Luận án tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:178

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm sử dụng phế thải rong câu trong sản xuất Agar để tạo ra nguồn nguyên liệu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT KHÁNH HÒA, 2017 i ------------
BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 60.54.10.05 Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn PGS.TS. Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA, 2017 ii
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nha Trang, Ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Hương Thủy iii
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho Thầy GS.TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn - nguyên Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang và PGS.TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin cám ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản và các cán bộ Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học, Xí nghiệp Giống thủy sản Hải Phòng, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án vừa qua. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, Ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Hương Thủy iv
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................ix DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................xi DANH MỤC SƠ ĐỒ................................................................................................... xiii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...............................................................................................xiv TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ...........................................xv MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3 1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar ...............................................3 1.1.1. Nguyên liệu rong biển ...................................................................................3 1.1.2. Các quy trình sản xuất agar ...........................................................................4 1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar ..............................................................8 1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar ..............................................................9 1.2. Tổng quan về Cellulase .....................................................................................11 1.3. Enzym Cellulase .................................................................................................13 1.3.1. Định nghĩa và phân loại ...............................................................................13 1.3.2. Tính chất ......................................................................................................14 1.3.3. Cơ chế thủy phân cellulose ..........................................................................15 1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase......................................................................16 1.4. Vi sinh vật tổng hợp Cellulase ...........................................................................18 1.4.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase .....................18 1.4.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase ...22 1.4.3. Ứng dụng của enzym cellulase vi sinh vật ..................................................24 1.4.4. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu ................................................26 1.4. 5. Phương pháp thu nhận enzym cellulase .....................................................27 1.5. Sản lượng nuôi cá rô phi .....................................................................................30 1.6. Đặc điểm sinh học của cá rô phi.........................................................................32 v
1.6.1. Phân loại ......................................................................................................32 1.6.2. Đặc điểm hình thái: .....................................................................................32 1.6.3. Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng. ....................................................33 1.6.4. Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi ...............................................................34 1.6.5. Nhu cầu dinh dưỡng và ảnh hưởng của thức ăn lên sinh trưởng của cá rô phi. .........................................................................................................................38 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................42 2.1. Đối tượng ............................................................................................................42 2.1.1. Bã thải rong sau sản xuất agar .....................................................................42 2.1.2. Giống vi sinh vật sinh cellulase ...................................................................42 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................43 2.2.1. Phương pháp phân tích ................................................................................43 2.2.2. Các phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính cellulase ........................44 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật...................................................................................................................47 2.2.4. Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm ............................................50 2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án ................................................57 2.3.1. Hóa chất .......................................................................................................57 2.3.2. Thiết bị.........................................................................................................57 2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................59 3.1. Khảo sát đánh giá khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong câu chỉ vàng sau sản xuất agar .........................................................................................59 3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn .....................................................................................61 3.2.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật ......................61 3.2.2. Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn ....65 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B. Subtilis VTCC B-505 và B. Lichenformis (Li) và ứng dụng thủy phân bã rong câu (G. Verrucosa) sau sản xuất Agar..............................................................................72 3.3.1. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất enzyme cellulase từ 2 chủng B505 và Li ...........................................................................................72 vi
