacbon = hydrocacbon đa nhân PCB Polychlorinatedbiphenyl PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxin PCDFs Polychlorinated dibenzofuran POPs Các hợp chất hữu cơ khó phân hủy ppm Parts per million (mg/kg) ppt Parts per trillion (ng/kg) RBBR Remazol Brilliant Blue R TBP Tribromophenol VA Valli anilin ViO Violuric acid VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật
Danh mục bảng Bảng Tên bảng Trang Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ Bảng 1.1 9 vòng thơm Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy PAH, thuốc Bảng 1.2 10 bảo vệ thực vật ở Việt Nam Bảng 1.3 Ứng dụng của laccase trong phân hủy các chất hữu cơ có clo 12 Bảng 1.4 Phân loại màu và tính chất các màu thuốc nhuộm 17 Bảng 1.5 Các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm 20 Ứng dụng của laccase trong phân hủy sinh học thuốc Bảng 1.6 23 nhuộm Bảng 1.7 Các công nghệ có thể xử lý đất, trầm tích ô nhiễm dioxin 30 Bảng 1.8 Phân hủy các đồng loại dioxin bởi nấm đảm 36 Tổng hợp các thực nghiệm nghiên cứu loại màu thuốc Bảng 2.1 49 nhuộm bởi laccase, laccase-like Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi nấm đảm Bảng 2.2 52 sinh tổng hợp laccase Bảng 3.1 Đặc điểm mẫu nấm đã phân lập được 58 Bảng 3.2 Hoạt tính laccase-like của các chủng xạ khuẩn 61 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hai chủng xạ khuẩn XKBHN1 Bảng 3.3 61 và XKBiR929 Ảnh hưởng của chất ức chế lên hoạt tính Lac1, Lac2 của Bảng 3.4 75 FBV40 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính Lac1 và Lac2 76 Bảng 3.6 Quan hệ giữa nồng độ ABTS với hoạt tính laccase tinh sạch 78 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới hoạt tính laccase thô Bảng 3.7 79 của FBV40 So sánh hiệu suất loại màu thuốc nhuộm sử dụng laccase từ Bảng 3.8 87 FBV40 và các chủng nấm đảm khác Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm và biến động hoạt tính Bảng 3.9 89 laccase theo thời gian (%) Biến động hoạt tính laccase trong quá trình loại màu thuốc Bảng 3.10 nhuộm MN.FBN bởi FBV40 trong môi trường chứa các 104 loại đường khác nhau Khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết bằng laccase thô chủng Bảng 3.11 109 FBV40 Khả năng phân hủy chất diệt cỏ và các chất ô nhiễm khác Bảng 3.12 110 bằng laccase thô Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất ô nhiễm bởi chủng Bảng 3.13 112 FBV40 Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất bởi đơn chủng Bảng 3.14 113 FBV40 và hỗn hợp chủng FBV40, FBD154 và FNBLa1 Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng và hỗn hợp Bảng 3.15 117 chủng
Danh mục hình Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc không gian ba chiều của laccase 5 Cơ chế giả định sự phân hủy 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo) Hình 1.2 22 benzenesulfonic Acid bởi laccase Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện nghiên cứu 42 Hỉnh ảnh sợi, bào tử dưới kính hiển vị điện tử và ảnh phân lập Hình 3.1 58 mặt trước, mặt sau của chủng FBV40 Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loài chủng nấm FBV40 60 Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng XKBHN1 Hình 3.3. 