Luận văn:Nghiên cứu quá trình lên men axit gluconic từ rỉ đường bằng Aspergillus niger

Chia sẻ: Nguyen Vang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

65
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Axít citric là một axít hữu cơ thuộc loại yếu và nó thường được tìm thấy trong các loại trái cây thuộc họ cam quít. Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và thường được thêm vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua. Ở lĩnh vực hóa sinh thì axít citric đóng một vai trò trung gian vô cùng quan trọng trong chu trình axít citric của quá trình trao đổi chất xảy ra trong tất cả các vật thể sống....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu quá trình lên men axit gluconic từ rỉ đường bằng Aspergillus niger

1 2 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Công trình ñư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Đ I H C ĐÀ N NG PH M TH THÙY TRANG Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS. TS. Đ ng Minh Nh t NGHIÊN C U QUÁ TRÌNH LÊN MEN Ph n bi n 1: GS. TS. Đào Hùng Cư ng AXIT GLUCONIC T R ĐƯ NG Ph n bi n 2: PGS. TS. Lê Th Liên Thanh B NG ASPERGILLUS NIGER Chuyên ngành: Công ngh Th c ph m và Đ u ng Lu n văn ñư c b o v trư c H i ñ ng ch m Lu n văn t t nghi p Mã s : 60.54.02 th c sĩ k thu t h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 17 tháng 11 năm 2012. TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ K THU T Có th tìm hi u lu n văn t i: − Trung tâm Thông tin-H c li u, Đ i h c Đà N ng Đà N ng, Năm 2012 − Trung tâm H c li u, Đ i h c Đà N ng
3 4 M Đ U Trên th gi i, nghiên c u s n xu t axit gluconic ngày càng 1. TÍNH C P THI T C A Đ TÀI ñư c quan tâm m nh m , glucose ñư c s d ng là ngu n cacbon cho Axit gluconic là m t axit h u cơ y u, ñư c phát hi n l n ñ u h u h t các loài vi sinh v t s n xu t axit gluconic, tuy nhiên ñ t o ra tiên vào năm 1870 b i Hasiwetz và Habermann. Axit gluconic và các s n ph m thương m i v a ñ m b o ch t lư ng v a ñ m b o hi u qu mu i gluconat có trong t nhiên khá ph bi n do nó ñư c hình thành kinh t cao thì nguyên li u ñóng vai trò ñ c bi t quan tr ng, m t t quá trình oxy hóa glucose. Vào th k th 18, axit này ít ñư c bi t trong nh ng ngu n nguyên li u ñáp ng các y u t trên chính là r ñ n, tuy nhiên ngày nay axit gluconic ñang ñư c ng d ng r ng rãi ñư ng, v i ưu ñi m ch a 48-56% ñư ng t ng s , ñó là ngu n cacbon trong nhi u lĩnh v c như công ngh hóa h c, th c ph m, dư c ph m, r ti n, r ñư ng hi n nay là s l a ch n hàng ñ u c a các nhà nghiên d t, luy n kim, thu c da, v t li u xây d ng và nhi u ngành công c u s n xu t axit gluconic. nghi p khác. H ng năm trên th gi i s n xu t kho ng 50.000-100.000 Theo báo cáo c a Hi p h i mía ñư ng Vi t Nam c nư c có t n axit gluconic và t ng t t c các lo i mu i gluconat kho ng kho ng 40 nhà máy s n xu t ñư ng, v i t ng công su t 105.750 t n 65.000-100.000 t n, trong ñó g m các lo i mu i như natri gluconat, mía/ngày, bình quân ñ t kho ng 2.500 t n mía/ngày/nhà máy, lư ng kali gluconat, canxi gluconat hay este glucono-δ-lacton cũng là r ñư ng t o ra chi m 3-5% tr ng lư ng ép, vì v y t ng kh i lư ng r nh ng ph gia th c ph m ñư c ch ng nh n an toàn khi s d ng ñư ng c a c nư c r t l n, kho ng 3-5 t n/ngày. R ñư ng mía còn M và Châu Âu (theo C c Qu n Lý Th c Ph m và Dư c Ph m Hoa ñư c dùng làm nguyên li u trong công nghi p lên men ñ s n xu t Kỳ), ñư c s d ng làm ch t ñi u v , ph gia trong s n xu t bánh rư u, c n, dung môi axeton, sinh kh i n m men, axit xitric, axit nư ng, s a ñ u nành, s a chua, phomat, bánh mỳ. lactic và glyxerin,... m t ph n ñư c dùng làm th