Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:54

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)" được hoàn thành với mục tiêu nhằm xác định các hoạt chất sinh học có khả năng kháng khuẩn và ứng dụng cao chiết từ cây sài đất trong phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp định hướng sử dụng thảo dược trong quy trình nuôi tôm, giảm thiểu việc dùng thuốc và hóa chất, hướng tới một ngành nuôi trồng thủy sản an toàn và bền vững.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN NGUYÊN NGỌC SỬ DỤNG CÂY SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis) ĐỂ PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) DO VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY RA TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 9620301 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Linh PGS. TS Nguyễn Ngọc Phước HUẾ, NĂM 2024
Công trình hoàn thành tại: Trường Đại học Nông Lâm Huế, Đại học Huế Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN QUANG LINH PGS.TS. NGUYỄN NGỌC PHƯỚC Phản biện 1: .................................................................................... .................................................................................... ..................................................................................... Phản biện 2: .................................................................................... .................................................................................... ..................................................................................... Phản biện 3: .................................................................................... .................................................................................... ..................................................................................... Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại: ............................................................................................................. Vào hồi ….. giờ….., ngày…….. tháng …. năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Trường Đại học Nông Lâm Huế
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nuôi trồng thuỷ sản đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nước ta, với sản lượng thuỷ sản Việt Nam đứng thứ tư trên thế giới, kim ngạch xuất khẩu lên đến hàng tỷ USD hàng năm. Tuy nhiên, dịch bệnh xảy ra đặc biệt bệnh do vi khuẩn là một trong những thách thức chính cho sự phát triển thủy sản nước ta cũng như trên thế giới. Bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND), là bệnh nguy hiểm có thể gây ra tỷ lệ chết cao (có thể lên tới 100%) ở tôm nuôi trên toàn thế giới. Bệnh AHPND gây ra do nhóm vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Vibrio, chủ yếu là Vibrio parahaemolyticus (viết tắt là VpAHPND) mang plasmid chứa các gene độc tố nhị phân PirA và PirB (Photorhabdus insect-related -Pir) gây ra. Do khả năng lây lan nhanh và gây ra thiệt hại lớn, AHPND được đưa vào danh mục các bệnh nguy hiểm của tổ chức sức khoẻ động vật thế giới từ năm 2016 (World Organisation for Animal Health - OIE). Nghiên cứu các giải pháp phòng và trị bệnh này trên tôm nuôi mà không sử dụng kháng sinh đang là mối quan tâm hàng đầu của các nước trên thế giới. Thảo dược được xem là một trong những giải pháp để thay thế kháng sinh, trong thảo dược chứa các hoạt chất sinh học kháng khuẩn tự nhiên được xem là giải pháp an toàn để phòng trị bệnh cho động vật nuôi, thân thiện với môi trường và đảm bảo an toàn thực phẩm. Sài đất (Wedelia chinensis) thuộc họ cúc (Asteraceae), được ứng dụng nhiều trong y học để trị các bệnh ngoài da ở trẻ em, điều trị các bệnh viêm cơ, sốt xuất huyết, viêm tuyến vú ở người lớn. Các hoạt chất sinh học như polyphenol, flavonoid, alkaloid, trong cây sài đất đã được chứng minh có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm mạnh và các chất này còn có khả năng bảo vệ tế bào gan chống lại sự gây nhiễm của các tác nhân gây bệnh, cũng như phục hồi chức năng các tế bào gan sau viêm nhiễm. Tuy nhiên, ứng dụng cao chiết sài đất lên động vật thủy sản chỉ mới giới hạn trong việc khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết sài đất lên một số vi khuẩn gây bệnh trong điệu kiện in vitro, chưa có nghiên cứu hoàn chỉnh nào về sử dụng cao chiết sài đất để phòng và trị bệnh trên động vật thuỷ sản. Nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng thêm loại thảo dược mới trong phòng và trị bệnh vi khuẩn trên tôm, nghiên cứu: “Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” thực hiện với các mục tiêu sau: 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Nghiên cứu nhằm xác định các hoạt chất sinh học có khả năng kháng khuẩn và ứng dụng cao chiết từ cây sài đất trong phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng.
