Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG

CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT CÂY ME

(Tamarindus indica L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Văn Ngọc

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG

CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME

(Tamarindus indica L.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Mai Phương

Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Hồng Minh

Hà Nội - 2021

1

MỞ ĐẦU

Loãng xương đang là căn bệnh phổ biến toàn cầu. Loãng xương làm tăng tính dòn của xương dẫn đến dễ bị gãy, vì thế ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, cuộc sống của mỗi cá nhân và cả cộng đồng xã hội. Tổ chức y tế thế giới đang rất quan tâm và mong muốn cải thiện được tình trạng này, nhằm nâng cao sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của con người. Tỷ lệ người bị loãng xương đang ngày một tăng lên ở cả các nước phát triển và đang phát triển, đặc biệt là với những người có tuổi. Các số liệu thống kê cho thấy khoảng trên 200 triệu người trên toàn thế giới bị bệnh này và khoảng 2,8 triệu người Việt Nam đang mắc phải bệnh loãng xương.

Loãng xương xảy ra do sự mất cân bằng giữa sự mất xương và sự hình thành xương, trong đó sự hình thành xương xảy ra chậm hơn sự mất xương. Vì vậy, các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chất có hoạt tính làm tăng sự hình thành xương hoặc làm giảm sự mất xương để điều trị loãng xương đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm. Phần lớn các thuốc trên thị trường là các tác nhân làm giảm sự mất xương. Trong khi đó, chỉ có rất ít chất có khả năng cảm ứng làm tăng sự tạo xương. Thêm vào đó, việc sử dụng các thuốc hóa học hiện nay để xử lý loãng xương có một số hạn chế về hiệu quả cũng như gây phản ứng phụ khi sử dụng lâu dài. Do đó, việc phát hiện và sử dụng những chất tự nhiên có khả năng cảm ứng tái tạo xương mới, ít gây phản ứng phụ để xử lý bệnh loãng xương và duy trì độ bền của xương là hướng nghiên cứu mới, có nhiều tiềm năng ứng dụng để điều trị bệnh loãng xương cũng như các bệnh liên quan khác.

Theo thống kê của Viện Dược liệu thì nước ta có khoảng 4000 loài thực vật được dùng làm thuốc ở các mức độ khác nhau. Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam rất phong phú, có thể sử dụng như nguồn nguyên liệu tiềm năng trong các nghiên cứu sàng lọc nhằm tìm ra những hợp chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất có tác dụng cảm ứng tái tạo xương mới và hiệu quả.

2

Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới ở trên 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam. Polysaccharide từ hạt me (TSP) có nhiều hoạt tính sinh học quý và được ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. TSP có khả năng chống oxy hóa, hạ cholesterol, giảm khả năng xơ vữa thành mạch máu. TSP cũng có thể sử dụng như là một chất làm đặc và ổn định, làm tác nhân gel hóa, làm chất làm ổn định nước đá tinh thể và thay thế tinh bột vì nó có tính chất tương tự như tinh bột nhưng ổn định hơn. TSP đã được thử nghiệm có hiệu quả trong điều trị bệnh về tiêu hóa và được sử dụng làm chất mang thuốc chữa bệnh đại tràng. Liên quan đến hướng nghiên cứu về tác dụng lên bảo vệ xương, các hợp chất tách chiết từ hạt me cũng đã được chứng minh là có tác dụng tích cực đối với một số bệnh xương khớp. Ngoài ra, các hợp chất polysaccharide tự nhiên từ quả me cũng đang được nghiên cứu theo hướng tạo vật liệu sinh học scaffold ứng dụng trong y dược. Mặc dù các công trình công bố đã chứng tỏ TSP và các dẫn xuất của nó có nhiều hoạt tính sinh học quý, có khả năng ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của TSP và các dẫn xuất của nó đối với quá trình biệt hóa tế bào tạo xương vẫn còn thiếu vắng. Cho đến nay, chưa có công trình nào

nghiên cứu một cách toàn diện và đầy đủ ảnh hưởng của TSP và các dẫn xuất của nó, đặc biệt là dẫn suất sulphate, đến quá trình tái tạo xương (TTX).

Xuất phát từ những tồn tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, cũng như để góp phần khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình

thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.)” nhằm đánh giá đầy đủ tác dụng cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất TSP tiềm năng trên mô hình in vitro.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÃNG XƯƠNG

1.1.1. Lịch sử, định nghĩa, và phân loại loãng xương

1.1.1.1. Lịch sử bệnh loãng xương

Loãng xương được xác định xuất hiện từ thời Ai Cập cổ đại năm 990 – TCN khi tìm thấy các xác ướp có bướu ở người hạ cấp. Thế kỷ 18, bác sĩ phẫu thuật người Anh John Hunter đã phát hiện ra rằng khi xương mới được đặt trong cơ thể, xương cũ sẽ bị phân hủy hoặc được tái hấp thụ. Quá trình phân hủy hay tái hấp thu này được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong bệnh loãng xương.

Bình thường

Loãng xương

Năm 1830, nhà nghiên cứu bệnh học người Pháp Jean Lobstein nhận thấy rằng xương của một số bệnh nhân bị thủng lỗ lớn hơn thông thường và ông đã đặt ra thuật ngữ loãng xương (xương xốp) để mô tả sự thay đổi của xương người.

Hình 1.1. Cấu trúc mô xương người bình thường so với người loãng xương [1]

4

Mặc dù có lịch sử lâu đời nhưng định nghĩa bệnh loãng xương mới chỉ được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO) chính thức đưa ra vào năm 1991 tại Thụy Sĩ và tiếp tục hoàn thiện cập nhật vào năm 2001[1]. Loãng xương được định nghĩa là một tình trạng rối loạn chuyển hóa của bộ xương làm giảm sức mạnh của xương dẫn đến làm tăng nguy cơ gãy xương. Sức mạnh của xương được phản ánh thông qua hai yếu tố: khối lượng xương và chất lượng xương [2]. Đo mật độ xương sẽ cho ta biết lượng chất khoáng trong 1 đơn vị diện tích hoặc thể tích của xương. Còn chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, tốc độ chuyển hóa của xương, độ khoáng hóa, mức độ tổn thương tích lũy, tính chất của các chất cơ bản của xương.

1.1.1.2. Phân loại bệnh loãng xương

Dựa vào các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển hóa xương, loãng xương có thể được phân thành hai nhóm chính là loãng xương nguyên phát (type 1 và type 2) do tuổi tác hoặc tình trạng mãn kinh và loãng xương thứ phát do một số bệnh mạn tính hoặc liên quan đến sử dụng một số loại thuốc…

1.1.2. Cơ chế và các phương pháp điều trị bệnh loãng xương

1.1.2.1. Cơ chế

Loãng xương xuất phát từ sự mất cân đối giữa hai hoạt động tạo xương và hủy xương mà cụ thể là lượng xương bị đào thải nhiều hơn lượng xương mới thay.

Ở cấp độ phân tử, mô xương được cấu thành từ tế bào tạo xương (osteoblast), tế bào hủy xương (osteoclast) và nhóm một số tế bào khác. Những tế bào này tương tác với một số chất khoáng, protein, hormone và các phân tử khác để nuôi dưỡng xương, liên tục đục bỏ xương cũ thay bằng xương mới. Tế bào tạo xương (osteoblast) có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell – MSC) có tác động thay đổi đến cấu trúc xương, tạo những lớp xương góp phần tạo lực của xương. Những tế bào này khi đặt trong điều kiện thích hợp có thể chuyển hóa thành tế bào xương nhưng trong

5

điều kiện khác chúng cũng có thể trở thành tế bào cơ, mỡ hoặc sụn. Tế bào hủy xương (osteoclast) là những tế bào xuất phát từ tế bào tạo máu có chức năng đục bỏ xương cũ hay xương bị tổn hại qua một quá trình phân hủy chất khoáng. Trong điều kiện bình thương, chức năng của tế bào hủy xương và tế bào tạo xương hoạt động mức độ tương đương nhau và tín hiệu của loại tế bào này ảnh hưởng đến loại tế bào kia.

Trong cơ thể con người, mô xương được cấu thành từ trong bụng mẹ và được làm mới duy trì sự phát triển qua hai quá trình là modelling và remodelling. Hai quá trình này xảy ra với những cơ chế riêng biệt để biệt hóa các nhóm tế bào xương, giúp đạt được sự tạo thành xương hoặc làm mới xương. Hai quá trình này, phối hợp nhau trong quá trình phát triển xương để định dạng xương thích hợp, duy trì nồng độ huyết thanh của các ion và sửa chữa các vùng cấu trúc xương bị tổn thương.

Hình 1.2. Quá trình remodel [3]

6

Quá trình remodel là quá trình chu chuyển xương từ lúc còn nhỏ đến trước khi trưởng thành (18-20 tuổi). Chức năng của quá trình là hoàn chỉnh khối xương làm cho xương thay đổi kích thước hình dạng và tăng trưởng. Trong quá trình này, hai hoạt động tạo và hủy xương xảy ra một cách độc lập tại một vị trí, hoạt động tạo xương diễn ra mạnh hơn hủy xương. Quá trình remodel là quá trình diễn ra liên tục, suốt đời, nhưng tốc độ xảy ra giảm dần theo tuổi tác. Chức năng của quá trình là duy trì mật độ xương, phân hủy những mảng xương cũ hay xương bị tổn hại và thay thế bằng những mảng xương mới. Remodel là quá trình rất cần thiết để duy trì lực của xương. Quá trình này luôn xảy ra theo trình tự gồm: hoạt hóa (activation), hủy xương (resorption), trung gian (reversal), hình thành xương (bone formation) và khoáng hóa (mineralization).

Quá trình remodel được bắt đầu khi các tế bào hủy xương (osteoclast) được biệt hóa và hoạt động để loại bỏ xương già, xương hỏng bằng cách hấp thu các chất khoáng để lại những lỗ hổng trên bề mặt xương. Tế bào đơn nhân (monocuclear cells) thu dọn các mảnh vụn được thải ra trong hoạt động hủy xương và chuẩn bị bề mặt đã được phục hồi trước khi tế bào tạo xương (osteoblast) sửa chữa xương bị tổn hại. Tiếp theo, tế bào tạo xương tổng hợp các thành phần hữu cơ và vô cơ của xương, thay thế phần xương đã bị hấp thụ thông qua quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation). Sự khoáng hóa xương (mineralization) và sự biệt hóa của một số tế bào tạo xương thành tế bào xương (osteocytes) là giai đoạn cuối để hoàn thành quá trình tái mô hình [4].

Trong quá trình remodel, hai hoạt động tạo và hủy xương diễn ra trên bề mặt xương với tốc độ 2-10% xương hằng năm. Trước khi bước vào giai đoạn trưởng thành hoạt động tạo xương diễn ra tương đương hoạt động hủy xương, do đó mật độ xương đạt mức độ cao ở độ tuổi 20-30. Sau khi đạt mức tối đa, xương bắt đầu suy giảm với tốc độ khác nhau theo độ tuổi. Sau thời kỳ mãn kinh vài năm ở nữ và sau 50 tuổi ở nam, hoạt động hủy xương lấn át hoạt động tạo xương, tỷ lệ hủy xương và tạo xương mất cân bằng mà cụ thể là sự hình thành xương ít hơn sự hấp thụ xương, sẽ gây mất cân bằng nội mô xương

7

và dẫn đến tình trạng cơ thể bắt đầu mất xương, mật độ xương, trọng lượng và độ cứng của xương giảm dẫn đến tình trạng loãng xương.

Trong quá trình remodel, một số protein và các nhân tố như osterix (OSX), COX2 và Runx2 tham gia vào quá trình làm tăng sự biểu hiện của alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (OPN) và osteocalcin (OSC). Đây là những nhân tố quyết định sự tạo ra tế bào xương trưởng thành (mature osteoblast) (Hình 1.3).

Tế bào gốc trung mô từ tủy xương (MSC) đến thời điểm này đã được chứng minh là dòng tế bào gốc đa năng, với khả năng biệt hóa giới hạn trong các dòng tế bào thuộc lớp trung mô như tế bào xương, sụn, và mỡ. Tuy nhiên, một số thí nghiệm khác cũng cho thấy rằng dòng tế bào gốc này cũng có khả năng biệt hóa thành tế bào gan, tế bào tim, tế bào thần kinh nhưng quá trình biệt hóa rất nhiều giai đoạn và có tỉ lệ thành công thấp.

Hình 1.3. Sơ đồ quá trình phát triển biệt hóa tế bào gốc (MSC) thành tế bào

tạo xương [5]

8

Quá trình biệt hóa tế bào xương trưởng thành từ tế bào gốc MSC trải qua 4 giai đoạn được chỉ ra trong hình 1.3. Bắt đầu của quá trình là từ tế bào gốc ở tủy – MSC (1), trải qua giai đoạn tăng sinh - proliferation (2) để trở thành tiền tế bào xương – pre-osteoblast (3) và qua giai đoạn khoáng hóa (mineralization) để trở thành tế bào xương trưởng thành – mature osteoblast (4) [2].

1.1.2.2. Các phương pháp điều trị loãng xương

Kiểm soát loãng xương có thể không dùng thuốc bao gồm việc cung cấp đủ canxi và vitamin D, tập thể dục tăng cân, cai thuốc lá, hạn chế uống rượu / caffein và các kỹ thuật phòng ngừa bị ngã.

Trong trường hợp phải điều trị loãng xương dùng thuốc thì định hướng

hiên nay tập trung vào hai hướng là:

 Ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hủy xương (osteoclast)

 Làm gia tăng các nhân tố tái tạo xương (TTX) thông qua biệt hóa các tế

bào tạo xương (osteoblast differntiation).

Hiệu quả điều trị của thuốc phụ thuộc vào tuổi tác, giới tính và sức khỏe của bệnh nhân. Các chất ức chế đang được sử dụng là bisphosphonates, chất chủ vận/ đối kháng estrogen [EAAs], estrogen, calcitonin và denosumab). Bisphosphonates vẫn là lựa chọn điều trị hàng đầu và tiết kiệm chi phí nhất cho bệnh loãng xương, nhưng ngày càng có nhiều lo ngại về tính an toàn lâu dài của chúng. Tuy nhiên, không phải tất cả các loại thuốc điều trị loãng xương đều được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) chấp thuận để điều trị loãng xương. Thuốc điều trị đầu tay cho hầu hết bệnh nhân có nguy cơ gãy xương cao bao gồm alendronate, risedronate, zoledronic acid và denosumab. Đối với những người không thể sử dụng liệu pháp uống và có nguy cơ gãy xương cao, nên sử dụng teriparatide, denosumab hoặc axit zoledronic. Đối với nam giới bị loãng xương, điều trị đầu tay là dung thuốc bisphosphonates [6].

9

Hầu hết những liệu pháp điều trị loãng xương hiện nay tập trung vào giải pháp làm giảm sự mất xương nhưng không khôi phục lại được khối lượng xương đã bị mất và độ cứng của xương, liệu pháp làm gia tăng TTX còn ít được đề cập đến [6]. Vì vậy, hướng nghiên cứu và ứng dụng những nhân tố (factor) kích thích TTX để phục hồi một phần khối lượng xương đã bị mất, sửa chữa sự mất cân bằng các đặc điểm vi cấu trúc xương xốp do loãng xương nhờ đó làm tăng độ cứng của xương và kết hợp giữa các nhân tố kìm hãm sự mất xương với kích thích TTX đang là hướng nghiên cứu mới và đầy triển vọng cho điều trị loãng xương.

Sử dụng các chất có khả năng cảm ứng TTX, người ta có thể tạo vật liệu sinh học mới ở dạng “giá đỡ” ba chiều (3D scaffold) có khả năng điều trị bệnh [6]. Vật liệu này là một khuôn ngoại bào nhân tạo với nhiều lỗ xốp và có khả năng phân hủy sinh học, bao gồm các tế bào nuôi cấy, các phân tử tín hiệu (các nhân tố tăng trưởng hay chất TTX) và khuôn 3D. Các tế bào và phân tử tín hiệu sẽ được cấy vào khuôn 3D scaffold và sau đó được đưa vào vùng xương cần ghép để cảm ứng sự tăng trưởng và sản sinh xương mới. Sau khi scaffold được đưa vào cơ thể, tế bào sẽ bám dính, phân chia, biệt hóa, di chuyển vào các lỗ scaffold, đồng thời tiết ra các thành phần nền ngoại bào cần thiết để tạo mô và tổ chức hình thành mô khỏe mạnh bình thường [7].

