LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

Chia sẻ: Rose_12 Rose_12 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:104

Thêm vào BST

Báo xấu

226
lượt xem 61
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các nước phát triển.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ____________________ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2009 i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _____________________ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS Chuyên ngành : Hoá phân tích Mã số : 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. PHẠM HÙNG VIỆT Hà Nội - Năm 2009 i
LỜI CẢM ƠN Bản luận văn này được thực hiện và hoàn thành tại Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố HCM với sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Hùng Việt. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Phạm Hùng Việt đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Dương Hồng Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, Tập thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, bạn bè và đồng nghiệp đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Khoa Hóa học, cùng các thầy cô Trường đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm luận văn. Hà Nội, tháng 12 năm 2009 Học viên Đinh Đăng Huy
MỤC LỤC MỞ ĐẦU.......................................................................................................................... 1 Chương 1 - TỔNG QUAN............................................................................................... 4 1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ ................................................................................... 4 1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản.................................................................. 6 1.3. Đại cương về axít domoic (DA)........................................................................ 8 1.3.1. Tính chất hóa lý. ....................................................................................... 8 1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: ........................................................ 8 1.3.3. Độc tính của DA ....................................................................................... 9 1.4. Một số phương pháp phân tích DA ................................................................... 9 1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................ 10 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS).. 11 1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA............................................................. 12 1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................ 12 1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng ........................................................................ 12 1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] ........................ 12 1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản ............................................. 13 1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) .............. 15 1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng ................................ 23 1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột............ 23 1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký................................................... 26 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: .................................................................................... 27 1.7.2. Chiết pha rắn SPE: .................................................................................. 27 Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 29 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài....................................................................... 29 2.2. Mô hình thực nghiệm ...................................................................................... 29 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: ............................................................................. 29 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: .................................................................................... 29 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: ............................................................................... 30 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:......................................................................... 30 2.5. Xác định các thông số tối ưu:.......................................................................... 31 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS ..................................................... 31 2.5.2. Cột:.......................................................................................................... 31 2.5.3. Pha động và chế độ gradient: .................................................................. 32 2.5.4. Dung môi chiết:....................................................................................... 32 2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: ................................................................................ 32 2.5.6. Tính toán : ............................................................................................... 33 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: ................................................................... 33 2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: ..................................................... 33 2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp: ................................................................... 34 2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp:................................................................ 34 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể.................................. 35 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................ 36 3.1. Xác định các thông số tối ưu:.......................................................................... 36 3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS .............................................. 36 i
