Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

4
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)" được hoàn thành với mục tiêu nhằm tạo protein tái tổ hợp từ gene LvCTL3 mã hóa C-type lectin phân lập từ tôm thẻ chân trắng, và thử nghiệm sử dụng protein tái tổ hợp này làm chất bổ sung vào thức ăn giúp tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

I H C HU TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN VINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO C-TYPE LECTIN TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN HUẾ - 2024
I H C HU TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN VINH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO C-TYPE LECTIN TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) Ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 9620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS NGUYỄN NGỌC PHƢỚC HUẾ - 2024
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề CTL được xem như chất kích thích miễn dịch kích hoạt hệ thống bổ thể của tôm trong quá trình opsonin hoá và thực bào tác nhân gây bệnh nhằm thay thế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng. Tuy nhiên, việc nghiên cứu chiết xuất lectin từ thực vật hay động vật cho sinh khối nhỏ, giá thành cao nên chỉ mới được ứng dụng trong y học, chưa đáp ứng được nhu cầu trong phòng trị bệnh cho vật nuôi. Năm 2020, Nguyễn Thị Phương Thảo và cs [22], đã ứng dụng kỹ thuật gene và sử dụng protein LvDLdlrCTL tái tổ hợp có thể giúp tăng cường biểu hiện CTL, và được xem có tiềm năng ứng dụng trong hỗ trợ điều trị AHPND do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng protein tái tổ hợp từ vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm đáp ứng nhu cầu phòng và trị bệnh cho động vật nói chung và động vật thuỷ sản nói riêng, đặc biệt là ứng dụng hỗ trợ trong điều trị bệnh trên tôm thẻ chân trắng là nhóm động vật bậc thấp, chỉ có hệ thống miễn dịch tự nhiên, không có khả năng ghi nhớ là vấn đề cấp thiết hiện nay. Do đó, luận án được thực hiện với tên đề tài: “Nghiên cứu tạo C-type lectin tái tổ hợp và ứng dụng trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)” với các mục tiêu như sau: 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Nhằm tạo protein tái tổ hợp từ gene LvCTL3 mã hóa C-type lectin phân lập từ tôm thẻ chân trắng, và thử nghiệm sử dụng protein tái tổ hợp này làm chất bổ sung vào thức ăn giúp tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được tác nhân chính gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng có mang gene độc tố pirAvp và pirBvp để sử dụng cho các nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính và thí nghiệm gây bệnh cảm nhiễm của protein LvCTL3 tái tổ hợp; 1
- Xác định được cơ quan có mức độ phiên mã gene LvCTL3 cao nhất trên tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh và không nhiễm bệnh AHPND; - iều chế được protein LvCTL3 tái tổ hợp có hoạt tính ngưng kết mạnh với vi khuẩn V. parahaemolyticus; - ánh giá được vai trò của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên các chỉ tiêu miễn dịch của tôm thẻ chân trắng cũng như khả năng kháng bệnh AHPND trong điều kiện in vivo. 3. Ý nghĩa của luận án 3.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu đã thành công trong việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo ra protein tái tổ hợp từ tôm thẻ chân trắng thông qua việc biểu hiện các gene mã hóa CTL trong vi khuẩn E. coli, tổng hợp protein tái tổ hợp và xác định cấu trúc không gian của chúng. Là nghiên cứu đầu tiên đánh giá đầy đủ chức năng protein tái tổ hợp trong cả hai điều kiện in vitro và in vivo, và thử nghiệm sử dụng protein tái tổ hợp như chất kích thích miễn dịch bổ sung vào thức ăn cho tôm. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng về vai trò của LvCTL3 tái tổ hợp đến hoạt động đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm thẻ chân trắng và khả năng phòng bệnh AHPND do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra, làm nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng protein LvCTL3 tái tổ hợp trong phòng trị bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng nói riêng và các tác nhân vi sinh vật khác gây ra trên tôm nuôi tại Việt Nam. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Hiệu quả bước đầu của protein LvCTL3 tái tổ hợp bổ sung vào thức ăn đã tăng cường đáp ứng miễn dịch và kháng bệnh AHPND do vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng. iều này cho thấy tính khả thi của việc ứng dụng LvCTL3 tái tổ hợp trong phòng và trị bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus, hướng đến không dùng kháng sinh trong nuôi tôm. 4. Những đóng góp mới của luận án Công bố đầu tiên tại Việt Nam trong việc phân lập, tạo dòng cũng như xác định mức độ phiên mã gene LvCTL3 mã hóa C-type 2
lectin từ các cơ quan khác nhau ở tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh và không nhiễm bệnh AHPND; Kết quả đã điều chế được protein LvCTL3 tái tổ hợp từ việc biểu hiện gene LvCTL3 ở vật chủ E. coli BL21 (DE3), protein LvCTL3 tái tổ hợp dạng thể vùi, sau khi tái gấp cuộn có hoạt tính ngưng kết mạnh với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus (TTHVP202101001) mang gene độc tố pirAvp và pirBvp gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng; Nghiên cứu đã đánh giá đầy đủ chức năng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên tăng trưởng, đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh trên tôm thẻ chân trắng (in vivo). ây cũng là lần đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu thử nghiệm protein LvCTL3 tái tổ hợp như là chất kích thích miễn dịch trong việc nâng cao khả năng đáp ứng miễn dịch tự nhiên và kháng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng thông qua thức ăn. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về tôm thẻ chân trắng 1.1.1. Sơ lược về tôm thẻ chân trắng 1.1.2. Tình hình nuôi và sản lượng tôm thẻ chân trắng trên thế giới 1.1.3. Tình hình nuôi và xuất khẩu tôm ở Việt Nam 1.2. Tổng quan về bệnh hoại tử gan tụy cấp 1.2.1. Đặc điểm phân bố bệnh 1.2.2. Tác nhân gây bệnh 1.2.3. Dấu hiệu bệnh lý và đặc điểm bệnh học 1.2.4. Biện pháp phòng và trị 1.3. Tổng quan về hệ thống miễn dịch ở tôm 1.3.1. Đáp ứng miễn dịch dịch thể 1.3.2. Đáp ứng miễn dịch tế bào 1.4. C- type lectin (CTL) và vai trò trong hoạt động đáp ứng miễn dịch của tôm 1.4.1. Tổng quan về C-type lectin ở tôm he 1.4.2. Vai trò của CTL trong khả năng kháng vi khuẩn 1.4.3. Phân lập, tạo dòng và biểu hiện gene mã hóa CTL từ tôm 1.4.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu và ứng dụng protein CTL tái tổ hợp tại Việt Nam 3