c ăn gia súc. S n xu t axit gluconic b ng con ñư ng vi sinh ñã ñư c nghiên Hi n nay, Vi t Nam chưa có cơ s nào s n xu t axit c u và ng d ng r ng rãi trong nhi u th p k qua, trong ñó quá trình gluconic, t t c axit gluconic hi n có ñ u ph i nh p t nư c ngoài v i lên men b ng Aspergillus niger (A. niger) ñư c nghiên c u s d ng giá thành cao. Vì v y, vi c s d ng axit này trong các ngành công nhi u nh t. A. niger r t ph bi n trong t nhiên có th tìm th y trên lá nghi p nư c ta s g p khó khăn v m t giá thành cũng như chúng khô, th m th c v t m c nát, ñ t, cây tr ng. A. niger có t c ñ sinh ta s không ch ñ ng ñư c ngu n cung c p. trư ng phát tri n nhanh, d dàng phân l p các ñi u ki n thông Xu t phát t nh ng v n ñ trên, chúng tôi th c hi n ñ tài thư ng, trong phòng thí nghi m. Do kh năng sinh t ng h p enzym "Nghiên c u quá trình lên men axit gluconic t r ñư ng b ng cao nên A. niger ñư c dùng r ng rãi trong công nghi p th c ph m ñ Aspergillus niger", nh m kh o sát các ñi u ki n lên men thích h p thu nh n các ch ph m enzyme như amylase, protease, pectinase, cho quá trình sinh t ng h p axit gluconic. glucose oxydase,… và các axit h u cơ như axit xitric, axit gluconic, Đ tài này có th m ra thêm m t hư ng tri n v ng cho vi c axit fumaric,.... thu nh n axit gluconic t ph ph m c a quá trình s n xu t, nó không
5 6 ch có ý nghĩa v kinh t mà còn m ra kh năng gi i quy t các v n - Phương pháp toán h c: ñ v ch t lư ng s n ph m, các v n ñ v gi i pháp k thu t m t cách S d ng quy ho ch th c nghi m toàn ph n 3 y u t ñ kh o hi u qu sát nh hư ng c a các y u t thành ph n ñ n hàm lư ng axit gluconic. 2. M C TIÊU NGHIÊN C U S d ng phương pháp leo d c ñ t i ưu hóa các y u t nh - Xác ñ nh các thông s công ngh t t nh t như: t l gi ng, hư ng. th i gian lên men, hàm lư ng nitơ b sung trong quá trình lên men. 5. Ý NGHĨA KHOA H C C A Đ TÀI - Đ xu t quy trình k thu t lên men axit gluconic t r - Xác ñ nh m t s thành ph n hóa h c trong r ñư ng và hàm ñư ng b ng ch ng n m m c A. niger. lư ng axit gluconic b ng các phương pháp (PP) phân tích hi n ñ i. 3. Đ I TƯ NG VÀ PH M VI NGHIÊN C U - Xác ñ nh ñi u ki n lên men t t nh t thu ñư c hàm lư ng - S d ng r ñư ng ñư c thu nh n công ty Đư ng Kon axit gluconic cao nh t. Tum t i Km 2, xã Vinh Quang, Thành ph Kon Tum, t nh Kon Tum. - Xây d ng ñư c quy trình lên men gluconic t r ñư ng - Ch ng n m m c A. niger t i phòng thí nghi m khoa Hóa, quy mô PTN. trư ng Đ i h c Bách Khoa, Đ i h c Đà N ng. 6. Ý NGHĨA TH C TI N C A Đ TÀI - Nghiên c u lên men axit gluconic t r ñư ng b ng ch ng - Nghiên c u này ñã giúp s d ng ph ph m c a quá trình n m m c A. niger qui mô phòng thí nghi m (PTN). s n xu t ñư ng t o ra ngu n nguyên li u chính s n xu t axit 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U gluconic, mang l i l i ích kinh t cho các nhà s n xu t ñư ng. - Phương pháp v t lý: - Gi m lư ng axit gluconic ngo i nh p, ch ñ ng s n xu t. Xác ñ nh n ng ñ ch t khô b ng Bx k - M r ng ng d ng công ngh sinh h c trong công ngh - Phương pháp hóa h c: th c ph m và m t s lĩnh v c khác. Xác ñ nh hàm lư ng ñư ng kh b ng phương pháp Bectran 7. C U TRÚC LU N VĂN Xác ñ nh hàm lư ng nitơ t ng b ng phương pháp kjehldal. Ngoài ph n m ñ u, k t lu n, tài li u tham kh o và ph l c, - Phương pháp hóa lý: trong lu n văn g m có các chương như sau : Xác ñ nh pH r ñư ng và pH c a môi trư ng nuôi c y trư c và Chương 1: T ng quan sau lên men Chương 2: Đ i tư ng và phương pháp nghiên c u Xác ñ nh axit gluconic b ng máy s c ký l ng hi u năng Chương 3: K t qu và th o lu n - Phương pháp vi sinh: Phương pháp ho t hóa gi ng Phương pháp lên men chìm.