1.1.3. Tình hình nghiên cứu loãng xương trên thế giới và ở Việt

Nam

1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trong các nghiên cứu đã được công bố, hợp chất berberine được nghiên cứu khá nhiều và đã được chứng minh là có thể làm giảm loãng xương bằng cách ức chế hoạt tính của tế bào hấp thụ xương osteoclast và kích thích biệt hóa tế bào tạo xương osteoblast. Li và cs., [8] đã chứng minh rằng berberine làm ngăn chặn sự suy giảm mật độ khoáng hóa xương in vivo và in vitro bằng cách ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hấp thụ xương osteoclast. Ngoài ra, berberine còn cảm ứng sự chết tế bào hấp thụ xương osteoclast theo con đường apoptosis. Nhóm nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh rằng berberine có thể ngăn chặn sự mất xương ở những người bị loãng xương do

10

sự già hóa [9]. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của berberine đến quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation), Lee và cs., [10] đã cho thấy berberine làm tăng sự hình thành xương (bone formation) thông qua việc hoạt hóa nhân tố phiên mã chính trong quá trình tạo xương (Runx2) bởi protein p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), từ đó chứng minh berberine có thể là nhân tố tiềm năng để điều trị các rối loạn liên quan đến bao gồm loãng xương, xương. Nghiên cứu của Han và cs., [11] đã chỉ ra hợp chất dẫn xuất của berberine (berberine bioisostere Q8) có thể cảm ứng biệt hóa tế bào tạo xương in vitro.

Trong một nghiên cứu khác với hợp chất từ quả me, Sundaram và cs., [12] đã chứng tỏ hiệu quả chống viêm khớp của dịch chiết hạt me (tamarind seed extract- TSE). TSE đóng vai trò là một nhân tố ức chế sự thoái hóa sụn, phân hủy xương và kháng viêm. Nghiên cứu của Sanyasi và cs., [13] đã mô tả và xác định một hydrogel mới đóng vai trò là một vật liệu cho kỹ nghệ mô xương (bone tissue engineering), trong đó carboxyl methyl tamarind polysaccharide là một polymer bán tổng hợp từ quả me. Nhóm tác giả chứng minh rằng vật liệu này là thích hợp cho sự bám dính, sự sinh trưởng một cách hiệu quả các tế bào tiền tạo xương (bone precursor cells). Gần đây, nhóm nghiên cứu này đã tìm ra một vật liệu mới được tổng hợp từ polysaccharide tự nhiên có nguồn gốc từ bột quả me được gắn với acrylic acid (AA) là TKP – AA có tiềm năng sử dụng như là vật liệu sinh học scaffold và cho kỹ nghệ mô xương với giá thành thấp.

Lĩnh vực thiết kế chế tạo vật liệu sinh học scaffold sử dụng kỹ thuật in 3D (3D printing) đã được sử dụng nhiều trên thế giới. Kỹ thuật in 3D đã được sử dụng rộng rãi cho việc chế tạo "giá đỡ" ứng dụng trong y học và tái tạo mô hay kỹ nghệ mô tế bào (TE). TE là một công nghệ đầy triển vọng cho việc gia tăng tái tạo và sửa chữa những sai sót của mô bởi sự tương tác giữa tế bào, “giá đỡ” (scaffold) và tương thích những nhân tố tăng trưởng trên bề mặt “giá đỡ”. Những đặc điểm này giúp cho vật liệu nhân tạo tương tự như mô tự nhiên. Do đó, tế bào dễ dàng bám dính và tăng sinh trên vật liệu 3D.

11

Nguyên lý chung cho việc chế tạo vật liệu 3D scaffold để điều trị bệnh về xương là tạo vật liệu giá đỡ 3D (chất nền) mang các yếu tố bổ sung để giúp cho tế bào xương có thể phát triển và biệt hóa. Sau đó, chất tự nhiên có hoạt tính cảm ứng TTX được gắn trên chất nền sẽ cảm ứng tế bào xương, kích thích quá trình biệt hóa tế bào, hình thành xương mới. Tuy nhiên, nhiều vật liệu giá đỡ 3D không có khả năng tự hủy trong cơ thể sau khi đã hình thành tế bào xương mới do đó bệnh nhân cần phải thực hiện lại phẫu thuật nhằm đem vật liệu đó ra khỏi cơ thể. Các nghiên cứu theo hướng này đang được tiến hành mạnh mẽ nhằm khắc phục nhược điểm này bằng cách sử dụng chất nền sinh học và hướng tới ứng dụng điều trị

Hàng loạt các nghiên cứu trên các đối tượng thực vật khác nhau đã cho thấy triển vọng của việc phát hiện các chất tự nhiên có hoạt tính TTX từ thực vật [14,15,16]. Tuy nhiên, các nghiên cứu theo hướng này còn chưa nhiều và còn thiếu vắng các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng ở mức phân tử cũng như những đánh giá đầy đủ trên mô hình in vivo nhằm mục đích ứng dụng trong điều trị hay tạo vật liệu cho TE.

1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú, chứa đựng kho tàng vô giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học và dược lý. Rất nhiều loài thực vật được sử dụng như là nguồn dược liệu quí trong nhân dân để chữa trị bệnh với tính an toàn và hiệu quả cao, trong đó có những loại cây được sử dụng lâu đời để điều trị các bệnh về xương khớp như Mimosa pudica L., Solanum procumbens, Piper lolot. Đây chính là nguồn nguyên liệu phong phú và tiềm năng để cung cấp các chất có hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương.

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính cảm ứng TTX tiềm năng, có thể ứng dụng và ít tác dụng phụ cho điều trị loãng xương và các bệnh xương khớp đang là vấn đề còn mới mẻ và cũng nhận được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Hướng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có khả năng ứng dụng trong điều trị loãng xương mới chỉ được thực hiện trên mô hình in vivo. Trong khi đó, các nghiên cứu trên mô hình in vitro còn rất hạn chế. Nhóm nghiên cứu của trường Đại học Tôn Đức Thắng đã tiến hành

12

khảo sát tác dụng của cao xương cá sấu hoa cà trên mô học xương đùi chuột nhắt trắng bị gây loãng xương cảm ứng bởi prednison (corticoid). Chuột thí nghiệm bị loãng xương sau đó được điều trị bằng alendronat (5 mg/kg) hay cao xương cá sấu hoa cà ở cả hai liều uống 1.89 g/kg và 3.77 g/kg trong 4 tuần. Kết quả cho thấy, việc sử dụng cao xương cá sấu hoa cà có tác dụng làm giảm thiểu các khuyết hỏng do prednison gây ra trong cấu trúc xương, làm tăng sự hiện diện của các tế bào xương (cốt bào, hay osteocyte cells) ở khu vực bị loãng xương, phục hồi lại sự hiện diện của các nguyên bào xương (tế bào tạo xương, hay osteoblast cells) tại những vị trí mà xương bị thiếu hụt. Điều này chứng tỏ quá trình khôi phục xương đang diễn ra để lặp lại sự cần bằng trong quá trình tái cấu trúc xương [16]. Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa đi sâu tìm hiểu cơ chế và đường hướng phân tử của cao xương cá sấu hoa cà đối với sự TTX. Có thể thấy, phần lớn các nghiên cứu hiện nay sử dụng mô hình gây loãng xương in vivo trên chuột do phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam so với các mô hình in vivo trên các động vật khác trên thế giới. Tuy nhiên, việc sử dụng mô hình in vivo trên chuột cũng còn nhiều hạn chế trong các nghiên cứu sàng lọc cũng như nghiên cứu cơ chế phân tử.

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Tô Thanh Thúy, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội lại tập trung theo hướng phát triển, chuyển hóa xương trên mô hình cá medaka và zebrafish và sàng lọc các thuốc và hợp chất tự nhiên có tác dụng đến chuyển hóa xương và chống loãng xương [17,18]. Nhóm nghiên cứu sử dụng mô hình cá chuyển gen rankl:HSE:CFP mang cấu trúc gen chuyển bao gồm một promoter cảm ứng nhiệt điều khiển hai chiều đồng thời gen rankl (receptor activator of niclear factor kappa-β ligand) và gen mã hóa cho protein chỉ thị huỳnh quang CFP (complement factor properdin) để sàng lọc các hoạt chất chống loãng xương. Ấu trùng cá này khi bị sốc nhiệt sẽ biểu hiện Rankl ngoại sinh làm tế bào hấp thụ xương hình thành và hoạt động, gây ra sự phá hủy mô xương đang được khoáng hóa tạo ra kiểu hình giống loãng xương ở giai đoạn phát triển rất sớm. Trong một nghiên cứu gần đây, ấu trùng cá medaka chuyển gen mô phỏng bệnh loãng xương được điều trị bằng hai loại thuốc là etidronate và alendronate (hai loại biphosphonates thông dụng để điều trị bệnh loãng xương trên người). Sử dụng

13

các kỹ thuật hình ảnh, các kết quả cho thấy tác dụng ức chế hoạt tính của tế bào hấp thụ xương một cách có hiệu quả và phụ thuộc nồng độ, làm duy trì và phục hồi độ toàn vẹn xương. Nhóm tác giả đã kết luận mô hình cá medaka là phù hợp để nghiên cứu sàng lọc thuốc chống loãng xương in vivo [18]. Tuy vậy, cơ chế phân tử của thuốc cần sàng lọc (chất cần nghiên cứu) đối với bệnh loãng xương vẫn chưa được thực hiện trên mô hình cá này. Như vậy, có thể thấy rằng các nghiên cứu trong nước đối với các chất có khả năng TTX, đặc biệt là trên các chất tự nhiên còn rất hạn chế và chưa được đầu tư nghiên cứu chuyên sâu.

Với tamarind seed polysaccharide (TSP) và dẫn suất dạng sulfate của nó (TSPS), nhóm nghiên cứu của Bùi Ngọc Tân và cs., [19, 20] đã nghiên cứu chiết tách và bước đầu xác định thành phần hóa học của TSP từ quả me. Sau đó, nhóm nghiên cứu này cũng đã tổng hợp dẫn suất TSPS và đánh giá một số hoạt tính sinh học của dẫn suất thu được. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu về

các hoạt tính sinh học, đặc biệt là hoạt tính cảm ứng TTX của các dẫn suất sulfate này vẫn chưa được thực hiện.

1.2 TỔNG QUAN VỀ POLYSACCHARIDE TỪ QUẢ ME

1.2.1 Giới thiệu về cây me

Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới ở trên 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam. Cây me được sử dụng như một loại thảo dược tại nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ và Châu Phi [21].

14

Hình 1.4. Cây me (Tamarindus indica L.)

Các bộ phận của cây me được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau trong lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm. Cây me cao 15 đến 30 m, tán cây rộng, nhiều lá. Lá cây me có dạng kép lông chim chẵn, dài từ 8 cm đến 10 cm, gồm 10 đến 20 đôi lá chét thuôn không cân xứng, chóp lõm, dài 20 mm, rộng 2mm. Hoa trắng nhạt có những vệt đỏ hay trắng, mọc thành chùm đơn ở kẽ lá hay thành chùy tận cùng. Quả dài mọc thõng xuống, hơi dẹt, dài 7-12 cm, rộng 25 mm, dày 10 mm. Vỏ quả ngoài mỏng, cứng, giòn, màu hung đỏ, vỏ quả giữa có xơ, vị chua, sau khi loại hết xơ, thịt thì phần hạt ở giữa có màu nâu nhạt hay vàng nhạt. Quả chứa 3-5 hạt dẹt, nhẵn màu nâu đỏ, bóng. Mùa quả vào tháng 10-11.

Các bộ phận của cây me như quả, hạt, lá, hoa và vỏ cây me đều được sử dụng với mục đích hóa học thực vật và dược phẩm. Lá và hoa me có thể được sử dụng như một loại rau trong bữa ăn truyền thống của nhiều dân tộc.

Đặc biệt, quả me và hạt me đã được nhiều tác giả nghiên cứu về thành phần và tác dụng trong hóa học thực vật và dược phẩm. Trong quả me có chứa chủ yếu hơn 10% acid hữu cơ (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric, 0,45% acid malic), kali bitactrat 3,25%, đường 12,5%, gồm 4,70%, pectin 6,25%. Ngoài ra còn có 34,35% xơ, nước 27,55%. Trong hạt có glucose, xylan, protein, chất béo, muối vô cơ. Trong đời sống quả me được sử dụng theo mùa vụ, như làm thực phẩm, tạo hương vị, gia vị trong món cà ri, súp và

15

cũng là thành phần chính trong một số loại nước ép và đồ uống. Người ta có thể dùng quả me để ăn trực tiếp hoặc thêm vào trong đồ uống và cũng có thể chế biến thành mứt, kẹo. Nước quả me là loại đồ uống bổ dưỡng, được nhiều nước trên thế giới sử dụng và có nhiều cách thức chế biến khác nhau. Tại một số quốc gia châu Phi, nước quả me được trộn với tro gỗ để trung hòa vị chua của acid tartaric. Tuy nhiên phương pháp phổ biến nhất là thêm đường để tạo vị ngọt cho đồ uống. Phần lớn sản phẩm đồ uống có nước me được sản xuất thương mại. Đôi khi nước quả me được cho vào trong đồ uống có cồn [22].

Trong y học, theo đông y quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng. Vỏ cây me có vị chát, có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa (kiết lỵ, ỉa chảy..) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi [21].

Lá me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngoài da, lá me thường được dùng để nấu nước tắm cho trẻ em đề phòng bệnh ngoài da vào mùa hè. Thịt me, lá và hoa được kết hợp với nhau trong nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các khớp bị đau. Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me còn có tác dụng như: Quả me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ mang thai, điều trị nôn mửa, đầy hơi và khó tiêu; chữa cảm lạnh. Hạt me có tác dụng tẩy giun, lá me có tác dụng chữa rôm sảy, mẩn ngứa, vỏ cây me có tác dụng chữa táo, phòng và chữa viêm lợi, viêm nha chu. Hạt me rang được coi là một loại gia vị đặc biệt trong thực phẩm [21].

Theo y học phương Tây, quả me được sử dụng như một phương thuốc lợi tiểu điều trị chứng rối loạn mật, vàng da và tiêu chảy, giúp hệ thần kinh hoạt động tốt (hàm lượng thiamin 29%), thiamin là một loại vitamin B có vai trò quan trọng trong các hoạt động của dây thần kinh và cơ bắp. Me là một nguồn cung cấp vi chất cho cơ thể như Mg2+, Ca2+. Quả me là một trong những nguồn cung cấp chất xơ cao nhất trong các loại trái cây, giúp ngăn ngừa táo bón (hàm lượng chất xơ 20%). Chất xơ có tác dụng điều hòa nhu động ruột và được coi như một loại thuốc nhuận tràng tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Quả me có thành phần kali cao gấp hai lần lượng kali trong chuối. Do đó, quả me có tác dụng kiểm soát huyết áp tốt không kém gì chuối.

16

Nước me giúp ổn định huyết áp bằng cách kiểm soát các tác động của natri trong cơ thể, tránh để tình trạng lượng natri tăng cao làm cho huyết áp tăng [22].

Quả me cũng được biết đến như một loại thuốc chữa bệnh thiếu máu (hàm lượng sắt 2,8%). Vì vậy, đây cũng là loại trái cây rất tốt cho phụ nữ mang thai. Giúp kiểm soát mức cholesterol (hàm lượng niacin 1,2%). Me chứa khá nhiều chất niacin, một loại vitamin B rất quan trọng với sức khỏe. Chất này có thể giúp giảm cholesterol xấu và tăng lượng cholesterol tốt trong cơ thể. Thành phần của me bao gồm chất riboflavin sẽ giúp chuyển hóa carbohydrate trong cơ thể thành năng lượng cho nên có thể cung cấp năng lượng mà không gây béo (hàm lượng riboflavin 9%). Quả me có tác dụng hỗ trợ cơ chế đông máu (hàm lượng calcium 7%). Quả me là một trong những loại trái cây giàu canxi. Canxi (với sự giúp đỡ của vitamin K) đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình đông máu. Vì vậy, quả me được coi là loại quả có tác dụng ổn định cơ chế đông máu. Quả me cũng có tác dụng giảm sốt và bảo vệ chống lại cảm lạnh (dùng thịt quả me đun với nước dùng để uống). Quả me giúp cơ thể tiêu hóa thức ăn, vỏ của hạt me là một phương thuốc hiệu quả chống tiêu chảy và bệnh lỵ. Mặc dù đã có nhiều tác giả đã công bố về các ứng dụng đa dạng của cây me và được đưa vào sử dụng trong cuộc sống. Tuy nhiên cây me vẫn còn có rất nhiều tiềm năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá trị của cây me đặc biệt là trong lĩnh vực dinh dưỡng và dược phẩm [22].

1.2.2. Cấu trúc hóa học của TSP

Theo Joseph và cs. [22] polysaccharide phân lập được từ quả me thuộc

lớp chất xyloglucan, có liên kết -(1-4)-D-glucoside là mạch chính, tại vị trí

C6 là liên kết với -D-xylopyranose và liên kết với -D-galactopyranose-(1-

2)--Dxylopyranose. Chuỗi này đƣợc lập lại nhiều đơn vị theo dạng XXXG,

bao gồm ba nhóm đơn vị bị xylosyl hóa glucopyranose (X) và được phân cách bằng một glucopyranose (G), và có thể một vài nhóm xylose được liên kết với galactopyranose (L) theo Hình 1.5.

