Luận văn:Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

Chia sẻ: Rose_12 Rose_12 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:75

Thêm vào BST

Báo xấu

122
lượt xem 27
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

TRƯỜNG…………………. KHOA……………………… LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản 1
MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………... 4 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………...5 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam…………………………………………5 1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay ……... 9 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam…………………………….11 1.3.1. Phương pháp quang học ………………………………………………...11 1.3.2. Phương pháp điện hóa …………………………………………………..12 1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………..12 1.3.4.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) ……..14 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………17 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu …………………………………………….17 2.1.1. Đối tượng ……………………………………………………………….. 17 2.1.2. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………17 2.2. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản ………………………. 17 2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản……………………… 17 2.2.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản………………………….. 18 2.2.3 . Các quá trình xẩy ra trong mao quản………………………………… 19 2.2.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản……………………………………………………………………………... 29 2.2.5. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC).. 20 2.2.6. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản………….26 2.3. Thực nghiệm…………………………………………………………………… .27 2.3.1. Máy móc và dụng cụ …………………………………………………….27 2.3.2. Hóa chất ………………………………………………………………….27 2
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………….29 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β - Lactam ……………………..29 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất …………………………………………29 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách………………………… 30 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu …………………………………………..31 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng ……………………………………..32 3.1.5. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di …………………………….33 3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm …………………………...36 3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS ……………….37 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm…………………………………40 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu ………………………………43 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di ……………………………………….45 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản …………………………47 3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu ……………………………………………….50 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ……………………………………………...51 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn ……………………..51 3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của đường chuẩ n (LOQ)…………………………………………………………………………... 54 3.2.5. Độ chính xác của phép đo ………………………………………………55 3.2.6. Độ lặp lại của phép đo …………………………………………………..57 3.3. Phân tích mẫu thực ……………………………………………………………..59 3.3.1. Phân tích mẫu thuốc …………………………………………………….59 3.3.2 Phân tích mẫu máu …………………………………………………….. .63 3.4. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) ……………………………………………………………………...64 3.5. Hướng phát triển của đề tài. …………………………………………………...65 PHỤ LỤC ………………………………………………………………..71 3
MỞ ĐẦU Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các kháng sinh β-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường chủ yếu là các công trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp HPLC là phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời gian phân tích ngắn. Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao. Ngược lại, phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng một lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3 – 4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam bằng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm của nó thì phương pháp sẽ ngày càng thông dụng được áp dụng nhiều trong phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài là “ Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản” 4
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25] Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm s ử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên. Cấu trúc và phân loại: * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β- Lactam S CH3 R CO N 4 6 5 H 3 7 1 CH3 N 2 O COOM Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3- dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau. 5
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh R Hoạt tính CH - Gồm các Penicillin tự Penicillin 2 Nhóm penicillin nhiên và dẫn chất.Phổ G tự nhiên Benzyl hẹp: vi khuẩn gram(+). (PENG) β- Benzathin Không kháng lactamase CH3 Nhóm penicillin kháng penicilliiase C- Oxacillin Là các Penicillin bán NO (OXA) 6-[(5-methyl-3-phenyl- tổng hợp. Phổ hẹp như 1,2-oxazole-4-carbonyl)amino] nhóm I. Kháng penicilliiase, không tác O Cl N C- động vào vòng β– Cloxacillin CH3 Lactam được. (CLO) 6-{[3-(2-chlorophenyl )- 5-methyl-oxazole-4-carbonyl]amino} NH2NH2 CH- Ampicillin Nhóm penicillin phổ rộng Phổ rộng, tác dụng cả (AMP) 6-([(2R)-2-amino-2- khuẩn gram (+) và (-). phenylacetyl]amino) β- Không kháng NH2NH2 Amoxicilli lactamase và CH- n (AMO) penicilliiase 6-{[(2R)-2-amino-2-(4- HO hydroxyphenyl)-acetyl]amino} 6
* Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R R2 S 1 R1 CO N 6 2 7 H 8 3 N5 4 R3 O COOM Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5- thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF) Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin Thế hệ Kháng sinh R1 R2 R3 I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng Cephalexin H -CH3 CH- mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+), (CEP) NH2 yếu nhất trên gram (-). Không bền và dễ bị β-lactamase phá hủy 7
H2N III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram Cefixim H -CH=CH2 N (-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác (CEF) S N dụng kém penicillin và HOOCCH2O cephalosporin thế hệ I. Bền với β- lactamase Tính chất: Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ). Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng. Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 PEN 2.74 AMO 2. 8 CLO 2. 7 AMP 2.7 CEP 2. 6 CEF 2.75 OXA 2.72 Tác dụng: Cơ chế: Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa 8
enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng. Kháng thuốc: Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin). Độc tính: Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ.. Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc. 1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales [6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề 9
kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao. Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [17] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [4], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày). Theo [4] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít tr ẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42% Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the 10
Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển. Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất…… Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiêu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng. 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1. Phương pháp quang học Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm. Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích. Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β- lactam. A. Fernández-González và cộng sự [11] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 11
4.10-7M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [18], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1 mg/l. Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này. 1.3.2. Phương pháp điện hóa Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều. Theo [7], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0.1M pH=5.2. 1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các ch ất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha 12
đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Theo [29], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25- 100 μg/kg. J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1 mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý. Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 16] 13
nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được. Tác giả Ngô Quang Trung [5] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, 5 µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%. Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212 nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l, hệ số tương quan R > 99.8%. Gi ới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích các β-lactam. Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. 1.3.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch 14
chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15%. Độ thu hồi trên 96%. Biyang Deng và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu. Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh h ọ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8. Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng. M.I.Bailon-Perez và cộng sự [22] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%. Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [23] xác định 9 loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8.5 làm chất 15
nền điện di và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD 0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn định lượng 2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7%. Độ thu hồi từ 91 – 95.6%. .Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến hành, đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc phân tích các mẫu có đa thành phần. Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn. Vì vậy phương pháp MEKC sẽ là bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của phương pháp quang, điện, HPLC mà kết quả đáng tin cậy. Trong bản luận văn này, chúng tôi nghiên cứu theo hướng của tác giả L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21], M.I. Bail ´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [23] trong mẫu dược phẩm và sinh học. 16
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng Xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như đã chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là penicillin (PENG), cloxacillin (CLO), oxacilin (OXA) ampicillin (AMP), amoxicillin (AMO), cephalexin (CEP), cefixim (CEF) là các kháng sinh β-lactam được sử dụng phổ biến hiện nay. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu Nội dung đề tài cần giải quyết là: - Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với detector DAD Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách các kháng sinh  -lactam có thể tách - và xác định đồng thời các kháng sinh -lactam như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ…. - Đánh gía thống kê phương pháp phân tích - Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc và mẫu máu - Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp 250C 2.2. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản [7,8,20] Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản 17
- Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển - Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25 - 100 m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao. - Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng của lực điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của chúng. (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện thẩm). 2.2.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản - Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy phải có các bộ phận chính như sau: 1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt), 2. Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản), 3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá trình điện di (sắc ký) của các chất, 4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách), 5. Bộ phận phát hiện các chất sau khi tách (detector), 6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản, 7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu. Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 1. 18
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 2.2.3 . Các quá trình xẩy ra trong mao quản Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là: 1. Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản, 2. Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 A), 3. Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu, EOF, 4. Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản, 5. Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển, 6. Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC), 7. Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên, 8. Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh. 9. Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử trung tính) trong mao quản. Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất. Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có thể làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất. 19
Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC. Trong 9 quá trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá trình khác (1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp. Vì thế, muốn có kết quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá trình đó và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản. Tức là phải tối ứu hoá các điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác định, để có được hiệu quả tách cao. 2.2.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xẩy ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (Mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và sử dụng chúng cho thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là: 1. Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE) 2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE) 3. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Electro- Kenetic:MEK hay MCEK). 4. Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE), 5. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF). 6. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP). 2.2.5. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis) và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược. Nó là một kiểu 20