7 8 CHƯƠNG 1 Axit gluconic có c u trúc hoá h c bao g m m t chu i sáu T NG QUAN cacbon v i năm nhóm hydroxyl và k t thúc b ng m t nhóm ch c 1.1. AXIT GLUCONIC cacboxyl (-COOH). Trong dung d ch nư c n ng ñ 1/1000 axit 1.1.1. Gi i thi u v axit gluconic cacboxylic pH g n trung tính, axit cacboxylic này t o ra các ion Axit gluconic là m t axit h u cơ y u, có tính sát khu n, gluconat và các mu i c a axit gluconic g i chung là các gluconat. không bay hơi, không ñ c, không có tính ăn mòn, có ngu n g c t β- Khi hòa tan trong nư c axit nhanh chóng chuy n sang tr ng thái cân D-glucose t o thành b i m t ph n ng oxy hóa dư i xúc tác c a b ng ñ ng v i vòng glucono-δ-lacton, làm cho dung d ch tr thành enzym glucose oxidase. Axit gluconic có m t t nhiên trong các lo i h n h p c a axit v i glucono-δ-lacton. qu , m t ong, trà kombucha (n m h ng trà) và rư u vang. 1.1.3. Tính ch t c a axit gluconic và mu i gluconat Trong công nghi p th c ph m axit gluconic ñư c s d ng 1.1.4. L ch s phát tri n axit gluconic như m t ch t ñi u v , nó có kh năng t o ra hương v chua d u nh và 1.1.5. ng d ng c a axit gluconic và mu i gluconat ñư c s d ng như m t ph gia ñi u ch nh v chua (E574) dùng cho 1.1.6. S n xu t axit gluconic và mu i gluconat các s n ph m như rư u vang, nư c ép trái cây, s a chua,.… 1.1.6.1. S n xu t axit gluconic t enzyme glucose oxidase Tên khoa h c: 1.1.6.2. S n xu t axit gluconic t vi khu n (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahyñroxyhexanoic axit 1.1.6.3. S n xu t axit gluconic t A. niger và Penicillium luteum 1.1.2. C u t o c a axit gluconic Axit gluconic là m t h p ch t h u cơ có công th c phân t là C6H12O7, công th c c u t o là: Axit gluconic C6H12O6 + H2O + O2 → C6H12O7 + H2O2 Hình 1.1. C u t o phân t axit gluconic Hình 1.2. Sơ ñ chuy n hóa glucose thành axit gluconic b i A. niger
9 10 1.2. CƠ S QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT GLUCONIC CHƯƠNG 2 1.2.1. Gi i thi u v Aspergillus niger Đ I TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 1.2.2. Các phương pháp lên men 2.1. Đ I TƯ NG NGHIÊN C U 1.2.2.1. Phương pháp lên men b m t 2.1.1. R ñư ng 1.2.2.2. Phương pháp lên men b sâu R ñư ng l y t công ty Đư ng Kon Tum và ñư c x lý 1.2.3. S sinh trư ng và phát tri n c a vi sinh v t trong ñi u ki n trong phòng thí nghi m trư c khi lên men. R ñư ng ñư c pha loãng nuôi c y tĩnh v i t l r ñư ng:nư c là 2:1 kg/kg, ti n hành x lý nhi t 85-90oC 1.2.3.1. Pha m ñ u (pha ti m phát) trong th i gian 45-60 phút, ñi u ki n này h u h t các t p khu n ñ u 1.2.3.2. Pha logarit (pha lũy ti n) b tiêu di t. Sau khi x lý nhi t ti n hành ly tâm nguyên li u 8oC, t c 1.2.3.3. Pha n ñ nh (pha cân b ng) ñ 5500 vòng/phút, th i gian 30 phút, tách các ch t không hòa tan và 1.2.3.4. Pha t vong các ch t keo ra kh i r ñư ng. K t thúc quá trình x lý r ñư ng ñư c 1.2.4. Các y u t nh hư ng ñ n quá trình lên men axit gluconic b o qu n 4oC. 1.2.4.1. nh hư ng c a cacbon 2.1.2. Ch ng vi sinh v t 1.2.4.2. nh hư ng c a nitơ Ch ng n m m c A. niger ñư c nuôi c y và gi gi ng t i 1.2.4.3. nh hư ng c a th i gian PTN khoa Hóa, trư ng Đ i h c Bách Khoa, Đ i h c Đà N ng. 1.2.4.4. nh hư ng c a oxy 2.2. HÓA CH T VÀ THI T B 1.2.4.5. nh