17

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học xyloglucan của

tamarind seed polysaccharide (TSP)

Gần đây, cấu trúc của TSP được mô tả có dạng heptasaccharide (Glc4Xyl3, theo kiểu XXXG), octasaccharide (Glc4Xyl3Gal, theo kiểu XXLG), và monosaccharide (Glc4Xyl3Gal2, theo kiểu XLLG) đã được đề cập.

Nhiều tính chất của xyloglucan (khả năng tạo gel, độ tan…) phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, một số polysaccharide có trọng lượng phân tử nhỏ đều có các hoạt tính sinh học quý giá và được sử dụng trong y học.

TSP chiết trong nước có dạng gel và kết tủa trong dung môi hữu cơ, TSP có trọng lượng phân tử từ 700–2500 kDa. TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me phụ thuộc vào nguồn gốc. TSP được sử dụng để kiểm soát liều lượng thuốc và không gây bất kỳ phản ứng phụ nào, có thể tạo khuôn với natri alginate để làm bao cho viên thuốc. Người ta đã tạo dẫn chất sulfate hóa và cetyl hóa của polysaccharide để làm tăng khả năng chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định. Gần đây, TSP đã được xác định là chất không gây ung thư, là chất kết dính có nguồn gốc tự nhiên, và là chất mang có khả năng giữ thuốc cao [22].

18

1.2.3. Phân lập TSP từ hạt me

TSP có thể được phân lập bằng các kỹ thuật khác nhau thông qua phương pháp hóa học, phương pháp enzyme sử dụng protease và kết hợp của protease với siêu âm cường độ cao. Trong phương pháp hóa học, bột hạt ngâm nước được đun sôi trong nước. Sau đó, chất nhầy được lọc và thêm vào một lượng acetone bằng nhau để kết tủa polysaccharide, sau đó được cô đặc và sấy khô. Trong phương pháp enzyme, bột nhân trộn với ethanol được xử lý bằng protease. Sau đó, dung dịch được ly tâm và phần nổi phía trên được thêm vào ethanol để kết tủa, sau đó được tách ra và làm khô. Độ tinh khiết của TSP có thể được xác định bởi sự vắng mặt của protein. TSP có thể biến tính tạo thành kết tủa không hòa tan, do đó làm cho việc tách TSP trở nên khó khăn hơn. Vì thế, loại bỏ các protein là mục tiêu chính trong tất cả các các phương pháp phân lập TSP [22].

1.2.4. Ứng dụng của polysaccharide từ quả me

Polysaccharide chiết xuất từ hạt me đã được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, có thể ứng dụng trong dược phẩm. Ví dụ, hoạt tính kháng u và kích thích miễn dịch của polysaccharide PST001 được phân lập từ hạt me (T. indica) đã được Aravind và cs., công bố [23]. Kết quả thu được đã chỉ ra rằng PST001 ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Hơn nữa, độc tính của PST001, khả năng làm giảm khối u và điều hòa miễn dịch cũng được đánh giá trong các nghiên cứu in vivo. Các tác giả đã cho thấy PST001 làm giảm đáng kể khối u và cải thiện mạnh mẽ hoạt động điều hòa miễn dịch [23]. Hơn nữa, TSP này cũng đã được đánh giá các đặc tính hóa học, bao gồm độ ẩm, độ tro, pH, hàm lượng khoáng chất, khả năng giữ nước, tính chất vi lượng, hàm lượng đường tổng số, hàm lượng sulphate, protein và axit uronic [23]. Ngoài ra, gần đây TSP này cũng được đánh giá về ảnh hưởng của nó lên quá trình tiêu hóa và lên men in vitro, ảnh hưởng đến thành phần hệ vi sinh vật đường ruột [24].

Do TSP là một polymerđa chức năng, có nhiều đặc tính lý hóa đặc biệt như đóng vai trò của chất ổn định, chất làm đặc, chất kết dính, chất làm chậm giải phóng, chất điều chỉnh chất tạo huyền phù, chất tăng độ nhớt, chất tạo

19

nhũ, như một chất mang trong vận chuyển thuốc mới để uống, uống, ruột kết, hệ thống mắt, chế tạo nano, băng vết thương, thực phẩm, mỹ phẩm, bánh kẹo, bánh, v.v. TSP được sử dụng khá rộng rãi trong các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm.

Trong công nghiệp thực phẩm, TSP từ hạt me có thể có các ứng dụng như là chất làm đặc và chất ổn định, tác nhân gel hóa, chất làm ổn định nước đá tinh thể và thay thế tinh bột vì tính chất của nó tương tự như tinh bột nhưng ổn định hơn [22].

Trong y học, TSP được thử nghiệm trong nhãn khoa và có hiệu quả trong việc thử nghiệm áp lực nội nhãn của sản phẩm nhỏ mắt và đã được thử nghiệm trên thỏ. TSP đã được thử nghiệm có hiệu quả trong điều trị bệnh về tiêu hóa và được sử dụng là chất mang của thuốc chữa bệnh đại tràng [22].

Các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu tạo dung dịch polysaccharide với tỷ lệ dung môi khác nhau. Nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của TSP. Một số polysaccharide có tác dụng tốt trong nhãn khoa. Gần đây các nghiên cứu đã khẳng định TSP chiết từ hạt me có khả năng ổn định huyết áp và lipid máu. TSP đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên bệnh nhân cao huyết áp. Ngoài ra, TSP còn làm tăng cường khả năng chống viêm và làm thuốc giảm đau. Dịch gel của TSP đã đựợc thử nghiệm in vitro trong việc chống lại hiện tượng đục thủy tinh thể. Hỗn hợp của TSP và acid hyaluronic là nước mắt nhân tạo được sử dụng cho hội chứng khô mắt. TSP có thể được sử dụng là thành phần chính tá dược trong thuốc kháng sinh ưa nước và kị nước. TSP kết hợp với pectin có lượng methoxyl cao (6,8- 8,4%) có khả năng thúc đẩy sự phát triển gel và ổn định nhiệt. Một số kết quả nghiên cứu TSP và sản phẩm biến tính của TSP đã thể hiện tốt khả năng làm chất mang cho thuốc và kiểm soát liều lượng nhả thuốc khi sử dụng qua đường uống [22].

Trong dược phẩm, để phát triển một tá dược mới chất này phải không có độc tính, có khả năng tương thích và có tính kinh tế. Các đặc tính này được thể hiện ở polysaccharide, đặc biệt là TSP (Bảng 1.1). Vì thế, TSP là ứng viên

20

đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp dược phẩm và các ngành công nghiệp thực phẩm.

Bảng 1.1. Các ứng dụng của TSP trong dược phẩm [22]

Ứng dụng Dạng sử dụng Các thuốc đã sử dụng

Chất hòa tan và nhũ hóa Dạng uống Nimesulfate, Paracetamol

Chất gắn kết Viên Tramadol HCl, ibuprofen

Chất điều biến kiểm soát Hạt composit, Diclofenac sodium

nhả Chất nền matrix, Composite beads

Chất điều biến nhả Viên tan, Diclofenac sodium

thuốc đường uống Viên ngậm Matrix, Paclitaxel

Ketoprofen, Lamivudine, Diclofenac sodium

Buccal drug release modifier, Buccal tablets

Nitrendipine,Metronidazole Mắt Dạng gel

Thuốc nhỏ mắt Nifedipine,Timolol, Pilocarpine, Eyedrops

Ketotifene fumarate

Chất mang hướng đích Viên tan

Đại tràng Viên Ibuprufen, Pushyanuga churna, Triphala churna

Hạt nano Hạt nano Tropicamide

Povidoneiodine,

Màng bọc vết thương và Film Epichlorohydrin

làm lành vết thương

21

1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về polysaccharide

trên các bệnh xương khớp

Gần đây polysaccharide từ hạt me (TSP) được quan tâm nghiên cứu nhiều do những tính chất đặc biệt của nó. TSP là một polymer tự nhiên có trọng lượng phân tử từ 700 – 2500 kDa. TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp chiết tách [25]. TSP không tan trong dung môi hữu cơ, phân tán tốt trong nước ấm tạo thành dung dịch có độ nhớt cao. TSP có các đặc trưng đặc biệt như khả năng tạo gel ở khoảng pH rộng, không bị ảnh hưởng khi đun sôi, do vậy được sử dụng nhiều trong thực phẩm [25]. Hơn thế nữa, TSP còn được sử dụng trong phẫu thuật nhãn khoa để làm chất kết dính các tế bào kết mạc và chữa lành vết thương giác mạc [26].

Các hợp chất tách chiết từ hạt me cũng đã được chứng minh là có tác dụng tích cực đối với một số bệnh xương khớp. Nghiên cứu của Sundaram và cs., [12] đã chứng tỏ hiệu quả chống viêm khớp của dịch chiết hạt me (tamarind seed extract, TSE). TSE có tính chất bảo vệ sụn và xương bằng cách ức chế các hoạt động tăng cường của metalloproteinases (MMPs), hyaluronisases (Haase), exoglycosidases, capthepsis. Nó cũng làm giảm nhẹ mức tăng các chất trung gian gây viêm như interleukin (IL) - 1β, các nhân tố hoại tử (tumor necrosis factor) – α, IL-6, IL-23 và cyclooxygenase-2. Nhóm tác giả kết luận rằng TSE đóng vai trò là một nhân tố ức chế sự thoái hóa sụn,

phân hủy xương và kháng viêm.

Ngoài ra, các hợp chất polysaccharide tự nhiên từ quả me cũng đang được nghiên cứu theo hướng tạo vật liệu sinh học scaffold ứng dụng trong y dược. Polysaccharide này đã được nghiên cứu sử dụng trong kỹ nghệ mô xương. Vật liệu tổng hợp nano hydroxyapatite/chitosan-me (n-HA/CS-TSP) với tỷ lệ phội hợp khác nhau đã được chế tạo [27] và đã thể hiện các đặc tính mong muốn cho kỹ nghệ mô xương như: bề mặt xốp và thô, tăng cường độ ổn định nhiệt và cường độ nén với mô đun cao nhất, tăng cường chức năng sinh học, phản ứng không độc với tế bào xương MG-63 và có khả năng tương thích tốt. Các tác giả kết luận rằng vật liệu nano n-HA/CS-TSP có thể là giải

22

pháp thay thế đầy hứa hẹn để ứng dụng trong kỹ nghệ mô xương. Nghiên cứu của Sanyasi và cs., [13] đã mô tả và xác định một hydrogel mới đóng vai trò là một vật liệu cho kỹ nghệ mô xương (bone tissue engineering), trong đó carboxyl methyl tamarind polysaccharide là một polymer bán tổng hợp từ quả me. Nhóm tác giả đã chứng minh rằng vật liệu này là thích hợp cho sự bám dính, sự sinh trưởng một cách hiệu quả cho các tế bào tiền tạo xương (bone precursor cells). Kết quả nghiên cứu còn cho thấy vật liệu hydrogel này không có bất kỳ độc tính nào và thích hợp cho tế bào người, vì thế nó có tiềm năng sử dụng trong kỹ nghệ mô xương cũng như là các ứng dụng thương mại trong tương lai. Gần đây, nhóm nghiên cứu này cũng đã tìm ra một vật liệu mới được tổng hợp từ polysaccharide có nguồn gốc từ bột quả me (tamarind kernel polysaccharide -TKP) được gắn với acrylic acid (AA) là TKP-AA. Vật liệu mới tạo được thích hợp cho việc sinh trưởng và biệt hóa của tế bào xương cũng như các tế bào khác. TKP-AA cũng thích hợp cho tế bào tạo xương biệt hóa và kích thích sự khoáng hóa xương in vitro. Ngoài ra, TKP-AA còn có thể sử dụng cho sự sinh trưởng của tế bào tạo xương có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô. Nhóm tác giả gợi ý rằng TKP-AA có tiềm năng sử dụng như là vật liệu sinh học scaffold và đặc biệt là cho kỹ nghệ mô xương với giá thành thấp [13]. Tuy vậy, tại thời điểm này, nhóm tác giả vẫn chưa đánh giá toàn diện được tác dụng tái tạo xương của TKP in vitro và in vivo cũng như chưa đi sâu tìm hiểu cơ chế và đường hướng phân tử mà TKP làm gia tăng sự hình thành xương. Đây là những dẫn liệu rất quan trọng, giúp làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của TKP đối với quá trình TTX và khẳng định khả năng ứng dụng của nó.

Cấu trúc phân tử của polysaccharide sẽ điều chỉnh các hoạt động sinh học của TSP, do đó việc sửa đổi phân tử và cải thiện cấu trúc của polysaccharide có thể giúp cải thiện các đặc điểm sinh học nội tại của chúng và thậm chí tạo ra các đặc tính chức năng mới, ưu việt hơn [28, 29]. Sự biến đổi sulfatecủa polysaccharide giúp tăng cường mạnh mẽ các hoạt tính sinh học của chúng, ví dụ như chống đông máu, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, chống khối u, chống virus và các hoạt động khác [30]. Có thể thấy rằng

23

cho đến nay, các nghiên cứu đầy đủ về tác dụng cảm ứng TTX của TSP cũng như dẫn suất của nó vẫn chưa được thực hiện.

Tại Việt Nam, cây me được trồng rộng rãi ở nhiều tỉnh từ Bắc Ninh, Vĩnh Phú tới các tỉnh Tây Nguyên, miền Trung, miền Nam và các Hải đảo. Quả me được sử dụng chủ yếu làm thực phẩm, nứớc sốt, gia vị... Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều nghiên cứu về polysaccharide có nguồn gốc từ quả me ở Việt Nam được công bố. Nghiên cứu gần đây nhất về TSP là của tác giả Bùi Ngọc Tân [19,20] đã xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me. Kết quả nghiên cứu cho thấy dẫn xuất sulfate hóa làm tăng khả năng ly giải cục máu đông, khả năng chống đông tụ máu và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định còn dẫn xuất acetyl hóa làm tăng khả năng chống oxy hóa so với mẫu TSP tự nhiên. Như vậy, mặc dù đã có các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của TSP trong lĩnh vực kỹ nghệ mô, việc đánh giá hoạt tính tái tạo xương của TSP và các dẫn xuất của nó một cách chi tiết trên cả mô hình in vitro và in vivo vẫn chưa được thực hiện.

Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tổng hợp các dẫn suất polysaccharide dạng sulfate hóa và lần đầu tiên đánh giá ảnh hưởng của

TSP và TSPS lên sự biệt hóa của tế bào xương in vitro thông qua việc xác định ảnh hưởng của chúng lên hoạt tính enzyme ALP và sự khoáng hóa của tế bào tạo xương. Nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm sáng tỏ tác dụng và tiềm năng ứng dụng của dẫn suất tổng hợp được.

24

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Dựa trên các kết quả điều tra về hàm lượng TSP và hoạt tính sinh học của quả me ở các vùng nguyên liệu khác nhau, chúng tôi đã thu thập nguyên liệu quả me từ tỉnh Sơn La cho nghiên cứu này. Mẫu nguyên liệu được TS. Nguyễn Thị Thanh Hương phân loại và lưu giữ mẫu vật tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ: Cốc thủy tinh, ống nghiệm, giấy lọc, phễu, pipet, micropipet 10-1000 µl, bình đựng nước cất và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm.

- Thiết bị: Tủ sấy, máy cô quay chân không, máy lắc voltex, tủ nuôi cấy tế bào, tủ an toàn sinh học, máy đo pH, máy ly tâm, máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR.

2.1.3. Hóa chất

- Tế bào tiền tạo xương osteoblast MC3T3-E1 được mua từ hãng Sigma

(Hoa Kỳ).

- Enzyme alkaline phosphatase (ALP), một chỉ thị đặc trung cho sự tạo xương và chất nhuộm Alizarin red S (dẫn xuất anthraquinone) để đánh giá sự hình thành canxi được mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ).

- Các môi trường nuôi cấy tế bào được mua từ hãng Invitrogen (Hoa

Kỳ).

- Pullulan, chất chuẩn polysaccharide được mua từ hãng Sigma (Hoa

Kỳ).

- Các hóa chất còn lại đạt mức độ tinh sạch phân tích.

25

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Chiết tách TSP từ hạt me

Quả me sau khi thu hái được rửa sạch chất bẩn dưới vòi nước rồi sấy ở

60oC – 70oC trong 48 giờ, sau đó vỏ quả được loại bỏ và tách riêng phần hạt me và thịt me. Phần hạt me được tách bỏ vỏ cứng sau đó được nghiền nhỏ và giữ trong bình hút ẩm. Việc tách chiết TSP từ hạt me được thực hiện theo quy trình của Deveswaran và cs., [26]. Cụ thể như sau: mẫu bột me (20 g) được hòa trong 200 mL nước cất và khuấy đều, sau đó thêm 800 mL nước sôi. Dung dịch được đun sôi trong 20 phút và để qua đêm để loại bỏ protein và phần sợi, sau đó ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút. Phần cặn không tan được loại bỏ và thu lại phần dịch trên tủa. Dịch ly tâm được cất quay loại dung môi, thêm hai phần thể tích ethanol vào dịch cô quay (vừa bổ sung vừa khuấy) để thu được TSP. Mẫu sau khi chiết tách được loại bỏ protein theo phương pháp của Oliveira và cs., [31]. Để tinh sạch thêm TSP, màng thẩm tách đã được sử dụng. TSP thu được sau thẩm tách được sử dụng để điều chế các dẫn xuất sulphate.