62 (A, C) và chủng XKBiR929 (B, D) Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loài 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 63 Hình 3.5 Hoạt tính laccase thô chủng FBV40 ở các môi trường nuôi cấy 65 Hình 3.6 Khả năng sinh tổng hợp laccase-like theo thời gian 67 Hình 3.7 Hoạt tính laccase tinh sạch của chủng FBV40 69 Hình 3.8 Diện di protein chủng FBV40 69 Hình 3.9 Hoạt tính laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929 70 Hình 3.10 Phản ứng oxy hóa của laccase-like tinh sạch với ABTS 71 Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH lên Lac 1, Lac 2/FBV40 72 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ bền nhiệt lên hoạt tính 73 Hình 3.13 Cơ chất đặc hiệu đối với Lac1 (A) và Lac 2 (B) 74 Ảnh hưởng của chất ức chế lên Lac 1 (A), Lac 2 (B) của Hình 3.14 76 chủng FBV40 Hình 3.15 Ảnh hưởng của ion kim loại lên Lac 1, Lac 2/FBV40 77 Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất với hoạt tính Lac1 (A) và Hình 3.16 78 Lac2 (B) Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền pH (B); ảnh hưởng của nhiệt độ (C, D); động học xúc tác (E, G) và ảnh Hình 3.17 81 hưởng của chất ức chế và ion kim loại (H, K) lên hoạt tính laccase thô của chủng FBV40 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền (B); động học Hình 3.18 xúc tác (C, D) và ảnh hưởng của chất ức chế (E) và ion kim 82 loại (G) lên laccase-like tinh sạch của XKBiR929 Khả năng loại màu NY1 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase Hình 3.19 85 theo thời gian (B) Khả năng loại màu NY5 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase Hình 3.20 85 theo thời gian (B) Khả năng loại màu NY7 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase Hình 3.21 86 theo thời gian (B) Phổ UV-Vis và hình ảnh loại màu một số thuốc nhuộm hoạt Hình 3.22 91 tính thương mại của Nhà máy X20/TCHC Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt ViO ở Hình 3.23 93 các nồng độ khác nhau Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với Hình 3.24 95 thuốc nhuộm MN.FBN Hình 3.25 Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với 95
Hình Tên hình Trang thuốc nhuộm NN.SG Khả năng loại màu và thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian Hình 3.26 96 loại màu MN.FBN khi có mặt D-glucose Hình 3.27 Loại màu MN.FBN bởi Lac1 97 Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng laccase-like Hình 3.28 97 của chủng XKBiR929 Khả năng loại màu và sự biến động hoạt tính laccase theo thời Hình 3.29 gian trong loại màu thuốc nhuộm MY.EG, MY. BES, 99 MN.FBN Phổ UV-Vis của thuốc nhuộm MN.FBN sau khi nuôi cấy Hình 3.30 100 bằng FBV40 sau 1 ngày (A) và sau 4 ngày (B) Khả năng loại màu MN.FBN bằng chủng FBV40 sau 1 ngày Hình 3.31 100 (A) và sau 4 ngày nuôi cấy (B) Khả năng loại màu MN.FBN và hoạt tính laccase của chủng Hình 3.32 101 FBV40 Sự thay đổi màu MN.FBN bằng chủng FBV40 ở các nồng độ Hình 3.33 thuốc nhuộm 50, 100 và 200 mg/L sau 1 ngày (A), 2 ngày (B) 102 và sau 3 ngày (C) Khả năng loại màu bằng chủng FBV40 với nồng độ D-glucose Hình 3.34 102 khác nhau Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng chủng FBV 40 (A) và Hình 3.35 hoạt tính laccase (B) theo thời gian trong môi trường nuôi 104 cấy chứa các loại đường khác nhau Phổ UV-Vis của màu thuốc nhuộm MN.FBN được loại bằng Hình 3.36 chủng FBV40 trong môi trường chứa các loại đường sau 4 104 ngày nuôi cấy Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV40 Hình 3.37 trong môi trường chứa các loại đường khác nhau sau 2 ngày 105 (A), 3 ngày (B) và sau 7 ngày (C) Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV Hình 3.38 40 (A) và hoạt tính laccase (B) theo thời gian khi sử dụng các 106 hợp chất chứa nitơ Hình 3.39 Hoạt tính laccase theo thời gian xử lý DCĐ 109 Hàm lượng và hiệu suất phân hủy 2,4,5-T (A), hoạt tính laccase Hình 3.40 110 thô theo thời gian (B) Hiệu suất phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động hoạt Hình 3.41 111 tính laccase thô theo thời gian (B) Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự thay đổi hoạt Hình 3.42 113 tính laccase thô theo thời gian (B) Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến Hình 3.43 114 động hoạt tính laccase thô theo thời gian (B) Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD (A) và quá trinh sinh tổng Hình 3.44 116 hợp laccase theo thời gian (B)
1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, ô nhiễm bởi các loại hóa chất trong đó có các chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) do con người tạo ra ngày càng được phát hiện nhiều, mức độ ngày càng nghiêm trọng và hậu quả gây nên rất nhiều hệ lụy cho sức khỏe con người, môi trường và hệ sinh thái. Các chất gây ô nhiễm môi trường phổ biến trong nước thải công nghiệp hiện nay ở Việt Nam gồm các hợp chất của phenol, các hợp chất đa vòng thơm chứa halogen và thuốc nhuộm, v.v. Ở các nước đang phát triển như Việt Nam, việc sử dụng và xả thải hóa chất trong nông nghiệp, công nghiệp, y dược và các ngành sản xuất khác không có khả năng kiểm soát đã gây nên những hậu quả nghiêm trọng với môi trường và con người. Nhiều chất ô nhiễm được thải ra môi trường có độc tính cao, thời gian bán hủy dài, khả năng tích lũy cao ở các dạng khác nhau trong hệ sinh thái dẫn đến giảm đa dạng sinh học và xuất hiện nhiều loại bệnh hiểm nghèo. Ngoài ra, ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật, các chất diệt cỏ chứa dioxin có nguồn gốc từ chiến tranh hoặc nước thải ngành dệt nhuộm vẫn hàng ngày âm thầm gây tác động lớn tới môi trường và sức khỏe con người. Những chất ô nhiễm này đều là những chất rất bền vững và khó bị phân hủy bằng các công nghệ, giải pháp đơn giản nên để tiến tới xử lý triệt để ô nhiễm cần tính tới các giải pháp tích hợp các công nghệ, giải pháp để xử lý và quản lý bền vững. Với các thành tựu khoa học công nghệ ngày càng được nâng cao và hướng tiếp cận sử dụng tổ hợp các chuỗi công nghệ, giải pháp thì khả năng xử lý triệt để hoàn toàn các chất ô nhiễm trên ngày càng có tính khả thi cao hơn. Đến nay, di chứng của dioxin tới nạn nhân chất độc màu da cam đã đến thế hệ thứ 4. Trong hai thập kỷ qua các nghiên cứu ở quy mô khác nhau đều nhằm tìm kiếm các công nghệ khả thi để xử lý khử độc ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong môi trường phù hợp với điều kiện Việt Nam. Nhiều nghiên cứu từ năm 1999 trong phòng thí nghiệm, quy mô pilot và hiện trường sử dụng công nghệ phân hủy sinh học (bioremediation) đã chứng minh là một trong các giải pháp có hiệu quả cao về công nghệ, kinh tế và môi trường. Ở quy mô hiện trường, sử dụng công nghệ phân hủy sinh học đã xử lý hoàn toàn 3.384m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, kết quả đã được Hội đồng khoa học độc lập cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ đánh giá, sau 40 tháng xử lý tổng độ độc trung bình trong các lô xử lý sinh học tại sân bay Biên Hòa chỉ còn 14,12 ngTEQ/kg đất khô (99,6% độ độc đã bị loại bỏ), thấp dưới ngưỡng quy định cho đất sử dụng trồng cây hàng năm theo QCVN45:2012 (40 ng TEQ/kg) [29].