2 Kết quả nghiên cứu sẽ giúp định hướng sử dụng thảo dược trong quy trình nuôi tôm, giảm thiểu việc dùng thuốc và hóa chất, hướng tới một ngành nuôi trồng thủy sản an toàn và bền vững. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Nhằm xác định một số hoạt chất sinh học trong cao chiết sài đất có hoạt tính kháng khuẩn và hiệu suất chiết xuất cao toàn phần. - Nhằm đánh giá hiệu quả của cao chiết sài đất lên tăng cường đáp ứng miễn dịch và khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học về các thành phần hoạt chất có trong các bộ phận của cây sài đất và xác định các nhóm chất phổ biến có khả năng kháng khuẩn cao trong cây sài đất: flavonoid và polyphenol, có tính kháng khuẩn với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng. Đồng thời, đánh giá cao chiết sài đất lên đáp ứng miễn dịch và thử nghiệm cao chiết sài đất trong phòng và trị bệnh AHPND ở tôm. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học về tiềm năng sử dụng thảo dược nói chung và cây sài đất nói riêng trong nuôi trồng thủy sản. Từ đó khuyến cáo áp dụng cao chiết sài đất, bổ sung vào thức ăn nuôi tôm nhằm nâng cao hiệu quả phòng trị bệnh AHPND, góp phần nâng cao tỷ lệ sống, thay thế kháng sinh đảm bảo an toàn cho tôm và thực phẩm cho con người. 3.3. Những điểm mới của luận án - Lần đầu công bố các hoạt chất sinh học (định tính và định lượng) có trong cao chiết sài đất ở 3 loại dung môi methanol, ethanol và nước cất, cũng như khả năng kháng khuẩn của cao chiết sài đất ở 3 loại dung môi này với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm nuôi. - Xác định tính an toàn của cao chiết sài đất lên tôm thẻ chân trắng, từ đó cung cấp cơ sở khoa học về việc ứng dụng cao chiết sài đất trong nuôi trồng thuỷ sản. - Xác định được liều lượng và thời gian bổ sung cao chiết sài đất (W. chinensis) giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch cho tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) và khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Chương này được trình bày với 4 nội dung chính: (i) Tổng quan về tôm thẻ chân trắng; (ii) Tổng quan về bệnh vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm thẻ chân trắng; (iii) Thảo dược và vai trò của thảo dược trong phòng và trị bệnh ở động vật thuỷ sản; và (iv) Tổng quan về cây sài đất.
4 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và đối tượng nghi n cứu 2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Khoa Dược, trường Đại học Y Dược, Đại học Huế. - Phòng thí nghiệm khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế. - Thời gian nghiên cứu được thực hiện trong 3 năm từ 2021 - 2024. 2.1.2. Đối tượng và khách thể nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu - Cao chiết sài đất (W. chinensis) (Osbeck) Merr. - Vi khuẩn V. parahaemolyticus.  Khách thể nghiên cứu - Tôm thẻ chân trắng (P. vannamei Boone, 1931) 2.2. Nội dung nghi n cứu - Xác định thành phần các hoạt chất sinh học và hiệu suất chiết xuất cao toàn phần trong cây sài đất. - Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng của cao chiết sài đất. - Xác định ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên đáp ứng miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng. - Đánh giá hiệu quả của cao chiết cây sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng. 2.3. Phư ng ph p nghi n cứu 2.3.1. Phương pháp xác định thành phần các hoạt chất sinh học có trong cây sài đất 2.3.1.1. Xác định định tính các thành phần hoạt chất sinh học có trong cây sài đất Phương pháp xác định các nhóm hoạt chất sinh hoc từ thân và lá cây sài đất trong các dung môi methanol hoặc ethanol hoặc nước cất được tiến hành theo phương pháp của Trần Hùng và Nguyễn Viết Kình (2015).