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. ............................................... 40 3.1.3. Dung môi chiết:....................................................................................... 45 3.2. Khoảng tuyến tính: .......................................................................................... 47 3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: ............................................................. 49 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: ..................................................... 49 3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể. ................................................... 51 3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp:............................................................ 52 3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. .................................................................... 54 3.7.1. Phạm vi áp dụng: .................................................................................... 54 3.7.2. Nguyên tắc: ............................................................................................. 54 3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:................................................... 54 3.7.4. Chuẩn bị mẫu: ......................................................................................... 57 3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: ............................................................................ 58 3.7.6. Đảm bảo chất lượng ................................................................................ 60 3.7.7. Tính toán kết quả: ................................................................................... 60 KẾT LUẬN .................................................................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 62 PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN................... 1 PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU ........................... 4 PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH ...................................... 13 PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ ........... 19 PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ ………….BẰNG HPLC –UV ........................................................................ 29 ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt DA Axít domoic Axít Domoic DAD Diot Array Detector Đầu dò Diot Array EU European Liên minh Châu Âu FA Formic acid Axít Formic FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography LC-MS/MS Liquid Chromatograph Sắc ký lỏng ghép 2 lần Tandem Mass Spectrometer khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng NPLC Normal Phase Liquid Sắc ký lỏng pha thuận Chromatography ND Not detected Không phát hiện RPLC Reversed Phase Liquid Sắc ký lỏng pha đảo Chromatography SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic UV Ultra Violet Cực tím VIS Visible Nhìn thấy iii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Diễn giải Trang Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC .....................................................26 Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm ..........................................................................30 Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản........................................36 Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone................................................37 Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm.......................................................38 Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm ............39 Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1.............................................................40 Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1....................................................................41 Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2....................................................................42 Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2....................................................................43 Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2....................................................................44 Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm ...........................47 Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark not defined. Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ............................49 Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. ...................49 Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) ........................51 Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS.........................53 iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Diễn giải Trang Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng...................................................16 Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp......................................................................17 Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm ....................................................................17 Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. .................................................................18 Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. .............................................................19 Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử ..............................................................................20 Hình 07. Bộ ion hóa hóa học.....................................................................................20 Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực ..............................................................................22 Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS ..................................................23 Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18...............................................................24 Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất.........................24 Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. ..............25 Hình 14. Mô hình thực nghiệm .................................................................................29 Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV.....................................37 Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V ...............38 Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA .....................................................................39 Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV...........................................40 Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 ....................................41 Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 ....................................42 Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 ....................................43 Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 ....................................44 Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 ....................................45 Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 ......................46 Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93..46 Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .....................47 Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .............................................................48 Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV...53 Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV ..........................54 v
MỞ ĐẦU Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các nước phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm 2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD. Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu, để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích. Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên 1
quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ). Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có công thức cấu tạo: Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine đối với họ cá thu ngừ…). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC- UV và LC/MSn, phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … ) là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất khẩu. Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại 2
phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam. 3
Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản xuất sơ cấp đồng thời còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động vật phù du, ấu trùng tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v. Phần lớn các loài vi tảo là có lợi cho các sinh vật thủy sinh. Tuy vậy, một phần nhỏ trong chúng, với khoảng 100 trong tổng số trên 5.000 loài tảo phù du đã được phát hiện trên thế giới thuộc tảo khuê (Bacillariophyta), tảo giáp (Dinoflagellata), các tảo có roi khác và vi khuẩn lam (Cyanobacteria) có chứa các độc tố gây hại cho sinh vật khác. Các loài tảo và vi khuẩn có chứa các sắc tố màu khác nhau, sống trôi nổi, dưới những điều kiện môi trường nhất định có thể sinh trưởng thành các quần thể to lớn ở vùng ven bờ gây nên sự đổi màu nước. Sự đổi màu nước tự nhiên thành mầu đỏ, nâu, vàng nâu nhạt (màu hổ phách) hoặc xanh vàng ở các vùng nước rộng lớn diễn ra là kết quả của sự nở hoa (Algal blooms) của các loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực. Ví dụ: màu đặc trưng của Biển Đỏ gây nên bởi sự nở hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các sắc tố đỏ phycoerythrin ... “Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó gây ra làm đổi màu nước. Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm, cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ngộ độc và có thể bị tử vong. Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các sự kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hoặc một số loài tảo độc hại đạt tới mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác. Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau: a. Các loài không chứa độc tố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở hoa có thể tăng đến mật độ rất cao làm chết cá và các động vật không xương sống có trong thủy vực đó do cạn kiệt oxy. Tiêu biểu trong nhóm này là các 4
loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium erythraeum (tảo lam). b. Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có thể phát hiện được thông qua chuỗi thức ăn tới con người, gây nên một loạt các chứng bệnh về thần kinh và tiêu hóa, chẳng hạn như: Độc tố PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp: Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula, ... sản sinh ra. Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica, ... sản sinh ra. Độc tố ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) do các loài tảo khuê Pseudonitzschia multiseries, P. pseudodelicatissima, P. australis, ... sản sinh ra. Độc tố CFP (Ciguatera Fish Poisoning) do các loài tảo giáp chủ yếu sống đáy Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum spp, ... sản sinh ra. Độc tố NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning) do các loài Gymnodinium breve, Gymnodinium G. cf.breve (New Zealand), ... sản sinh ra. Độc tố Các độc tố tảo lam do các loài tảo lam Anabaena circinalis, Mycrocystis aeruginosa, Nodularia spumigena, ... sản sinh ra. c. Các loài không độc với người nhưng lại độc với cá và các động vật không xương sống (đặc biệt trong các hệ thống nuôi thâm canh) do phá hủy hoặc làm tắc các mang của chúng; bao gồm các loài tảo khuê Chaetoceros convolutus, tảo giáp Gymnodinium mikimotoi,... gây nên. Một vài loài tảo có thể gây độc ngay ở mật độ thấp chưa làm thay đổi màu nước, chẳng hạn như loài Alexandrium tamarense, các độc tố PSP được phát hiện trong thân mềm khi mật độ của loài này thấp hơn 103 tế bào/lít, trong khi các tảo khác thường gây hại khi chúng xuất hiện ở các mật độ cao hơn, làm thay đổi màu nước và kết quả là gây nên thủy triều đỏ. Loài 5
