Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:170

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)" được hoàn thành với mục tiêu nhằm xác định được cơ quan có mức độ phiên mã gene LvCTL3 cao nhất trên tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh và không nhiễm bệnh AHPND; Đánh giá được vai trò của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên các chỉ tiêu miễn dịch của tôm thẻ chân trắng cũng như khả năng kháng bệnh AHPND trong điều kiện in vivo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

I H C HU TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN VINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO C-TYPE LECTIN TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN HUẾ - 2024
I H C HU TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN VINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO C-TYPE LECTIN TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) Ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 9620301 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS NGUYỄN NGỌC PHƢỚC HUẾ - 2024
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của tôi, hình ảnh và số liệu được trình bày trong kết quả luận án này là bản gốc của tác giả, trung thực, chính xác, danh dự và chưa từng được bảo vệ ở bất kỳ một học vị nào. Thừa Thiên Huế, ngày 17 tháng 9 năm 2024 TÁC GIẢ LUẬN ÁN Trần Vinh Phƣơng i
LỜI CẢM ƠN ể thực hiện được các nội dung nghiên cứu và hoàn thiện luận án một cách tốt nhất, ngoài sự cố gắng, nổ lực không ngừng nghỉ của bản thân, nghiên cứu sinh đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của nhiều tổ chức, cá nhân và tập thể. Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc ại học Huế, Ban Tổ chức cán bộ ại học Huế, lãnh đạo và tập thể Ban Khoa học, Công nghệ và Quan hệ quốc tế ại học Huế là nơi NCS đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, hỗ trợ học phí cũng như lãnh đạo Ban đã phân công, bố trí công việc một cách hợp lý để NCS có thể vừa học tập vừa làm việc tại đơn vị. Nghiên cứu sinh xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường ại học Nông Lâm, ại học Huế; Phòng ào tạo và Công tác sinh viên; Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản và Bộ môn Bệnh Thủy sản là nơi NCS đang được đào tạo, học tập, nghiên cứu và sinh hoạt chuyên môn trong thời gian học tập tại Khoa và Nhà trường. Trong thời gian này, đơn vị đào tạo đã bố trí, hỗ trợ về cơ sở vật chất, trang thiết bị, phòng thí nghiệm để NCS được sử dụng các thiết bị cần thiết của Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh Thủy sản thuộc Khoa để thực hiện một số nội dung nghiên cứu thử nghiệm, phân tích liên quan đến luận án. ể đạt được kết quả học tập tốt, NCS trân trọng gửi lời cảm ơn đến GS.TS Lê ức Ngoan, PGS.TS Tôn Thất Chất, PGS.TS Lê Văn Dân, PGS.TS Nguyễn Duy Quỳnh Trâm là những thầy cô giáo đã tham gia giảng dạy trực tiếp các học phần lý thuyết thuộc chương trình đào tạo trình độ tiến sĩ cho NCS. Nghiên cứu sinh trân trọng cảm ơn đến TS. Hoàng Tấn Quảng (Trưởng PTN) và nhóm nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, ại học Huế đã hỗ trợ cho tôi trong việc thực hiện một số nội dung liên quan đến lĩnh vực công nghệ sinh học của luận án. Bên cạnh đó, NCS xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Quang Linh (Nguyên Giám đốc ại học Huế) là nhà khoa học bảo trợ và cũng là giáo viên hướng dẫn thành công Chuyên đề “Bổ thể trong nuôi trồng thủy sản” cho NCS. Cũng nhờ sự giúp đỡ, hỗ trợ tối đa của thầy ngay từ khi mới phát triển ý tưởng nghiên cứu đến giai đoạn hoàn thành luận án, cũng nhờ sự hướng dẫn của thầy mà NCS đã có được công trình nghiên cứu được đăng tải trên tạp chí quốc tế uy tín. ii
ể hoàn thiện được luận án một cách tốt nhất, NCS xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Phước là giáo viên hướng dẫn độc lập luận án, giảng dạy học phần lý thuyết và cũng là nhà khoa học bảo trợ cho NCS trong chương trình học bổng thạc sỹ, tiến sĩ trong nước của VINIF, em xin ghi nhận lòng biết ơn và trân trọng đến thầy đã dành thời gian quý báu và đã tận tình, tận tâm hướng dẫn, sửa bài, cũng nhờ sự giúp đỡ, dẫn dắt của thầy mà NCS có thể hoàn thành luận án một cách tốt nhất và có được những công trình đã công bố trên các tạp chí quốc tế uy tín (thuộc danh mục Scopus) và trong nước. Chúng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến Quỹ ổi mới sáng tạo (VINIF), Viện nghiên cứu Dữ liệu lớn (BIGDATA) của tập đoàn Vingroup đã tài trợ học bổng tiến sĩ cho NCS trong năm 2022 và 2023 [VINIF2022.TS097 và VINIF2023.TS.089], xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài KH&CN cấp Quốc gia “Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất một số chế phẩm bổ sung vào thức ăn thủy sản”; mã số: T L.CN-56/22; cảm ơn các em sinh viên Khoa Thủy