hư ng c a nhi t ñ 2.2.1. Hóa ch t 1.2.4.6. nh hư ng c a PH 2.2.2. Thi t b 1.2.4.7. nh hư ng c a t l gi ng 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 1.3. NGUYÊN LI U R ĐƯ NG 2.3.1. Phương pháp v t lý 1.3.1. Gi i thi u nguyên li u r ñư ng 2.3.2. Phương pháp hóa lý 1.3.2. M c ñích c a x lý r ñư ng trư c khi lên men 2.3.3. Phương pháp hóa h c 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U AXIT GLUCONIC VI T 2.3.4. Phương pháp vi sinh NAM VÀ TRÊN TH GI I 2.3.5 Phương pháp toán h c 1.4.1. Các công trình nghiên c u trong nư c 1.4.2. Các công trình nghiên c u nư c ngoài
11 12 CHƯƠNG 3 (g/100ml) K T QU VÀ TH O LU N 3.1. KH O SÁT THÀNH PH N HÓA H C C A R ĐƯ NG S c ký ñ B ng 3.1. K t qu kh o sát thành ph n hóa h c c a r ñư ng Thành ph n Giá tr Bx 84.41 Như v y, trong ñi u ki n có c ñ nh n m m c lên men axit pH 5.40 gluconic trên máy l c, do s c n tr c a ch t mang oxy khó hòa tan, Protein 3.64 (% ch t khô) quá trình lên men di n ra ch m, th i gian lên men kéo dài t o s n Đư ng kh 22.70 (% kh i lư ng) ph m ph . Lên men trong môi trư ng l ng trên máy l c t o ñi u ki n Đư ng t ng 54.50 (% kh i lư ng) cho oxy ti p xúc cơ ch t, quá trình lên men di n ra trong toàn b kh i Đư ng saccarose 30.21 (% kh i lư ng) d ch lên men, th i gian lên men ng n, hi u su t lên men cao. T k t 3.2. NGHIÊN C U L A CH N PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN qu trên, chúng tôi l a ch n phương pháp lên men trong môi trư ng AXIT GLUCONIC l ng trên máy l c làm phương pháp nghiên c u c a mình. B ng 3.2. K t qu nghiên c u l a ch n phương pháp lên men axit gluconic 3.3. NGHIÊN C U XÂY D NG PHƯƠNG PHÁP XÁC Đ NH Phương pháp HÀM LƯ NG AXIT GLUCONIC B NG MÁY HPLC Phương pháp c ñ nh Thông s không c ñ nh 3.3.1. Nghiên c u xây d ng ñư ng chu n HPLC cho axit gluconic n m m c A. niger n m m c A. niger 3.3.1.1. Nghiên c u t l pha ñ ng khi c ñ nh pH m u phân tích 7.0 X lý xơ d a, c ñ nh Ho t hóa n m m c B ng 3.3. Nghiên c u t l pha ñ ng khi c ñ nh pH m u phân tích 7.0 Chu n b n m m c 20 gi trên máy l c 20 gi Tên quy pH m u lên men T l pha ñ ng Đ th ñ nh tính trong ñi u ki n tĩnh trình phân tích X lý sau Acetonitrile:nư c pH = 7.0. L c ép chân không L c tách bã 1 lên men 3:7 (v/v) Vd ch lên men 50 ml 75 ml Acetonitrile:nư c pH = 7.0. (ml/100ml) 2 Chi u cao 7:3 (v/v) 266.95 380.26 peak (mAU) Acetonitrile pH = 7.0. 3 Axit gluconic 2.53 3.59 100%
13 14 D a vào k t qu phân tích cho th y s c ký ñ có hình d ng 3.3.1.3. Nghiên c u pH pha ñ ng khi c ñ nh pH m u phân tích 2.5 ph c t p. Khi s d ng NaOH tinh khi t ñ ñi u ch nh pH m u phân Chúng tôi ti n hành ñi u ch nh pH pha ñ ng 2.5, b ng cách tích 7.0, lúc này m u phân tích t n t i 3 h p ch t (axit gluconic, b sung H3PO4 vào nư c c a pha ñ ng t l axit H3PO4:nư c (1:1000 glucono-δ-lacton, mu i gluconat), do ñó trong dung d ch t n t i h v/v), t l pha ñ ng acetonitrile:nư c (3:7 v/v). Trong ñi u ki n này bi n gi a 2 d ng ñ ng phân này. Thay ñ i t l pha ñ ng ch làm thay ch xu t hi n 1 peak duy nh t. Như v y, trong môi trư ng H+ ñ i s chuy n hóa gi a các ch t, ch t nào t n t i nhi u nh t cho hình glucono-δ-lacton m vòng chuy n hóa v axit gluconic, lúc này dung d ng peak cao nh t. K t qu s