Gyrodinium aureolum gây chết cá và các động vật đáy ở mật độ cao hơn 107 tế bào/lít (Andersen, 1996). Những tác hại do tảo độc hại nở hoa gây nên là rất lớn. Người ta đã thống kê được từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal, Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 người bị ngộ độc, trong đó có 6 người chết. ở vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 trường hợp bị ngộ độc, trong đó có 101 người chết. Năm 1989 ở vịnh False (Nam Phi) loài Gymnodinium sp. nở hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ngư. ở Monte Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc nở hoa đã làm chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides). Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở hoa ở biển Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế rất lớn; cụ thể là từ năm 1987 đến năm 1991 ở khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở hoa trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt với tổng số thiệt hại là 4.452 triệu yên, v.v. Ở Việt Nam, một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et al., 1996). 1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản a. Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù du. Thông qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể, bao gồm: Độc tố gây liệt cơ (paralytic shellfish poisonings - PSP): có khoảng 20 loại là các dẫn xuất của saxitoxin. Liều lượng gây chết cho người là từ 0,1 tới 1 mg. Các độc tố PSP bền với nhiệt và có thể tan trong nước. 6
Độc tố gây tiêu chảy (Diarrheic shellfish poisoning –DSP) là nhóm độc tố có khối lượng phân tử lớn, bao gồm axit okadaic, dinophysis, pectenotoxins và yessotoxin. Độc tố gây mất trí nhớ (Amnesic shellfish poisoning - ASP) gây lên bởi domoic axit. Domoic axit thường được phát hiện tại hàm lượng thấp ở trong rất nhiều loài tảo đỏ (Chondria armata, Alsidium corallinum và Digenea simplex). Độc tố thần kinh (Neurotoxin Shellfish Poisoning - NSP) bao gồm các đồng phân của brevetoxin. Các phân tử này có thể tan trong mỡ. Tất cả các loài nhuyễn thể (loài thân mềm ăn thức ăn bằng phương thức màng lọc) đều có nguy cơ bị nhiễm độc tố. Tuy nhiên, chúng thường thấy ở một số loài sau: PSP thường có trong vẹm, nghêu, sò, điệp; DSP thường có trong vẹm, trai, điệp; ASP thường chỉ có trong vẹm, NSP thường có trong trai, vẹm. b. Khi con người ăn nhuyễn thể 2 mảnh vỏ đã bị tích tụ độc tố có thể gây ra nhiều triệu chứng nhưng các triệu chứng này tùy thuộc vào loại độc tố, hàm lượng độc tố trong nhuyễn thể và lượng nhuyễn thể mà chúng ta ăn vào cơ thể. Các triệu chứng: Gây ra bởi PSP: phần lớn sẽ ảnh hưởng đến hệ thần kinh, bao gồm: tê liệt cơ, nói ngọng, khó thở, mẩm ngứa, sốt, mệt mỏi. Gây ra bởi DSP: gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa, ví dụ: nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, đối với trẻ em thì kèm theo các dấu hiệu như sốt, đau đầu. Gây ra bởi ASP: tương tự như DSP độc tố ASP cũng gây ra các triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng đồng thời kèm theo các triệu chứng đối với hệ thần kinh (lẫn, mất trí nhớ, tai biến mạch máu, hôn mê) Gây ra bởi NSP: Giải phóng Na+ trong quá trình vận chuyển ion vào trong tế bào dẫn tới việc không điều chỉnh được Na+ vào trong tế bào làm thay đổi đặc tính của tế bào, gây ra sự giải phóng thần kinh phá huỷ Acetylcholine gây co cơ. 7
1.3. Đại cương về axít domoic (DA) 1.3.1. Tính chất hóa lý. DA là chất bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ 223-224oC, tan tốt trong nước (8mg/ml), tan ít trong metanol (0.6mg/ml). Tên đầy đủ: ([2S-[2α,3β,4β (1Z,3E,5R)]]-2-Carboxy-4-(5-carboxy-1- methyl-1,3-hexadienyl)-3- pyrrolidineacetic acid) Công thức phân tử: C15H21NO6: Công thức cấu tạo: Trọng lượng phân tử: 311.34 g/mol. Độ tan trong nước là 8 mg/ml ở 25oC, trong Metanol là 0.6 mg/ml. Nhiệt độ nóng chảy từ 223-224oC. 1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: DA được phát hiện đầu tiên từ loài tảo đỏ lớn Chondria ớ phía nam Nhật Bản (Take moto and Daigo, 1958). Tuy nhiên đến năm 1987 nó lại bùng phát tại Canada do loài Pseudo-nitzschia sinh ra (Perl et all.., 1990). Pseudo-nitzschia phân bố rộng khắp trong nước biển trên thế giới, ở cả khí hậu ấm và khí hậu lạnh. Tảo nở hoa tăng lên khi thời tiết chuyển từ mùa xuân sang mùa thu khi có mưa rào và dồi dào chất giúp cho quá trình tăng trưởng [B. Jeffery*, T. Barlow, K. Moizer, S. Paul, C. Boyle1]. Ngoài ra cùng với việc tốc độ gió và dòng nước thấp giúp cho việc tăng sự tích tụ tảo trên vùng nước mặt ấm. DA được tìm thấy trong các loài nhuyễn thể như sò (Cerastoderma edule), cua (Cancer magister), nghêu (Scrobicularia plana), trai (Mytilus 8
edulis), razor clams (Siliqua patula) and điệp (Pecten maximus) [Wekell et al., 1994; Rhodes et al., 1998; Vale and Sampayo, 2001]. DA bị tích tụ trong nhuyễn thể do cơ chế ăn kiểu màng lọc nên có thể trực tiếp các loài tảo độc hoặc các vi sinh vật đã có hàm lượng DA bị tích tụ trong NT2MV, hàm lượng độc tố ở hệ thống tiêu hóa của nhuyễn thể cao hơn so với ở cơ thịt, tốc độ tích tụ DA trong nhuyễn thể cũng rất khác nhau giữa các loài nhuyễn thể [Vale and Sampayo, 2001; Hay et al., 2000], Khả năng chuyển hóa DA trong nhuyễn thể là rất thấp. Khi nhuyễn thể đã bị tích tụ độc tố sinh học biển, ta có thể nuôi lưu (nuôi ở trong môi trường nước biển sạch) thì có thể làm giảm hàm lượng độc tố. Ví dụ, theo nghiên cứu của (Novaczek, 1992): 50% hàm lượng DA trong loài vẹm xanh được rửa giải trong vòng 24 h nuôi lưu, trong khi đó phải mất 86 ngày để rửa giải 50% DA trong razor clams (Siliqua patula) (Horner et al., 1993) 1.3.3. Độc tính của DA LD50 của DA khoảng 2,3 mg/kg khối lượng cơ thể theo nghiên cứu của Iverson và các cộng sự (1989). Quy định của các thị trường nhập khẩu (Canada, Mỹ, Châu Âu, Úc...) và Việt Nam quy định mức giới hạn tối đa cho phép trong nhuyễn thể là 20 µg DA/g thịt nhuyễn thể (20ppm), khi kết quả phân tích vượt mức trên sẽ bị đình chỉ vùng thu hoạch và lấy mẫu tăng cường để kiểm tra chỉ tiêu này. 1.4. Một số phương pháp phân tích DA Dựa vào tính chất và cấu trúc của Axít domoic (DA), hiện nay trên thế giới đã có một số phương pháp xác định trong các nền mẫu khác nhau (nước biển, tảo, nhuyễn thể hai mảnh vỏ...) như: sinh hóa trên chuột (mouse bioassay), sắc ký lỏng với đầu dò UV-VIS, huỳnh quang (HPLC-UV/FLD) hoặc LC-MS/MS. 9