sản, Trường ại học Nông Lâm, ại học Huế các Khóa từ K53-54 đã tham gia nghiên cứu, thực hiện đề tài tốt nghiệp cùng chúng tôi trong quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm, động viên và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. ặc biệt, hành trình học tiến sĩ của tôi sẽ không thể đến đích nếu không có sự hỗ trợ thường xuyên từ vợ và hai con nhỏ, những người đã luôn bên cạnh và động viên tôi theo đuổi ước mơ của mình. Cảm ơn vợ đã chăm sóc gia đình để tôi có thể tập trung vào việc nghiên cứu để hoàn thành luận án này. Cuối cùng, tôi rất biết ơn gia đình nội ngoại hai bên đã luôn ủng hộ và động viên tôi theo đuổi và hoàn thành những mục tiêu cá nhân. Mặc dù đã có nhiều nổ lực, cố gắng, không ngừng tìm tòi, học hỏi để bổ sung kiến thức nhằm hoàn thiện luận án một cách tốt nhất. Tuy nhiên, cũng không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong quý thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè có những góp ý tích cực để luận án được hoàn thiện hơn. Xin trân trọng cảm ơn! TÁC GIẢ LUẬN ÁN Trần Vinh Phƣơng iii
TÓM TẮT Luận án được thực hiện với mục tiêu điều chế được protein tái tổ hợp để sử dụng làm chất kích thích miễn dịch bổ sung vào thức ăn thủy sản nhằm nâng cao đáp ứng miễn dịch tự nhiên và khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập, tạo dòng và điều chế được protein LvCTL3 tái tổ hợp, là một C-type lectin mã hóa từ gene LvCTL3 phân lập từ tôm thẻ chân trắng, cũng như bước đầu đánh giá được chức năng của protein này lên khả năng ngưng kết vi khuẩn V. parahaemolyticus trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu lần đầu tiên xác định được vai trò của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên khả năng đáp ứng miễn dịch, cũng như khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của tôm thẻ chân trắng thông qua con đường thức ăn. Luận án được thiết kế gồm 4 nội dung chính: 1) Phân lập, xác định tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng; 2) Phân lập, tạo dòng và đánh giá mức độ biểu hiện gene LvCTL từ tôm thẻ chân trắng; 3) ánh giá hoạt tính ngưng kết vi khuẩn V. parahaemolyticus của protein LvCTL3 tái tổ hợp và 4) ánh giá ảnh hưởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus và 10 chủng V. vulfinicus từ 40 mẫu tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh AHPND tại Thừa Thiên Huế. Kết quả gây cảm nhiễm đã xác định được vi khuẩn V. parahaemolyticus (ký hiệu là TTHVP202101001) mang gene độc tố pirAvp và pirBvp là tác nhân chính gây bệnh AHPND với liều gây chết 50% (LD50) là 105 CFU/mL. Trong tổng số 5 gene mã hóa C-type lectin (CTL) được khảo sát (LvCTL3, LvCTL4, LvAV, LvCTLD và LvLdlrCTL), chỉ có hai gene LvCTL3 và LvCTL4 được khuếch đại từ RNA tổng số và có kích thước lần lượt khoảng 450 và 420 bp. Trong đó, gene LvCTL3 có mức độ phiên mã mạnh hơn trên mẫu tôm bệnh AHPND nên được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Gene LvCTL3 phân lập được có kích thước 444 bp, tỷ lệ tương đồng 98,87% so với trình tự tham chiếu KF156943 đã công bố. Phân tử LvCTL3 có khối lượng là 16,91 kDa, điểm đẳng điện là 4,66, dự đoán cấu trúc không gian có 2 chuỗi xoắn alpha và 9 chuỗi beta. Gene LvCTL3 có mức độ phiên mã ở các cơ quan khác nhau của tôm thẻ chân iv
trắng nhiễm bệnh AHPND. Tuy nhiên, mức độ phiên mã mạnh nhất được xác định ở mô gan tụy của tôm. Sản phẩm gene LvCTL3 tinh sạch được chọn để tạo dòng vào vector pET200/D-TOPO, tế bào Escherichia coli BL21 (DE3) mang vector pET200/LvCTL3 được cảm ứng bằng IPTG để tạo LvCTL3 tái tổ hợp. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp cho thấy protein LvCTL3 được biểu hiện chủ yếu trong thể vùi, sau đó được tái hòa tan và tái gấp cuộn bằng phương pháp pha loãng nhanh. Protein LvCTL3 tái tổ hợp sau khi tái gấp cuộn đã thể hiện hoạt tính mạnh khi ngưng kết V. parahaemolyticus (nồng độ 500 µg/mL). Trong đó, tỷ lệ kết hợp giữa Vibrio + Ca2+ và LvCTL3 tái tổ hợp (1:2) cho kết quả mật độ vi khuẩn V. parahaemolyticus đạt OD600 = 0,665 bị ngưng kết đáng kể so với các tỷ lệ còn lại (p < 0,05). Tôm thẻ chân trắng được cho ăn thức ăn có bổ sung protein LvCTL3 tái tổ hợp ở các nồng độ 2; 4 hoặc 10 mg/kg thức ăn với tần suất 3 lần/ngày, cho ăn liên tục trong 30 ngày cho thấy tốc độ tăng trưởng, đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh cao hơn so với tôm không sử dụng LvCTL3. Khối lượng cuối của tôm đạt từ 4,62-5,77 g/con, tăng trọng từ 4,06-5,22 g/con; tăng trưởng khối lượng theo ngày đạt 0,14-0,17 g/ngày; tăng trưởng đặc trưng từ 7,06-7,84 %/ngày, hệ số chuyển đổi thức ăn là 1,06-1,22; hiệu quả sử dụng thức ăn từ 72,10-84,91% và tỷ lệ sống giữa các nghiệm thức lên đến 92,20-95,56%. ồng thời việc chế độ ăn được bổ sung protein LvCTL3 tái tổ hợp như trên giúp nâng cao đáp ứng miễn dịch ở tôm thẻ chân trắng, cụ thể: tổng số tế bào máu (THC) và hoạt động các enzyme liên quan miễn dịch như PO, MPO, SOD, lysozyme và hoạt động thực bào đều cao hơn so với tôm cho ăn thức ăn không bổ sung LvCTL3 (p < 0,05). Việc cho tôm ăn thức ăn có bổ sung LvCTL3 tái tổ hợp giúp cải thiện đáng kể khả năng kháng bệnh của tôm. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm ở các nghiệm thức có bổ sung 2; 4 và 10 mg/kg thức ăn lần lượt là 36,67; 30 và 20%, trong khi tôm ở nghiệm thức không sử dụng LvCTL3 (đối chứng) là 63,33%, p < 0,05. Kết quả nghiên cứu này cho thấy protein LvCTL3 tái tổ hợp có thể sử dụng qua đường thức ăn để nâng cao hoạt động đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp do vi khuẩn V. parahaemoyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng. v
ABSTRACT The thesis focused on production a recombinant protein from C-type lectin in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) to used as an immunostimulant in feed. This protein aims to enhance non-specific immune responses and bolster disease resistance against Vibrio parahaemolyticus, particularly in combating acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei). This study successfully in isolated, cloned, and produced a recombinant LvCTL3 protein, encoded by the LvCTL3 gene obtained from whiteleg shrimp. Subsequently, it evaluated the initial function of this protein in vitro, focusing on its agglutination ability towards V. parahaemolyticus. Understanding the potential role of this protein is crucial for elucidating disease resistance in shrimp. Additionally, this study represents the pioneering investigation into the effects of recombinant LvCTL3 supplementation in feed on the immune response and resistance of whiteleg shrimp to V. parahaemolyticus infection. The thesis comprises four chapters: 1) Isolation and identification of the causative agent of AHPND in whiteleg shrimp; 2) Isolation, cloning and expression level evaluation of the LvCTL gene from whiteleg shrimp; 3) Assessment of the agglutination ability of recombinant LvCTL3 protein towards V. parahaemolyticus; and 4) Evaluation of the efficacy of recombinant LvCTL3 protein suplementation in feed on the non-specific immune response and disease resistance of whiteleg shrimp toward AHPND- causing V. parahaemolyticus. Thirty strains of V. parahaemolyticus and ten (10) strains of V. vulfinicus were isolated from 40 disease shrimps exhibiting clinical signs of AHPND in Thua Thien Hue province, Vietnam. The experimental challenge results revealed that the V. parahaemolyticus strain (TTHVP202101001) carrying two toxin genes, pirAvp and pirBvp served as the primary causative agent of AHPND, with an LD50 value of 105 CFU mL-1. Of the five LvCTL genes encoding C-type lectin (LvCTL3, LvCTL4, LvAV, LvCTLD, and LvLdlrCTL), only two genes, LvCTL3 and LvCTL4, were successfully amplified from total RNA. LvCTL3 gene exhibited a size of 450 bp, while LvCTL4 gene showed a size of 420 bp. The LvCTL3 exhibited strong transcription level in samples from diseased shrimp, prompting its selection for further study. The isolated LvCTL3 gene shared a high homology of 98.87% with the published gene (439 out of 444 nucleotides compared to KF156943). Additionally, the molecular weight of LvCTL3 was determined to be 16.91 kDa, vi
with an isoelectric point (pI) of 4.66. The spatial structure prediction revealed that the LvCTL3 molecule consisted of two alpha helices and nine beta helices. Transcription level of the LvCTL3 was detected in various organs of AHPND- infected shrimp, with the strongest expression observed in the hepatopancreatic tissue. The LvCTL3 gene was purified and subsequently cloned into the pET200/D-TOPO vector. Escherichia coli BL21 (DE3) carrying the pET200/LvCTL3 vector were then induced with IPTG to synthesize the recombinant LvCTL3. The expressed recombinant LvCTL3 was primarily found in inclusion bodies, which were later resolubilized and refolded using the rapid dilution method. After refolding, the recombinant LvCTL3 demonstrated a robust ability to agglutinate V. parahaemolyticus, particularly at a concentration of 500 µg mL-1. Notably, when combined with Vibrio and ion Ca2+ at a ratio of 1:2, the results showed a significantly enhanced agglutination, with the density of V. parahaemolyticus reaching OD600 = 0.665, which was markedly different compared to the other ratios (p < 0.05). Dietary supplementation of recombinant LvCTL3 at doses of 2, 4, or 10 mg -1 kg over a period of 30 days resulted in improved growth performance in whiteleg shrimp. The final weight of the shrimp ranged from 4.62 to 5.77 g shrimp-1, with weight gain (WG) ranging from 4.06 to 5.22 g shrimp -1. Daily weight gain (DWG) averaged between 0.14 and 0.17 g day -1, while