c ký ñ t n t i nhi u peak ph c t p. d ch ñi qua c t là axit gluconic ñ ng nh t, trên s c ký ñ cho duy 3.3.1.2. Nghiên c u t l pha ñ ng khi c ñ nh pH m u phân tích 2.5 nh t 1 peak. K t qu nghiên c u th hi n b ng 3.5. B ng 3.4. Nghiên c u t l pha ñ ng khi c ñ nh pH m u phân tích 2.5 B ng 3.5. Nghiên c u pH pha ñ ng khi c ñ nh pH m u phân tích 2.5 Tên quy pH m u Đ th ñ nh tính Cơ ch chuy n hóa T l pha ñ ng Đ th ñ nh tính trình phân tích δ glucono-δ-lacton Acetonitrile:nư c thành axit gluconic 1 pH = 2.5 3:7 (v/v) Acetonitrile:nư c pH = 2.5. 2 7:3 (v/v) Acetonitrile pH = 2.5 3 Như v y, chúng tôi xây d ng ñư c quy trình phân tích axit 100% gluconic như sau pha tĩnh là c t C18, t c ñ dòng 0.5 ml/phút, bư c sóng 210 nm, t l pha ñ ng: acetonitrile:nư c (3:7 v/v), pHnư c = 2.5. Khi c ñ nh pH m u phân tích 2.5 v m t lý thuy t axit 3.3.1.4. Xây d ng ñư ng chu n axit gluconic gluconic t n t i d ng m ch th ng. Tuy nhiên, do pha ñ ng có pH trung tính, hi u qu pha loãng pha ñ ng nh hư ng l n ñ n pH c a m u khi ñi qua c t làm tái xác l p cân b ng gi a 2 d ng ñ ng phân. Axit gluconic nhanh chóng chuy n sang tr ng thái cân b ng v i vòng glucono-δ-lacton. Khi thay ñ i t l pha ñ ng ch làm thay ñ i t l gi a axit gluconic và glucono-δ-lacton. Khi m u qua c t trên s c ký ñ xu t hi n 2 peak tương ñ i rõ. Hình 3.1. Đư ng chu n axit gluconic
15 16 Phương trình ñư ng chu n axit gluconic: y = 212,6.x - 2,032 (3.1) 3.4.1. Xác ñ nh s lư ng bào t trư c khi ho t hóa gi ng Trong ñó: y: Chi u cao peak (mAU) Chúng tôi s d ng bu ng ñ m h ng c u ñ m bào t n m. x: N ng ñ axit gluconic (g/l) Sau khi xác ñ nh m t ñ bào t n m m c ñ t 106-107 bào t /ml, 3.3.2. Nghiên c u x lý d ch lên men và thu nh n axit gluconic chúng tôi ti n hành l c liên t c trên máy l c ñ ñ m b o huy n phù 3.3.2.1. Nghiên c u x lý d ch lên men ñ nh lư ng axit gluconic ñ ng nh t, sau ñó gi ng ñư c chuy n vào môi trư ng ho t hóa. D ch sau lên men g m axit gluconic t do, canxi gluconat, 3.4.2. nh hư ng c a t l gi ng ñ n hàm lư ng axit gluconic n m m c, khoáng dư, các s n ph m ph khác. K t thúc quá trình lên men, nâng nhi t ñ ñ n 90oC trong n i cách th y. Sau ñó ti n hành l c, lo i b bã, các t bào ch t thu h i d ch. D ch sau l c k t t a canxi gluconat b ng c n 96o, sau ñó l c ñ thu k t t a canxi gluconat, hòa tan k t t a trên gi y l c b ng H2SO4 0.2 M, l c tách b CaSO4, dung d ch axit gluconic thu ñư c ñ nh lư ng b ng máy HPLC. 3.3.2.2. Nghiên c u k t t a canxi gluconat b ng c n 96o B ng 3.6. Kh o sát t l c n 96o thích hơn k t t a canxi gluconat D ch lên 5:1 5:2 5:3 5:4 5:5 5:6 5:7 men: c n (v/v) Hình 3.4. nh hư ng t l gi ng ñ n hàm lư ng axit gluconic mcanxi gluconat (g/l) 26.0 30.4 34.7 38.5 39.0 40.2 40.2 Đ th hình 3.4 cho th y ban ñ u khi t l gi ng tăng d n, Như v y, k t t a canxi gluconat b ng c n 96o cho k t qu t t hàm lư ng axit gluconic sinh ra tăng. Tuy nhiên, khi t l gi ng quá nh t v i t l 5:6 (d ch sau lên men:c n v/v), trong 10 gi . cao thì hàm lư ng axit gluconic gi m. Khi t l gi ng quá ít so v i B ng 3.7. Kh o sát th i gian k t t a canxi gluconat b ng c n 96o lư ng cơ ch t thì lư ng enzyme sinh ra ít. Do ñó, th i gian lên men Th i gian k t t a (h) 2 4 6 8 10 12 kéo