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phạm vi và đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Phạm vi nghiên cứu - ịa điểm nghiên cứu: + Quá trình thu mẫu (tôm bệnh và tôm khỏe còn sống) được thực hiện tại các ao nuôi tôm ở huyện Phong iền, tỉnh Thừa Thiên Huế. + Phân lập vi khuẩn Vibrio spp., và các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên đáp ứng miễn dịch và khả năng phòng bệnh của vi khuẩn V. parahemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng được bố trí tại Phòng thí nghiệm Bệnh thuỷ sản. Phân tích mức độ phiên mã gene LvCTL3 bằng kỹ thuật Realtime PCR tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Thủy sản, Trường ại học Nông Lâm, ại học Huế. + Phân lập, tạo dòng gene LvCTL3, LvCTL4, biến nạp gene LvCTL3 vào vật chủ E. coli BL21 (DE3), thử hoạt tính ngưng kết vi khuẩn của LvCTL3 tái tổ hợp được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, ại học Huế. 2.1.2. Đối tượng và khách thể nghiên cứu - ối tượng nghiên cứu + Nguồn vi khuẩn: V. parahaemolyticus TTHVP202101001 mang gene độc tố pirAvp và pirBvp được phân lập từ mẫu tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh + Gene LvCTL3 và LvCTL4: được phân lập từ tôm thẻ chân trắng + Nguồn LvCTL3 tái tổ hợp: được biểu hiện thông qua vật chủ vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). - Khách thể nghiên cứu: tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) 2.2. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1. Phân lập, xác định tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng Nội dung 2. Phân lập, tạo dòng và xác định mức độ biểu hiện gene LvCTL từ tôm thẻ chân trắng Nội dung 3. ánh giá hoạt tính ngưng kết vi khuẩn V. parahaemolyticus của protein LvCTL3 tái tổ hợp 4
Nội dung 4. ánh giá ảnh hưởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 5
Hình 2.1. Sơ đồ tổng thể các nội dung nghiên cứu luận án 1
2.3.1. Phân lập, xác định tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng 2.3.1.1 Thu thập mẫu tôm bệnh Bốn mươi mẫu tôm sống nhiễm bệnh có dấu hiệu mềm vỏ, khối gan tụy bị teo nhỏ được thu thập tại ba ao nuôi tôm thâm canh tại huyện Phong iền, tỉnh Thừa Thiên Huế. 2.3.1.2. Phân lập và định danh vi khuẩn và xác định sự hiện diện gene độc tố Phân lập vi khuẩn: Vi khuẩn Vibrio spp. được phân lập theo mô tả của Sung và cs (2001) [134]. Định danh vi khuẩn: Các đặc điểm sinh lý và sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang của Cowan và Steels (1993) (Barrow và Felthham) [34], kết hợp với sử dụng kit API 20E (BioMerieux, Pháp). Xác định sự hiện diện của các gene độc tố: Sự hiện diện của các gene độc tố trong 30 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và 10 chủng vi khuẩn V. vulfinicus được xác định bằng cách sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra sự xuất hiện của các gene mã hóa hai loại protein độc tố pirAvp và pirBvp theo mô tả của Hoàng Tấn Quảng và cs (2020) [19]và theo cặp mổi AP3 theo mô tả của Sirikharin và cs (2014) [129] Định danh khẳng định: bằng kỹ thuật phân tử dựa trên sự tương đồng của gene 16S rRNA với cặp mồi đăch trưng. 2.3.1.3. Xác định khả năng cảm nhiễm với vi khuẩn và liều gây chết 50% (Lethal dose- LD50) Chuẩn bị vi khuẩn: chọn ngẫu nhiên 01 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus ký hiệu TTHVP202101001 trong số các chủng mang gene độc tố pirAvp và pirBvp (từ kết quả khảo sát sự hiện diện gene độc tố và định danh khẳng định) và 01 chủng V. vulfinicus ký hiệu là TTHVV202101009 (được chọn từ kết quả định danh khẳng định). Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm xác định giá trị LD50 được bố trí trên 7 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần) bao gồm: 6 nghiệm thức thí nghiệm (tôm được ngâm với một trong sáu mật độ các chủng vi khuẩn trên từ 1 × 108 đến 1 × 103 CFU/mL trong 60 phút) và 1 nghiệm thức đối chứng âm (tôm 1