specific growth rate (SGR) ranged from 7.06 to 7.84% day-1. Moreover, the feed conversion rate (FCR) and feed efficiency (FE) were superior to those in the control treatment (without LvCTL3 in feed). Furthermore, shrimp fed with recombinant LvCTL3 incorporated into their feed exhibited significantly higher levels of total hemocyte count (THC) and immune-related enzyme activity, such as PO, MPO, SOD, and LYS, along with an increased phagocytic rate compared to the control group (p < 0.05). The cumulative mortality rates of shrimp in treatments fed with dietary supplementation of recombinant LvCTL3 at doses of 2; 4 and 10 mg kg-1 of feed were 36.67%, 30%, and 20%, respectively. In contrast, the cumulative mortality rate of shrimps fed with a basal diet without recombinant LvCTL3 protein (the control treatment) reached 63.33%. This study suggests that recombinant LvCTL3 could serve as an effective dietary supplement to enhance the immune response and disease resistance of whiteleg shrimp against AHPND-causing V. parahaemolyticus. vii
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Năm quốc gia sản xuất tôm lớn nhất thế giới năm 2023............................7 Bảng 1.2. Diện tích và sản lượng tôm nuôi ở các khu vực Việt Nam năm 2022 .......8 Bảng 1.3. Tổng hợp các chủng vi khuẩn Vibrio mang plasmid gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng ..............................................................................................16 Bảng 1.4. Vi khuẩn phân lập được trên tôm thẻ chân trắng nhiễm AHPND nuôi tại một số tỉnh ở Việt Nam .............................................................................................17 Bảng 1.5. Chức năng của tế bào máu giáp xác .........................................................29 Bảng 1.6. Biểu hiện của các gene mã hóa CTL trên tôm thẻ chân trắng ................33 Bảng 2.1. Thông tin chung về các ao nuôi tôm được thu thập mẫu tôm ..................38 Bảng 2.2. Trình tự các mồi sử dụng xác định sự hiện diện gene độc tố...................38 Bảng 2.3. Thành phần hóa chất của phản ứng tổng hợp cDNA ...............................42 Bảng 2.4. Thành phần hóa chất của phản ứng tổng hợp cDNA (tiếp theo) .............43 Bảng 2.5. Các đoạn mồi đặc hiệu để tạo dòng các gene LvCTL ..............................44 Bảng 2.6. Các đoạn mồi đặc hiệu để tạo dòng các gene LvCTL ..............................44 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR kiểm tra sự hiện diện của các gene LvCTL ........................................................................................................................44 Bảng 2.7. Trình tự mồi khuếch đại cho phản ứng RT - qPCR .................................47 Bảng 2.8. Các cặp mồi đặc hiệu mã hóa gene LvCTL3 ............................................49 Bảng 2.9. Thành phần (% vật chất khô) của khẩu phần thức ăn cơ bản...................52 Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu tôm nhiễm bệnh ................................61 Bảng 3.2. ặc điểm sinh hoá của các chủng V. parahaemolyticus phân lập và chủng đối chứng ...................................................................................................................63 Bảng 3.3. ặc điểm sinh hoá của các chủng V. vulfinicus phân lập .......................64 Bảng 3.4. Các chủng V. parahaemolyticus mang gene độc tố .................................66 Bảng 3.5. ặc điểm phân tử LvCTL3 và LvCTL4 mã hóa CTL .............................77 Bảng 3.6. Hoạt tính ngưng kết V. parahaemolyticus của LvCTL3 tái tổ hợp ..........85 Bảng 3.7. Tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng thí nghiệm ở các nghiệm thức ..........................................................................88 Bảng 3.8. Chỉ tiêu miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ở các nghiệm thức ................90 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) .............................................6 Hình 1.2. Sản lượng tôm thẻ chân trắng ở nước ngọt và nước lợ trên thế giới ..............6 Hình 1.3. Xuất khẩu tôm Việt Nam giai đoạn 2016-2022 .......................................10 Hình 1.4. Diễn biến sản lượng tôm nuôi tại Thừa Thiên Huế giai đoạn 2019-2022 10 Hình 1.5. Bản đồ phân bố bệnh AHPND trên thế giới .............................................13 Hình 1.6. Plasmid V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND.....................................15 Hình 1.7. Các dấu hiệu lâm sàng chung của bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng ...18 Hình 1.8. Cấu trúc mô gan tụy của tôm khỏe (S02) và tôm nhiễm AHPND (5HP) .......19 Hình 1.9. Hệ thống miễn dịch tự nhiên ở tôm he .....................................................25 Hình 1.10. Sơ lược về hệ thống miễn dịch dịch