2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất sulfate hóa của TSP (TSPS)

Dẫn xuất sulfate của TSP (TSPS) được điều chế theo phương pháp của Fan và cs., [32] và Chen và cs., [33]. Quá trình này được thực hiện theo 04 bước như sau:

i - Tạo tác nhân sulfatehóa: Phản ứng hóa học tạo tác nhân sulfate hóa được tiến hành theo phương trình:

4NaHSO3 + NaNO2 (NaSO3)3N + Na2SO3 + 2H2O

ii – Thực hiện phản ứng: Tác nhân sulfate hóa được điều chỉnh pH bằng natri hydroxide, sau đó thêm dung dịch TSP (1.5g TSP hòa trong 30mL nước) và khuấy mạnh, phản ứng được thực hiện tại 50oC trong 4 giờ.

iii – Thu nhận dẫn suất sulfate: Hỗn hợp được cất loại bỏ dung môi, kết tinh lại và rửa nhiều lần bằng ethanol. TSPS sau đó được sấy khô tại 40oC trong 48 giờ.

26

iv - Điều chế các dẫn xuất sulfate hóa có mức độ sulfatekhác nhau: dựa theo phản ứng giữa TSP với tác nhân sulfatecó tỷ lệ số mol của NaHSO3 và NaNO2 khác nhau để thu được các mẫu TSPS có mức độ sulfatehóa khác nhau.

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc

2.2.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR)

Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc các ionic polysaccharide nói riêng. Phương pháp này cung cấp những thông tin về cấu trúc quan trọng để xác định kiểu nhóm chức trong phân tử polysaccharide.

27

Bảng 2.1. Một số nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR

của polysaccharide

thành công để phân

tích các Phổ FT-IR đã được áp dụng polysaccharide như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển. Bảng 2.1 đưa ra các nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của polysaccharide.

Trong thí nghiệm này, mẫu TSP và dẫn xuất TSPS được ép viên với KBr theo tỷ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR được đo trên máy Nicolet iS50 FTIR (Thermo Scientific) trong vùng dải sóng 4000-400 cm-1.

28

2.2.3.2. Phương pháp phổ NMR

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1H-NMR còn dùng để định lượng polysaccharide có trong mẫu phân tích Phổ NMR được thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Đặc trưng phổ 1H- NMR và 13C-NMR của glucan được thể hiện trong Hình 2.1. Trong phổ 1H- NMR tất cả độ dịch chuyển hóa học của carbohydrate bao gồm mono-, oligo-, và polysaccharide có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6 ppm trong chất nội chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học proton anomer của mỗi

monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình  hay . Ví

dụ như với protonanomer sẽ xuất hiện tại δ 5–6 ppm trong khi đó với

proton - anomer là tại vùng δ 4–5 ppm. Phổ 13C-NMR thường có tín hiệu

yếu hơn nhưng có những lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharide vì độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR được trải rộng trên thang đo (Hình 2.1). Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C-NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1H-NMR. Trên phổ 13C- NMR các tín hiệu carbon anomer xuất hiện tại vùng δ 90–110 ppm trong khi đó các tín hiệu của carbon không ở vị trí anomer xuất hiện tại δ 60 và 85 ppm. Với polysaccharide có nhóm deoxy như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15–20 ppm). Với hai loại proton anomer, tín hiệu của

carbon-anomer xuất hiện tại δ 95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết

carbon-anomer xuất hiện tại δ 100-105 ppm. Với polysaccharide có chứa

nhóm acid uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170–180 ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60–64 ppm), trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65–85 ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển về phía

29

trường yếu 5–10 ppm. Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharide chưa xác định ngay được cấu trúc mà cần được so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc dùng phổ 2D-NMR và một số kỹ thuật khác. Phổ 1H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharide. Tuy nhiên, có sự xuất hiện hiện tượng chồng chéo của các tín hiệu proton trong quá trình định lượng polysaccharide. Do vậy phổ 13C-NMR với kỹ thuật đo đặc biệt cũng có thể dùng để định lượng polysaccharide vì các tín hiệu của carbon anomer được tách riêng trong phổ. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid).

Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4 đến 5,8 ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của tín hiệu các cộng hưởng proton anomer ta cũng có thể đánh giá tỷ lệ của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn chung, kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá học.

30

Hình 2.1. Phổ NMR của -D-glucan. a) Phổ 1H-NMR của (13) và (14)

-D-glucan; b) Phổ 13C-NMR của (13) và (14) -D-glucan

Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC. Từ các thông số độ chuyển dịch hóa học của C1, H1 thông qua phổ tương tác dị hạt nhân 1H – 13C HSQC có thể đưa ra được cấu trúc hóa học cơ bản của monosaccharide (Bảng 2.2).

31

Bảng 2.2. Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu sugabase của dạng glucose,galactose và xylose dung môi D2O

Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế. Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hoá. Trật tự các monomer trong mạch polysaccaride được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ HMBC và NOESY.

Trong thí nghiệm ở đây, việc chuẩn bị mẫu được thực hiện bằng cách hòa tan 5 mg polysaccharide tinh khiết đông khô trong 600 μL nước deuterium (D2O). Dung dịch được khuấy trong 2 giờ ở 40°C và sau đó đông khô. Quá trình này được lặp lại hai lần. Phổ 1H NMR của TSP và TSPS trong D2O được ghi lại trên máy đo phổ Bruker Avance 500 MHz (Bruker Biospin, Đức) sử dụng TMS (tetramethyl silane) làm chất nội chuẩn. Sự thay đổi hóa

32

học được biểu thị bằng ppm. Phân tích được thực hiện tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3.3. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lượng trung bình Mw, trọng lượng phân tử trung bình số Mn, và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tử của nó. GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymertổng hợp hay các polymertự nhiên như polysaccharide. Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố trọng lượng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần của nó như polymer, oligomer, monomer, và các chất phụ gia. Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC được đưa ra trên sơ đồ hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC

Trọng lượng phân tử trung bình của dẫn xuất TSP được xác định bằng hệ thống sắc ký GPC P100 (Aligent technologies, Hoa Kỳ) với dòng chảy duy trì 1mL/phút, pha động là NaNO3 0.1N, sử dụng detector RI, cột đo TSK G3000-PW, nồng độ mẫu TSP là 0.001 mg/mL, nhiệt độ là 30oC. Các dữ liệu

33

được xử lý bằng phần mềm Jiangshen Workstation. Phân tích được thực hiện tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.4. Phương pháp xác định hình thái bề mặt TSP dưới kính hiển

vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM)

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM), là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Việc phát các chùm điện tử trong SEM cũng giống như việc tạo ra chùm điện tử trong kính hiển vi điện tử truyền qua, tức là điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt, hay phát xạ trường...), sau đó được tăng tốc. Tuy nhiên, thế tăng tốc của SEM thường chỉ từ 10 kV đến 50 kV vì sự hạn chế của thấu kính từ, việc hội tụ các chùm điện tử có bước sóng quá nhỏ vào một điểm kích thước nhỏ sẽ rất khó khăn. Điện tử được phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm Angstrong đến vài nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện. Độ phân giải của SEM được xác định từ kích thước chùm điện tử hội tụ. Ngoài ra, độ phân giải của SEM còn phụ thuộc vào tương tác giữa vật liệu tại bề mặt mẫu vật và điện tử. Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này.

Trong thí nghiệm này, hình thái bề mặt của TSP và TSPS được xác định bằng phương pháp đo dưới kính hiển vi điện tử quét có độ phân giải cao (FE-SEM, Hitachi-S4800, Japan). Phân tích được thực hiện tại Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.5. Phương pháp đo mức độ sulfate hóa

Hàm lượng S được xác định trực tiếp bằng phương pháp cảm ứng ghép Plasma - Quang phổ phát xạ quang học (ICP-OES) sử dụng máy đo Perkin Elmer Optima 2000 (Anh Quốc). Thí nghiệm được thực hiện tại Đại

34

học Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là sự kích hoạt các nguyên tử S trong plasma Ar và định lượng phổ phát xạ thu được ở một bước sóng đặc trưng. Cường độ của phổ phát xạ S là hàm trực tiếp của nồng độ S trong dung dịch, không phụ thuộc vào loại hợp chất chứa S và trạng thái oxi hóa của nguyên tử S được phân tích. Phương pháp ICP-OES đã được sử dụng thành công để phân tích S trong mô thực vật sau quá trình phân hủy và oxy hóa mẫu với các hỗn hợp axit và chất oxy hóa khác nhau. Nó cũng phải phù hợp để xác định các hợp chất hữu cơ S, nếu loại trừ các ảnh hưởng của chất nền và nhiễu. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả các mẫu được phân tích mà không cần tiền xử lý bằng thiết bị Perkin Elmer

Optima 2000 (Anh Quốc) ở vạch phát xạ S  = 180,669 nm trong hai lần xác

định lặp lại. Mức độ sulfatehóa (DS) được tính theo công thức sau:

DS = 2.25 x S (%)/C (%)

2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.6.1. Nuôi cấy và biệt hóa tế bào tiền tạo xương

Dòng tế bào tiền tạo xương MC3T3-E1 (Sigma, Hoa Kỳ) được sử dụng trong các thí nghiệm in vitro để đánh giá khả năng tạo xương của chất nghiên cứu. Tế bào MC3T3-E1 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS (fetal bovine serum) trong bể ủ nhiệt 37oC và CO2 5%. Sự biệt hóa tế bào được thực hiện trong môi trường osteogenic differentiation medium (ODM) bao gồm DMEM chứa FBS 5%, penicillin-streptomycin 1%, ascorbic acid 100 µg/mL, dexamethasone 10 nM và β- glycerophosphate10 mM.

2.2.6.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng phương pháp MTT. Nguyên tắc của phương pháp này là đánh giá hoạt động trao đổi chất của tế bào sống thông qua hoạt động của enzyme oxidoreductase phụ thuộc NADPH. Enzyme này sẽ khử thuốc nhuộm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

35

diphenyltetrazolium bromide (MTT) có màu vàng thành sản phẩm formazan có màu tím và không tan. Giá trị OD đo được của formazan sau khi hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ phản ánh mức độ hoạt động của enzyme, tương ứng với độ sống sót của tế bào. Cụ thể, tế bào được nuôi cấy lặp lại 3 lần trong đĩa 96 giếng ở mật độ 5×103 tế bào/giếng và bổ sung các hàm lượng khác nhau của các chất cần nghiên cứu (dẫn xuất TSP), hoặc không bổ sung những chất này để làm mẫu đối chứng. Sau khi ủ 24 giờ, tế bào được rửa lại và thêm vào 100 µl MTT (1 mg/mL) và ủ tiếp trong 4 giờ. Cuối cùng, DMSO (150 µL) được thêm vào và đo OD ở 540 nm. Khả năng sống sót của tế bào được so sánh ở các giếng có bổ sung các nồng độ khác nhau của chất quan tâm so với mẫu không có bổ sung chất quan tâm. Từ kết quả MTT sẽ lựa chọn được nồng độ chất thích hợp mà không làm ảnh hưởng đến sự sống sót của tế bào cho các nghiên cứu in vitro tiếp theo để đánh giá ảnh hưởng của chất quan tâm đến sự biệt hóa tế bào tạo xương [34].

2.2.6.3. Đánh giá hoạt tính enzyme alkaline phosphatase (ALP)

Hoạt tính enzyme ALP được đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi Nguyen et al [34]. Để đánh giá hoạt tính ALP, tế bào MC3T3-E1 được nuôi cấy trong đĩa 24 giếng trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS. Môi trường nuôi cấy sau đó được thay thế bằng môi trường DMEM mới có bổ sung chất nghiên cứu, hoặc không bổ sung những chất này để làm đối chứng và ủ trong 48 giờ. Sau đó, tế bào được rửa với đệm PBS kết hợp với đệm carbonate buffer (pH 10.3) 25 mM có chứa 0.1% Triton X-100. Tiếp đó, tế bào được ủ trong 1 giờ ở 37oC với đệm carbonate 250 mM có chứa 1.5 mM MgCl2 và 15 mM p-NPP. Với sự hiện diện của ALP, chất p-NPP sẽ được chuyển đổi thành para-nitrophenol (có màu vàng) và inorganic phosphate. Sau đó, hoạt tính ALP trong các mẫu được đo ở bước sóng 405 nm bằng máy đo quang phổ. Hoạt tính ALP được tính toán dựa theo công thức sau:

𝐻𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ 𝐴𝐿𝑃 (%) = 𝑥 100% 𝐴 − 𝐴𝑜 𝐴𝑜

Trong đó: - A là độ hấp thụ của tế bào được bổ sung chất nghiên cứu, - Ao là độ hấp thụ của tế bào không được bổ sung chất nghiên cứu

36

2.2.6.4. Đánh giá hoạt tính khoáng hóa xương

Hoạt tính khoáng hóa của tế bào được đánh giá theo phương pháp được

mô tả bởi Nguyen et al., [34]. Mức độ khoáng hóa được xác định bằng cách nhuộm tế bào với alizarin red-S trong đĩa 6 giếng. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có chứa vitamin C (50 µg/mL) và β-glycerolphosphate (10 mM) trong 2 tuần cùng với nồng độ thích hợp của chất cần nghiên cứu, hoặc không bổ sung chất nghiên cứu để làm đối chứng. Sau đó, tế bào được rửa hai lần với PBS, cố định trong cồn lạnh đá 70% (v/v) trong 1 giờ và được làm khô trong không khí. Dung dịch ethanol 100% được dùng để cố định tế bào và chất nền được nhuộm với alizarin red-S 40 mM (pH 4,2) trong 1 giờ và được rửa kỹ với nước. Tiếp theo, tế bào được rửa trong 15 phút với cetylpyridium chloride 10% được pha trong 10 mM đệm phosphate natri (pH 7.0). Sự nhuộm màu của tế bào thể hiện mức độ khoáng hóa và mật độ quang học được đo ở 562 nm để xác định mức độ nhuộm màu của tế bào trong các mẫu nghiên cứu và đối chứng. Hoạt tính khoáng hóa xương được tính toán dựa theo công thức dưới đây:

𝐻𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ 𝑘ℎ𝑜á𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) = 𝑥 100% 𝐴 − 𝐴𝑜 𝐴𝑜

Trong đó: - A là độ hấp thụ của tế bào được bổ sung chất nghiên cứu,

- Ao là độ hấp thụ của tế bào không được bổ sung chất nghiên cứu.

2.2.7. Xử lý thống kê

Các số liệu được phân tích thống kê sử dụng t-test hoặc ANOVA khi so

sánh nhiều mẫu với P < 0,05.

37

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TINH SẠCH TSP TỪ HẠT ME

Bột hạt me khô xay (20 g) được hòa với nước cất (1000 mL) sau đó được khuấy và đun nóng ở 100°C trong 20 phút. Dung dịch huyền phù sau đó được làm nguội đến nhiệt độ phòng, để qua đêm để loại bỏ protein và chất xơ rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút để thu phần hòa tan và loại bỏ phần cặn không hòa tan. Trong bước tiếp theo, dung dịch hòa tan được cất cô quay để thu cặn và sau đó cho thêm hai thể tích ethanol để thu được polysaccharide hạt me (TSP). Các mẫu TSP thu được sẽ được tinh sạch bằng túi thẩm tách SnakeSkin để thu được TSP có độ tinh khiết cao (Hình 3.1). Sơ đồ quá trình thu nhận TSP được trình bày ở hình 3.2 với hiệu suất đạt 13,4%.

A B

Hình 3.1. Sản phẩm TSP từ hạt me. A) Bột hạt me đun trong nước trong 20 phút; B) TSP thu được sau khi kết tủa trong ethanol và lọc qua rây (kích thước 0.125 mm).

38

Bột nguyên liệu

o

Thêm nước, đun ở 100

C, 20 phút

Dịch huyền phù

Ly tâm 5000 rpm/20 phút

Dịch trên tủa

Tủa ethanol

Tủa ethanol

Thẩm tích trong nước cất

TSP

Hình 3.2. Sơ đồ quá trình thu nhận TSP từ hạt me

3.2. TỔNG HỢP CÁC DẪN SUẤT SULFATE CỦA TSP

3.2.1. Tổng hợp dẫn suất TSPS

Quá trình sulfatehóa polysaccharide của hạt me được thực hiện theo phản ứng như mô tả của Fan và cs., [32] và Chen và cs., [33]. Sơ đồ phản ứng được minh họa trong Hình 3.3.

39

Hình 3.3. Phản ứng tổng hợp TSPS từ TSP của hạt me (Fan và cs., [32]

Sơ đồ quá trình thu nhận TSP được trình bày ở hình 3.4.