dài, t n năng lư ng, hi u qu kinh t không cao ho c t o ra s n mcanxi gluconat (g/l) 16,5 21.3 34,9 38.2 40.5 40.5 ph m ph không mong mu n rư u, andehyt,…. Ban ñ u b sung m t Sau 10 gi k t t a canxi gluconat b ng c n 96o, chúng tôi thu lư ng gi ng quá cao, x y ra s c nh tranh dinh dư ng, làm tiêu hao ñư c k t qu t i ưu 40,5 (g/l). m t lư ng l n cơ ch t cho quá trình tăng sinh kh i. Do ñó, hi u qu 3.4. NGHIÊN C U M T S Y U T NH HƯ NG Đ N chuy n hóa cơ ch t thành axit gluconic không cao. Đ ng th i, ngu n HÀM LƯ NG AXIT GLUCONIC T O THÀNH TRONG QUÁ dinh dư ng nghèo ñi cũng d n ñ n lư ng axit gluconic t o thành TRÌNH LÊN MEN
17 18 gi m. K t qu t l gi ng b sung là 10% v i m t ñ bào t 106-107 3.4.4. nh hư ng c a hàm lư ng nitơ b sung ñ n hàm lư ng bào t /ml thu ñư c k t qu t t nh t là 30.24 g/100g m t r . axit gluconic 3.4.3. nh hư ng c a th i gian lên men ñ n hàm lư ng axit gluconic Hình 3.6. nh hư ng hàm lư ng nitơ b sung Hình 3.5. nh hư ng th i gian lên men ñ n hàm lư ng axit gluconic ñ n hàm lư ng axit gluconic Qua quan sát hình 3.5 cho th y ban ñ u khi th i gian lên men Qua nghiên c u nh hư ng c a hàm lư ng nitơ b sung ñ n tăng, hàm lư ng axit gluconic sinh ra tăng, khi th i gian lên men kéo hàm lư ng axit gluconic t o thành, d a vào ñ th hình 3.6 cho th y dài hàm lư ng axit gluconic gi m. Th i gian ñ u n m m c s d ng ngu n nitơ có s n trong nguyên li u không ñ m b o cho quá trình cơ ch t ñ tăng sinh kh i, ñ ng th i ti t enzyme ñ chuy n hóa các sinh trư ng phát tri n c a vi sinh v t. Trong giai ño n ñ u khi hàm ch t. Khi lư ng t bào càng l n thì lư ng enzyme ti t ra càng nhi u, lư ng nitơ b sung tăng hàm lư ng axit tăng lên rõ r t, ñ t giá tr cao lư ng axit gluconic sinh ra càng tăng theo th i gian. th i ñi m 96 nh t 29.18 g/100g m t r v i hàm lư ng (NH4)2HPO4 3 g/l. Ti p t c gi qu n th vi sinh v t bư c vào pha cân b ng hàm lư ng axit tăng hàm lư ng (NH4)2HPO4, khi hàm lư ng nitơ quá cao d n ñ n gluconic sinh ra l n nh t. N u ti p t c kéo dài th i gian lên men, khi lư ng sinh kh i t o ra ngày càng nhi u, x y ra hi n tư ng c nh tranh ngu n dinh dư ng c n ki t cùng v i s n ph m axit gluconic t o ra dinh dư ng nh hư ng ñ n hi u su t lên men. Hàm lư ng axit nhi u s c ch s phát tri n c a vi sinh v t. N m m c b t ñ u s gluconic sinh ra gi m d n và th p nh t 23.97 g/100g m t r khi hàm d ng s n ph m sinh ra làm cơ ch t, t o ra các s n ph m ph gây t n lư ng (NH4)2HPO4 5 g/l. K t qu hàm lư ng axit gluconic t o thành th t s n ph m chính ñ ng th i gây khó khăn cho quá trình tinh s ch l n nh t là 29.18 g/100g m t r khi hàm lư ng (NH4)2HPO4 b sung s n ph m. K t qu sau 96 gi hàm lư ng axit gluconic l n nh t là là 3 g/l, 30.81 g/100g m t r . 3.5. NGHIÊN C U NH HƯ NG Đ NG TH I C A BA Y U T Đ N QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT GLUCONIC