thể của tôm ...................................26 Hình 1.11. Sơ lược về hệ thống miễn dịch tế bào của tôm ......................................27 Hình 1.12. Hình thái tế bào máu tôm thẻ chân trắng................................................28 Hình 1.13. Chức năng và cơ chế kháng vi khuẩn Vibrio của CTL ở tôm ................31 Hình 2.1. Sơ đồ tổng thể các nội dung nghiên cứu luận án ......................................37 Hình 2.2. Bản đồ cấu trúc vector tạo dòng vector pGEM-T Easy ...........................45 Hình 2.3. Bản đồ cấu trúc vector biểu hiện pET/D-TOPO ......................................48 Hình 3.1. Tôm có dấu hiệu bệnh và tiêu bản mang ..................................................61 Hình 3.2. Gan tôm và tiêu bản gan ...........................................................................61 Hình 3.3. Khuẩn lạc V. parahaemolyticus ................................................................62 Hình 3.4. Khuẩn lạc V. vulfinicus .............................................................................62 Hình 3.5. iện di sản phẩm PCR gene pirAvp của các chủng Vibrio spp. phân lập từ tôm bằng cặp mồi AP1 ..............................................................................................63 Hình 3.6. iện di sản phẩm PCR gene pirBvp của các chủng Vibrio spp. phân lập từ tôm bằng cặp mồi AP2 ..............................................................................................64 Hình 3.7. iện di sản phẩm PCR gene pirAvp của các chủng Vibrio spp. phân lập từ tôm bằng cặp mồi AP3 ..............................................................................................64 Hình 3.8. Sản phẩm PCR đoạn 16S rRNA của các chủng Vibrio .............................69 Hình 3.9. Cây phát sinh loài của chủng TTHVP202101001 và TTHVV202101009 so với các chủng đã công bố .....................................................................................69 Hình 3.10. Tỷ lệ chết tích lũy (%) của tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm với V.parahaemolyticus ...................................................................................................70 ix
Hình 3.11. iện di sản phẩm PCR các gene LvCTL ................................................72 Hình 3.12. Mức độ tương đồng của trình tự nucleotide của gene LvCTL3 phân lập được so với gene LvCTL3 đã được công bố (KF156943) .........................................73 Hình 3.13. Mức độ tương đồng của trình tự amino acid suy diễn từ gene LvCTL3 so với trình tự amino acid đã được công bố (AGV68681) ............................................74 Hình 3.14. Mức độ tương đồng của trình tự nucleotide của gene LvCTL4 phân lập được so với gene LvCTL4 đã được công bố (KM387560) .......................................74 Hình 3.15. Mức độ tương đồng của trình tự amino acid suy diễn từ gene LvCTL4 so với trình tự amino acid đã được công bố (AKA64754) .......................................74 Hình 3.16. So sánh trình tự amino acid suy diễn của LvCTL3 và LvCTL4 ..........75 Hình 3.17. Mô hình cấu trúc không gian của LvCTL3 ............................................78 Hình 3.18. Mô hình cấu trúc không gian của LvCTL4 ............................................78 Hình 3.19. Mức độ phiên mã của gene LvCTL3 các cơ quan khác nhau ở tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh AHPND ...............................................................................79 Hình 3.20. Biểu đồ phân bố mức độ phiên mã gene LvCTL3 giữa các cơ quan khi nhiễm AHPND ..........................................................................................................80 Hình 3.21. Tạo dòng gene LvCTL3 vào vector biểu hiện.........................................81 Hình 3.22. Sản phẩm PCR từ vector pET200/LvCTL3 của khuẩn lạc E. coli BL21(DE3) ................................................................................................................82 Hình 3.23. iện di protein tổng số từ tế bào E. coli BL21 trên gel polyacrylamide83 Hình 3.24. iện di protein tái gấp cuộn từ thể vùi trên gel polyacrylamide ............84 Hình 3.25. Khả năng ngưng kết vi khuẩn V. parahaemolyticus TTHVP202101001 của protein LvCTL3 tái tổ hợp ..................................................................................86 Hình 3.26. Các loại tế bào máu tôm (độ phóng đại 100×) ............................................91 Hình 3.27. Hoạt động thực bào ................................................................................95 Hình 3.28. Tỷ lệ chết tích lũy ở các nghiệm thức ....................................................98 Hình 3.29. Tôm thí nghiệm sau cảm nhiễm .............................................................99 Hình 3.30. Mô gan tụy của tôm ở các nghiệm thức ...............................................100 x