5 2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần  Định lượng hàm lượng polyphenol tổng - Nguyên tắc định lượng theo phương pháp của Smith và Charter Edward (2010). - Cách tiến hành theo phương pháp của Milan và Bharat (2019).  Định lượng flavonoid toàn phần - Nguyên tắc định lượng theo phương pháp của Makasa và Ningsih (2020). - Cách tiến hành theo phương pháp của Pham Thi Thu Ha và cs (2020). 2.3.1.3. Phương pháp tạo cao chiết và hiệu suất chiết xuất cao sài đất Phương pháp tạo cao chiết từ thân và lá sài đất trong ba dung môi là methanol hoặc ethanol hoặc nước cất được tiến hành theo phương pháp của Trần Hùng và Nguyễn Viết Kình (2015). 2.3.2. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng của cao chiết sài đất. X c định khả năng kh ng khuẩn của cao chiết Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết sài đất ở ba dung môi hoặc methanol hoặc ethanol hoặc nước cất được tiến hành theo phương pháp của Tucker và cs (2009). Phư ng ph p x c định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phương pháp pha loãng nồng độ trên đĩa 96 giếng của CLSI (2012). Phư ng ph p x c định nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) Phương pháp xác định nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) được xác định theo phương pháp trải đĩa thạch theo CLSI (1998). 2.3.3. Phương pháp đánh giá ngưỡng an toàn của cao chiết sài đất lên tôm thẻ chân trắng - Nồng độ cao chiết sài đất sử dụng cho thí nghiệm đánh giá ngưỡng an toàn dựa vào phương pháp của Stallard và Whitehead (1995). - Giá trị LD50 của cao chiết theo công thức của Reed và Muench (1938).
6 2.3.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của cao chiết sài đất đến các chỉ tiêu miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng - Phư ng ph p x c định tổng tế bào máu (THC) Tổng số tế bào máu (THC) của tôm được xác định theo phương pháp của Le Moullac và cs (1997). - Hoạt tính enzyme lysozyme (LYS) Hoạt tính enzyme lysozyme được xác định theo phương pháp của Hong và cs (2022). - Hoạt tính enzyme phenoloxidase (PO) Hoạt tính enzyme phenoloxidase (PO) được xác định theo phương pháp của Herández-Lospez và cs (1996). - Hoạt tính superoxide dismutase (SOD) Hoạt tính (SOD) được xác định dựa trên kit thương mại (CS0009, Sigma- Aldrich) theo phương pháp của Biagini và cs (1995). - Hoạt động thực bào Hoạt động thực bào của tế bào máu tôm được xác định theo phương pháp của Liu và Chen (2004). 2.3.5. Phương pháp đánh giá hiệu quả của cao chiết cây sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng 2.3.5.1. Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung cao chiết sài đất (liệu trình bổ sung cao chiết) lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng Để xác định liệu trình bổ sung cao chiết sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng, tiến hành bố trí 2 thí nghiệm song song với 3 nồng độ cao chiết sài đất với hai liệu trình cho ăn. - Liệu trình bổ sung 1 lần: Tôm thí nghiệm được cho ăn thức ăn có bổ sung cao chiết sài đất liên tục trong 7 ngày, sau đó tiến hành gây bệnh thực nghiệm vào ngày thứ 8. - Liệu trình bổ sung 2 lần: Tôm được cho thức ăn có bổ sung cao chiết sài đất trong vòng 2 đợt, mỗi đợt kéo dài 7 ngày liên tục. Thời gian nghỉ giữa hai đợt cho ăn cao chiết sài đất là 7 ngày, sau đó tiến hành gây bệnh thực nghiệm vào ngày thứ 22. - Tỷ lệ bảo hộ cao chiết (RPS) được tính theo công thức của Amend (1981).