Tác nhân sulphate hóa

Bột TSP

C, 20 phút,

o 50 Cô quay thu chất khô

TSPS thô

Rửa ethanol lặp lại, Sấy ở 40oC trong 48 giờ

TSPS tinh sạch

Hình 3.4. Sơ đồ quá trình thu nhận TSPS từ hạt me

Trong thí nghiệm này, dung dịch Na2NO3 5% được thêm vào dung dịch NaHSO3 đã chuẩn bị trước trong nước cất. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng

40

ở 90°C trong 90 phút và được trung hòa bằng NaOH 15% đến pH 9.0 để tạo tác nhân sulphat hóa. Sau đó, bột khô nguyên liệu hạt me (1 g) được thêm vào dung dịch tác nhân sulphat hóa này. Hỗn hợp phản ứng được làm ấm đến 50°C trong 4 giờ và ethanol (40 mL) được thêm vào hỗn hợp để tạo kết tủa. Kết tủa sau đó được thu lại bằng cách lọc qua màng lọc. Dung dịch tủa được thẩm tách và được làm đông khô để thu được TSPS của hạt me đã được sulfate hóa. Hiệu suất chuyển hóa từ TSP sang TSPS của quy trình đạt 86,5%.

3.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của dẫn suất TSPS

TSP được cấu tạo bởi các đơn vị đường, bao gồm α-D-xylopyranose, β- D-galactopyranose và glucose, được liên kết thông qua liên kết glycosidic để tạo thành polymerphân nhánh [35]. Phổ 1H-NMR của TSP và TSPS (Hình 3.5) cho thấy xuất hiện một vùng tín hiệu dày đặc giữa δ 3,00 ppm đến δ 5,00 ppm là đặc trưng của polysaccharide, điều này xác nhận sự hiện diện của nhiều gốc đường tương tự.

Kết quả thu được trong hình 3.6 cho thấy có các proton α-anomeric ở vùng 5–5,6 ppm và các proton vòng ở vùng 3,4–4,4. Các tín hiệu giữa δ 3,90– 3,50 ppm tương ứng với các nhóm CH2 của arabinose. Các tín hiệu proton của

các đơn vị đường trong khoảng  4,32-3,80 ppm góp phần tạo ra các nhóm

methine oxy hóa của phân tử đường. Các tín hiệu đơn lẻ dịch chuyển ở  5,53

ppm, 5,33 ppm và 4,95 ppm được cho là các proton α-anomeric và β- anomeric. Phân tích 1H-NMR này phù hợp với dữ liệu được công bố bởi Chawananorasest và cs., [35] So với phổ 1H NMR của TSP, các tín hiệu proton của TSPS đã bị dịch chuyển một chút về mặt hóa học sang trường cao hơn trong NMR. Đây có thể là do ảnh hưởng của quá trình sulfatehóa TSP

41

.

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của TSPS và TSP trong D2O.

3.2.3. Hình thái bề mặt của TSP và TSPS

Hình ảnh SEM về hình thái bề mặt của TSP và TSPS trong hình 3.6. Hình ảnh thu được cho thấy TSP có bề mặt nhẵn và kín, trong khi TSPS có bề mặt tương đối xốp và thô. Điều này chỉ ra rằng sự kết hợp của các nhóm sulfate đã tạo ra ảnh hưởng đáng chú ý đến hình thái bề mặt của TSPS. Hơn nữa, bề mặt thô và xốp của mẫu TSPS có thể thúc đẩy sự kết dính của tế bào, sự gắn kết của tế bào, sự phát triển của mô và cung cấp chất dinh dưỡng cho vị trí tái tạo mô [ 27]. Do đó, việc gắn thêm các nhóm sulfate trong TSPS dẫn

42

đến bề mặt thô và xốp và có thể đã giúp làm tăng các hoạt động sinh học của TSPS so với TSP.

Hình 3.6. Hình thái bề mặt của TSP và TSPS dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). TSP (A, B) và TSPS (C, D). A and C: Hình ảnh SEM images ở độ phóng đại 3 kx. C and D: Hình ảnh SEM images ở độ phóng đại 30 kx.

3.2.4. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của TSP và TSPS

Phổ FT-IR được sử dụng để nghiên cứu dao động của các phân tử và liên kết phân cực giữa các nguyên tử khác nhau. Số liệu trong Hình 3.7 cho thấy

43

rằng phổ FT-IR của TSP và TSPS đã hiển thị các đỉnh trong vùng 3447 và 3436 cm-1, tương ứng với dao động kéo dài hydroxyl của các mẫu polysaccharide. Bên cạnh đó, các đỉnh hấp thụ cụ thể của sulfat được tìm thấy trong TSPS, nhưng không được tìm thấy trong mẫu TSP. Chúng bao gồm sự xuất hiện của các cực đại ở 1260 cm-1, tương ứng với sự kéo dài S = O và ở 873 cm-1, biểu thị một dao động C-S-O đối xứng liên kết với một nhóm C-O- SO3. Những phân tích này đã khẳng định sự thành công của quá trình sulfate hóa TSP.

Hình 3.7. Phổ FT-IR của TSP và TSPS.

3.2.5. Xác định mức độ sulfate hóa của TSPS

Một trong những phương pháp tin cậy để xác định lượng sulfate có mặt là phân tích nguyên tố. Với phương pháp này, lượng sulfate trung bình trên mỗi khối lượng của polymerhoặc phân tử nhỏ có thể được xác định. Nếu người ta biết khối lượng phân tử của polyme, thì lượng sulfate trung bình của mỗi monome được ước tính bằng mức độ %. Mức độ DS được xác định bằng

44

phương trình chuyển đổi phần trăm hàm lượng sulfate (S%) sang mức độ thay thế (DS) là đại diện cho số lượng sulfate trung bình trên dư lượng monomer được sử dụng. Kết quả về DS của TSPS và TSP được trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Mức độ sulfatehóa của TSPS

Mẫu S (%) DS (%)

TSPS 4.86 ± 1.14 0.31 ± 0.06

TSP 0.3 ± 0.15 ND

(Số liệu được trình bày là giá trị trung bình của ba phép xác định độc lập được lặp lại. ND: Không phát hiện)

Mặc dù phương pháp này không xác định được (các) vị trí của (các) nhóm sulfate hoặc số lượng chính xác các sulfate có trong mỗi đơn phân, dữ liệu thu được đã cho thấy TSPS được tổng hợp thành công với DS là 0,31 ± 0,06, trong khi DS của TSP không thể phát hiện được. Kết quả này phù hợp với các dữ liệu được báo cáo bởi Xie và cs., [28].

3.2.6. Xác định khối lượng phân tử (Mw) của TSP và TSPS

Khối lượng phân tử (Mw) của TSP và TSPS được xác định bằng cách sử dụng sắc ký thấm gel hiệu năng cao (HPGPC). Dung dịch mẫu (20 μL) được bơm vào HPGPC trong mỗi lần chạy với hệ thống Agilent 1260 HPLC (Agilent, Hoa Kỳ). Pullulan được sử dụng làm chất chuẩn và Mw của TSP và TSPS được ước tính dựa trên phương trình của đường chuẩn.

Kết quả thu được ở Hình 3.8 cho thấy Mw của TSP và TSPS ước tính lần lượt là 1,37 x 106 và 1,34 x 106. Kết quả của chúng tôi tương tự với Mw

45

của polysaccharide tự nhiên và phù hợp với dữ liệu của Xie và cs., [34] đã báo cáo trước đó.

Hình 3.8. Phổ GPC của TSPS và TSP sử dụng chất chuẩn là pullulan.

3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CẢM ỨNG GIA TĂNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN SUẤT TSPS

Sự biến đổi sulfate của polysaccharide được cho là giúp tăng cường mạnh mẽ các hoạt tính sinh học của chúng [29, 30]. Hiện tại chưa có các nghiên cứu đầy đủ về tác dụng cảm ứng TTX của TSP cũng như dẫn suất sulfate của nó. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá ảnh hưởng của TSP và TSPS lên sự biệt hóa của tế bào xương in vitro thông qua việc xác định ảnh hưởng của chúng lên hoạt tính enzyme ALP và sự khoáng hóa của tế bào tạo

46

xương là hai chỉ thị quan trọng cho giai đoạn sớm và muộn của quá trình biệt hóa của tế bào xương.

3.3.1. Đánh giá độc tính của TSPS lên dòng tế bào tạo xương

osteoblast

Tác dụng gây độc tế bào của các nồng độ TSP và TSPS khác nhau trên tế bào tiền nguyên bào MC3T3-E1 được xác định bằng phương pháp MTT. Số liệu ở hình 3.10 cho thấy là cả TSP và TSPS đều không gây độc đối với sự tăng sinh của tế bào MC3T3-E1 ở nồng độ thử nghiệm trong 3 ngày nuôi cấy. Không những thế, cả TSP và TSPS đều làm tăng khả năng sống của tế bào sau khi xử lý (Hình 3.9) (P>0,05). Do đó, nồng độ của các mẫu nằm trong khoảng từ 5 - 40 µg/mL đã được chúng tôi lựa chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.9. Ảnh hưởng của TSP và TSPS lên khả năng tăng sinh của tế bào MC3T3-E1. Control: mẫu đối chứng không bổ sung chất nghiên cứu. Kết quả trình bày là giá trị trung bình ± SD.

47

3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của TSPS lên hoạt tính enzyme ALP

Sự biệt hóa của tế bào xương (nguyên bào xương) có thể được xác định trong ba giai đoạn gồm: i) giai đoạn tăng sinh tế bào; ii) giai đoạn chất nền trưởng thành; và iii) giai đoạn khoáng hóa. Trong quá trình tăng sinh tế bào và giai đoạn trưởng thành chất nền, hoạt tính của enzyme phosphatase kiềm (ALP) được thể hiện rất mạnh. Do đó, hoạt tính ALP có thể được sử dụng như một chỉ thị để xác định xem liệu việc xử lý mẫu có thể tạo ra sự biệt hóa tế bào nguyên bào xương hay không. Kết quả hiển thị trong Hình 3.10 chỉ ra rằng TSPS có thể gây tăng hoạt tính ALP một cách có ý nghĩa thống kê sau 5 ngày xử lý ở nồng độ 20 µg/mL và 40 µg/mL. Ở các nồng độ 5 và 10 µg/mL, TSPS không có ảnh hưởng đến hoạt tính củe enzyme này (Hình 3.10).

Hình 3.10. Ảnh hưởng của TSP và TSPS lên hoạt tính ALP của tế bào MC3T3-E1. Control: mẫu đối chứng không bổ sung chất nghiên cứu; Kết quả trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn; * p ≤ 0.05.

Hoạt tính ALP tăng khoảng 20% và 27% lần lượt ở các nồng độ 20 và

48

40 µg/mL, trong khi đó, xử lý TSP đã không làm tăng hoạt tính ALP của tế bào xương ở tất cả các nồng độ đã thử nghiệm sau 5 ngày (P<0,05). Do đó có thể kết luận rằng dẫn xuất sulfatecủa TSP có hoạt tính cảm ứng TTX.

3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của TSPS lên hoạt tính khoáng hóa của

tế bào tạo xương

Quá trình khoáng hóa xương là quá trình mà mô hữu cơ trở nên cứng bởi sự lắng đọng sinh lý của muối canxi, được gọi là giai đoạn cuối của quá trình biệt hóa nguyên bào xương. Trong nghiên cứu này, độ khoáng hóa của tế bào xương được đo bằng phương pháp nhuộm alizarin red S của tế bào nuôi cấy khi xử lý với TSP và TSPS và sau đó định lượng hàm lượng canxi bằng mật độ quang học.

Hình 3.11. Ảnh hưởng của TSPS và TSP lên hoạt tính khoáng hóa xương của tế bào MC3T3-E1. Control: mẫu đối chứng không bổ sung chất nghiên cứu; kết quả trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn; * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01.

49

Kết quả thu được trong Hình 3.11 và 3.12 cho thấy rằng TSPS đã giúp sự khoáng hóa của tế bào xương diễn ra mạnh mẽ hơn sau 4 tuần nuôi cấy so với các tế bào không được xử lý. Kết quả cũng chỉ ra rằng các tín hiệu khoáng hóa ở các mẫu thí nghiệm xử lý với TSP là tương tự với nhóm không được xử lý sau 4 tuần. Trong khi đó, xử lý tế bào với TSPS đã đẩy nhanh quá trình khoáng hóa ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm. Cụ thể là sự khoáng hóa trong các tế bào MC3T3-E1 sau khi xử lý bằng TSPS ở các nồng độ 10, 20 và 40 μg/mL đã tăng lên lần lượt là 51,7%, 57,6% và 62,8% sau 4 tuần xử lý.

Đối chứng

Hình 3.12. Hình ảnh nhuộm tế bào osteoblast MC3T3-E1 hình thành khoáng hóa khi có mặt của TSPS. Tế bào được nhuộm alizarin Red-S trong 4 tuần sau khi xử lý mẫu. Quá trình hình thành khoáng hóa được tăng lên một cách phụ thuộc vào liều lượng. Mỗi giá trị là giá trị trung bình của các mẫu cấy ba lần và mỗi vạch chỉ ra trung bình ± S.D. * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01.

Tác dụng ức chế loãng xương của polysaccharide từ một số nguồn tự nhiên cũng đã được công bố. Ví dụ như polysaccharide từ cây Achyranthes bidentata Blume, một cây thuốc được trồng phổ biến ở Trung Quốc và các nước châu Á, có nhiều đặc tính dược lý, chẳng hạn như chống HIV, chống lão hóa, chống stress oxy hóa và có hoạt tính bảo vệ xương [36]. Các tác giả đã chứng minh rằng các polysaccharide của A. bidentata có tiềm năng đặc biệt

50

trong việc phòng và điều trị loãng xương thông qua việc tăng cường vi kiến trúc xương và rút ngắn giai đoạn giai đoạn các dấu ấn sinh học chuyển hóa xương, thúc đẩy sự biệt hóa của các tế bào tạo xương MC3T3-E1 thông qua việc tăng sinh tế bào, tăng hoạt động ALP, tăng sự khoáng hóa và tăng sự biểu hiện của một số gene đánh dấu liên quan đến quá trình hình thành xương như Osx, Ocn và Bsp [36]. Nghiên cứu của Ou và cs., [37] cũng chỉ ra rằng polysaccharide của Astragalus membranaceus (APS) có thể ức chế chứng loãng xương ở chuột bằng cách tăng khối lượng xương và hàm lượng canxi trong máu, cải thiện stress oxy hóa. Kết quả này có thể là do ảnh hưởng của APS đối con đường tín hiệu FoxO3/Wnt2.

Như vậy, ác số liệu thu được trong nghiên cứu này bước đầu đã chỉ ra rằng quá trình sulfatehóa TSP đã giúp làm tăng cường cả hoạt tỉnh ALP và khả năng khoáng hóa xương của tế bào ở các nồng độ thấp là 10, 20 và 40 μg/mL so với TSP (P<0.05), tức là có thể kích thích sự biệt hóa tế bào tạo xương ở cả giai đoạn đầu và giai đoạn cuối của quá trình biệt hóa. Các kết quả thu được là những số liệu mới về hoạt tính cảm ứng tái tạo xương của TSPS, gợi ý dẫn suất này có tiềm năng ứng dụng trong trị liệu các bệnh về xương. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra cơ chế phân tử, các con đường phân tử liên quan đến sự cảm ứng hình thành xương cũng như các thí nghiệm đánh giá hoạt tính trên các mô hình in vivo là cần thiết để khẳng định tiềm năng của TSPS cho các ứng dụng trị liệu.

51

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

- Đã thu nhận được polysaccharide từ hạt me (TSP) và tổng hợp thành công dẫn xuất sulfatecủa polysaccharide này (TSPS) với khối lượng phân tử đạt 1.34 x 106, có cấu trúc hóa học được khẳng định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ hồng ngoại (FT-IR) và mức độ sulfatehóa đạt 0,31%.

- Đã đánh giá được hoạt tính cảm ứng tái tạo xương của TSPS tổng hợp được trên mô hình tế bào tiền tạo xương osteoblast MC3T3-E1 với các kết quả cụ thể là:

i) TSPS làm tăng hoạt tính enzyme phosphatase kiềm (ALP) cả tế bào osteoblast lên khoảng 20% và 27% lần lượt ở các nồng độ 20 và 40 µg/mL sau 5 ngày xử lý;

ii) TSPS ở các nồng độ 10, 20 và 40 μg/mL đã làm tăng hoạt tính khoáng hóa của tế bào osteoblast lên lần lượt là 51,7%, 57,6% và 62,8% sau 4 tuần xử lý.

4.2. KIẾN NGHỊ

Tiếp tục đánh giá đầy đủ cơ chế cảm ứng tái tạo xương của các TSPS

và đánh giá tác dụng trên mô hình in vivo.

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

the

1. https://www.vinmec.com/vi/tin-tuc/thong-tin-suc-khoe/benh-loang-xuong/ 2. Khajuria DK., Razdan R., Mahapatra DR., 2011, Drugs for management of osteoporosis: a review, Braz J Rheum, 51: 372–82.