2 Cho đến thời điểm này, chưa có thông báo nào liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở các quy mô khác nhau bằng các vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào, enzyme thô do chúng sinh ra nói chung và laccase nói riêng. Trong khi đó, Việt Nam là một nước nhiệt đới có đa dạng sinh học cao nằm trong top 10 của thế giới, đặc biệt là đa dạng vi sinh vật. Có nhiều loài vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme khác nhau, trong đó có hai họ oxidoreductase và peroxidase với nhiều ứng dụng mang hiệu quả cao trong các lĩnh vực kinh tế, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Laccase thuộc nhóm oxidoreductase có khả năng hoạt động mạnh chỉ cần oxy tự do để oxy hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ vòng thơm trong thời gian ngắn. Chúng đã trở thành tâm điểm của nhiều nghiên cứu sàng lọc, sản xuất công nghiệp của hàng trăm phòng thí nghiệm và công ty trên toàn thế giới. Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu của nghiên cứu sinh với tên “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase” đã được tiến hành với mục đích tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like để có thể sử dụng trong phân hủy các chất ô nhiễm đa vòng thơm chứa và không chứa clo, cụ thể là hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và thuốc nhuộm hoạt tính. Kết quả thu được sẽ giúp chúng ta hiểu sâu sắc thêm về tiềm năng của laccase, laccase-like và bản thân chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chúng nhằm hướng tới nghiên cứu tạo công nghệ khả thi để xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ tồn tại trong môi trường. Mục tiêu: - Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh laccase, laccase-like từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì, trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa; - Đánh giá khả năng phân hủy các chất diệt cỏ chứa dioxin và loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase, laccase-like và chủng VSV được lựa chọn nhằm định hướng áp dụng trong hoạt động quốc phòng. Nội dung chính của luận án cần thực hiện:  Phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase và laccase-like có tiềm năng cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì và đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin khu vực Z1 và khu vực mới Tây Nam (Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa, Đồng Nai;  Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like cao;
3  Chiết tách và tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cao đã được phân lập;  Nghiên cứu đặc tính hóa-lý, hóa-sinh cơ bản của laccase, laccase-like tinh sạch;  Đánh giá hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase, laccase-like và bản thân chủng VSV sinh tổng hợp laccase, laccase-like;  Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T tinh khiết và có trong đất ô nhiễm (dịch chiết đất -DCĐ) tại sân bay Biên Hòa bởi laccase, đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;  Đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase; NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Công trình đầu tiên nghiên cứu tinh sạch và đặc tính laccase-like được sinh tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBiR929 và khả năng của laccase-like trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại MN.FBN; 2. Chứng minh được nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 có hoạt tính laccase thô lên tới 107.708 U/L và tiềm năng cao trong loại màu thuốc nhuộm tổng hợp gốc azo, anthraquinone và đặc biệt là màu thuốc nhuộm thương mại được sử dụng trong quân đội; 3. Khẳng định nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 đồng thời có khả năng phân hủy được các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T và đồng loại độc nhất của dioxin là 2,3,7,8-TCDD. Bên cạnh đó, đã làm sáng tỏ hỗn hợp các loài nấm khác nhau (nấm đảm và nấm sợi) có khả năng sinh tổng hợp laccase phân lập từ thiên nhiên Việt Nam không chỉ phân hủy được 2,4-D, 2,4,5-T mà còn phân hủy được cả đồng loại 2,3,7,8- TCDD đạt hiệu suất cao hơn gấp 2 lần khi chỉ sử dụng đơn chủng với tổng độ độc ban đầu tới 2000 ng TEQ/L; Hy vọng với kết quả ban đầu của công trình nghiên cứu này sẽ góp phần định hướng tiếp cận trong triển khai các nghiên cứu tiếp theo, để sáng tạo nên các chuỗi công nghệ mang tính đột phá trong sử dụng hỗn hợp vi sinh vật và các chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh tổng hợp như laccase, laccase-like đều có tiềm năng cao để giải quyết vấn đề ô nhiễm màu thuốc nhuộm trong hoạt động quốc phòng và xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy (POPs) trong đó có chất diệt cỏ chứa dioxin.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 1.1.1. Giới thiệu chung về laccase Laccase ngày càng được quan tâm nhiều hơn trong những năm gần đây do tiềm năng của chúng trong việc phân hủy, khử độc các chất ô nhiễm là các hợp chất của phenol và các chất đa vòng thơm [142]. Laccase thuộc nhóm oxidoreductase là một trong số ít các enzyme đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19. Năm 1883, Yoshida là người đầu tiên mô tả laccase từ dịch chiết thân cây Rhus vernicifera ở Nhật Bản [52]. Laccase có hiệu quả oxy hóa với phổ cơ chất rộng và do chỉ sử dụng oxy là tác nhân nhận điện tử cuối cùng nên nó được áp dụng trong nhiều ngành công nghiệp với những mục đích khác nhau như dệt nhuộm, chế biến thức ăn, nhiên liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ, xử lý môi trường, giấy và nước thải, dược phẩm và công nghiệp mỹ phẩm. Thực tế, đã có một số sản phẩm laccase thương mại để ứng dụng trong các lĩnh vực chế biến thức ăn, giấy, dệt nhuộm và các ngành công nghiệp khác [89, 155]. 1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase Một loài sinh vật có thể sinh tổng hợp có nhiều loại laccase khác nhau (các isozyme) và các isozyme thường khác nhau về trình tự axit amin và tính chất động học xúc tác. Isozyme laccase khác nhau ở mức độ glycosyl hóa và thành phần các gốc carbonhydrat. Loài nấm đảm Trametes versicolor có 5 loại isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrat của chúng thay đổi từ 10-45% so với khối lượng của protein. Phân tử laccase có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60-100 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10-25% [72]. Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.