3.3.2. Đề xuất quy trình nuôi cấy và thu nhận chế phẩm cellulase thô .................80 3.3.3. So sánh đánh giá hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 với chế phẩm cellulase từ các VSV khác .....................................................................................84 3.3.4. Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar bằng enzyme cellulase từ hai chủng vi khuẩn B 505 và Li ........................................................................88 3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong trong thức ăn nuôi cá rô phi ..............................................................................................................................95 3.4.1. Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi ................................................95 3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi .......................................97 3.4.3. Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi ......................................100 3.4.4. Thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong .............................................................................................................................104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...................................................................................................................110 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................111 vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A530 : Đo OD ở bước sóng 530nm B26 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-26 B505 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505 CMC : Carbonyl – methyl cellulose CMCase : Carbonyl – methyl cellulase CPF : Tập đoàn Nông sản Charoen Pokphand Thái Lan Thailand ĐC : Đối chứng DNSA : 2 –hydroxyl – 3,5 dinitrobenzoic acid DO : Hàm lượng oxy hòa tan DWG : Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối : Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ Chức FAO Liên Hiệp Thế Giới về Lương Thực và Nông Nghiệp) FCR : Feed convertion ratio (Hệ số chuyển đổi thức ăn) K-Na : TartratePotassium Sodium Tartrate Tetrahydrate Li : Vi khuẩn Bacillus lichenformis NT : Nghiệm Thức Nxb : Nhà xuất bản OD : Optical Density ( mật độ quang học) TCA : Tricloacetic axit TLS : Tỷ lệ sống TM & SX : Thương mại và sản xuất TNHH : Trách nhiệm hữu hạn USD : Đô la Mỹ VSV : Vi sinh vật Wt : Khối lượng cá ứng với thời điểm t viii
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Vi sinh vật phân hủy lignocellulose ................................................................19 Bảng 1.2. Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg) ..............20 Bảng 1.3. Phân biệt cá đực, cá cái ..................................................................................32 Bảng 1.4. Giới hạn các thành phần trong thức ăn có giá thành ít nhất cho cá rô phi ở các giai đoạn ................................................................................................................35 Bảng 1.5. Cung cấp bổ sung vitamin và khoáng chất trong thức ăn của cá rô phi ..........36 Bảng 1.6. Tiêu chuẩn kỹ thuật của thức ăn nuôi cá rô phi và chế độ ăn trong nuôi lồng và ao thâm canh ....................................................................................................37 Bảng 1.7. Thành phần hoá học cá rô phi nuôi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein 34,2 (%) ................................................................................................................40 Bảng 1.8. Nuôi cá rô phi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác nhau. .......40 Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác nhau ......................................41 Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn glucose ......................................................................46 Bảng 3.1. Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ các vùng rong nguyên liệu khác nhau .......................................................................................................................59 Bảng 3.2. Hàm lượng các chất cơ bản trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar ...............................................................................................................................60 Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar ...............................................................................................................................60 Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu ...............62 Bảng 3.5. Hoạt tính enzym cellulase của chủng Li, B505, B26 và CFd .........................63 Bảng 3.6. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li, B505 trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2% ........................................................................................................69 Bảng 3.7. Khả năng thủy phân bã thải agar bằng cellulase từ 2 chủng Li và B505 ........70 Bảng 3.8. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi trong các môi trường khác nhau .....................................................................................73 Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy ở các môi trường khác nhau ...........................................................................................73 Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các nhiệt độ khác nhau ................................................................................................76 ix
Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở các pH khác nhau ..............................................................................................................77 Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy .................................................................................................................78 Bảng 3.13. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy .........................................................................................................79 Bảng 3.14. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505 và T3) trên đĩa thạch có CMC 0,2% ..........................................................................85 Bảng 3.15. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505 và T3) trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2% ....................................................87 Bảng 3.16. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken ............................................89 Bảng 3.17. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm DX6 ....................................................89 Bảng 3.18. Kết quả dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mô hình Box-Behnken..........91 Bảng 3.19. Kết quả kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm ..........................92 Bảng 3.20. Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn ......................................95 Bảng 3.21. Thành phần nguyên liệu của các công thức thức ăn phối trộn bã rong thủy phân. ......................................................................................................................99 Bảng 3.22. Dao động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm .....................101 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi trong 80 ngày nuôi......................................................................................................................104 x
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen ......................................11 Hình 1.2. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật .........................12 Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzym cellulase ...........................................................17 Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose ............................................................................17 Hình 1.5. Hình dạng nấm mốc A. niger .........................................................................23 Hình 1.6. Hình dạng nấm Trichoderma viride .............................................................23 Hình 2.1. Bã thải sau sản xuất agar ...............................................................................42 Hình 2.2. Cá rô phi ........................................................................................................43 Hình 2.3. Bố trí các giai nuôi thử nghiệm cá rô phi ......................................................55 Hình 3.1. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân CMCcủa 4 chủng vi sinh vật lựa chọn trên đĩa thạch chứa 1% CMC .......................................................................63 Hình 3.2. Điện di đồ chế phẩm cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn B505 và Li trên gel polyacrylamis 12,5 % theo hệ đệm Laemmi ........................................................68 Hình 3.3. So sánh vòng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn Li, B505 trên đĩa thạch bổ sung cơ chất bột giấy 0,2% ...................................................................................69 Hình 3.4. Khả năng thủy phân bã thải agar của cellulase ngoại bào từ chủng Li và B505 .....71 Hình 3.5. Khả năng thủy phân bã thải agar của hỗn hợp cellulase ngoại bào từ 4 chủng (B505, B26, Li, CFd) ............................................................................................71 Hình 3.6. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng B505 nuôi trong các môi trường khác nhau ..................................................................................................72 Hình 3.7. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng vi khuẩn Li nuôi trong các môi trường khác nhau .....................................................................................74 Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các nhiệt độ khác nhau ................................................................................................75 Hình 3.9. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH khác nhau ..............................................................................................................77 Hình 3.10. Đường kính vòng thủy phân của cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2% ...........................................................................................84 Hình 3.11. Đường kính vòng thủy phân cellulase từ Tricoderma trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 %....................................................................................................85 Hình 3.12. Hoạt tính cellulase Aspergillus trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 % .......85 xi
Hình 3.13. Hoạt tính cellulase của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus nuôi ở các môi trường khác nhau trên đĩa thạch có chứa cơ chất bột giấy 0,2 %. .................86 Hình 3.14. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2 % ......................................................................86 Hình 3.15. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) của hàm lượng đường tổng số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme .......................................................91 Hình 3.16. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) tiên đoán hàm lượng đường tổng số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme...................................................92 xii