3. http://hoiyhoctphcm.org.vn/sinh-ly-hoc-loang-xuong 4. Kapinas K., Delany AM., 2011, MicroRNA biogenesis and regulation of

bone remodeling, Arthritis Res Ther, 13(3): 220.

5. https://www.researchgate.net/figure/Osteoblast-differentiation-

Osteoblasts-originate-from-mesenchymal-stem-cells-in-a_fig2_241868391 6. Ozra TM., Pooneh S., Patricia K., Bagher L., 2017, New horizons in

treatment of osteoporosis, Daru, 25: 2.

7. Lee JS., Hong JM., Jung JW., Shim JH., Oh JH., Cho DW., 2014, 3D to ear tissue with complex shape applied

printing of composite regeneratino, Biofabrication, 6(2): 024103.

8. Li H., Miyahara T., Tezuka Y., Namba T., Suzuki T., Dowaki R., Watanabe M., Nemoto N., Tonami S., Seto H., Kadota S., 1999, The effect of kampo formulae on bone resorption in vitro and in vivo, II, Detailed study of berberine, Biol Pharm Bull, 22(4): 391-396.

9. Li H., Miyahara T., Tezuka Y., Tran QL., Seto H., Kadota S., 2003, Effect of berberine on bone mineral density in SAMP6 as a senile osteoporosis model, Biol Pharm Bull, 26(1): 110-121.

10. Lee HW., Suh JH., Kim HN., Kim AY., Park SY., Shin CS., Choi JY., Kim JB., 2008, Berberine promotes osteoblast differentiation by Runx2 activation with p38 MAPK, J Bone Miner Res, 23(8): 1227-37.

11. Han Y., Jin Y., Lee SH., Khadka DB., Cho WJ., Lee KY., 2017, Berberine bioisostere Q8 compound stimulates osteoblast differentiation and function in vitro, Pharmacol Res, 119: 463-475.

12. Sundaram MS., Hemshekhar M., Santhosh MS., Paul M., Sunitha K., Thushara RM., NaveenKumar SK., Naveen S., Devaraja S., Rangappa KS., Kemparaju K., Girish KS., 2015, Tamarind seed (Tamarindus indica)

53

extract ameliorates adjuvant-induced arthritis via regulating the mediators of cartilage/bone degeneration, inflammation and oxidative stress, Sci Rep, 5: 11117.

13. Sanyasi S., Kumar S., Ghosh A., Majhi RK., Kaur N., Choudhury P., Singh UP., Goswami C., Goswami L., 2017, A modified polysaccharide-based for enhanced osteogenic maturation and mineralization hydrogel factors, Macromol Biosci, 17(3): independent of differentiation 201600268.

14. An J., Yang H., Zhang Q., Liu C., Zhao J., Zhang L., Chen B., 2016, treatment of osteoporosis: The effects and Natural products for mechanisms on promoting osteoblast-mediated bone formation, Life Sci, 147: 46–58.

15. Tai BH., Cuong NM., Huong TT., Choi EM., Kim JA., Kim YH., 2009, Chrysoeriol isolated from the leaves of Eurya ciliata stimulates proliferation and differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 cells, J Asian Nat Prod Res, 11(9): 817-823.

16. Trần Minh Thông, Nguyễn Thị Thu Hương, Hà Quang Than, Nguyễn Minh Đức, 2016, Khảo sát mô học tác dụng của cao xương cá sấu hoa cà trên chuột nhắt trắng bị gây loãng xương bằng corticoid, Tạp chí Dược liệu, 21 (1&2): 17-24.

17. To TT., PE Witten PE., Huysseune A., Winkler C., 2015, An adult osteopetrosis model in medaka reveals the importance of osteoclast function for bone remodeling in teleost fish, Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 187: 68-75.

18. Yu T., Witten PE., Huysseune A., Buettner A., To TT., Winkler C., 2016, Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model, Dis Model Mech, 9(2): 155-163.

19. Bui Ngoc Tan, Quach Thi Minh Thu, Dang Vu Luong, Nguyen Tuan Anh and Thanh Thi Thu Thuy, 2016, Structure and antitumor activity of tamarind seed polysaccharide (TSP) and its sulfated derivative (TSPS), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 54(2B): 170-176.

54

20. Bùi Ngọc Tân, Thành Thị Thu Thủy, Quách Thị Minh Thu, Nguyễn Tuấn Anh, 2015, Nghiên cứu chiết tách và bước đầu xác định thành phần hóa học của tamarind seed polysaccharide (TSP) từ quả me, Tạp chí Hóa học, 53(6e3): 152-155.

21. Đỗ Tất Lợi, 2000, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà

Nội.

22. Joseph J., Kanchalochana SN., Rajalakshmi G., Hari V., Durai RD., 2012, Tamarind seed polysaccharide: A promising natural excipient for pharmaceuticals, Int J Green Phar, 6(4): 270-278.

23. Aravind SR., Joseph MM., Varghese S., Balaram P., Sreelekha TT., 2012, Antitumor and immunopotentiating activity of polysaccharide PST001 isolated from the seed kernel of Tamarindus indica: an in vivo study in mice, Sci World J, 2012: 361382.

24. Samal PK., Dangi JS., 2014, Isolation, preliminary characterization and hepatoprotective activity of polysaccharides from Tamarindus indica L, Carbohydr Polym, 102:1-7.

25. Emmy DC., Halamova K., Damme PV., 2010, Tamarindus indica L. – A review of traditional uses, phytochemistry and pharmacology, Afr Focus J, 23: 53-83.

26. Deveswaran R., Sundhu Abraham, Bharath S., Basavaraij BV., Sharon F., Madhavan V., 2009, Design and characterization of diclofenac sodium tablets containing Tamarind seed polysaccharide as release retardant, Int J PharmTech, 1: 191-195.

27. Shakir M., Zia I., Rehman A., Ullah R., 2018, Fabrication and characterization of nanoengineered biocompatible n-HA/chitosan-tamarind tissue seed polysaccharide: Bio-inspired nanocomposites for bone engineering, Int J Biol Macromol, 111: 903-916.

28. Xie JH., Wang ZJ., Shen MY., Nie SP., Gong B., Li HS., Zhao Q., Li WJ., Xie MY., 2016, Sulfated modification, characterization and antioxidant activities of polysaccharide from Cyclocarya paliurus, Food Hydrocol, 53: 7-15.

55

longan polysaccharide and

29. Jiang J., Meng FY., He Z., Ning YL., Li XH., Song H., Wang J., Zhou R., its 2014, Sulfated modification of immunomodulatory and antitumor activity in vitro, Int J Biol Macromol, 67: 323-329

30. Wang Z., Xie J., Shen M., Nie S., Xie M., 2018, Sulfated modification of polysaccharides: Synthesis, characterization and bioactivities, Trend Food Sci Technol, 74: 147-157.

31. Oliveira R., Marques F., Azeredo J., 1999, Furification of polysaccharide from a biofilm matrix by selection precipitation of protein, Bio Tech, 13: 391-

393

32. Fan L., Jiang L., Xu Y., Zhou Y., Shen Y., Xie W., Long Z., Zhou J., 2011, Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfates, Carb Poly, 83: 1797-1803.

33. Chen X., Yang S., Wang J., Song L., Xing R., Liu S., Yu H., and Li P., 2015, Sulfated polysaccharides isolated from cloned Grateloupia filicina and their Anticoagulant activity, Biomed Res Int, 2015: 612352.

34. Nguyen MTH., Qian ZJ., Nguyen VT., Choi IW., Heo SJ., Oh CH., Kang DH., Kime GH., Jung WK., 2013, Tetrameric peptide purified from hydrolysates of biodiesel byproducts of Nannochloropsis oculata induces osteoblastic differentiation through MAPK and Smad pathway on MG-63 and D1 cells, Process Biochem, 48(9): 1387-1394. 3

35. Chawananorasest

K., Saengtongdee P., Kaemchantuek P., 2016, Extraction and characterization of tamarind (Tamarind indica L.) seed polysaccharides (TSP) from three difference sources, Molecules, 21(6): 775.

36. Zhang D., Wang C., Hou X., Yan C., 2019, Structural characterization and osteoprotective effects of a polysaccharide purified from Achyranthes bidentata, Int J Biol Macromol, 139:1063-1073.3

37. Ou L., Wei P., Li M., Gao F., 2019, Inhibitory effect of Astragalus polysaccharide on osteoporosis in ovariectomized rats by regulating FoxO3a /Wnt signaling pathway, Acta Cir Bras, 34(5): e201900502.

56

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

-------------

1. Le Phuong Ha, Nguyen Van Ngoc, Nguyen Thi Trang Huyen, Le Thi Thu Hang, Nguyen Thi Kieu Oanh, Nguyen Thi Mai Phuong, Nguyen Thi Hong Minh*, 2021, Total phenolic content, flavonoid content and antioxidant activities of tamarind seed extracts, Tạp chí Công nghệ sinh học (đã nhận đăng).

57

PHỤ LỤC

58

Phụ lục 1. Hình ảnh chuẩn bị nguyên liệu bột me cho thí nghiệm

Sản phẩm hạt me sau sấy và nghiền. A) Quả me sau khi tách vỏ và sấy khô; B) Thịt me sau khi nghiền; C) Hột me sau nghiền; D) Bột thịt me sau rây (kích thước rây 0.125 mm); E) Bột hạt me sau rây (kích thước rây 0.125 mm).

59

Phụ lục 2. Số liệu đánh giá độc tính của TPS và TSP

Tên mẫu SD

P value (so sánh với control) Giá trị trung bình (n=3)

Control 100 6.4

TSP 5 µg/ml 116.2 19.4 0.498

TSP 10 ug/ml 115.5 6.7 0.4302

TSP 20 ug/ml 124.1 14.6 0.0905

TSP 40 ug/ml 114.6 10.6 0.4904

TSPS 5 µg/ml 104.7 4.5 0.9974

TSPS 10 ug/ml 99.1 12.8 0.9999

TSPS 20 ug/ml 101.2 8.5 0.9998

TSPS 40 ug/ml 99.1 11.8 0.9999

60

Phụ lục 3. Số liệu đánh giá ảnh hưởng của TSP và TSPS

lên hoạt tính ALP

Tên mẫu P value (so sánh SD

Giá trị trung bình (n=3) với control)

Control 100 7.8

TSP 5 µg/ml 101.1 7.3 0.9998

TSP 10 ug/ml 87.6 5.5 0.4923

TSP 20 ug/ml 88.7 15.6 0.5857

TSP 40 ug/ml 102.3 5.5 0.9996

TSPS 5 µg/ml 93.1 15.9 0.9299

TSPS 10 ug/ml 106.8 4.2 0.9339

TSPS 20 ug/ml 123.6 11.6 0.037*

18.7 TSPS 40 ug/ml 127.9 0.0106*

TSP.SL-D2O-1H

7 2 5 . 5

5 3 3 . 5

9 4 9 . 4

3 1 7 . 4

9 2 3 . 4

3 0 3 . 4

8 7 1 . 4

6 1 1 . 4

2 6 0 . 4

5 4 0 . 4

1 3 0 . 4

5 7 9 . 3

6 4 9 . 3

3 0 8 . 3

8 6 6 . 1

4 8 5 . 1

0 7 5 . 1

6 5 5 . 1

Current Data Parameters NAME MINH_TSP.SL EXPNO 10 PROCNO 1

F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200614 Time 10.46 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT D2O NS 16 DS 2 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 44.31 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 343.0 K D1 1.00000000 sec TD0 1

======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.2420892 MHz NUC1 1H P1 10.20 usec PLW1 22.00000000 W

F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.2390000 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

-1

ppm

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

0 0 1

8 4 1

1 0 3

3 4 5

7 9 2

1 9 3

1 0 4

6 0 1

1 9 0

4 5 1 1

6

.

0

5

1.00

5.527

.

5

5.335

1.48

5

.

3.01

0

4.949

4.713

4

.

5

5.43

2.97

11.54

4 . 0

3.91

4.329 4.303 4.178 4.116 4.062 4.045 4.031 3.975 3.946 3.803

4.01

3 . 5

T S P . S L - D 2 O - 1 H

3 . 0

2 . 5

2 . 0

1.06

0.91

1.668 1.584 1.570 1.556

1 . 5

p p m

6

.

0

5

1.00

5.527

.

5

5.335

1.48

5

.

3.01

0

4.949

4.713

4

.

5

5.43

2.97

11.54

4 . 0

3.91

4.329 4.303 4.178 4.116 4.062 4.045 4.031 3.975 3.946 3.803

4.01

3 . 5

T S P . S L - D 2 O - 1 H

3 . 0

2 . 5

2 . 0

1.06

0.91

1.668 1.584 1.570 1.556

1 . 5

p p m

TSPS4-D2O-1H

5 4 1 . 5

4 3 9 . 4

0 0 7 . 4

6 4 5 . 4

9 3 5 . 4

2 3 5 . 4

8 9 2 . 4

0 1 9 . 3

1 8 8 . 3

7 9 6 . 3

9 5 6 . 3

6 4 6 . 3

2 3 6 . 3

8 1 6 . 3

4 0 6 . 3

3 9 5 . 3

7 3 5 . 3

8 1 5 . 3

4 7 3 . 3

6 2 3 . 3

Current Data Parameters NAME MINH_TSPS4 EXPNO 10 PROCNO 1

F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200808 Time 16.29 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT D2O NS 16 DS 2 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 142.98 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 302.8 K D1 1.00000000 sec TD0 1

======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.2420892 MHz NUC1 1H P1 10.20 usec PLW1 22.00000000 W

F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.2390034 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

-1

ppm

.

.

.

.

.

.

.

.

.

0 0 1

9 2 2

9 5 8

2 5 1 1

2 1 3 1

2 9 9 1

4 0 0 2

1 7 4 1

2 3 2 1

5

.

4

5

.

3

5

.

2

5.145

1.00

5

.

1

5

.

0

4.934

2.29

4

.

9

4

.

8

4

.

4.700

7

4

.

6

11.52

4.546 4.539 4.532

4 . 5

4 . 4

4.298

4 . 3

4 . 2

T S P S 4 - D 2 O - 1 H

4 . 1

4 . 0

13.12

3 . 9

3.910 3.881

3 . 8

19.92

3 . 7

20.04

14.71

3 . 6

12.32

3 . 5

3.697 3.659 3.646 3.632 3.618 3.604 3.593 3.537 3.518

8.59

3 . 4

3.374 3.326

3 . 3

3 . 2

3 . 1

p p m

TSP 22-Dec-20, 19:11:56 C:\Chem32\GPC\calib\New 2000 U LINEAR.CAL Tuesday 12/22/20 10:01:24 6.060 min 6.060 min 0.000000E+0

1.000 g/l RID A, Refractive Index Signal PTTT

9.671 min 9.671 min 1.000000E+0 ml/g 1.000 ml/min 20.000 ul 0.000 ml 0.430 sec

Sample : Injection Date : Calibration File : Calibration Date : Baseline from : Integration from: MHK - A (Cal.): Eluent : Concentration : Detector 1 : Operator :

Baseline to : Integration to : MHK - K (Cal.): Flowrate : Inject volume : Delay volume : Acquisition interval :

0.8

0.6

)

0.4

M g o l (

2 0

.

W

.

1 0 B

. v e R

0.2

-

n o d d A C P G

t n e

l i

g A

0.0

5

6

7

1e

1e

1e

Molar mass [D]

rid1A

g/mol g/mol g/mol g/mol

6.7051e5 1.6408e6 2.8922e6 0.000000 2.4471e0 0.000000 7.4518e0 1.5902e6 4.9229e3 2.8842e5 7.0780e5 1.2297e6 1.9905e6 3.5474e6

ml/g ml g/mol ml*V g/mol g/mol g/mol g/mol g/mol

Mn : Mw : Mz : Mv : D : [n]: Vp : Mp : A : 10% 30% 50% 70% 90%

C:\CHEM32\1\DATA\CAR GPC\PSTUYEN12200018.D Wednesday 12/23/20 09:44:46

Data File : Print Date :

Sign :

Page 1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAR GPC\HN011220000001.D Sample Name: TSPS

===================================================================== Acq. Operator : PTTT Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 1 Injection Date : 12/1/2020 7:19:33 PM Acq. Method : C:\CHEM32\1\METHODS\GPC WAT.M Last changed : 12/1/2020 6:16:32 PM by PTTT (modified after loading) Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\DEF_LC.M Last changed : 12/1/2020 8:10:34 PM by PTTT (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated RID1 A, Refractive Index Signal (CAR GPC\HN011220000001.D)

nRIU

2 7 5 . 7

3000

2500

2000

1500

1000

500

4 7 3 . 1 1

6 9 3 . 0 1

0

min

2

4

6

8

10

12

===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: RID1 A, Refractive Index Signal Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [nRIU*s] [nRIU] % ----|-------|----|-------|----------|----------|--------| 1 7.572 BV 1.4804 3.34018e5 3487.16309 93.4417 2 10.396 VV 0.6679 1.24111e4 249.01244 3.4720 3 11.374 VBA 0.5692 1.10322e4 298.63818 3.0863 Totals : 3.57461e5 4034.81371

Instrument 1 12/1/2020 8:11:18 PM PTTT

Page 1 of 2

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAR GPC\HN011220000001.D Sample Name: TSPS

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 12/1/2020 8:11:18 PM PTTT

Page 2 of 2

Print of window 38: Current Chromatogram(s)

Current Chromatogram(s)

RID1 A, Refractive Index Signal (CAR GPC\PSTUYEN12200018.D) RID1 A, Refractive Index Signal (CAR GPC\HN011220000001.D) RID1 A, Refractive Index Signal (CAR GPC\380KPL122000001.D)

nRIU

8000

380 kDa pullulan std (control spl)

6000

TSPS

4000

TSP

9 5 4 . 7

2 7 5 . 7

2000

0

min

0

2

4

6

8

10

Instrument 1 12/23/2020 9:52:03 AM PTTT

Page 1 of 1

TOTAL PHENOLIC CONTENT, FLAVONOID CONTENT AND ANTIOXIDANT

ACTIVITIES OF TAMARIND SEED AND PULP EXTRACTS

Le Phuong Ha1, Nguyen Van Ngoc2, Nguyen Thi Trang Huyen1, Le Thi Thu Hang1, Nguyen Thi Kieu Oanh1, Tran Thi Tuyet3, Nguyen Thi Mai Phuong2,4, Nguyen Thi Hong Minh1,*

1University of Science and Technology of Hanoi, Vietnam Academy of Science and

Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam.