5 Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc 3 chiều của laccase (A) của chủng Bacillus subtilis 168. Ion màu xanh là 4 nguyên tử đồng. (B) số lượng nghiên cứu công bố về các loại enzyme trong giai đoạn 1940 - 2013 [9] Cấu trúc 3 chiều của laccase bao gồm 3 tiểu phần (vùng A: màu đỏ, vùng B: màu vàng và vùng C: màu xanh lá cây) có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều đóng vai trò trong quá trình xúc tác. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [147]. Trung tâm đồng một chỉ chứa một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.1) [99]. 1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase Cơ chất khi bị oxy hóa bởi laccase sẽ nhường một electron cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, thông qua hợp chất trung gian peroxy và peroxy bị khử thành nước. Một số nhà nghiên cứu cho rằng, sự oxy hóa hợp chất peroxy trung gian hình thành laccase ở trạng thái bị oxy hoạt hóa, trong đó cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái oxy hóa. Sau đó, enzyme nhanh chóng tham gia vào chu trình xúc tác mới [99]. Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể diễn ra theo cách khác đó là khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Các phân
6 tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế oxi hóa khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm xúc tác của laccase. Trong trường hợp này cần một chất gắn kết (mediator) hoặc hệ chất gắn kết để tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase để bị laccase oxy hóa, sau đó mediator ở dạng oxy hóa nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác [117]. Ngược lại, laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục tham gia vào chu trình xúc tác tiếp theo. Các mediator thường phù hợp cho laccase là 3-hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2’- azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic axit) (ABTS), N-hydroxybenzo- trialzone (HOBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (ViO) v.v. Sự có mặt của mediator đã góp phần làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase. 1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase Đến nay, đã có khoảng 100 loại laccase khác nhau đã được tinh sạch và xác định đặc điểm sinh hóa với các cơ chất là ABTS, 2,6-DMP và SGZ. Gene laccase đặc biệt mã hoá cho một protein khoảng 500 - 600 amino acid và trọng lượng phân tử trong khoảng 60 đến 90 kDa khi được xác định bằng SDS-PAGE [156]. Đến tháng 9 năm 2017, có khoảng 112.000 kết quả tra cứu các tiêu đề bài báo khoa học có từ khóa laccase (https://scholar.google.com.vn). Đã có một vài hệ gene của các chủng nấm có chứa hơn một gene laccase [36]. Mức độ biểu hiện của các gene điển hình khác nhau phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy [145]. Với hàm lượng nitơ cao trong môi trường đã giảm sự dịch mã của gene laccase trong chủng Basidiomycete sp. I-62 (CECT 20197) và loài Pleurotus sajorcaju [18]. Có nhiều bước được sử dụng trong quá trình tinh sạch protein laccase như siêu lọc (lọc thẩm thấu màng), kết tủa với amoni sulfat hoặc với dung môi hữu cơ và trao đổi ion cũng như sắc ký khối lượng. Laccase đại diện của nấm là các protein có khối lượng trong khoảng 50 đến 90 kDa, điểm đẳng điện xung quanh giá trị 4.0. Một số loài nấm sinh tổng hợp laccase đã được nghiên cứu bao gồm Coprinus plicatilis, Fomes fomentarius, Heterobasidion annosum, Hypholoma fasciculare, Kuehneromyces mutabilis, Leptoporus litschaueri, Panus stipticus, Phellinus igniarius, Pleurotus corticatus, P. ostreatus, Polyporus brumalis, Stereum hirsutum, Trametes gibbosa, T. hirsuta, và T. versicolor có hơn một isozyme và điểm đẳng điện (pI) trong khoảng từ 3 đến 5 [4].