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết TT Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tắt 1 AAI Average Amino Acid Identity Acute Hepatopancreatic Necrosis 2 AHPND Bệnh hoại tử gan tụy cấp Disease 3 AMP Antimicrobial peptide Peptide kháng khuẩn 4 AP AHPND primer set 5 BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò 6 CDS Coding Sequence Trình tự mã hóa 7 COX1 Cytochrome c oxidase I Miền nhận diện 8 CRD Carbohydrate recognition domain Carbohydrate 9 CTL C-type lectin Lectin loại C 10 CTLD C-type lectin domain Miền lectin loại C Tăng trưởng khối lượng 11 DWG Daily Weight Gain theo ngày 12 EDTA EthyleneDiamineTetraAcetic 13 EHP Enterocytozoon hepatopenaei Bệnh vi bào tử trùng 14 EMS Early Mortality Syndrome Hội chứng chết sớm 15 EU Eropean Union Liên minh Châu Âu 16 FCR Feed conversion rate Hệ số chuyển đổi thức ăn 17 FE Feed efficiency Hiệu quả sử dụng thức ăn Bệnh hoại tử cơ quan tạo Infectious hypodermal and 18 IHHNV máu và cơ quan lập biểu haematopoietic necrosis virus mô Global biodiversityinfomation Cơ sở Thông tin a dạng 19 GBIF facility Sinh học Toàn cầu Hội nghị thị trường thủy 20 GSMC Global Seafood Market Conference sản thế giới 21 H&E Hematoxylin & Eosin Phương pháp nhuộm xi
Hematoxylin & Eosin 22 IPTG Isopropylthiogalactoside Integrated Taxonomic Information 23 ITSI Hệ thống phân loại tích hợp System 24 LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50% 25 LB Luria Bertani 26 LRRs Leucine Rich Repeats 27 LPS Lipopolysaccharide lipoglycan hoặc nội độc tố 28 LTL L-type lectin Lectin loại L 29 LYS Lysozyme 30 MBV Monodon Baculovirus Bệnh còi do Baculovirus 31 MPO Myeloperoxidase National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Công 32 NCBI Information nghệ Sinh học Quốc gia 33 OIE Office International des Epizooties Tổ chức Thú y thế giới 34 ORF Open reading frame Khung đọc mở 35 PA Phagocytic Activity Hoạt động thực bào Dung dịch muối đệm 36 PBS Phosphate-buffered saline phosphate 37 PCR Polymerase Chain Reaction 38 proPO Pro-phenoloxidase 39 PO Phenoloxidase 40 PRR Pattern recognition domain Miền nhận dạng mẫu 41 RBA Respiratory burst acitivity 42 SDS Sodium dodecyl sulfate 43 SOD Superoxide dismutase 44 SGR Specific Growth Rate Tăng trưởng đặc trưng 45 TAE Tris, axit axetic và EDTA 46 TBS Tris Buffered Saline xii
Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose Môi trường đặc trưng nuôi 47 TCBS agar cấy vi khuẩn Vibrio 48 THC Total haemocyte count Tổng số tế bào máu 49 TNE Tris, NaCl và EDTA 50 TSA Tryptic Soy Agar 51 TSB Tryptic Soy Broth 52 Sổ đăng ký thế giới các loài WORMS World Register Marine of Species 53 sinh vật biển 54 WG Weight gain Tăng trọng 55 WSSV White spot syndrome virus Vius gây bệnh đốm trắng 56 YHD Yellow head disease Bệnh đầu vàng 57 YHV Yellow head Virus Virus gây bệnh đầu vàng xiii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii TÓM TẮT ................................................................................................................. iv ABSTRACT .............................................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... xi MỤC LỤC ............................................................................................................... xiv MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................. 2 3. Ý nghĩa của luận án............................................................................................... 3 4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................ 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................ 5 1.1. Tổng quan về tôm thẻ chân trắng ..................................................................... 5 1.1.1. Sơ lược về tôm thẻ chân trắng ............................................................... 5 1.1.2. Tình hình nuôi và sản lượng tôm thẻ chân trắng trên thế giới............... 6 1.1.3. Tình hình nuôi và xuất khẩu tôm ở Việt Nam ....................................... 7 1.1.4. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Thừa Thiên Huế ............... 11 1.2. Tổng quan về bệnh hoại tử gan tụy cấp ......................................................... 12 1.2.1. ặc điểm phân bố bệnh ....................................................................... 12 1.2.2. Tác nhân gây bệnh ............................................................................... 14 1.2.3. Dấu hiệu bệnh lý và đặc điểm bệnh học .............................................. 18 1.2.4. Biện pháp phòng và trị ......................................................................... 19 1.3. Tổng quan về hệ thống miễn dịch ở tôm ........................................................ 24 1.3.1. áp ứng miễn dịch dịch thể ................................................................. 25 1.3.2. áp ứng miễn dịch tế bào .................................................................... 27 1.4. C- type lectin và vai trò trong hoạt động đáp ứng miễn dịch của tôm........ 29 xiv