được ngâm với nước muối sinh lý (0,85% NaCl) trong 60 phút) [108]. Tỷ lệ chết được theo dõi trong 14 ngày [26]. Giá trị liều gây chết 50% (Lethal Dose 50 - LD50) được xác định theo phương pháp của Reed và Muench (1938) [121]. 2.3.2. Phân lập, tạo dòng và xác định mức độ biểu hiện gene LvCTL từ tôm thẻ chân trắng 2.3.2.1. Thu thập tôm thẻ chân trắng Tôm thẻ chân trắng khỏe mạnh (không nhiễm bệnh) còn sống với khối lượng cơ thể 20 (± 0,5) g/con. Giải phẫu và thu khối gan tụy, bảo quản trong Nitơ lỏng ở -96oC và sử dụng trực tiếp các khối gan tụy này để tách chiết RNA. 2.3.2.2. Phân lập, tạo dòng và phân tích trình tự gene LvCTL Trình tự 5 gene mã hóa LvCTL được lấy từ dữ liệu ngân hàng gene (GenBank) và với các cặp mồi đặc hiệu được tham khảo từ các tài liệu đã công bố do Công ty Cổ phần Phù Sa Genomics tổng hợp. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng SafeViewTM Classic (abm, Canada). Các đoạn mồi đặc hiệu để tạo dòng các gene LvCTL như: LvCTLD (Junkunlo và cs, 2012) [76]; LvCTL3 (Li và cs, 2014) [91]; LvCTL4 (Li và cs, 2015) [92]; LvAV (He và cs, 2015) [65] và LvLdlrCTL (Liang và cs, 2019) [95]. Sản phẩm PCR tinh sạch được tạo dòng vào vector pGEM T-Easy (pGEM) (Promega, Hoa Kỳ), vector tái tổ hợp được chuyển vào vi khuẩn E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Thể tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung 50 μg/mL Ampicillin (Apm), X-Gal/IPTG. Tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp (khuẩn lạc trắng) sau đó được nhân sinh khối bằng cách cấy chuyền vào 5 mL môi trường LB lỏng có bổ sung Amp 50 µg/mL. Tách chiết DNA plasmid từ các tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp bằng kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ). DNA plasmid sau khi tách được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và được sử dụng để phân tích trình tự gene LvCTL3 và LvCTL4 [3]. Trình tự nucleotide của 2 gene LvCTL3 và LvCTL4 được phân tích bằng phương pháp Sanger (Công ty Firstbase, Malaysia). Sau đó, trình tự nucleotide của các gene được kiểm tra bằng phần mềm BioEdit và so sánh với các trình tự đã được công bố trên Genbank thông qua công cụ BLAST 2
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Cây phát sinh loài của trình tự amino acid suy diễn được xây dựng bằng phần mềm MEGA 11 với thuật toán Neighbor-Joining [135]. 2.3.2.3. Dự đoán đặc điểm và cấu trúc không gian phân tử LvCTL3 và LvCTL4 ặc điểm của phân tử LvCTL3 và LvCTL4 được xác định bằng các công cụ tin sinh học 2.3.2.4. Đánh giá mức độ phiên mã gene LvCTL3 ở các cơ quan khác nhau trên tôm thẻ chân trắng - Thu thập mẫu tôm: 5 mẫu tôm nhiễm bệnh AHPND có các dấu hiệu đặc trưng như mô tả Lightner và cs (1996) [68], về dấu hiệu bệnh lý và 10 mẫu tôm không nhiễm bệnh AHPND được chọn ngẫu nhiên từ các mẫu thu thập để làm đối chứng định lượng mức độ phiên mã gene LvCTL3 ở các cơ quan khác nhau. - Tách chiết RNA tổng số: Mô của 06 cơ quan tương ứng (gan tụy, ruột, dạ dày, mang, cơ, tế bào máu) được tách chiết RNA. Sau đó, cDNA được sử dụng để phân tích mức độ phiên mã gene bằng kỹ thuật realtime PCR. Các đoạn mồi đặc hiệu cho gene LvCTL3 và Actin được sử dụng là gene tham chiếu. Trình tự mồi khuếch đại cho phản ứng RT – qPCR như cặp mồi: RT-LvCTL3-F và RT-LvCTL3- R theo Li và cs (2014) [91]; cặp mồi Actin F và Actin R theo Tang và cs (2021) [137]. 2.3.3. Đánh giá hoạt tính ngưng kết V. parahaemolyticus của protein LvCTL3 tái tổ hợp 2.3.3.1. Tạo protein LvCTL3 tái tổ hợp - Tạo dòng gene LvCTL3 vào vector biểu hiện: Vector tái tổ hợp pGEM mang gene LvCTL3 được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR thu nhận vùng gene LvCTL3 mã hóa CTL để biểu hiện trong vector pET200/D-TOPO (Thermofisher, Hoa Kỳ). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng SafeViewTM Classic (abm, Canada) [120]. Sản phẩm của phản ứng PCR thu nhận gene LvCTL3 từ vector tái tổ hợp pGEM (mang gene LvCTL3) được cắt ra trên gel agarose 1%. Sau đó, tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit GeneJET Gel Extraction (ThermoFisher Scientific, Hoa Kỳ) theo quy trình của nhà sản xuất. - Biến nạp sản phẩm gắn vào tế bào E. coli TOP10: Vector pET200/D-TOPO mang gene LvCTL3 được biến nạp vào tế bào E. 3
coli chủng BL21 (DE3) bằng phương pháp hóa biến nạp tương tự như đối với tế bào E. coli TOP10. - Biểu hiện protein tái tổ hợp: Tế bào E. coli BL21 (DE3) mang gene LvCTL3 được chọn lọc và nuôi tăng sinh trong bình tam giác chứa 50 mL môi trường LB, có bổ sung 100 µg/mL Kanamycin ở 37°C; tốc độ lắc 200 vòng/phút. Ly tâm để thu lấy protein thể dịch (protein dạng hòa tan). Tiếp tục hòa tan phần kết tủa (protein dạng thể vùi) với dung dịch đệm 8M Urea ở 30ºC trong 1 giờ, sau đó ly tâm để thu lấy protein trong thể vùi. - Định lượng protein tái tổ hợp: Sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong E. coli BL21 (DE3) được đánh giá bằng phương pháp SDS - PAGE, với chất chuẩn Albumin huyết thanh bò (BSA, Hoa Kỳ) với nồng độ 500 µg/mL. 2.3.3.2. Đánh giá hoạt tính ngưng kết vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND của protein LvCTL3 tái tổ hợp - Chuẩn bị protein LvCTL3 tái tổ hợp: Tế bào E. coli BL21 tái tổ hợp mang gene LvCTL3 được hòa tan trong 5 mL dung dịch đệm ly giải. - Chuẩn bị hỗn hợp vi khuẩn và LvCTL3 tái tổ hợp: V. parahaemolyticus TTHVP202101001 được pha loãng về mật độ 105 CFU/mL trong dung dịch đệm TBS-Ca. Lấy 50 µL dung dịch hỗn hợp (25 µL huyền phù vi khuẩn V. parahaemolyticus và 25 µL dung dịch đệm TBS-Ca) được trộn với LvCTL3 tái tổ hợp ở các nồng độ 25; 50; 100 µL. - Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành với 5 nghiệm thức có hoặc không có sự hiện diện của ion Ca2+ với các tỷ lệ khác nhau: Nghiệm thức 1 (T1 - đối chứng): V. parahaemolyticus không bổ sung LvCTL3 tái tổ hợp; nghiệm thức 2 (T2): V. parahaemolyticus trong TBS + LvCTL3 tái tổ hợp (1:1); nghiệm thức 3 (T3): V. parahaemolyticus trong TBS-Ca + LvCTL3 tái tổ hợp (tỷ lệ 1:0,5); nghiệm thức 4 (T4): V. parahaemolyticus trong TBS-Ca + LvCTL3 tái tổ hợp (1:1), và nghiệm thức 5 (T5): V. parahaemolyticus TBS-Ca + LvCTL3 tái tổ hợp (1:2). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 2.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng 4
2.3.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng - Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm: protein LvCTL3 tái tổ hợp ở các nồng độ: CTL3 (1) (100 µg/mL); CTL3 (2) (200 µg/mL) và CTL3 (3) (500 µg/mL) được chuẩn bị từ mẫu chuẩn có nồng độ 500 µg/mL, pha loãng bằng dung dịch đệm muối phốt phát. - Chuẩn bị thức ăn: Việc chuẩn bị, thành phần nguyên liệu và bảo quản khẩu phần được tiến hành theo nghiên cứu của Hong và cs (2022) [67], (có điều chỉnh). Bột cá: 35%; lecithin: 2,0%; Dầu cá: 3,0%; bột mì: 28,5%; bột đậu nành: 20%; bột ngô: 2,5%; vitamin hỗn hợp: 2,0%; Canxi đihiđro phốt phát: 2,5%; khoáng hỗn hợp: 2,0%; Cholesterol: 2,5%. Tất cả các nguyên liệu khô được cân và nghiền nhỏ, rây qua lưới 60 µm, và trộn đều. Thức ăn được ở bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ đến độ ẩm