7 Khả năng xúc tác của enzyme đã được mô tả thông qua định lượng bằng hằng số Michaelics Km và hằng số hiệu quả xúc tác Kcat. Những hằng số này đã được công bố với một lượng lớn laccase và có sự khác biệt trong số chúng. Hằng số Km của laccase nhìn chung dao động xung quanh giá trị 2,5 𝜇M phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất. Giá trị Km của laccase được xác định với cơ chất là 2,6- dimethoxyphenol nhìn chung là cao hơn khi xác định với syringadazine (sự trùng hợp của hai phân tử là 2,6-dimethoxyphenol được liên kết với nhau bằng cầu azide) [117]. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và các điều kiện nhiệt độ lên hoạt tính laccase đã được thực hiện. Theo đó, sự biến động hoạt tính của laccase theo pH thường có hình chuông và khoảng tối ưu xung quanh giá trị 4,6 khi sử dụng cơ chất có nguồn gốc phenol [139]. Hoạt tính laccase giảm trong điều kiện pH trung tính hoặc kiềm là do tăng anion - OH, anion này có kích thước nhỏ nên là tác nhân gây ức chế hoạt tính của laccase. Khi pH tăng thế khử của cơ chất có bản chất phenol giảm dẫn đến cơ chất này nhạy cảm hơn với quá trình oxy hoá bởi laccase [47, 48]. Sự ổn định hoạt tính laccase đối với pH nhìn chung trong khoảng từ 8-9 [175] và sự ổn định hoạt tính của laccase theo nhiệt độ thay đổi phụ thuộc lớn vào nguồn gốc vi sinh vật, nhìn chung nằm trong khoảng từ 30 đến 50oC và hoạt tính giảm nhanh chóng ở nhiệt độ trên 60oC [114, 94]. 1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase Laccase từ thực vật được tìm thấy trong xylem nơi chúng có thể oxy hóa các monoligno ở trạng thái ban đầu của quá trình lignin hóa và cũng tham gia trong các cơ chế gốc cơ bản của sự hình thành lignin cao phân tử [79]. Thêm vào đó laccase đã được nghiên cứu về khả năng tham gia vào bước đầu tiên của quá trình hàn gắn vết thương trên lá [133]. Hiện tại, nghiên cứu về laccase thực vật bậc cao còn rất hạn chế so với laccase từ các chủng nấm [113, 147]. Thực tế, một số nghiên cứu về hoạt tính laccase ở vi khuẩn không giống laccase ở các nhóm nhân sơ [24]. Protein laccase của vi khuẩn là protein nội bào hoặc ở khoang chu chất [4]. Chủng Bacillus subtilis đã sinh ra loại laccase CotA ổn định nhiệt tham gia vào sự hình thành màu ở màng nội bào [88]. Laccase cũng đã được tìm thấy từ loài Streptomyces cyaneus [3] và S. lavendulae. Laccase đã được nghiên cứu khá chi tiết ở nhiều chủng nấm thuộc nấm sợi (Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes) và chúng đã được tinh sạch từ nhiều
8 chủng khác nhau. Có nhiều nghiên cứu về sản phẩm laccase tinh sạch của các loài nấm Ascomycetes như loài Melanocarpus albomyces [69], Cerrena unicolor [70], Magnaporthe grisea [19], Trametes versicolor, Trichoderma reesei [81] và Xylaria polymorpha [102]. Nấm men là nhóm riêng biệt có thể thuộc cả Ascomycetes và Basidiomycetes. Hiện nay, laccase được tinh sạch từ chủng Cryptococcus (Filobasidiella) neoformans gây bệnh cho người, chủng nấm men này sinh ra laccase thật có khả năng oxy hóa phenol và aminophenol và cũng có thể oxy hóa tyrosine [34]. Ngoài ra, laccase còn có thể tìm thấy trong một số côn trùng nơi mà chúng được cho là thể kích hoạt quá trình hình thành biểu bì [35]. Ngày này, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu sàng lọc từ tự nhiên các chủng nấm sinh tổng hợp laccase với mong muốn tìm được chủng có hoạt tính cao và có đặc tính mới. Hoạt tính laccase thay đổi phụ thuộc vào các loài, các chủng vi sinh vật, vì ở điều kiện tự nhiên hoạt tính laccase rất thấp. Việc lựa chọn, sàng lọc các chủng có khả năng sinh tổng hợp laccase từ tự nhiên là bước rất quan trọng sau đó là tối ưu các điều kiện môi trường nuôi cấy để chúng sinh tổng hợp laccase cao hơn với các đặc tính vượt trội hơn [112]. 1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm Ứng dụng của chủng nấm và enzyme trong xử lý các chất ô nhiễm môi trường đã được nghiên cứu. Trong đó, laccase có khả năng phân hủy và khử độc có hiệu quả các hợp chất hữu cơ khó phân hủy đã nhận được nhiều sự quan tâm trong lĩnh vực công nghệ sinh học [16] và chúng cũng đã được sử dụng như các sensor sinh học trong quan trắc, xử lý ô nhiễm môi trường trong các lĩnh vực công nghiệp dệt, thức ăn, xử lý gỗ, dược và hoá chất [125]. Laccase có khoảng cơ chất đặc hiệu rộng nên có thể oxy hoá với phạm vi lớn các chất độc sinh học ngoại lai bao gồm các hợp chất phenol có clo [151], thuốc trừ sâu [120], các hợp chất hữu cơ đơn và đa vòng thơm được khai thác từ các nhiên liệu hoá thạch [10]. Laccase tinh sạch từ loài Coriolopsis gallica oxy hoá carbozole, N- ethylcarbozole, fluorine và dibenzothiophene khi có mặt 1-hydroxybenzotriazole và 2.2-azinobis (3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid như là một chất gắn kết [8].
9 Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã chứng minh rằng phenol và các amin thơm có thể bị loại bỏ khỏi nước khi sử dụng laccase. Cơ chế của quá trình này là sự oxy hoá của enzyme với các chất ô nhiễm thành các cấu tử tự do hoặc quinone và sau đó là quá trình kết tủa từng phần [164]. Bảng 1.1. Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm Hợp chất Nguồn gốc laccase Cơ chất Hình thức Phenols Laccase tái tổ hợp Chlorophenols, Trametes sanguineus biểu - Nuôi cấy cresols, nitrophenols hiện trong Trichoderma atroviride Technical nonylphenol Phoma sp. UHH 5-1-03 SA Tự do ABTS, HBT, Oxybenzone, P. ostreatus HPI, Tự do pentachlorophenol TEMPO, SA, Laccase tái tổ hợp 4-tert-butylphenol, 4- Myceliophthora biểu hiện SA Nuôi cấy tert-octylphenol trong Aspergillus oryzae Pycnoporus sanguineus 2,4-dichlorophenol - Tự do CS43 Các chất làm hỏng hệ miễn dịch Coriolopsis gallica, Bisphenol A (BPA) Bjerkandera HBT Tự do adusta, T. versicolor Laccase tái tổ hợp T. BPA sanguineus biểu hiện - Nuôi cấy trong T.atroviride Laccase tái tổ hợp T. BPA versicolor biểu hiện trong ABTS Nuôi cấy S.cerevisiae Các hợp chất hydrocarbon (PAHs) Laccase tái tổ hợp B. 15 loại PAHs (theo US subtilis CotA biểu hiện ABTS Tự do EPA) trong E. coli Cố định lên Naphthalene, T. versicolor (Sigma- - đất sét hoạt phenanthrene Aldrich) tính Laccase tái tổ hợp T. Benzo[a]pyrene, sanguineus biểu hiện - Tự do phenanthrene trong T.atroviride Laccase được tinh sạch từ chủng nấm đảm trắng Basidiomycete, Trametes villosa có khả năng phân huỷ bisphenol A, đây là một chất gây biến đổi hệ nội tiết [123]. Các chất phenol đang thu hút nhiều sự quan tâm vì khả năng gây tác động tới