Tuy nhiên tại Việt Nam, hiện chưa có một tiêu chuẩn hoặc phương pháp nào đề cập đến việc phân tích DA ngoại trừ một số qui trình tự xây dựng của một số phòng kiểm nghiệm. Sau đây là một số phương pháp điển hình, phù hợp đáp ứng được phân tích dư lượng DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản: 1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột Pha loãng dung dịch chuẩn ASP ở một số nồng độ tăng dần bằng nước vô trùng và tiêm vào màng bụng một số con chuột, tiêm mỗi con 1 ml cho đến khi xác định được nồng độ gây chết chuột trong khoảng thời gian từ 5 đến 7 phút. Lưu ý: kiểm tra pH của các dung dịch trước khi tiêm. pH của dung dịch phải nằm trong khoảng từ 2-4, không được lớn hơn 4,5. Từ nồng độ được chọn, pha loãng thêm hai nồng độ mới bằng cách thêm hay bớt 1 ml nước vô trùng so với thể tích ban đầu. Thí dụ nếu 10ml chuẩn được pha loãng với 25ml nước vô trùng thì khi pha thêm hai dung dịch mới sử dụng thể tích nước vô trùng là 24ml và 26ml. Tiêm mỗi nồng độ chuẩn pha loãng thu được ở bước trên vào một nhóm gồm 10 chuột (10 chuột/ một nồng độ), mỗi con chuột 1ml dung dịch. Xác định thời gian gây chết chuột tính từ thời điểm tiêm xong đến thời điểm tim chuột đập lần cuối cùng. Lặp lại qui trình trên 1 hoặc 2 ngày sau đó với dung dịch chuẩn làm việc mới được chuẩn bị. Tính thời gian gây chết trung bình của mỗi nhóm 10 chuột ứng với mỗi độ pha loãng. Loại bỏ các độ pha loãng có thời gian gây chết chuột trung bình nhỏ hơn 5 phút hoặc lớn hơn 7 phút. Từ thời gian gây chết chuột thu được, tra bảng Sommer’s, để xác định hàm lượng độc tố tính theo đơn vị MU trong 1ml dung dịch (MU/ml) ứng với mỗi độ pha loãng. Tính hệ số chuyển đổi CF (hệ số chuyển đổi giữa lượng độc tố tính bằng µg và tính bằng MU) cho mỗi độ pha loãng bằng cách chia nồng độ của dung dịch (µg/ml) với số đơn vị độc tố tính theo MU vừa tra (MU/ml). Đơn vị của CF sẽ là µg/MU 10
Tính giá trị trung bình của các hệ số CF thu được ở trên. Sử dụng hệ số CF này trong tính kết quả. Hệ số chuyển đổi CF cần được kiểm tra thường xuyên, việc kiểm xoát lại hệ số chuyển đổi CF được thực hiện bằng cách chích vào 5 con chuột dung dịch chuẩn đã pha loãng sao cho thời gian gây chuột chết nằm trong khoảng 5-7 phút. Xác định hệ số CF và so sánh với CF tham chiếu đã xác định được trước đó. Sự sai lệch phải nằm trong khoảng ± 20 %. Nếu sự sai lệch vượt khoảng này, tiêm thêm 5 con chuột và bổ sung vào 5 con chuột đã chích trước đó để có nhóm chuột gồm 10 con, chọn và chích thêm nhóm chuột thứ hai gồm 10 con với cùng nồng độ dung dịch chuẩn như nhóm 1. Tính hệ số CF của 2 nhóm chuột và tính CF trung bình. Hệ số CF thu được này được xem như giá trị CF mới sử dụng trong tính kết quả, vì độ lệch nằm ngoài khoảng ± 20 % có khả năng do kỹ thuật hoặc do sự thay đổi đáp ứng của giòng chuột đối với độc tố. Sư thay đổi này đòi hỏi phải thay đổi hệ số CF [Sổ tay phương pháp của Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 2009]. 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC- MS/MS) Thường mẫu được ly trích bằng một dung môi hữu cơ và được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với các đầu dò UV, PDA, FLD hoặc MS/MS. Đối với đầu dò huỳnh quang FLD, sau khi qua cột phân tích DA được cho phản ứng với một chất phù hợp để tạo thành hợp chất có tính chất huỳnh quang trước khi vào đầu dò. Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha đảo hoặc pha thuận) thường là chất rắn và pha động (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò UV, PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) hoặc đầu dò khối phổ MS/MS. Đối với đầu dò UV hay DAD bên cạnh việc phát hiện bởi tín hiệu bị dung môi chứa cấu tử rửa giải hấp thụ ở một bước sóng nhất định để định lượng. Đối 11
với đầu dò khối phổ cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS và ở đây cấu tử được ion hóa, phân mảnh và được phát hiện dựa vào thông số m/z. Trên cơ sở này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách rõ ràng, khẳng định về một hợp chất nào đó. 1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA 1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột Phương pháp sinh hóa trên chuột có ưu điểm là thực hiện nhanh, đơn giản, dễ làm, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, đầu tư ban đầu ít (về nhân lực, thiết bị, hóa chất, dụng cụ), đối với phân tích độc tố thì phương pháp sinh hóa trên chuột đang được chọn là một trong các phương pháp kiểm khẳng định. Tuy nhiên đối với các loại độc tố có nhiều đồng phân thì không thể phân biệt được hàm lượng của từng loại độc tố (ví dụ DSP, PSP có nhiều hợp chất cùng nhóm). Ngoài ra, tại một số nước luật pháp không cho phép làm các thử nghiệm trên động vật. 1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng Phương pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là một phương pháp khá nhạy và có tính chọn lọc rất cao, có thể định lượng và khẳng định ngay mà chi phí phân tích ở mức trung bình. Tuy nhiên phương pháp lại khó có thể phát triển để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP với mức giới hạn cho phép thấp (ppb). Với những tồn tại của các phương pháp trên đới với DA thì việc cần có một phương pháp khác như phương pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có thể phát triển để định lượng DSP, PSP cùng với việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra của các tiêu chuẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nước là vô cùng cần thiết. 1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] 12