Tiêu bản bằng phương pháp nhuộm nhuộm Giemsa, quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (Leica, ức) ở độ phóng đại 100× để xác định các loại tế bào theo phương pháp của Dantas-Lima và cs (2013) [48]. - Hoạt tính phenoloxidase (PO): theo phương pháp của Pan và cs (2008) [111], Sung và cs (1994) [133]. Hoạt tính Myeloperoxidase (MPO): Hoạt tính MPO được thực hiện theo phương pháp của Quade và Roth (1997) [118]. Hoạt tính superoxide dismutase (SOD): Hoạt tính của SOD được đo bằng khả năng ức chế các phản ứng phụ thuộc vào gốc superoxide bằng cách sử dụng bộ kit Superoxide Dismutase (Ransod) assay (Randox, Vương quốc Anh). Hoạt tính enzyme lysozyme (LYS): Hoạt tính lysozyme được xác định theo phương pháp của Chiu và cs (2007) [44]. Hoạt động thực bào (PA): Hoạt động thực bào của tế bào máu tôm được xác định theo phương pháp của Huynh và cs (2018) [69], Liu và Chen (2004) [98]. 2.3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của protein LvCTL3 tái tổ hợp lên khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng - Chuẩn bị vi khuẩn: V. parahaemolyticus TTHVP202101001 (mang gene độc tố pirAvp và pirBvp) với mật độ 1 × 105 CFU/mL. - Chuẩn bị tôm thí nghiệm: Tôm có khối lượng trung bình 5,0 ± 0,8 g/con (10 tôm/bể, 3 bể/nghiệm thức) được cảm nhiễm bằng cách ngâm trong 10 L nước biển 20‰ chứa vi khuẩn V. parahaemolyticus TTHVP202101001 ở 1 × 105 CFU/mL ở 28 ±1°C trong 1 giờ. Theo dõi dấu hiệu bệnh lý và tỷ lệ chết hàng ngày. Tỷ lệ chết tích lũy được xác định sau khi kết thúc thí nghiệm theo công thức của Ellis (1998) [52]. Phương pháp mô học: Tiêu bản mô gan tụy được quan sát dưới kính hiển vi quang học (Leica, ức) ở độ phóng đại 10× và 40×. 2.4. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0 để so sánh sự khác biệt ở mức độ biểu hiện gene LvCTL3 được coi là có ý nghĩa với p < 0,05 bằng phép thử LSD. Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel 2016 để tính giá trị trung bình (Mean) và độ lệch chuẩn (SD)/sai số chuẩn (SE). Phân tích phương sai một nhân tố (One way Anova) trong phần 6
mềm SPSS 16.0 để so sánh sự khác biệt ở các nghiệm thức về ngưng kết, tăng trưởng, tỷ lệ sống, các chỉ tiêu miễn dịch và tỷ lệ chết tích lũy ở mức α = 0,05, được coi là có ý nghĩa với p < 0,05 bằng phép thử LSD. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, xác định tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng 3.1.1. Kết quả quan sát tiêu bản tươi mang và gan tụy Dấu hiệu ban đầu cho thấy, tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh được thu thập tại Thừa Thiên Huế có khả năng nhiễm vi khuẩn Vibrio. 3.1.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn và xác định hiện diện gene độc tố 3.1.2.1. Phân lập vi khuẩn Từ 40 mẫu tôm có dấu hiệu bệnh lý điển hình của bệnh APHND, kết quả đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc màu xanh và 10 chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS. 3.1.2.2. Định danh vi khuẩn và xác định sự hiện diện gene độc tố Đặc điểm sinh hóa: Kết quả phân lập được 40 chủng vi khuẩn trên môi trường TCBS cho hai dạng khuẩn lạc với màu sắc khác nhau: khuẩn lạc vàng (10 chủng) và khuẩn lạc xanh (30 chủng). Tuy nhiên, khi cấy 30 khuẩn lạc xanh trên môi trường CHROMagarTM đều cho khuẩn lạc có màu tím hoa cà. Vì vậy, kết luận 30 chủng vi khuẩn phân lập được là V. parahaemolyticus và được ký hiệu là TTHVP202101001 đến TTHVP2021010030. Mười chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc màu vàng trên TCBS khi nuôi cấy trên môi trường CHROMagarTM cho khuẩn lạc màu xanh ngọc. Vì vậy kết luận rằng các chủng vi khuẩn này là Vibrio vulnificus và được ký hiệu là TTHVV202101001 đến TTHVV2021010010. Bảng 3.2. Đặc điểm sinh hoá của các chủng V. parahaemolyticus phân lập và chủng đối chứng Tỷ lệ % V. V. parahaemolyticus Chỉ tiêu hình thái, parahaemolyticus TT phân lập (n = 30) sinh lý, sinh hoá (Đại học Stirling, Dƣơng Vƣơng quốc Anh) Âm tính tính 7