19 20 3.5.1. Ch n y u t nh hư ng T2 10 96 3 0 0 0 0 0 0 0 32.49 3.5.2. Ch n ñi u ki n thí nghi m T3 10 96 3 0 0 0 0 0 0 0 33.31 Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 (3.2) B ng 3.8. Các ñi u ki n thí nghi m 3.5.4. Tính các h s h i quy Các m c B ng 3.11. Giá tr các h s b trong phương trình h i quy y Kho ng Y ut M c dư i M c cơ s M c trên b0 27.03 b12 - 1.49 bi n thiên -1 0 +1 b1 - 1.02 b13 - 0.10 Z1 8 10 12 2 b2 1.64 b23 0.28 Z2 84 96 108 12 b3 2.02 b123 0.19 Z3 2 3 4 1 3.5.5. Ki m ñ nh tính ý nghĩa c a các h s h i quy và s tương 3.5.3. T ch c và th c hi n các thí nghi m thích c a phương trình 3 B ng 3.9: K t qu thí nghi m quy ho ch nhân t toàn ph n 2 B ng 3.12. Giá tr các chu n Student th c nghi m ttn Các nhân t theo t t0 124.713 t12 6.859 Các nhân t trong h to ñ không th nguyên l xích t nhiên t1 4.728 t13 0.461 TT Z1 Z2 Z3 x1 x2 x3 x1x2 x1x3 x2x3 x1x2x3 y t2 7.550 t23 1.315 1 8 84 2 - - - + + + - 22.90 t3 9.302 t123 0.895 2 12 84 2 + - - - - + + 24.42 Tra b ng phân b phân v chu n Student (tb) v i m c ý nghĩa 3 8 108 2 - + - - + - + 28.97 p = 0,05 b c t o f = 2 ta có: t0,05;2 = 4,3. 4 12 108 2 + + - + - - - 23.76 Do t13 , t23 , t123 < tp(f) nên h s b13, b23, b123 không có ý 5 8 84 4 - - + + - - + 26.95 nghĩa, ta lo i ra kh i phương trình, lúc này phương trình h i quy có 6 12 84 4 + - + - + - - 27.29 d ng: 33.38 y = 27.03 - 1.02x1 + 1.64x2 + 2.02x3 - 1.49x1x2 (3.9) 7 8 108 4 - + + - - + - 8 12 108 4 + + + + + + + 28.55 T1 10 96 3 0 0 0 0 0 0 0 33.69 B ng 3.13. Các giá tr ñ tính ñ l ch dư
21 22 STN yu yu yu − y u 2 Các y u t nh hư ng Hàm m c tiêu Ký hi u Thí nghi m Z1,% Z2, gi Z3, g/l Y m u 1 22.90 24.68 3.17 1(TN t i tâm) 10 96 3 31.00 M12 2 24.42 25.68 1.59 2 9.6 99.6 3.4 33.91 M13 3 28.97 27.39 2.50 3 9.2 103.2 3.8 31.17 M14 4 23.76 25.34 2.50 4 8.8 106.8 4.2 28.88 M15 5 8.4 110.4 4.6 28.16 M16 5 26.95 28.15 1.42 6 27.29 26.10 1.42 Căn c vào k t qu qui ho ch th c nghi m cho th y r ng theo hư ng leo d c thí nghi m th 2 cho k t qu t t nh t v i hàm lư ng axit 7 33.38 31.99 1.94 gluconic 33.91 g/100g m t r cao nh t tương ng v i t l gi ng b sung 8 28.55 29.94 1.94 9,6%, th i gian lên men là 99.6 gi , hàm lư ng (NH4)2HPO4 3.4 g/l. 3.5.7. Thí nghi m ki m ch ng Suy ra Fb = F(0,05; 3; 2) = 19.13, do Ftn < Fb(f1f2), phương trình thu K t qu thu ñư c hàm lư ng axit gluconic 33.62 g/100g m t ñư c tương thích v i th c nghi m và phương trình này ñư c s d ng ñ r , k t qu này g n th a mãn giá tr t i ưu. tìm ki m t i ưu. PTHQ (3.9) hoàn toàn tuy n tính nên ta có th tìm ñi u 3.5.8. K t lu n ki n t i ưu b ng phương pháp leo d c (phương pháp Box-Wilson). B ng phương pháp quy ho ch th c nghi m chúng tôi ñã xây 3.5.6. T i ưu hoá th c nghi m d ng ñư c phương trình ñ ng h c mô t m i tương quan c a các y u B ng 3.14. Các ñi u ki n c n thi t ñ ti n hành thí nghi m leo d c t trong quá trình lên men ñ n hàm lư ng axit gluconic. Các ch tiêu Z1,% Z2, h Z3, g/l M c cơ s 10 96 3 Kho ng bi n thiên (λj) 2 12 1 H s bj - 1.02 1.64 2.02 bj λj - 2.04 19.68 2.02 bjλ j 2.04 19.68 2.02 Bư c chuy n ñ ng ( δ j ) - 0.373 3.6 0.369 Làm tròn bư c chuy n ñ ng ( δ j ) - 0.4 3.6 0.4 B ng 3.15. K t qu thí nghi m theo hư ng leo d c