7 2.3.5.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả của cao chiết sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng Sau 21 ngày thí nghiệm, mỗi nghiệm thức ở thí nghiệm này được phân thành 2 nhóm, gồm 3 nghiệm thức/nhóm, tổng cộng 12 bể/nhóm. Nhóm 1: Tiến hành cảm nhiễm 5 con tôm thẻ chân trắng (đánh dấu bằng cách cắt 1 phần đuôi) bằng phương pháp ngâm trong 2L nước biển 20‰ chứa vi khuẩn với liều 106 CFU/mL trong 30 phút. Sau đó tôm được vớt ra và đưa vào bể thí nghiệm nuôi chung với 20 tôm không cảm nhiễm. Nhóm 2: Tiến hành cảm nhiễm 5 tôm thẻ chân trắng (đánh dấu bằng cách cắt 1 phần đuôi) bằng cách ngâm trong 2L nước biển 20‰ chứa vi khuẩn với liều 106 CFU/mL trong 30 phút. Sau đó tôm được vớt ra và đưa vào bể thí nghiệm nuôi riêng trong giỏ nhựa có thể tích 0,4 cm3 với 20 tôm không cảm nhiễm. 2.3.5.3. Phương pháp phân tích mô học trên tôm thẻ chân trắng Phân tích mô bệnh học được thực hiện theo phương pháp của Lightner (1996). Mô bệnh học được phân tích mô tả theo Tang và cs (2020). 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng Excel 2016 để xác định các giá trị trung bình (Mean), độ lệch chuẩn (SD) và phần mềm SPSS 20.0, để phân tích phương sai ANOVA một yếu tố (One way Anova) để so sánh sự khác nhau về đường kính vòng kháng khuẩn và các chỉ tiêu đáp ứng miễn dịch. Kiểm định thống kê được thực hiện ở mức ý nghĩa P ≤ 0,05 bằng phép thử LSD.
8 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả x c định các thành phần hoạt chất sinh học và hiệu suất chiết xuất cao toàn phần có trong cây sài đất 3.1.1. Xác định các thành phần hoạt chất sinh học có trong cây sài đất 3.1.1.1. Kết quả định tính các thành phần hoạt chất sinh học có trong cây sài đất ở ba dung môi khác nhau Kết quả xác định các nhóm hoạt chất sinh học có trong các mẫu cao chiết sài đất ở ba dung môi methanol, ethanol, nước cất cho thấy sự hiện diện của các hoạt chất có hoạt tính sinh học kháng khuẩn như alkaloid, flavonoid, polyphenol, carotenoid, chất béo, tinh dầu, tanin, saponin, acid hữu cơ và hợp chất khử (bảng 3.1). Bảng 3.1. Kết quả xác định các hoạt chất sinh học có trong cây sài đất Kết quả định tính Nhóm trên ba dung môi Thuốc thử Phản ứng hoạt chất Methanol Ethanol Nước cất Nhỏ dung dịch Chất béo Vết trong mờ + + - lên giấy lọc Tinh dầu Bốc hơi tới cặn Mùi thơm + + - Carotenoid H2SO4 Xanh dương + + + Thuốc thử Alkaloid Kết tủa + + + chung Alkaloid Dung dịch Flavonoid HCl đậm đặc + + + màu đỏ Tanin FeCl3 Kết tủa xanh lục - + + Lắc mạnh dung Bọt bền Saponin - - + dịch nước trên 15 phút Dung dịch Dung dịch Polyphenol + + + FeCl3 xanh rêu Thuốc thử Hợp chất khử Tủa đỏ gạch + + + Fehling Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt + + + Chú thích: (+) có hiện diện; ( ) không hiện diện
9 3.1.1.2. Kết quả định lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần trong ba loại dung môi Polyphenol tổng (TPC) Flavonoid (TFC) Mẫu thử (mg GAE/g cao chiết) (mg RE/g cao chiết) Cao chiết với methanol 74,33 ± 4,49 a 24,59 ± 2,19 a 98,8% Cao chiết với ethanol 96% 73,65± 5,44a 20,63 ± 4,30 a Cao chiết với nước cất 53,07 ± 1,48 b 3,20 ± 0,07 b a,b Ghi chú: Ký tự trên cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P
