intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC dùng Detector UV

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:94

Thêm vào BST
Báo xấu
26
lượt xem 2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn "Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC dùng Detector UV" sẽ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàm lượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC dùng Detector UV

  1. §¹I HäC QuèC GIA Hµ NéI Tr-êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn ----------- TrÇn thÞ thanh nga X¸c ®Þnh rhodamine trong thùc phÈm b»ng Kü THUËT s¾c ký láng HiÖu n¨ng cao hplc Sö DôNG DETETOR UV LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc Gi¶ng viªn h-íng dÉn: pgs.ts ph¹m luËn Hà Nội - 2011
  2. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Môc lôc MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 3 1.1. Một vài nét về rhodamine B .................................................................. 3 1.1.1. Công thức cấu tạo ............................................................................ 3 1.1.2. Tính chất lý học ............................................................................... 3 1.1.3. Tính chất sinh học…………………………………………………..4 1.1.3. Ứng dụng .......................................................................................... 4 1.2. Các phƣơng pháp xác định rhodamine B ............................................ 5 1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký cổ điển - phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản mỏng- TLC ....................................................................................... 7 1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................... 8 1.2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC…………………...……………………………………………………..…8 1.2.2.2. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng…………10 1.2.2.3. Các kết quả nghiên cứu về rhodamine B bằng phƣơng pháp HPLC...........................................................................................................11 1.2.3. Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B ............................ 13 Chƣơng 2:............................................................................................................ 14 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 14 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ....................................... 14 2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu.................................................. 14 2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ....................................................................... 14 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................ 15 2.2.1. Detector UV-Vis ............................................................................... 16 2.2.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC .................................................. 17 2.3. Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu ................................................ 18 2.3.1. Hoá chất ............................................................................................ 18 2.3.2. Máy móc và thiết bị .......................................................................... 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 21 88 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  3. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ................................................................. 21 3.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) ............................................ 21 3.1.2. Chọn bƣớc sóng của detector .......................................................... 22 3.1.2.1. Phƣơng pháp 1........................................................................... 24 3.1.2.2. Phƣơng pháp 2........................................................................... 26 3.2. Chọn pha tĩnh .......................................................................................... 28 3.3. Tối ƣu hóa pha động ............................................................................... 30 3.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần pha động tới khả năng tách sắc ký .................................................................................................................. 30 3.3.1.1. Pha động thứ nhất ..................................................................... 31 3.3.1.2. Pha động thứ hai ....................................................................... 36 3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình tách sắc ký……………………………………………………………………….………40 3.3.2.1. Pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm ................................. 40 3.3.2.2.Pha động gồm 85% ACN- 15% đệm ........................................ 43 3.3.3. Ảnh hƣởng của các chất phụ ........................................................ 45 3.3.3.1. Ảnh hƣởng của trietylamin đối với hệ pha động gồm MeOH và đệm...........................................................................................................45 3.3.3.2. Ảnh hƣởng của natri 1- heptansunfonat tới dung môi ACN và đệm fomat có pH=3 ........................................................................... 