1.4.1. Tổng quan về C-type lectin ở tôm he .................................................. 29 1.4.2. Vai trò của CTL trong khả năng kháng vi khuẩn ................................ 30 1.4.3. Phân lập, tạo dòng và biểu hiện gene mã hóa CTL từ tôm.................. 32 1.4.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu và ứng dụng protein CTL tái tổ hợp tại Việt Nam ................................................................................................... 34 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU36 2.1. Phạm vi và đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 36 2.1.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 36 2.1.2. ối tượng và khách thể nghiên cứu ..................................................... 36 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 37 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu của luận án đƣợc thể hiện ở Hình 2.1. ..................... 37 2.3.1. Phân lập, xác định tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng37 2.3.2 Phân lập, tạo dòng và xác định mức độ biểu hiện gene LvCTL từ tôm thẻ chân trắng ................................................................................................. 42 2.3.3. ánh giá hoạt tính ngưng kết V. parahaemolyticus của LvCTL3 tái tổ hợp ................................................................................................................. 47 2.3.4. ánh giá ảnh hưởng của LvCTL3 tái tổ hợp lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng51 2.4. Xử lý số liệu ....................................................................................................... 58 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 60 3.1. Phân lập, xác định tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng... 60 3.1.1. Kết quả quan sát tiêu bản tươi mang và gan tụy .................................. 60 3.1.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn và xác định hiện diện gene độc tố .................................................................................................................... 61 3.1.3. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn phân lập được trong điều kiện in vivo. ................................................................................................................ 61 3.2. Phân lập, tạo dòng và xác định mức độ biểu hiện gene LvCTL từ tôm thẻ chân trắng ................................................................................................................ 72 3.2.1. Phân lập, tạo dòng và phân tích trình tự gene LvCTL ......................... 72 3.2.2. Dự đoán đặc điểm và cấu trúc không gian phân tử LvCTL3 và LvCTL4.......................................................................................................... 76 3.2.3. Mức độ phiên mã gene LvCTL3 ở các cơ quan khác nhau của tôm nhiễm bệnh AHPND ...................................................................................... 78 xv
3.3. Đánh giá hoạt tính ngƣng kết vi khuẩn V. parahaemolyticus của protein LvCTL3 tái tổ hợp .................................................................................................. 81 3.3.1. Tạo protein LvCTL3 tái tổ hợp............................................................ 81 3.3.2. ánh giá khả năng ngưng kết vi khuẩn V. parahaemolyticus của protein LvCTL3 tái tổ hợp ............................................................................. 84 3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp đến đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng87 3.4.1. Ảnh hưởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên tốc độ tăng trưởng và đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng .................................................... 88 3.4.2. Ảnh hưởng protein LvCTL3 tái tổ hợp lên khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng ...................... 97 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 103 4.1. Kết luận ........................................................................................................... 103 4.2. Kiến nghị ......................................................................................................... 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 105 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN ....... 