Tỷ lệ % V. V. parahaemolyticus Chỉ tiêu hình thái, parahaemolyticus TT phân lập (n = 30) sinh lý, sinh hoá (Đại học Stirling, Dƣơng Vƣơng quốc Anh) Âm tính tính 1 Gram – 0 100 2 Hình dạng Que ngắn Que ngắn 3 Phát triển trên TCBS Xanh 100 0 Phát triển 4 Tím 100 0 CHROMagarTM 5 Di động + 100 0 6 Oxidase + 100 0 7 Lysine Decarboxylase + 100 0 8 Glucose + 86,7 13,3 9 Nitrate thành Nitrite + 86,7 13,3 10 ONPG – 0 100 11 Sinh Urease – 0 100 Phenyl Alanine 12 – 0 100 Deaminase 13 Citrate – 0 100 14 Esculine – 0 100 15 H2S – 0 100 16 Indol + 100 0 17 Voges – Proskauer – 0 100 18 Sử dụng Malonate – 13,3 86,7 Chú thích: (+): phản ứng dương tính; (–) phản ứng âm tính. Chủng đối chứng là V. parahaemolyticus từ Đại học Stirling, Vương quốc Anh Bảng 3.3. ặc điểm sinh hoá của các chủng V. vulfinicus phân lập Tỷ lệ % V. vulfinicus Chỉ tiêu hình thái, sinh Buller phân lập (n = 10) TT lý, sinh hoá (2004) Âm Dƣơng tính tính 1 Gram – 100 0 Que 2 Hình dạng Que ngắn ngắn 3 Phát triển trên TCBS Vàng 100 0 8
Tỷ lệ % V. vulfinicus Chỉ tiêu hình thái, sinh Buller phân lập (n = 10) TT lý, sinh hoá (2004) Âm Dƣơng tính tính Xanh 4 Phát triển CHROMagarTM 100 0 ngọc 5 Di động + 100 0 6 Oxidase + 100 0 7 Lysine Decarboxylase + 100 0 8 Lactose + 90 10 9 Catalase + 90 10 10 ONPG – 0 100 11 ADH – 0 100 12 LDC – 0 100 13 Citrate – 0 100 14 Esculine – 0 100 15 H2S – 0 100 16 Indol + 100 0 17 ODC – 0 100 18 Glucose + 90 10 Chú thích: (+): phản ứng dương tính; (–) phản ứng âm tính Xác định sự hiện diện các gene độc tố: Từ 30 chủng Vibrio phân lập được trên tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh AHPND đã xác định gene độc tố bằng cặp mồi AP1 và AP2 cho thấy có 7/30 (23,33%) chủng V. parahaemolyticus mang đồng thời hai gene độc tố pirAvp và pirBvp. Tuy nhiên, kết quả xác định gene độc tố pirAvp bằng cặp mồi AP3 cho 10/30 (33,33%) chủng V. parahaemolyticus mang gene độc tố pirAvp. Các chủng V. parahaemolyticus còn lại và V. vulfinicus không biểu hiện sự mang gene độc tố nhị phân. Bảng 3.4. Các chủng V. parahaemolyticus đại diện có mang gene độc tố Mồi AP1 và Mồi TT Chủng vi khuẩn AP2 AP3 pirAvp pirBvp pirAvp 1 V. parahaemolyticus THVP202101001 + + + 2 V. parahaemolyticus THVP202101003 + + + 3 V. parahaemolyticus THVP202101005 + + + 9
4 V. parahaemolyticus THVP202101009 + + + 5 V. parahaemolyticus THVP202101010 - - + 6 V.parahaemolyticus TTHVP2021010015 - - + 7 V. parahaemolyticus TTHVP2021010017 + + + 8 V. parahaemolyticus TTHVP2021010020 - - + 9 V. parahaemolyticus TTHVP2021010025 + + + 10 V. parahaemolyticus TTHVP2021010030 + + + Ghi chú: “+”: mang gene độc tố “-”: không thể hiện sự mang gene độc tố Định danh khẳng định: Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu của vi khuẩn Vibrio, hình ảnh điện di cho thấy chủng tạo khuẩn lạc màu tím hoa cà (ký hiệu TTHVP202100101) và khuẩn lạc màu xanh ngọc (ký hiệu TTHVV202101009) xuất hiện hai băng sáng đều có kích thước khoảng 1.450 bp (Hình 3.8). Hình 3.8. Sản phẩm PCR Hình 3.9. Cây phát sinh loài của chủng đoạn 16S rRNA của các TTHVP202101001 và chủng Vibrio TTHVV202101009 so với các chủng đã công bố Kết quả so sánh BLAST vùng 16S rRNA cho thấy chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu tím hoa cà tương đồng 100% với trình tự tham chiếu là chủng V. parahaemolyticus (ATCC17802) và chủng tạo khuẩn lạc màu xanh ngọc tương đồng 99% với trình tự tham chiếu V. vulnificus (AB681906) (Hình 3.9). Từ kết quả định danh 10