23 24 3.6. Đ XU T QUY TRÌNH CÔNG NGH LÊN MEN AXIT 3.6.2. Thuy t minh quy trình GLUCONIC T R ĐƯ NG B NG ASPERGILLUS NIGER R ñư ng: Đư c thu nh n t các nhà máy s n xu t ñư ng. QUY MÔ PTN Pha loãng: Pha loãng r ñư ng:nư c (2:1 kg/kg) nh m thu n 3.6.1. Quy trình công ngh R ñư ng l i cho quá trình ly tâm tách t p ch t, gia nhi t tiêu di t t p khu n. Gia nhi t: Gia nhi t 85-90oC, gi nhi t ñ ñó trong kho ng Pha loãng 45-60 phút, h u h t các t p khu n b tiêu di t, sau ñó lý tâm. Ly tâm: Nguyên li u ñư c ly tâm tách các ch t không hòa Gia nhi t tan trong m t r . Nguyên li u sau x lý ñư c b o qu n 4oC Ti t trùng: M c ñích c a quá trình ti t trùng môi trư ng là Ly tâm tiêu di t các vi sinh v t nh hư ng ñ n quá trình lên men. Ti t trùng môi trư ng nhi t 121oC và th i gian 30 phút. Khoáng ch t Chu n b môi trư ng lên men Lên men: Thành ph n môi trư ng chu n b v i hàm lư ng cơ ch t m t r 150 g/l, (NH4)2HPO4 3 g/l, KH2PO4 0.5 g/l, Ti t trùng MgSO4.7H2O 0,1 g/l, CaCO3 40 g/l. Đi u ch nh pH 6.0 b ng H2S04 o t = 30 C 2.0 M, ti n hành lên men nhi t ñ 30oC, th i gian lên men 96 gi , A.niger Ho t hóa Lên men T= 96 gi theo dõi pH môi trư ng lên men 6 gi m t l n. pH = 6.0 Gi ng: Gi ng sau khi ho t hóa ñ m b o m t ñ 106-107 bào Tách bã t /ml v i t l gi ng 10% (v/v). Môi trư ng lên men ti t trùng xong Bã ñ ngu i v nhi t ñ môi trư ng thì ti n hành b sung gi ng. C n 96o Tách bã: Sau 96 gi lên men ti n hành l c s ch bã, thu h i d ch canxi gluconat. B sung c n k t t a canxi gluconat. D ch L c tách d ch Tách d ch: Sau khi k t t a canxi gluconat b ng c n, l c thu H2SO4 0.2 M k t t a lo i b d ch, r a k t t a trên gi y l c b ng H2SO4 0.2 M. Tách k t t a: R a k t t a canxi gluconat trên gi y l c b ng CaSO4 L c tách k t t a H2SO4 0.2 M, ti n hành lo i k t t a CaSO4, thu ñư c axit gluconic. ↓ Dung d ch axit gluconic Hình 3.15. Quy trình lên men axit gluconic
25 26 K T LU N VÀ KI N NGH 2. KI N NGH 1. K T LU N 1) Nên ti p t c nghiên c u các y u t nh hư ng khác ñ n 1) R ñư ng nhà máy ñư ng Kon Tum có ch t lư ng phù quá trình lên men: nhi t ñ lên men, n ng ñ m t r , n ng ñ oxy,... h p v i lên men axit gluconic có thành ph n hóa h c như sau: T ñó xây d ng phương trình t i ưu hóa các quá trình lên men ñ Bx: 84.41 m nh d n ñ xu t quy trình công ngh lên men axit gluconic t r pH: 5.40 ñư ng b ng ch ng n m m c A. niger quy mô pilot. Protein: 3.64 (% ch t khô) 2) Nghiên c u x lý màu c a s n ph m. Đư ng kh : 22.70 (% kh i lư ng) 3) Nghiên c u k t tinh s n ph m ñ t o s n ph m d ng r n. Đư ng t ng: 54.50 (% kh i lư ng) 4) Nghiên c u t n d ng bã th i c a môi trư ng sau lên men Đư ng saccarose: 30.21 (% kh i lư ng) ñ làm th c ăn gia súc, phân bón vi sinh. 2) Đã xây d ng phương pháp xác ñ nh axit gluconic b ng máy HPLC (Dionex - M ) v i các thông s như sau: S d ng pha tĩnh là c t C18, t c ñ dòng 0,5 ml/phút, bư c sóng phát hi n 210 nm, t l pha ñ ng là acetonitrile:nư c (3:7 v/v), t l axit H3PO4: nư c (1:1000 v/v), (pHnư c = 2.5), m u phân tích có pH = 2.5. 3) Sau khi nghiên c u nh hư ng ñ ng th i 3 y u t ñ n hi u su t thu h i axit gluconic: t l gi ng, gian lên men, hàm lư ng nitơ b sung b ng phương pháp quy ho ch th c nghi m, TYT23 thì phương trình h i quy thu ñư c là: y = 27.03 - 1.02x1+1.64x2+ 2.02x3 - 1.49x1x2 4) Khi t i ưu hóa th c nghi m b ng phương pháp leo d c v i các thông s lên men t i ưu: t l gi ng 9.6%, th i gian lên men 99.6 gi , lư ng (NH4)2HPO4 t 3.4 g/l. K t qu thu ñư c t thí nghi m ñ i ch ng hàm lư ng axit gluconic ñ t 33.62 g/100g m t r . 5) Đã ñ xu t qui trình lên men axit gluconic t r ñư ng s d ng Aspergillus niger qui mô PTN.