2Graduate University of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and

Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam.

3Dai Nam University, 1 Pho Xom, Phu Lam, Ha Dong, Hanoi, Vietnam

4Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc

Viet, Hanoi, Vietnam.

* Corresponding author: Nguyen Thi Hong Minh; tel. +84 943936511; e-mail: nguyen-thi-

hong.minh@usth.edu.vn;

SUMMARY

Background: Tamarind (Tamarindus indica) has long been known for its high nutrition

content and pharmacological potential. However, there is lack of studies on the content of

antioxidants, phenolic and flavonoid contents of tamarind seed grown in Vietnam. Thus,

the aim of this study was to compare the seeds and pulps of Tamarindus indica from three

different areas across Vietnam including Son La, Hai Phong and Sai Gon with regard to the

total phenolic content (TPC), total flavonoid content (TFC) and antioxidant capacity of

their water and methanol extracts, as well as their cytotoxicity on a normal BKH-21cells.

Materials and methods: TPC and TFC were evaluated by the Folin–Ciocalteu reagent and

aluminium chloride, respectively. The 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-

azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) radical scavenging assays were

used to investigate antioxidant capacity. The safety of T. indica extracts was assessed by

using MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay.

Results: The data showed that the methanolic extracts yielded higher TPC (742.919 ±

50.360 mg GAE/g extract), TFC (68.492 ± 0.023 mg QE/g extract) and possessed stronger

free radical scavenging capacity (IC50 of 52.5 µg/mL) compared to that of water extracts. T.

indica seeds from all three regions possessed higher TPC, TFC and antioxidant activity

than those of pulps. Regarding the safety, in vitro analysis showed that tamarind seed and

pulp extracts only became toxic to BHK-21 cell line at a very high concentration with IC50

values range from 143.77 µg/mL to 620.35 µg/mL.

Conclusion: Data from this study revealed that T. indica seeds and pulps can serve as

functional food as well as potential antioxidants in pharmaceutical products.

Keywords: ABTS, antioxidant, DPPH, Tamarindus indica.

INTRODUCTION

The accumulation of reactive oxygen species (ROS) with a single unpaired electron can

stimulate oxidative stress which participates in the pathogenesis of many physiological

disorders and diseases,

including cellular

injury, aging, cancer, and hepatic,

neurodegenerative, cardiovascular and renal disorders (Alfadda and Sallam 2012). The

human body possesses a variety of endogenous antioxidants such as superoxide dismutase,

catalase (CAT) and glutathione peroxidase. These enzymes neutralize free radicals by

giving up some of their electrons, thus maintaining cellular homeostasis (Kurutas 2016).

Nevertheless, endogenous antioxidants alone may be inadequate to deactivate the free

radicals in the body, especially during inflammation or oxidative stress (Young and

Woodside 2001).

Research has been on the rise for natural antioxidants from plants with low toxicity and

high efficacy since they can provide additional help for the plasma antioxidants in clearing

free radical (Ronald and Guohua 2000). Commonly known antioxidants in plants are

phenolic and flavonoid compounds such as tocopherols, carotenoids, phenolic acids

(benzoic acid derivatives and cinnamon acids), flavonoids, and dipropenes (Zargoosh et al.

2019). These natural compounds are plant secondary metabolites that hold an aromatic ring

with at least one hydroxyl group which are responsible for antioxidant activity because

they are good electron donors (Tungmunnithum et al. 2018, Bendary et al. 2013). Studies

have shown that phenolic compounds possess free radical inhibition capacity, metal

inactivation or oxygen scavenging and prevent oxidative disease burden (Babbar et al.

2015).

Tamarind (Tamarindus indica) is a fruit plant that belongs to the legume family, grows

in tropical and subtropical regions such as Africa, India and Southeast Asia, with ideal

average temperature of 25° C (Cardoso et al. 2016). Tsuda et al. (1994) reported four

phenolic antioxidants in Indian tamarind seeds: 2-hydroxy-30,40 dihydroxyacetophenome;

methyl 3, 4-hidydroxybenzoate; 3,4-dihydroxyphenyl acetate and epicatechin (Tsuda et al.

1994). Sudjaroen et al. (2005) identified the polyphenolics profile of Thailand tamarind

pericarp which was dominated by proanthocyanidins in various forms, indicating that

tamarind may be an important source of cancer chemopreventive natural products in

tropical regions (Sudjaroen et al. 2005). Even though tamarind extracts have been studied

for their chemical properties as well as biological activities in the world, there is very

limited study about its extracts in Vietnam. Therefore, further studies on the antioxidative

activities and toxicological effect of T. indica are required. In addition, chemical properties

and biological activities of tamarind fruits could be differed by the collected areas. From

these standpoint, it was of great interest to compare the total phenolic (TPC), flavonoid

contents (TFC) and cytotoxicity of T. indica seed and pulp extracts in water and methanol

obtained from three different areas across Vietnam (Son La, Hai Phong and Sai Gon).

Moreover, the antioxidant capacity of these extracts was determined using the DPPH and

ABTS radical scavenging activity.

MATERIALS AND METHOD

Sample collection and preparation

Fresh tamarind fruits were collected from three different areas across Vietnam (Son La,

Hai Phong and Sai Gon) in February 2019 when they were close to ripe and dried at 70°C

for 6 hours. The brown peel was then removed, whereas the seeds and pulps were

thoroughly separated and dried to constant weight. The samples were then blended to a

homogeneous, soft powder and sieved through a 0.18mm sieve.

Sample extraction

The grounded powders (30g) of T. indica seeds or pulps were immersed in water or

methanol (50ml) over night at room temperature to form water extracts or methanol

extracts. The mixture was then sonicated in an ultrasonic bath for 20 minutes to accelerate

the extraction process. This process was repeated three times. Next, the extracts were

concentrated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure and controlled

temperature (50–60°C) to give final residues. All samples were stored at 4°C until further

use.

Determination of total phenolic content (TPC)

TPC of T. indica extracts was measured using Folin–Ciocalteu test referring to the

protocol developed by Zargoosh et al. (Zargoosh et al. 2019) with some modifications. In

brief, each extract was dissolved in DMSO 99.9% (v/v) in a test tube to yield a stock

solution at 5 mg/mL. 20 µL of the extract (5 mg/mL) was mixed with 50 µL of the Folin–

Ciocalteu reagent (diluted 10-fold with deionized water beforehand). After incubating for 5

minutes at room temperature, the mixture was added 100 µL of sodium carbonate (Na2CO3)

along with 230uL deionized water to reach a final volume of 400uL. After 30 minutes, the

absorbance of each mixture was measured using the UV-spectrophotometer at 760 nm

against a blank of DMSO.

A serial dilution (0.0125 to 0.4 mg/mL) of gallic acid was prepared to construct a

calibration curve of standard reference. The TPC of the gallic acid standards was analyzed

in parallel with T. indica extracts. The absorbance was measured using the UV-

spectrophotometer at 760 nm against a blank of methanol (MeOH). TPC from plant

extracts was expressed as mg/g of gallic acid equivalents in milligrams per gram (mg

GAE/g) of dry extract.

Determination of total flavonoid content (TFC)

Total flavonoid content of individual extract was determined following a procedure

described by Chang et al (2002) with some modifications. An aliquot of 120 µL of extract

solution (5–100 mg/mL) or quercetin (0.05–1 mg/mL) were mixed with 20 µL of NaNO2

10% (w/w). The mixture was incubated for 6 minutes before adding 20 µL AlCl3 10%

(w/w). After another 6 minutes, 200 µL of NaOH (1M) and 140uL ethanol 30% was added.

The final mixture was incubated for 30 minutes at room temperature. Quercetin serial

dilution was used to construct the TFC standard curve. The absorbance was then measured

at 490 nm against a reagent blank of DMSO (for plant extract) or methanol (for quercetin).

The outcome data were expressed as milligrams of quercetin equivalents per gram (mg

QE/g) of dry extract.

DPPH radical scavenging activity

The 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay (Brand-Williams et al. 1995) was

adopted to measure the free radical scavenging activity (RSA) of T. indica extracts. Briefly,

9 μL of either extract solution (6.25, 25, 100 µg/mL) or Ascorbic acid (positive control,

1.25, 2.5, 5, 10, 50 µg/mL) in DMSO was added to 171 μL of DPPH (0.1 mM) solution.

The mixture was incubated for 20 minutes in a dark area. The absorbance was measured at

the wavelength of 490 nm using a microplate spectrophotometer (Bio-Rad) against DMSO

as negative control. The percentage of inhibition of the DPPH radical was calculated as

follows:

% scavenging of DPPH• = [(control absorbance− extract absorbance)/ control absorbance]

× 100

A graph of inhibition percentages against extract concentrations was plotted and EC50

value (concentration that scavenged 50% of DPPH radical activity) was deduced. All

experiments were carried out in triplicate. EC50 values were reported as mean ± SD of

triplicates.

ABTS radical scavenging activity

In addition to the DPPH assay, the 2,2-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), commonly called ABTS+ scavenging activity, was also implemented. Initially, ABTS 7

mM solution was reacted with potassium persulfate (K2S2O8) 2.45 mM solution and left

overnight in a dark room to yield a dark blue solution containing ABTS radical cations

(ABTS+). The working solution was prepared by diluting the prepared ABTS+ solution in

ethanol to reach an absorbance of 0.70 ± 0.02 at 750 nm.

ABTS radical scavenging activity was assessed by mixing 9 μL of either T. indica

extract (6.25- 750 µg/mL) or Trolox (positive control, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 µg/mL) with

171 μL of ABTS working solution. The mixture was incubated for 10 minutes in a dark

area. The absorbance was measured at the wavelength of 750 nm using a microplate

spectrophotometer (xMark, Bio-Rad) against DMSO (sample negative control) and

absolute ethanol (Trolox negative control). The percentage of inhibition (I%) was

calculated as follows:

% scavenging of ABTS• = [(control absorbance− extract absorbance)/ control absorbance]

× 100

A graph of inhibition percentages (I%) against extract concentrations was plotted and

EC50 value (the concentration necessary for 50% reduction of ABTS) was constructed. All

experiments were carried out in triplicate. Data was reported as mean ± SD of triplicates.

Cytotoxicity evaluation

Toxicological profile of T. indica extracts were assessed using MTT (3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Briefly, Baby Hamster

Kidney fibroblast (BHK-21) cells were seeded into four 96- well plate at a concentration of 7×103 cells/ well. After 24 hours, T. indica water and methanolic extracts (1, 3, 9, 27, 81,

243, and 729 µg/mL) were treated into the plates and incubated for 48 hours prior to the

addition of MTT. The absorbance was measured at 570 nm against untreated control.

Statistical analysis

ANOVA test followed by Tukey’s test (p < 0.05) was used to analyze the differences

among TPC, TFC in two extraction solvents (methanol, water). Paired sample t-test was

used to analyze the cytotoxic effect of different concentrations of tamarind extracts with

regards to untreated control. The data were statistically analyzed using IBM SPSS Statistics

version 26 (Armonk, NY: IBM Corp). EC50 values (concentration that inhibits 50% of

DPPH/ABTS activities) of the extracts were calculated using CurveExpert Professional 2.7

software. A value of p < 0.05 was considered significant.

RESULTS AND DISCUSSIONS

Total phenolic content

Phenolic compounds in plants have been shown to have redox properties which permit

them to act as antioxidants (Soobrattee et al. 2005). In principle, total phenolic content

(TPC) was measured using the Folin–Ciocalteu reagent in every extract. TPC was calculated from a gallic acid calibration curve (y= 46.619x + 0.005, R2 = 0.9972) and

expressed in gallic acid equivalents (GAE) per gram extract weight (GAE/g extract)

(Figure 1).

1.0

0.9

0.8

0.7

y = 46.619x + 0.005 R² = 0.9972

0.6

0.5

y t i s n e d

l

0.4

0.3

a c i t p O

0.2

0.1

0.0

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

Final concentration (mg/ml)

Figure 1. Gallic acid calibration curve. The experiment was carried out in triplicate.

According to Table I, TPC contained in methanolic extracts (ranging from 56.616 ±

0.523 to 742.919 ± 50.360 mg GAE/g extract) is higher than in water extracts (ranging

from 30.555 ± 4.987 to 240.482 ± 3.312 mg GAE/g extract).

Regarding the plant origin, the seeds of T. indica from Sai Gon exhibit the highest TPC,

both in water (240.482 ± 3.312 mg GAE/g) and methanolic (742.919 ± 50.360 mg GAE/g)

extracts, as compared with seeds from the other two regions. On the other hand, the pulps

of T. indica from Son La contained the highest TPC, as seen in both water (35.184 ± 3.526

mg GAE/g) and methanolic (82.612 ± 2.888 mg GAE/g) extracts.

Sai Gon methanolic seed extract yielded even higher TPC than those in previous studies.

The highest polyphenolic content obtained from the Malaysian T. indica methanolic seed

extract was 572 ± 3.78 mg GAE/g (Razali et al. 2015). In the other hand, the highest

polyphenolic content obtained from the Egypt T. indica seeds in n-butanol fraction was

378± 11.7 mg GAE/g (Guneidy et al. 2020). The variability can be caused from their

distinct geographical origins or different extraction methods.

Table I. Total phenolic content of T. indica in water and methanolic extracts (mg GAE/g)

Site

Part of the plant

Water extracts

Methanolic extracts

(mg GAE/g)

(mg GAE/g)

(H1) 240.482 ± 3.312

(M1) 742.919 ± 50.360

Sai Gon

Seed

(H2) 30.555 ± 4.987

(M2) 56.616 ± 0.523

Pulp

(H3) 174.527± 7.887

(M3) 666.082 ± 35.248

Son La

Seed

(H4) 35.184± 3.526

(M4) 82.612 ± 2.888

Pulp

Hai Phong

Seed

(H5) 119.647± 2.963

(M5) 673.927 ± 36.114

(H6) 33.128± 2.802

(M6) 57.045 ± 0.142

Pulp

Total flavonoid content

Conventionally, total flavonoid contents in plant extracts were quantitatively determined

using aluminium chloride in a colorimetric method. In this study, TFC results were derived

from the calibration curve (y = 2.9776x + 0.0172, R² = 0.9934) of quercetin (0.05- 1

mg/mL) and expressed in quercetin equivalents (QE) per gram dry extract weight (mg QE/g

extract) (Figure 2). TFC in methanolic extracts widely ranged from 6.420 ± 0.007 to 68.492

± 0.023 (mg QE/g extract), indicating a ten- fold variation. TFC in water extracts ranged

approximately six- fold variation (from 3.652 ± 0.315 to 19.084 ± 0.115 mg QE/g extract).

Of note, methanolic extracts yields a significantly higher TFC than water extracts (p <

0.05). Methanol was considered as the most effective solvent to extract bioactive

compounds from plants (Truong et al. 2019). This is because methanol contains both polar

(hydroxyl, -OH) and non- polar (methyl, -CH3) groups which facilitates the extraction of

many polar and non- polar phenolic compounds from the plants. As previously reported,

high flavonoids were also observed for fraction of n-butanol (83 ± 6 mg rutin/g) from

Egyptian T. indica seeds (Guneidy et al. 2020).

0.8

y = 2.9776x + 0.0172 R² = 0.9934

0.7

0.6

0.5

y t i s n e d

l

0.4

0.3

a c i t p O

0.2

0.1

0.0

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Final concentration (mg/mL)

Figure 2. Quercetin calibration curve. The experiment was carried out in triplicate.