phân tử đã khẳng định 2 khuẩn lạc màu tím hoa cà và xanh ngọc lần lượt là các chủng V. parahaemolyticus và V. vulnificus. 3.1.3. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn phân lập được trong điều kiện in vivo Kết quả thí nghiệm gây bệnh cảm nhiễm cho thấy, vi khuẩn V. vulfinicus TTHVV202101009 không gây chết ở bất kỳ nghiệm thức nào sau 11 ngày cảm nhiễm. Trong khi đó, tỷ lệ chết ở các nghiệm thức cảm nhiễm chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus TTHVP202101001 phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn đưa vào ban đầu. Giá trị LD50 đạt 105 CFU/mL. 3.2. Phân lập, tạo dòng và xác định mức độ biểu hiện gene LvCTL từ tôm thẻ chân trắng 3.2.1. Phân lập, tạo dòng và phân tích trình tự gene LvCTL Kết quả cho thấy chỉ hai đoạn DNA được khuếch đại có kích thước lần lượt khoảng 450 bp và 420 bp, tương ứng với chiều dài lý thuyết của đoạn cDNA của gene LvCTL3 và LvCTL4. Các gene thử nghiệm còn lại (LvAV-LvCTLD- LvLdlrCTL) không xuất hiện trong mẫu nghiên cứu (Hình 3.11). ~ 420 bp M 1 2 3 4 5 M 6 7 NC M 8 9 Hình 3.11. Điện di sản phẩm P các gene v Hình ảnh điện di cho thấy các sản phẩm PCR rất đặc hiệu, điều này chứng tỏ rằng gene LvCTL3 và LvCTL4 đã được gắn thành công vào vector pGEM (được gọi là vector tái tổ hợp pGEM/LvCTL3 và pGEM/LvCTL4). Do đó, các vector tái tổ hợp pGEM/LvCTL3 và pGEM/LvCTL4 đã được sử dụng để phân tích trình tự nucleotide. oạn gene LvCTL3 phân lập được có chiều dài 444 bp (bao gồm cả mã kết thúc) và tương đồng 98,87 % với gene đã được công bố (439/444 nucleotide so với trình tự có mã số KF156943). Sự thay đổi của gene LvCTL3 dẫn đến sự thay đổi trong trình tự các amino 11
acid suy diễn, sự tương đồng thu được cao nhất là 97,28% (143/147 amino acid) so với trình tự tham chiếu AGV68681. Gene LvCTL4 phân lập được có kích thước 417 bp, tương đồng 99,52% với gene của KM387560 (415/417 nucleotide). Tuy nhiên, sự thay đổi của gene LvCTL4 không làm thay đổi trình tự của amino acid suy diễn được mã hóa (tương tự 100%) so với trình tự tham chiếu (AKA64754). 3.2.2. Dự đoán đặc điểm và cấu trúc không gian phân tử LvCTL3 và LvCTL4 Trong nghiên cứu này, trình tự nucleotide của gene LvCTL3 có chiều dài 444 bp, mã hóa trình tự amino acid suy diễn gồm 147 amino acid. Trong khi đó, trình tự nucleotide của gene LvCTL4 từ sản phẩm PCR có chiều dài 417 bp, mã hóa trình tự amino acid suy diễn gồm 138 amino acid. Bảng 3.5. Đặc điểm phân tử LvCTL3 và LvCTL4 mã hóa CTL LvCTL3 LvCTL4 Đặc điểm Li và cs Nghiên Li và cs Nghiên (2014) cứu này (2015) cứu này Chiều dài đầy đủ 579 - 563 - gene (bp) Phân đoạn mã gene 492 444 471 417 (nucleotide) Trình tự amino acid suy diễn (amino 163 147 156 138 acid) Khối lượng phân tử 17,9 16,91 - 15,75 (kDa) iểm đặng điện (pI) 4,80 4,66 - 4,58 Miền (Domain) 1 1 - 1 Chuỗi xoắn alpha (α - 2 - 2 helix) Chuỗi beta (β strain) - 9 - 8 Ghi chú: dấu “-”: tài liệu không công bố ối với vùng bảo tồn được dự đoán bởi chương trình SMART, trình tự khung đọc mở của LvCTL3 có một miền (CTLD) từ vị trí amino acid từ 14 đến 146. LvCTL3 có khối lượng phân tử là 16,91 kDa, điểm đẳng điện (pI) là 4,66. Kết quả dự đoán cấu trúc không gian cho thấy phân tử LvCTL3 có 2 chuỗi xoắn alpha (16%) và 9 12