10 3.2. Đ nh giá khả năng kh ng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng của cao chiết sài đất 3.2.1. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết sài đất ở ba dung môi với vi khuẩn V. parahaemolyticus Tuy theo dung môi sử dụng, khả năng kháng khuẩn của cao chiết sài đất đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus có sự thay đổi khác nhau, trong đó cao chiết với dung môi methanol 99,8% cho khả năng kháng khuẩn cao nhất (bảng 3.4). Bảng 3.4. Đường kính vòng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của cao chiết sài đất với ba dung môi methanol, ethanol và nước cất Cao chiết sài đất Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Cao chiết với methanol 99,8% 15,1 ± 0,85a Cao chiết với ethanol 96% 13,6 ± 1,05a Cao chiết với nước cất 13,1 ± 1,15a Đối chứng dương (Kháng sinh AM) 9,0 ± 1,3b Đối chứng âm (nước cất) 0c Ghi chú: Các giá trị a,b,c trên cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P
11 Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc và xác định nồng độ MIC của cao chiết sài đất lên vi khuẩn V. parahaemolyticus Cao chiết sài đất Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nồng độ pha loãng (mg/L) Methanol Ethanol Nước cất 5000 - - - 2500 - - - 1000 - - + 500 - - + 250 - - + 125 - - + 62,5 - - + 31,25 - + + 15,5 + + + Ghi chú: (+) Vi khuẩn phát triển, (-) Vi khuẩn không phát triển Cao chiết sài đất trong dung môi nước cất ở nồng độ 1000 mg/L có sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus (sau 24 giờ ở nhiệt độ 28 – 30oC). Bên cạnh đó, cao chiết sài đất trong dung môi methanol và ethanol có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus ở nồng độ rất thấp (15,5 mg/L), tuy nhiên vi khuẩn mọc trở lại trên đĩa thạch ở cao chiết sài đất trong dung môi methanol (15,5 mg/L) và ethanol (31,25 mg/L) sau 24 giờ nuôi cấy. Từ kết quả sàng lọc và xác định nồng độ MIC lên vi khuẩn V. parahaemolyticus (bảng 3.5), tiếp tục xác định nồng độ MBC trong cao chiết sài đất lên vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng được trình bày ở bảng 3.6.
12 Bảng 3.6. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) của cao chiết sài đất lên vi khuẩn V. parahaemolyticus Cao chiết sài đất trong Nồng độ ức chế tối Nồng độ tiêu diệt tối MBC/MIC các loại dung môi thiểu (MIC) (mg/L) thiểu (MBC) (mg/L) Methanol 31,25 31,25 1 Ethanol 62,5 62,5 1 Nước cất 2500 5000 2 Kết quả xác định nồng độ MBC của cao chiết sài đất trong ba dung môi methanol, ethanol và dung môi nước lên vi khuẩn V. parahaemolyticus (bảng 3.6) cho thấy, cao chiết trong dung môi methanol tiêu diệt vi khuẩn hoàn toàn ở nồng độ 31,25 mg/L, cao chiết sài đất trong dung môi ethanol ở nồng độ 62,5 mg/L, còn cao chiết trong dung môi nước cất tiêu diệt vi khuẩn ở nồng độ 5000 mg/L. 3.3. Kết quả đ nh gi ngưỡng an toàn của cao chiết sài đất trên tôm thẻ chân trắng Kết quả sau 21 ngày thí nghiệm cho thấy, không có xuất hiện dấu hiệu bất thường trên tôm thẻ chân trắng khi bổ sung các nồng độ cao chiết sài đất này vào thức ăn ở các nghiệm thức thử nghiệm. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng khi cho ăn cao chiết sài đất ở các nghiệm thức này đều đạt 100% trong 21 ngày thí nghiệm (bảng 3.7). Do vậy không thể xác định được giá trị LD50 của cao chiết sài đất. Bảng 3.7. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng ở các nghiệm thức thí nghiệm Tỷ lệ sống của tôm thí nghiệm Nghiệm thức theo thời gian (%) (nồng độ cao chiết) 0 ngày 7 ngày 14 ngày 21 ngày Nghiệm thức ĐC 100 100 100 100 NT1 (31,25 mg/kg thức ăn) 100 100 100 100 NT2 (312,5 mg/kg thức ăn) 100 100 100 100 NT3 (625 mg/kg thức ăn) 100 100 100 100