48 3.3.4. Khảo sát tốc độ pha động.............................................................. 51 3.3.4.1. Hệ pha động MeOH – đệm....................................................... 51 3.3.4.2. Hệ pha động ACN – đệm .......................................................... 53 3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích .......................................................... 57 3.4.1. Tổng kết các điều kiện đã chọn....................................................... 57 3.4.2. Khảo sát lập đƣờng chuẩn trong khoảng nồng độ 0,01- 2,00ppm với pha động ACN- Đệm ........................................................................... 57 3.4.3. Giới hạn phát hiện (limit of detection- LOD) ................................ 61 3.4.3.1. Phƣơng pháp tính toán theo đƣờng chuẩn ............................. 61 3.4.3.2. Phƣơng pháp trực tiếp .............................................................. 63 3.4.4. Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ)............................ 64 89 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  4. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 3.4.5. Độ đúng của phép đo ..................................................................... 64 3.4.6. Độ lặp lại của phép đo ................................................................... 68 3.5. Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý và kết quả phân tích .... 69 3.5.1. Khảo sát dung môi chiết lấy Rhodamine B ................................... 69 3.5.1.1. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích ....................................................... 69 3.5.1.2. Chọn dung môi chiết ................................................................. 70 3.5.2. Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết .......................................... 74 3.5.2.1. Mẫu hạt dƣa............................................................................... 74 3.5.2.2. Mẫu bánh xu xê ......................................................................... 77 3.5.2.4. Mẫu siro dâu .............................................................................. 79 3.5.2.5. Mẫu nƣớc ngọt hƣơng dâu ....................................................... 80 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 85 90 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  5. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1 HPLC High performance Sắc ký lỏng hiệu năng liquid chromatography cao 2 UV Vùng tử ngoại 3 Vis Vùng khả kiến 4 ADN Acid dedonucleoic 5 LC- MS Sắc ký lỏng khối phổ 6 SPE Cột chiết pha rắn 7 TLC Sắc ký bản mỏng 8 MSD Detectơ khối phổ 9 DAD Diod array Điốt array 10 NP- HPLC Sắc ký hấp phụ pha thường 11 RP- HPLC Sắc ký hấp phụ pha đảo 12 Ex- HPLC Sắc ký trao đổi ion 13 Gel- HPLC Sắc ký rây phân tử 14 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 15 SD Độ lệch chuẩn 16 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện 17 LOQ Limit of quanlity Giới hạn định lượng
  6. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Danh môc b¶ng Bảng 3.1. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector đối với hệ dung môi 75% metanol-25% nước. ................................................. 25 Bảng 3.2. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector đối với hệ dung môi 85% axetonitril- 15% nước (0,005M natri 1- heptansunfonat). ............................................................................................... 27 Bảng 3.3. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động ..................... 31 Bảng 3.4. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động ..................... 37 Bảng 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 40 Bảng 3.6. Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 43 Bảng 3.7. Hệ số dung lượng ki’ phụ thuộc vào nồng độ trietylamin ................ 45 Bảng 3.8. Diện tích píc phụ thuộc vào nồng độ natri heptansunfonat ............ 48 Bảng 3.9. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động .... 51 Bảng 3.10. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động .. 54 Bảng 3.11. Diện tích píc sắc ký phụ thuộc vào nồng độ Rhodamine B ........... 58 Bảng 3.12. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,1ppm ............................... 65 Bảng 3.13. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,5ppm ............................... 66 Bảng 3.14. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 1,0ppm ............................... 67 Bảng 3.15. Độ lặp lại của các phép đo tại các nồng độ .................................. 69 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới hàm lượng Rhodamine B ....... 70 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới diện tích píc Rhodamine B ..... 72 Bảng 3.18. Kết quả phân tích mẫu hạt dưa ..................................................... 75 Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu bánh xu xê ................................................ 77 Bảng 3.20. Kết quả phân tích mẫu siro dâu .................................................... 79 Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu nước ngọt hương dâu ............................... 81 91 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  7. DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao............. 15 Hình 3.1. Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn rhodamine B .................. 23 Hình 3.2. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng của detectơ .................................................................................................................. 26 Hình 3.3. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B ................................................. 28 Hình 3.4. Sắc ký đồ của Rhodamine B ở các cột tách khác nhau ....................... 29 Hình 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH trong pha động ............................ 32 Hình 3.6. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau ......... 34 Hình 3.7. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần ACN khác nhau ................. 35 Hình 3.8. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN trong pha động ............................... 37 Hình 3.9. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau ......... 39 Hình 3.10. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm ........................... 41 Hình 3.11. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhauđối với pha động MeOH-đệm42 Hình 3.12. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm ........................... 43 Hình 3.13. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhau ............................................. 44 Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hệ số dung lượng vào nồng độ TEA ...................... 46 Hình 3.15. Sắc đồ píc sắc ký của các Rhodamine B với các nồng độ TEA ......... 47 Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ natri heptansunfonat ... 49 Hình 3.17. Sắc đồ píc sắc ký của Rhodamine B với các nồng độ ........................ 50 Hình 3.18. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động .............. 52 Hình 3.19. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động ....................... 53 Hình 3.20. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tốc độ pha động ......................... 54 Hình 3.21. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động ....................... 56 Hình 3.22. Đường chuẩn theo diện tích pic trong khoảng nồng độ ................... 59 Hình 3.23 Sắc đồ píc sắc ký tại các nồng độ khác nhau của Rhodamine B ....... 61 Hình 3.24. Sắc đồ píc sắc ký mẫu chuẩn Rhodamine B tại các nồng độ............ 63 Hình 3.25. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,1ppm .......................... 66 Hình 3.26. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,5ppm .......................... 67 Hình 3.27. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 1,0ppm .......................... 68 Hình 3.28. Sắc đồ píc sắc ký mẫu hạt dưa với các dung môi chiết ..................... 71 Hình 3.29 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine với các tỷ lệ dung môi chiết ............... 73 Hình 3.30. Đường chuẩn (a) và sắc đồ (b) khi thêm chuẩn đối với mẫu hạt dưa75 Hình 3.31. Đường chuẩn và sắc đồ khi thêm chuẩn đối với mẫu bánh xu xê ..... 78 Hình 3.32. Đường chuẩn(a) và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu siro ....... 80 Hình 3.33. Đường chuẩn (a)và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu nước ngọt82
  8. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích MỞ ĐẦU Khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khoẻ của con người ngày càng được chú trọng, trong đó vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh môi trường được đặt lên hàng đầu vì nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của con người. Sự tồn dư của các chất độc hại có trong thực phẩm đang là vấn đề đáng lo ngại đối với người tiêu dùng. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện đại đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau đặc biệt trong đánh giá, kiểm định các chất độc trong thực phẩm. Trong quá trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp, bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp. Phẩm màu công nghiệp nói chung, rhodamine B nói riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vì khó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại đến cơ thể con người, đặc biệt có thể gây ung thư. Phẩm màu thực phẩm và tự nhiên có độ bền kém hơn, lại đắt hơn phẩm màu công nghiệp. Do vậy nhiều người đã lạm dụng phẩm màu công nghiệp mặc dù chất này đã bị cấm sử dụng trong thực phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của các rhodamine B là vấn đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Tuy nhiên, ngoài sự có mặt của rhodamine B còn có các thành phần hoá học khác có trong phẩm nhuộm như Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu nhất để xác định rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đây là một phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong những năm gần đây. Nó được áp dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số phương pháp khác gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợp chất có tính chất hoá học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu 1 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  9. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích điểm mà các phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiều chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản,… Trong phân tích bằng phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sử dụng là cột trao đổi ion và cột tách pha đảo. Trong luận văn này, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàm lượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis. Phương pháp này có độ chọn lọc cao, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm ở nước ta, có tính khả thi và tính ứng dụng thực tế cao. Phân tích một số mẫu thực phẩm như hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và các mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm này. Dựa trên các kết quả nghiên cứu về phân tích hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm mà có thể đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm của các cơ sở sản xuất. 2 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  10. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Một vài nét về rhodamine B 1.1.1. Công thức cấu tạo Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu công nghiệp. Công thức phân tử là C28H31ClN2O3 Phân tử khối là 479,02g/mol. Công thức cấu tạo của rhodamine B [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride 1.1.2. Tính chất vật lý Rhodamin B là những tinh thể màu tối có ánh xanh hay ở dạng bột màu nâu đỏ. Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt trong methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l). Dung dịch nước và rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung dịch loãng. Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có  = 526 và 517 nm. 3 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  11. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 1.1.3. Tính chất sinh học Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính. Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da, mắt,... Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực. Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận. Nếu tích tụ dần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây ung thư [17,21]. Thực nghiệm trên chuột cho thấy rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm vào tĩnh mạch [21], khi rhodamine B đi vào cơ thể có thể chuyển hóa thành amin thơm tương ứng có phần độc hại hơn loại rhodamine B thường, gây ung thư và phát triển khối u dạ dầy. Tại đây rhodamine B và dẫn xuất của nó sẽ tác động mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan, vì gan là cơ quan tạng đầu tiên lọc chất rhodamine B [29]. Một số thực nghiệm khác cho thấy rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi cấy tế bào [24,19]. 1.1.4. Ứng dụng Rhodamine B thường được sử dụng trong nước để xác định tốc độ và hướng của dòng chảy vận chuyển [22]. Được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghệ sinh học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang [22]. Rhodamine B đang được thử nghiệm để sử dụng trong vắcxin bệnh dại cho động vật hoang dã [22]. Nó cũng được trộn vào thuốc diệt cỏ. Ngoài ra Rhodamine B còn được sử dụng để tạo mầu và nhuộm mầu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu trong phòng thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào do tính bền mầu [23]. Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một thuốc nhuộm huỳnh quang. Tận dụng đặc tính phát quang của rhodamine B, người ta dùng 4 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  12. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt, cây lấy dầu [23]. Tại Indonesia, phẩm mầu được đưa vào thực phẩm làm cho món hàng hấp dẫn hơn, đánh lừa cảm quan của người dân Indonesia. Việc tổng hợp màu ngày càng tăng trong một số loại thực phẩm do chi phí rất rẻ [21]. Kết quả phân tích Hóa Lý cho thấy việc sử dụng phẩm màu tổng hợp trong đồ ăn nhẹ và thức uống chứng minh rhodamine B là phẩm màu được sử dụng rộng rãi tại Jakarta. Thông tin này dựa trên những nghiên cứu chứng minh rằng trong 20 đồ ăn nhẹ, 10 loại thức uống và 8 thương hiệu của chất màu đều có chứa rhodamine B [21]. Một số loại phẩm mầu sử dụng tại Indonesia được cho vào các loại thực phẩm như: thức ăn snack, tôm, kẹo bông, siro,…Nghiên cứu cũng chỉ ra trong đồ uống được bán tại các trường tiểu học tiểu bang Bangdung có chứa phẩm mầu công nghiệp với hàm lượng từ 7,841- 3226,55 ppm [21]. Theo Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban châu Âu đã quy định rất rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ phẩm [11,17] nên không có giới hạn chấp nhận đối với nhóm chất nhuộm này. Do tính độc hại của rhodamine B nên ở các nước thuộc khối EU và hầu hết các nước trên thế giới đều cấm sử dụng rhodamine B cho sản xuất và chế biến thực phẩm [24, 19]. 1.2. Các phƣơng pháp xác định rhodamine B Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích rhodamine B đã được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm bao gồm các phương pháp vi sinh và hóa học. Phương pháp vi sinh phân tích rhodamine B cho độ nhạy và độ chọn lọc kém [12]. Vì vậy, các phương pháp hóa học được áp dụng rất rộng rãi trên thế giới như: phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang. 5 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  13. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Nhưng phương pháp sắc ký bản mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời gian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại và tốn kém [21, 15, 10]. Vì vậy phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang là các phương pháp được sử dụng hiện nay [19]… Tuy các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện 10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb [27] nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, thường phải chiết bởi các dung môi độc hại, làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE) [12] trước khi bơm vào cột sắc ký. Năm 2006, Brian Stuart và M Walker [11] đã đưa ra một phương pháp xử lý mẫu nhanh, đơn giản, ít phải sử dụng đến các dung môi độc. Rhodamine B có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến rất nhạy nên thiết bị sắc ký lỏng với detectơ UV- Vis là rất phù hợp cho việc phân tích rhodamine B. Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp của Brian Stuat và M.Walker để áp dụng cho nghiên cứu này. Hiện nay các phương pháp phân tích rhodamine B trong gia vị vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ cho các nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học. Tại Việt Nam, do ý thức chủ quan của con người, môi trường và thực phẩm ngày càng bị ô nhiễm, nhiều chất độc hại làm ảnh hưởng đến sức khỏe và gia tăng số người mắc bệnh ung thư. Đặc biệt là việc lạm dụng các chất phụ gia trong chế biến thực phẩm như sử dụng rhodamine B để làm tăng màu đỏ của gia vị: bột điều xay, ớt đỏ, bột sa tế, các loại gia vị nấu bò kho, nấu thịt hầm ragu và hạt dưa đỏ làm cho món hàng hấp dẫn hơn. Ngày 02 tháng 02 năm 2010, sở y tế Thành phố Hồ Chí Minh đã lấy mẫu ớt bột và mẫu gia vị có mầu đỏ tại cơ sở Kim Nga- quận Bình Tân để kiểm tra kết quả đã phát hiện mẫu ớt bột sản xuất ngày 20 tháng 01 năm 2010 có chứa 51 mg/kg rhodamine B và các mẫu bột gia vị nhuộm màu đỏ lấy cùng ngày có chứa 33,4 mg/kg. Cơ sở này buộc phải tiêu hủy 77,5kg ớt bột và 258kg gia vị có mầu đỏ vì không đảm bảo vệ sinh an toàn 6 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  14. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích thực phẩm [13]… Điều này hết sức nguy hại đối với sức khỏe người tiêu dùng và góp phần làm gia tăng trực tiếp số người mắc bệnh ung thư trong cộng đồng. Hiện ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về phẩm mầu công nghiệp nhóm azo [7, 8], nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về rhodamine B trong lĩnh vực thực phẩm. Do đó việc xây dựng một quy trình chuẩn áp dụng cho phòng thí nghiệm địa phương là rất cần thiết. Tiêu chuẩn giới hạn hàm lượng phẩm màu rhodamine B trong thực phẩm, hàng tiêu dùng…, và những quy định tiêu chuẩn sức khỏe liên quan tới sức khỏe cộng đồng của Việt Nam hiện nay vẫn chưa có. 1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký cổ điển- phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản mỏng (TLC) Phương pháp này khá đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích. Phương pháp này có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu song song trong một lúc rất tiện lợi. TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng [25,26]. Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn trong ethanol tuyệt đối để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10g/ml. Rồi tiến hành xác định định tính trong điều kiện sắc ký sử dụng bản mỏng silicagel 60F254, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Pha động được sử dụng gồm hai hệ: Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10) Hệ 2: EA- MeOH- H2O (100: 17: 13) Phát hiện vết bằng cách quan sát vết ở ánh sáng thường hoặc soi dưới đèn tử ngoại, bước sóng 366nm. So sánh vị trí và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử với vết mẫu của rhodamine B trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn để đánh giá kết quả [26]. 7 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  15. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi trường,…đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định rhodamine B trong thực phẩm với các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao… Detectơ ghép nối HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau rửa giải. Ngày nay có rất nhiều loại detectơ được sử dụng đã mở rộng khả năng phát hiện nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng thì người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD), nhất là tách và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Còn thông dụng người ta dùng detectơ UV-Vis hay detectơ huỳnh quang. Dùng detectơ UV-Vis thì xác định được nhiều loại chất, nhưng detectơ huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong nền mẫu. Ngoài ra còn dùng một số detectơ khác như detectơ điot array (DAD), detectơ điện hoá [16],… các detectơ này cũng thường được ứng dụng để phân tích các chất có trong phẩm nhuộm. 1.2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định, 8 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  16. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký. Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại. Như vậy là có một khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúc của mỗi chất tan khác nhau đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn đến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký [6]. Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:  Tương tác hấp thụ  Tương tác trao đổi ion  Tương tác theo cơ chế rây phân tử Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau.  Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP- HPLC và hấp phụ pha ngược RP- HPLC)  Sắc ký trao đổi ion (EX- HPLC)  Sắc ký rây phân tử (Gel- HPLC) Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển 9 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  17. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích tới detectơ để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detectơ khác nhau [6]. 