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới ............................6 Sơ đồ 1.2 Cơ chế chuyển hóa cellulose .........................................................................16 Sơ đồ 1.3. Thu nhận cellulase từ A. niger .....................................................................28 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát.................................................................51 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chế phẩm bã rong thủy phân trong nuôi cá rô phi ...............................................................................................................................53 Sơ đồ 3.3. Quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn .............................93 Sơ đồ 3.4. Quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi ....................................................97 xiii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1. Tăng trưởng sản lượng cá rô phi, cá da trơn và cá hồi giai đoạn 1980 – 2010 ......................................................................................................................30 Biểu đồ 3.1. Hoạt tính enzyme cellulase của 17 chủng vi sinh vật đã thử nghiệm .......62 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của bốn chủng vi khuẩn Li, B26, B505, CFd ................................................................................65 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của 4 chủng Li, B26, B505, CFd ....................................................................................66 Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy ........78 Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hoạt tính cellulase của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy .........79 Biểu đồ 3.6. Biến động nhiệt độ nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi. ..........................101 Biểu đồ 3.7. Biến động DO nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi ..................................102 Biểu đồ 3.8. Biến động độ pH của nước ao thí nghiệm ..............................................103 Biểu đồ 3.9. Tốc độ sinh trưởng (g/con) và DWG (g/ngày) của cá rô phi với thức ăn phối trộn bã rong thủy phân khác nhau sau 80 ngày nuôi. .................................105 Biểu đồ 3.10. Hệ số chuyển đổi thức ăn của nuôi thử nghiệm các công thức thức ăn.....106 xiv
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm”. Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến thủy sản Mã số: 62540105 Nghiên cứu sinh: Lê Hương Thủy Người hướng dẫn: 1. PGS. TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn 2 PGS. TS. Vũ Ngọc Bội Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Tóm tắt những đóng góp mới về lý luận và học thuật của luận án: Bã thải rong từ công nghệ sản xuất agar thường giàu cellulose là hợp chất hữu cơ rất khó bị phân hủy. Trên thế giới hiện nay, người ta đã tiến hành xử lý phế liệu rong biển để làm thức ăn gia súc bằng một số phương pháp thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học thường phức tạp, tốn kém và gây ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ vi sinh, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Thủy phân cellulose từ bã rong phế thải sẽ giúp động vật tiêu hóa và hấp thụ dễ dàng các protein, glucide, các nguyên tố khoáng đa vi lượng có trong bã thải sau quá trình sản xuất agar. Sự thành công của đề tài sẽ cơ sở khoa học cho việc tận dụng bã thải rong câu trong sản xuất thức ăn nuôi động vật thủy sản. Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) Lê Hương Thủy xv
Key Findings Thesis title: "Study on hydrolysis of seaweed wastes (Gracilaria verrucosa) by cellulase enzyme from bacteria to apply in the production of feed for tilapia". Mayor: Seafood processing technology Major code: 62540105 PhD Student: Lê Hương Thủy Supervisor: 1. Prof. PhD. Nguyen Trong Can 2 Assoc. Prof, PhD. Vu Ngoc Boi Institution: (Nha Trang University) Key Findings: Seaweed waste from agar production technologies are often richly organic cellulose that is very difficult to decompose. Todays, seaweed waste has processed to produce animal feeds by several hydrolysis methods in alkali or acidification. However, the processing of cellulose by physical and chemiscal methods are often complicate, expensive and polluting the environment. while the treatment of organic waste containing cellulose by microbial technology, especially the use of cellulase enzyme from microbial extracellular would have advantages in technical, economic and environmental aspects. Hydrolysis of cellulose from seaweed waste will help animals digest and easily absorb protein, glucide, mineral elements in the waste after the production of agar. The success of the research will be scientific basis for the utilization of seaweed waste in feed production of aquatic animals. Phd Student Le Huong Thuy xvi
MỞ ĐẦU Agar là hợp chất hữu có có nguồn gốc từ rong biển và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống như dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh, dùng trong chế biến các sản phẩm thực phẩm,… Trên thế giới, sản lượng agar vào khoảng 7.000 - 10.000 tấn/năm [26]. Hàng năm Việt Nam sản xuất khoảng 500 tấn agar [30]. Quá trình chiết rút agar từ rong câu thường thải ra môi trường một lượng lớn bã thải hữu cơ thải, ước tính vào khoảng 6 - 8 tấn bã thải hữu cơ/1 tấn sản phẩm agar. Như vậy, ước tính hàng năm lượng bã thải rong thải ra từ quá trình sản xuất agar ở nước ta vào khoảng 7.000 ÷ 9.000 tấn [15]. Riêng thành phố Hải Phòng có khoảng 40 xưởng sản xuất agar từ rong biển. Trong đó, xưởng sản xuất agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long sản xuất 50 tấn agar/năm và một số xưởng sản xuất agar khác tại Hải Phòng được tư nhân đầu tư sản xuất với công suất trung bình 10 tấn/năm [30]. Trong bã thải rong có chứa protein, carbohydrat, các khoáng chất có nguồn gốc từ biển như iod, phosphat, các nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của động vật nuôi. Chính vì thế, bã thải rong nếu không được tận dụng một cách hợp lý sẽ dẫn tới lãng phí và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sử dụng một cách hợp lý nguồn bã thải rong, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường và nâng cao giá trị cho nguồn tài nguyên rong biển, tạo công ăn việc làm cho người dân ven biển, giúp xóa đói giảm nghèo là cần thiết. Do vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm” là hướng nghiên cứu cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. Mục đích của luận án Sử dụng phế thải rong câu trong sản xuất Agar để tạo ra nguồn nguyên liệu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nội dung nghiên cứu của luận án 1) Đánh giá lượng bã thải rong và xác định thành phần cơ bản của bã thải rong sau sản xuất agar. 1
2) Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh cellulase cao từ bộ sưu tập giống vi khuẩn của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. 3) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ chủng vi khuẩn đã lựa chọn và ứng dụng thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) sau sản xuất agar. 4) Thử nghiệm sử dụng sản phẩm thủy phân bã rong bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm. Ý nghĩa khoa học của luận án Luận án lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng enzyme cellulase từ vi khuẩn trong xử lý bã thải rong sau sản xuất agar và sử dụng dịch thủy phân bã rong làm thức ăn nuôi cá rô phi. Luận án có ý nghĩa khoa học cao do kết quả nghiên cứu của Luận án đã khẳng định hoàn toàn có thể ứng dụng enzyme cellulase để chuyển bã thải rong sau sản xuất agar thành sản phẩm hữu ích dùng trong nuôi cá rô phi ở quy mô công nghiệp. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Thành công của đề tài có ý nghĩa về thực tiễn cao bởi giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ công nghệ sản xuất agar và giúp nâng cao giá trị của rau câu chỉ vàng, giảm chi phí sản xuất trong nuôi cá rô phi và đem lại hướng mới trọng tận dụng bã thải rong sau chế biến. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar 1.1.1. Nguyên liệu rong biển Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể là đơn bào, đa bào sống thành quần thể. Chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét. Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Rong biển là loại thực vật biển quý giá được làm nguyên liệu chế biến thành sản phẩm có giá trị trong công nghiệp, y dược và thực phẩm. Từ lâu rong biển đã được coi là đối tượng nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới [10], [69]. Các ngành rong biển được chú ý và đã đưa vào sản xuất công nghiệp và đời sống gồm: ngành rong đỏ, ngành rong nâu, rong lục. Sản lượng lớn rong nâu được dùng sản xuất acid alginic và alginat và quan trọng hơn là ngành rong đỏ được dùng để sản xuất agar và carrageenan. Một số loài rong đỏ có hàm lượng cao về agar, carrageenan, furcellaran. Theo tài liệu FAO, nhóm rong cho agar thuộc ngành rong Đỏ bao gồm các loại như: Gelidium, Gracilaria và Acanthopeltis. Rong biển phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triền sâu, vùng biển cạn... Ở nước ta có một số vùng chuyên canh trồng rong câu chỉ vàng, thuộc ngành rong Đỏ, như: Phá Tam Giang (Lăng Cô - Thừa Thiên Huế); Đầm Thị Nại (Bình Định); Đầm Ô Loan (Phú Yên) [11], [26]. Rong biển nước ta có sản lượng lớn là rong mơ Sargasum có thành phần acid alginic với chất dinh dưỡng cao chưa được khai thác và sử dụng, rong sụn cũng đang được trồng và chế biến thành carrageenan. Đặc biệt là rong câu Gracilaria là loài có giá trị kinh tế cao. Theo báo cáo điều tra khảo sát của chuyên gia tư vấn thuộc chương trình hỗ trợ phát triển nuôi trồng thuỷ sản nước lợ SUMA, sản lượng thu hoạch rong câu gracilaria ở nước ta mỗi năm khoảng 5000 tấn khô, còn theo con số ước tính của tổ chức FAO thì sản lượng này là khoảng 7000 tấn. Rong câu phân bố chủ yếu ở các địa phương như Hải Phòng, Nam Hà, Thái Bình,Thanh Hoá và Thừa Thiên Huế [26], [30], [99]. Sản lượng agar trung bình hàng năm của toàn thế giới là 7.000 – 10.000 tấn/năm. Nam Triều Tiên cung cấp nguyên liệu sản xuất agar chiếm 40% tổng sản lượng toàn thế giới. Sản lượng agar sản xuất tại các nước như sau: châu Á: 50% (chủ yếu là Nhật Bản 3
và Hàn Quốc); châu Âu: 30% (Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha); châu Mỹ: 15% (Mỹ, Achentina, Brazil, Chilê); châu Phi: 5% (Marốc) [11], [99]. Công nghệ sản xuất agar ở Việt Nam bắt đầu hình thành năm 1960, nhưng lúc đó tốc độ phát triển chậm do hạn chế bởi kiến thức, công nghệ thiết bị và thị trường. Năm 1983 dưới sự giúp đỡ của cộng hoà dân chủ Đức, một xưởng pilot agar công suất 50 tấn/năm đựợc lắp ráp tại Nhà máy cá hộp Hạ Long nhưng khi vận hành, quy trình công nghệ gặp nhiều khó khăn và công suất chỉ đạt 20 tấn/năm. Sau này công ty đồ hộp Hạ Long đã thay đổi quy trình sản xuất và sử dụng từng phần thiết bị để sản xuất theo hướng thủ công đạt công suất khoảng 50 tấn/năm. Từ 1986 đến 1990, Viện Nghiên cứu Hải sản kết hợp với Viện Nghiên cứu nghề cá và hải dương học Thái Bình Dương Liên Xô (TINRO) tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng rong câu năng suất cao và cải tiến công nghệ sản xuất agar cùng như áp dụng phương pháp ép tách nước gel agar bằng công nghệ ép 2 bước: ép sơ bộ bằng trọng vật và ép lần cuối bằng máy ép vít. Đây là giai đoạn phát triển mạnh của nghề sản xuất agar ở Việt Nam do nhu cầu đầu ra của nguyên liệu và sản phẩm đều rất lớn; vùng Viễn đông Liên Xô nhập một lượng lớn rong câu khô từ Hải Phòng với giá 600 USD/tấn, và khoảng 100 tấn agar bột đựợc tiêu thụ tại các tỉnh phía Nam nước ta [11], [15], [26]. Trong giai đoạn từ 1985 – 1995 nghề sản xuất agar đã có bước phát triển rất lớn. Hải Phòng là nơi tập trung các xưởng sản xuất agar, tính chung các quy mô khác nhau có khoảng 40 xưởng với tổng sản lượng agar ước tính sản xuất đạt 500 tấn/năm với tổng doanh thu khoảng 70 tỷ đồng và giải quyết công ăn việc làm cho hàng nghìn lao động. Riêng xưởng agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long có thể sản xuất thường xuyên với công suất 50 tấn/năm, một số xưởng sản xuất agar được tư nhân đầu tư sản xuất với công suất trung bình 10 tấn/năm [30]. 1.1.2. Các quy trình sản xuất agar Qua khảo sát tình hình sản xuất của một số cơ sở chế biến agar nhận thấy quy mô công nghệ sản xuất agar rất đa dạng từ quy mô thủ công hộ gia đình có công suất từ 10 – 30kg/ngày đến quy mô bán thủ công có công suất là 100 – 300 kg/ngày [26], [30], [73]. Quy trình sản xuất agar theo quy mô hộ gia đình: đây là quy mô sản xuất nhỏ, vốn đầu tư nhỏ, thiết bị ít, lao động thủ công, công xuất từ 10 – 30 kg/ngày, Sản phẩm 4