13 3.4. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất đến khả năng tăng cường đ p ứng miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng 3.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên tổng số tế bào máu (THC) trên tôm thẻ chân trắng Tổng số tế bào máu của tôm thẻ chân trắng ở NT2 (cho ăn cao chiết sài đất ở nồng độ 312,5 mg/kg thức ăn) tăng cao nhất so với các nghiệm thức thí nghiệm khác sau ngày thứ 7 và duy trì đến ngày thứ 21 dao động (90,8 – 97,5 x 106 tb/mL) (P0,05) về tổng số tế bào máu khi cho tôm ăn thức ăn có bổ sung cao chiết sài đất ở NT1 (31,25 mg/kg thức ăn), NT2 (312,5 mg/kg thức ăn) và NT3 (625 mg/kg thức ăn) ở ngày thứ 7. Tuy nhiên, tổng số tế bào máu ở ngày thí nghiệm 14 và ngày thứ 21 có sự khác biệt giữa NT2 và NT3 cao hơn và sai khác có ý nghĩa thống kê (P
14 lysozyme tăng cao và sai khác có ý nghĩa thống kê (P
15 Khi khảo sát hoạt tính enzyme PO ở bước sóng 490 nm (OD490) cho thấy hoạt tính của enzyme PO của tôm thẻ chân trắng ở NT2 (cho ăn cao chiết sài đất ở nồng độ 312,5 mg/kg thức ăn) tăng cao nhất so với các nghiệm thức thí nghiệm khác sau ngày thứ 7 và duy trì đến ngày thứ 21 dao động (0,249 – 0,251 U/mL) ở bước sóng OD490 (P
16 thẻ chân trắng tăng cao và sai khác có ý nghĩa thống kê (P
17 100 90 Tỷ lệ % tôm chết tích lũy 80 70 a 60 a a 50 a 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Đối chứng NT1 NT2 NT3 Ngày Hình 3.8. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau 7 ngày cho ăn cao chiết sài đất và cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus Nhằm nâng cao hiệu quả phòng bệnh của cao chiết sài đất đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng, chúng tôi tiến hành tăng liệu trình sử dụng cao chiết sài đất lên 2 lần với liệu trình sử dụng trong 7 ngày liên tục và thời gian nghĩ (cho ăn thức ăn không có bổ sung cao chiết) giữa 2 đợt bổ sung thức ăn có bổ sung cao chiết là 7 ngày (hình 3.9). 100 Tỷ lệ % tôm chết tích lũy 90 80 70 a 60 50 40 30 b b 20 b 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Đối chứng TN 1 TN 2 TN 3 Ngày Hình 3.9. Tỷ lệ chết của tôm thẻ chân trắng sau khi cho ăn cao chiết sài đất với liệu trình 2 lần cách tuần và cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus.
18 Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng khi bổ sung cao chiết sài đất với liệu trình 2 lần cách tuần đều giảm xuống dưới 30%, tỷ lệ chết thấp nhất ở NT2 (312,5 mg/kg thức ăn) chiếm 16%, tiếp đến NT1 (31,25 mg/kg thức ăn) chiếm 18% và NT3 (625 mg/kg thức ăn) là 28%. Kết quả cho thấy, khi cho ăn cao chiết sài đất 2 đợt, mỗi đợt 7 ngày cho kết quả tốt trong phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng nhất là ở NT2 (312,5 mg/kg thức ăn). Tỷ lệ bảo hộ (RPS) của cao chiết sài đất ở tôm chân trắng, khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus được trình bày ở (bảng 3.13). Bảng 3.13. Tỷ lệ bảo hộ cao chiết (RPS) của tôm chân trắng được sử dụng cao chiết sài đất trộn với thức ăn sau khi ngâm với V. parahaemolyticus Nghiệm thức RPS (%) NT1 (31,25 mg/kg thức ăn) 63 NT2 (312,5 mg/kg thức ăn) 69 NT3 (625 mg/kg thức ăn) 55 Qua bảng 3.13 cho thấy, RPS của tôm thẻ chân trắng khi cho ăn cao chiết sài đất ở NT1 và NT2 lần lượt đạt RPS là 63% và 69%, cao hơn so với tôm thẻ chân trắng được cho ăn cao chiết sài đất ở NT3 là (55%). 3.5.1.2. Dấu hiệu bệnh lý và biến đổi mô bệnh học của tôm thẻ chân trắng  Biến đổi mô bệnh học của tôm thẻ chân trắng Kết quả phân tích mô học cho thấy cao chiết sài đất khi bổ sung vào thức ăn không gây hại đến tế bào gan tuy và an toàn cho sự phát triển của tôm thẻ chân trắng thí nghiệm (hình 3.10). Tế bào gan tuỵ của tôm khi cho ăn cao chiết sài đất phát triển bình thường không có hiện tượng thoái hoá hay bất thường (hình 3.10)