1.2.2.2. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng Mẫu phân tích trong kỹ thuật HPLC thường ở trạng thái lỏng, đa số các trường hợp không thể chuyển mẫu trong trạng thái nguyên thủy lên cột tách được. Phương pháp xử lý mẫu hay được áp dụng trong phân tích là chuyển mẫu về trạng thái lỏng. Phương pháp chiết lỏng- lỏng được áp dụng để xử lý mẫu cho sắc ký lỏng. Cơ sở chính của phương pháp này dựa vào cân bằng phân bố của chất tan trong hai hệ dung môi, hệ dung môi chiết và nền của chất mẫu. Yêu cầu chủ yếu là chọn được một dung môi chiết thích hợp để chiết chất phân tích cho hiệu suất thu hồi tốt và không ảnh hưởng cho quá trình chạy sắc ký sau này. Ví dụ theo thạc sĩ Nguyễn Đắc Kiên- Trường Đại học Nha Trang- Khoa nuôi trồng thủy sản, để phân tích độc tố aflatoxin B1 trong thức ăn nuôi trồng thủy sản, mẫu phân tích được cân từ 10- 20 gam cho vào bình nón dung tích 250ml. Chiết mẫu bằng 100ml clorofom (CHCl3), lắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút. Sau đó tiến hành lọc vào bình 250ml và cô quay cạn ở 40 0C. Hòa cặn bằng 10ml diclometan (CH2Cl2), sau đó mẫu phân tích mới được bơm vào cột tách.[5] Theo tiêu chuẩn xác định hàm lượng Histamin trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp HPLC dựa theo tiêu chuẩn NMKL số 99-1981(Nordic committee on food analysis No 99- 1981), mẫu được nghiền bằng máy nghiền đồng thể, cho vào bình tam giác 150ml, thêm 50ml etanol, lắc đều trong hai phút. Đặt bình chứa dung dịch mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 60 0C trong 15 phút, sau đó chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình tam giác bằng metanol. Để dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng rồi định mức tới vạch bằng metanol. Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc. Mẫu đã chiết được bơm vào cột tách [28]. 10 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  18. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 1.2.2.3. Các kết quả nghiên cứu về Rhodamine B bằng phƣơng pháp HPLC Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu để xác định rhodamine B. Tháng 2 năm 1989, Carcinogen và Pesticide Branch [13], phòng thí nghiệm hóa phân tích OSHA, thành phố Salt Lake, Utah, đã xác định rhodamine B bằng phương pháp HPLC, sử dụng detectơ huỳnh quang với các điều kiện như sau: Cột tách: hypersil ODS, 100mm x 2,1mm, 5m. Nhiệt độ: 400C Pha động: 85% axetonitrile, 15% nước với 0,005M axit 1- heptansunfonic, được điều chỉnh pH tới 3,5 bằng axit H3PO4. Tốc độ dòng: 0,2ml/phút Bước sóng: 556nm Vòng mẫu: 1,0l. Với các điều kiện như trên rhodamine B có trong mẫu đã được phát hiện ở 4,5 phút. Cũng trong năm 1989, R.W. Mason và L.R.Edwards [20] cũng đã tiến hành thí nghiệm phân tích rhodamine B ở trong huyết tương thỏ và người, sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu DR-3 sử dụng detector huỳnh quang với các điều kiện: Cột tách: Bondapak CN (25mm x 4,6mm) Pha động: axetonitril và nước (35: 65 hoặc 40: 60) chứa 0,1% axit octo- photphoric. Tốc độ dòng: 1,8ml/phút. Nhiệt độ cột: 18  20C Mẫu huyết tương: 0,5ml huyết tương được pha loãng trong 0,5ml dung dịch 0,05M kali đihidro photphat, pH= 5,5, được chiết trong 5ml etylaxetat. Kết quả phân tích: Rhodamine B được phát hiện ở 9,7 phút. Mẫu huyết tương đem phân tích có chứa từ 25 đến 50 ng/ml [25]. 11 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  19. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Tháng 6 năm 1996, L. Gagliardi, D. De Orsi, G. Multari, D. Tonelli [16] đã phân tích rhodamine B trong mỹ phẩm với các điều kiện phân tích được thực hiện như sau: Cột tách: C- 18 Pha động: Axetonitril và nước chứa 0,1M natri peclorat với tỷ lệ thành phần thay đổi từ 50: 50 đến 70: 30. Mẫu phân tích được pha trong metanol và nước với tỷ lệ 8: 2 Kết quả phân tích mẫu thực cho thấy dung dịch phân tích có chứa 0,3g/ml rhodamine B, píc xuất hiện ở 9,15 phút [16]. Ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang tác giả J.W.Hofstraat và cộng sự đã xác định rhodamine B trong nước bề mặt. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 pg/l [17]. Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương [1] đã tiến hành phân tích Rhodamine B trên các mẫu dược liệu. Các điều kiện sắc ký đã được thực hiện như sau: Cột tách: RP- C18 (5m, 4,6mm x 250mm) Pha động: 50% Axetonitril- 50% đệm kaliđihidrophotphat 20mM- trietylamin (100: 0,3), điều chỉnh pH tới 3,0 bằng axit photphoric. Tốc độ dòng: 1,4ml/phút Detector: UV-Vis Bước sóng: 525nm. Lượng tiêm: 20l. Kết quả phân tích cho thấy trong dược liệu có chứa Rhodamine B[1]. Tháng 4 năm 2011, Việt Nam đã có TCVN 8670-2011, xác định Rhodamine B bằng HPLC [10] trên cơ sở của viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã xây dựng và thực nghiệm cho một số loại thực phẩm có nhuộm màu. 12 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
  20. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 1.2.2. Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B Để xác định rhodamine B, người ta còn sử dụng phương pháp UV- Vis. Lấy mẫu chất đem hoà tan trong dung môi thích hợp, lắc, rung siêu âm và chiết lấy dung dịch. Đem dung dịch chiết được đo bằng máy UV- Vis, dựa vào cực đại hấp thụ ta có thể định tính và định lượng rhodamine B [11, 15]. 13 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

TL.01: Bộ Tiểu Luận Triết Học
207 tài liệu
1468 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2