125 xvi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, việc nuôi tôm trong môi trường nước lợ ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon). Hai loài tôm này đóng vai trò quan trọng không chỉ trong chiến lược phát triển ngành thủy sản mà còn đóng góp vào tăng trưởng kinh tế của đất nước [6]. ặc biệt, tôm thẻ chân trắng đã được xác định là loài tôm nuôi chủ lực từ năm 2018, nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng cao và có khả năng cạnh tranh trên thị trường nội địa và quốc tế. Mục tiêu là đạt giá trị xuất khẩu tối thiểu 100 triệu USD/năm [167]. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2017) [162], ngành công nghiệp tôm nuôi đang đứng trước nhiều thách thức trong đó dịch bệnh như: bệnh virus đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV), virus đầu vàng (Yellow head virus - YHV), và đặc biệt là bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio trên tôm nuôi gây thiệt hại nghiêm trọng về cả năng suất và hiệu quả kinh tế cho người nuôi. Vibrio parahaemolyticus được xác định là tác nhân chính gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) hay còn gọi là Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS), bệnh này một trong những nguyên nhân gây chết hàng loạt đối với tôm nuôi dưới 30 ngày tuổi, và đây cũng là thách thức lớn nhất cho nghề nuôi tôm hiện nay trên thế giới và Việt Nam [140]. Bệnh AHPND xuất hiện lần đầu tiên tại Trung Quốc (2009), Việt Nam (2010), Malaysia (2010) và Thái Lan (2012) sau đó lan rộng ra các nước khác nhưng đến nay vẫn chưa có giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả [110]. Trước đây, kháng sinh được sử dụng phổ biến trong điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra trên tôm. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh tạo ra nhiều tác hại không mong muốn như: gia tăng các chủng vi sinh vật kháng kháng sinh, gây ô nhiễm môi trường nước và đất, tồn dư kháng sinh có thể gây ra vấn đề về an toàn vệ sinh thực phẩm, gây nguy cơ cho sức khỏe của con người [153]. ồng thời, trong bối cảnh Việt Nam đã cam kết hướng đến việc loại bỏ kháng sinh khỏi thực phẩm chăn nuôi từ năm 2018 và việc cấm một số loại kháng sinh trong chăn nuôi và thuỷ sản từ năm 2022 của Liên minh châu Âu [124], [162]. Vì vậy, việc sử dụng các chất sinh học đáp ứng yêu cầu vệ sinh thực phẩm, an toàn cho người sử dụng trong phòng và trị bệnh cho tôm nuôi là một yêu cầu cấp thiết. 1
Hệ miễn dịch của giáp xác nói chung và tôm nói riêng chỉ có miễn dịch tự nhiên (hay còn gọi là miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch không đặc hiệu) bao gồm miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể tạo ra phản ứng phòng vệ chung cho nhiều loại mầm bệnh [110]. Theo nghiên cứu của Xu và cs (2010) [152], khi có tác nhân gây bệnh xâm nhập, các phân tử thụ thể trong hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng sẽ nhận diện với nhiều loại phân tử của mầm bệnh khác nhau như lipopolysaccharide (LPS) của màng tế bào vi khuẩn Gram (-), các gốc đường của màng tế bào virus và kích hoạt phản ứng tiêu diệt tác nhân gây nhiễm. Lectin là một nhóm protein có thể gắn kết với glycoprotein hoặc glycolipid trên bề mặt vi sinh vật nên được xem là thành phần quan trọng của hệ thống miễn dịch tự nhiên của động vật giúp quá trình nhận diện và loại bỏ các vi sinh vật, hoặc các protein lạ hòa tan trong hệ thống tuần hoàn [156]. Trong đó, C-type lectin (CTL) là nhóm lectin được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất trong việc tăng cường hoạt động ngưng kết và tiêu diệt vi sinh vật cho giáp xác trong điều kiện in vitro [95]. CTL được xem như chất kích thích miễn dịch kích hoạt hệ thống bổ thể của tôm trong quá trình opsonin hoá và thực bào tác nhân gây bệnh nhằm thay thế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng. Tuy nhiên, việc nghiên cứu chiết xuất lectin từ thực vật hay động vật cho sinh khối nhỏ, giá thành cao nên chỉ mới được ứng dụng trong y học, chưa đáp ứng được nhu cầu trong phòng trị bệnh cho vật nuôi. Năm 2020, Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2020) [22], đã ứng dụng kỹ thuật gene và sử dụng protein LvDLdlrCTL tái tổ hợp có thể giúp tăng cường biểu hiện CTL, và được xem có tiềm năng ứng dụng trong hỗ trợ điều trị AHPND do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng protein tái tổ hợp từ vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm đáp ứng nhu cầu phòng và trị bệnh cho động vật nói chung và động vật thuỷ sản nói riêng, đặc biệt là ứng dụng hỗ trợ trong điều trị bệnh trên tôm thẻ chân trắng là nhóm động vật bậc thấp, chỉ có hệ thống miễn dịch tự nhiên, không có khả năng ghi nhớ là vấn đề cấp thiết hiện nay. Do đó, luận án được thực hiện với tên đề tài: “Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)” với các mục tiêu như sau: 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Nhằm tạo protein tái tổ hợp từ gene LvCTL3 mã hóa protein LvCTL3 phân lập từ tôm thẻ chân trắng, và thử nghiệm sử dụng protein tái tổ hợp này làm chất bổ sung 2