Table II. Total flavonoid content of T. indica in water and methanolic extracts (mg QE/g)

Site

Part of the plant

Water extracts

Methanolic extracts

(mg QE/g)

(mg QE/g)

(H1) 6.163 ± 0.025

(M1) 41.811 ± 0.621

Sai Gon

Seed

(H2) 5.550 ± 0.027

(M2) 6.420 ± 0.007

Pulp

(H3) 3.652 ± 0.315

(M3) 41.764 ± 0.015

Son La

Seed

(H4) 6.672 ± 0.009

(M4) 15.849 ± 0.710

Pulp

Hai Phong

Seed

(H5) 19.084 ± 0.115

(M5) 68.492 ± 0.023

(H6) 6.128 ± 0.015

(M6) 21.107 ± 1.169

Pulp

Antioxidant Potential

DPPH radical scavenging activity

The DPPH radical scavenging activities of T. indica seeds and pulps water extracts are

presented in Figure 3. All the extracts exhibited concentration- dependent DPPH radical

scavenging activities which were in the following order: H1> H3> H5> H6> H2> H4.

Given the range of extract concentrations (6.25, 25, 100 µg/mL) and ascorbic acid (1.25,

2.5, 5, 10, 50 µg/mL), only EC50 of ascorbic acid (11.6 µg/mL) and H1 (64.4 µg/mL) were

found. Thus, H1 (Sai Gon seed water extract) exhibited the strongest DPPH radical

scavenging activity compared to the other T. indica water extracts but weaker than that of

Ascorbic acid positive control.

80.00

70.00

60.00

50.00

40.00

H P P D f o g n i g n e v a c S %

30.00

20.00

10.00

0.00

0

20

100

120

40

80

60 Concentrations (µg/ml)

Figure 3. DPPH radical scavenging activity of T. indica water extract and ascorbic acid standard at different concentrations. Abbreviation: H1, Sai Gon seed water extract; H2 Sai Gon pulp water extract; H3, Son La seed water extract; H4, Son La pulp water extract; H5, Hai Phong seed water extract; H6, Hai Phong pulp water extract.

Figure ure 4 showed the DPPH radical scavenging activities of T. indica seeds and pulps

methanolic extracts which were in the following order: M3> M5 >M1 > M4 >M2> M6.

Given the range of extract concentrations (6.25, 25, 100 µg/mL), only EC50 values of M3

was deduced (52.5 µg/mL). In general, the seeds of T. indica from three areas exhibit

higher antioxidative activities than their pulps.

Cardoso and colleagues (2016) reported that the EC50 values of Brazilian tamarind

seeds, sweet variety ranged widely from 8.92 (CO2- 50% ethanol as extraction solvent) to

370.82 µg/mL (CO2- 10% ethanol as extraction solvent). In another study, EC50 values

using DPPH scavenging activity showed that n-butanol fraction of Egyptian T. indica seeds

has a powerful antioxidant capacity (2.1± 0.08 mg/g DW) (Guneidy et al. 2020). Even

though the samples originated from the same geographical regions (Brazilian tamarind

seeds), differences in extraction methods caused wide variability in the results of

antioxidant capacities, let alone different geographical locations.

80

70

60

50

40

30

20

10

H P P D f o g n i g n e v a c S %

0

0

20

100

120

60

80

40 Concentrations (µg/ml)

Figure 4. DPPH radical scavenging activity of T. indica methanolic extract and Ascorbic acid standard at different concentrations. Abbreviation: M1, Sai Gon seed methanolic extract; M2 Sai Gon pulp methanolic extract; M3, Son La seed methanolic extract; M4, Son La pulp methanolic extract; M5, Hai Phong seed methanolic extract; M6, Hai Phong pulp methanolic extract.

ABTS radical scavenging activity

The obtained data indicated that T. indica water extracts scavenged ABTS radical in a

dose-dependent manner (6.25- 100 µg/mL) (Figure 5). ABTS radical scavenging ability of

these samples can be ranked as H3 > H1 > H5 > H4 > H6> H2.

The ABTS radical scavenging activity of T. indica methanolic extracts were also

expressed in a dose-dependent manner (6.25- 750 µg/mL) (Figure 6). IC50 of Trolox (6.2

µg/mL), M3 (225 µg/mL), M5 (378.4 µg/mL) and M1 (471.6 µg/mL) were calculated from

this assay. Even though ABTS radical scavenging activity of the extracts was lower than

that of Trolox reference compound, their antioxidant activity could be considered good.

These data indicated that Tamarin seeds can be very potential natural antioxidants.

In this study, the radical scavenging activities of T. indica extracts were increased in a

dose- dependent manner but only in a limited range of concentrations. Above this

concentration range, the radical scavenging activities were decreased in a non- specific

manner (data not shown). This can be explained by the fact that beside the antioxidant

compounds, there were many other unknown substances exist in the same extract. When

increasing the extract concentration, the concentration of other substances in T. indica

extracts were also increased which might interfere with the radical scavenging capacities of

antioxidant compounds and led to the decrease in the scavenging capacity of total extracts.

100

90

80

70

60

+ S T B A

50

40

i

30

20

10

f o g n g n e v a c S %

0

0

20

80

60

100

120

40 Concentrations (µg/ml)

Figure 5. ABTS radical scavenging activity of T. indica water extracts and Trolox standard at different concentrations. Abbreviation: H1, Sai Gon seed water extract; H2 Sai Gon pulp water extract; H3, Son La seed water extract; H4, Son La pulp water extract; H5, Hai Phong seed water extract; H6, Hai Phong pulp water extract.

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

+ S T B A f o g n i g n e v a c S %

0

0

100

200

600

700

800

500

300 400 Concentrations (µg/ml)

Figure 6. ABTS radical scavenging activity of T. indica methanolic extracts and Trolox standard at different concentrations. Abbreviation: M1, Sai Gon seed methanolic extract; M2 Sai Gon pulp methanolic extract; M3, Son La seed methanolic extract; M4, Son La pulp methanolic extract; M5, Hai Phong seed methanolic extract; M6, Hai Phong pulp methanolic extract.

Previous studies have shown that the antioxidative capacity is greatly correlated with

the total flavonoid and total phenolic content of the plant leaves’ crude extract (Sim et al.

2010; Mustafa et al. 2010). Since we were not able to calculate the EC50 values of all the

extracts, it was difficult to understand if TPC and TFC were linearly correlated with

antioxidant capacities. Nevertheless, it was noticeable that M1, M3, M5 (T. indica seeds in

methanolic extracts) which contained the highest TPC, TFC also exhibit the strongest

DPPH and ABTS scavenging activities.

Cytotoxicity effect

Cytotoxicity effect of T. indica water and methanolic extracts (at 1, 3, 9, 27, 81, 243, and

729 µg/mL) on BHK-21 cells lines were illustrated in Error! Reference source not

found.7 and Error! Reference source not found.8, respectively. Table III. Cytotoxic

effect (% cell availability) of T. indica extracts on BHK-21 cells.

Extract

Concentration of the extract

1 µg/ml

3 µg/ml

9 µg/ml

27 µg/ml

81 µg/ml

243 µg/ml

729 µg/ml

H1

91.0 ± 1.6

93.35 ± 2.11

93.0 ± 3.1

92.9 ± 5.6

94.9 ± 3.8

76.7 ± 2.8

60.8 ± 2.4

(*)

(*)

H2

93.5 ± 4.2

93.6 ± 3.9

95.3 ± 2.0

84.3 ± 2.5

57.0 ± 4.2

37.4 ± 0.9

28.1 ± 3.0

(*)

(*)

(*)

H3

93.4 ± 2.3

90.6 ± 2.4

86.2 ± 2.6

94.1 ± 0.01

76.2 ± 2.0

59.8 ± 2.0

48.8 ± 2.0

(*)

(*)

(*)

(*)

H4

99.6 ± 7.8

97.0 ± 10.9

97.9 ± 12.1

94.0 ± 6.9

92.6 ± 3.1

91.7 ± 15.5

79.4 ± 0.8

H5

96.3 ± 3.3

95.9 ± 0.9

96.2 ± 1.3

91.6 ± 3.7

80.4 ± 9.4

68.7 ± 4.2

46.6 ± 0.4

(*)

H6

95.9 ± 3.3

98.0 ± 1.9

98.9 ± 1.9

94.0 ± 6.9

92.6 ± 3.1

91.7 ± 15.5

79.4 ± 0.8

M1

90.9 ± 1.5

90.5 ± 3.9

99.6 ± 3.9

88.1 ± 2.8

82.9 ± 8.9

66.6 ± 2.8

66.0 ± 6.4

(*)

M2

94.3 ± 2.7

96.6 ± 7.5

95.1 ± 0.2

94.2 ± 7.5

86.1 ± 3.0

58.2 ± 6.1

50.5 ± 2.6

(*)

(*)

(*)

M3

94.3 ± 7.9

92.3 ± 4.8

86.5 ± 11.4

83.8 ± 1.4

78.7 ± 4.0

52.7 ± 4.7

43.2 ± 6.3

M4

87.0 ± 1.5

87.0 ± 1.5

91.5 ± 0.01

90.3 ± 17.9

86.7 ± 0.7

82.5 ± 0.8

59.9 ± 0.2

(*)

(*)

(*)

(*)

M5

94.2 ± 8.3

100.8 ± 3.0

99.3 ± 2.9

89.1 ± 6.7

89.1 ± 9.9

66.3 ± 5.9

60.3 ± 2.0

(*)

M6

116.8 ± 1.2

104.6 ± 6.5

108.8 ±10.1

97.6 ± 3.8

93.4 ± 1.6

90.6 ± 6.2

46.2 ± 3.2

(*)

Data is represented as mean ± SD (n = 3). (*), p< 0.05

revealed that most T. indica extracts started to exert a significant toxicological effect on

BHK-21 cell lines from the concentration of 81 µg/mL compared to the control. Given the

concentration range, we could find the IC50 values of H2 (143.77 µg/mL), H3 (400.29

µg/mL), H5 (620.35 µg/mL), M3 (297.94 µg/mL) and M6 (694.713 µg/mL).

In the previous study which assessed the cytotoxic capacity of n-butanol T. indica

fraction for breast cancer cell line, MCF-7, the IC50 value is 68.5 μg/mL (Guneidy et al.

2020). Regarding the cytotoxic effects of the crude methanol seed extract of Malaysian T.

indica in liver cancer cell line, HepG2, the IC50 value was 104.71 ± 0.07 μg/mL (Razali et

al. 2015). Given the differences in the cell lines, the treated concentration range and the

extraction methods, the cytotoxicity of T. indica seed extracts varied between studies.

Nevertheless, given the lowest IC50 of 143.77 µg/mL, the extracts from Vietnamese T.

indica seeds and pulps could still be considered as safe.

EC50H2= 143.77 µg/ml EC50H3= 400.29 µg/ml EC50H5= 620.35 µg/ml

120

)

100

%

( y t c

80

i

60

x o t o t y C

40

20

0

Untreated

1

3

9

27

81

243

729

Concentration (µg/ml)

Figure 3. Determination of the cytotoxic activity of T. indica water extracts at different concentrations. Abbreviation: H1, Sai

Gon seed water extract; H2 Sai Gon pulp water extract; H3, Son La seed water extract; H4, Son La pulp water extract; H5, Hai Phong seed water extract; H6, Hai Phong pulp water extract.

EC50M3= 297.94 µg/ml EC50M6= 694.713 µg/ml

140

120

)

%

100

80

60

40

( y t c i x o t o t y C

20

0

Untreated

1

3

9

27

81

243

729

Concentration (µg/ml)

Figure 4. Determination of the cytotoxic activity of T. indica methanolic extracts at different concentrations. Abbreviation: M1,

Sai Gon seed methanolic extract; M2 Sai Gon pulp methanolic extract; M3, Son La seed methanolic extract; M4, Son La pulp

methanolic extract; M5, Hai Phong seed methanolic extract; M6, Hai Phong pulp methanolic extract.

Table III. Cytotoxic effect (% cell availability) of T. indica extracts on BHK-21 cells.

Extract

Concentration of the extract

1 µg/ml

3 µg/ml

9 µg/ml

27 µg/ml

81 µg/ml

243 µg/ml

729 µg/ml

H1

91.0 ± 1.6

93.35 ± 2.11

93.0 ± 3.1

92.9 ± 5.6

94.9 ± 3.8

76.7 ± 2.8

60.8 ± 2.4

(*)

(*)

H2

93.5 ± 4.2

93.6 ± 3.9

95.3 ± 2.0

84.3 ± 2.5

57.0 ± 4.2

37.4 ± 0.9

28.1 ± 3.0

(*)

(*)

(*)

H3

93.4 ± 2.3

90.6 ± 2.4

86.2 ± 2.6

94.1 ± 0.01

76.2 ± 2.0

59.8 ± 2.0

48.8 ± 2.0

(*)

(*)

(*)

(*)

H4

99.6 ± 7.8

97.0 ± 10.9

97.9 ± 12.1

94.0 ± 6.9

92.6 ± 3.1

91.7 ± 15.5

79.4 ± 0.8

H5

96.3 ± 3.3

95.9 ± 0.9

96.2 ± 1.3

91.6 ± 3.7

80.4 ± 9.4

68.7 ± 4.2

46.6 ± 0.4

(*)

H6

95.9 ± 3.3

98.0 ± 1.9

98.9 ± 1.9

94.0 ± 6.9

92.6 ± 3.1

91.7 ± 15.5

79.4 ± 0.8

M1

90.9 ± 1.5

90.5 ± 3.9

99.6 ± 3.9

88.1 ± 2.8

82.9 ± 8.9

66.6 ± 2.8

66.0 ± 6.4

(*)

M2

94.3 ± 2.7

96.6 ± 7.5

95.1 ± 0.2

94.2 ± 7.5

86.1 ± 3.0

58.2 ± 6.1

50.5 ± 2.6

(*)

(*)

(*)

M3

94.3 ± 7.9

92.3 ± 4.8

86.5 ± 11.4

83.8 ± 1.4

78.7 ± 4.0

52.7 ± 4.7

43.2 ± 6.3

M4

87.0 ± 1.5

87.0 ± 1.5

91.5 ± 0.01

90.3 ± 17.9

86.7 ± 0.7

82.5 ± 0.8

59.9 ± 0.2

(*)

(*)

(*)

(*)

M5

94.2 ± 8.3

100.8 ± 3.0

99.3 ± 2.9

89.1 ± 6.7

89.1 ± 9.9

66.3 ± 5.9

60.3 ± 2.0

(*)

M6

116.8 ± 1.2

104.6 ± 6.5

108.8 ±10.1

97.6 ± 3.8

93.4 ± 1.6

90.6 ± 6.2

46.2 ± 3.2

(*)

Data is represented as mean ± SD (n = 3). (*), p< 0.05

CONCLUSION

In this study, assessment of total phenolic and flavonoid content as well as free radical

scavenging activity showed that the seeds and pulps from T. indica can be the potent source

for natural antioxidants. The methanolic extracts yielded the highest TPC (742.919 ±

50.360 GAE/g extract), TFC (68.492 ± 0.023 mg QE/g extract) and possessed highest free

radical scavenging capacity (EC50 of 52.5 µg/mL) compared to water extracts. The

variability in phytochemical properties of these extracts could be explained by the

difference in their geographic origins (Sai Gon, Son La or Hai Phong) as well as what type

of plant components they were (T. indica seeds possessed higher TPC, TFC and antioxidant

activity than those of pulps). Regarding the safety, in vitro analysis showed that the extracts

from Vietnamese T. indica seeds and pulps were considerably safe (lowest IC50= 143.77

µg/mL). In general, tamarind seeds possessed the highest phenolic and flavonoid contents,

exhibited the strongest antioxidative capacities, and only became toxic to BHK-21 cell line

at very high concentrations (IC50 values ranging from 400.29 µg/mL to 620.35 µg/mL).

Regarding the safety of these extracts, in vitro analysis showed that they were not very

toxic (cell viability > 80%). While further toxicological assays are in need, the data of this

study provided evidences for the use of tamarind in ethnomedicine and their therapeutic

potential in modern medicine.

Acknowledgments: This research is funded by Vietnam National Foundation for Science

and Technology Development (NAFOSTED) under grant number 106.02-2018.24.

REFERENCES

Alfadda AA. and Sallam RM (2012) Reactive oxygen species in health and disease. J

Biomed Biotechnol 2012: 936486.

Babbar N, Oberoi HS, Sandhu SK (2015) Therapeutic and nutraceutical potential of

bioactive compounds extracted from fruit residues. Crit Rev Food Sci Nutr 55: 319-337.

Bendary E, Francis RR, Ali HMG, Sarwat MI, El Hady S (2013) Antioxidant and

structure–activity relationships (SARs) of some phenolic and anilines compounds. Annals

of Agricultural Sciences 58: 173-181.

Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C (1995) Use of a free radical method to evaluate

antioxidant activity. LWT - Food Science and Technology 28: 25-30.

Cardoso Lima Reis PM, Dariva C, Barroso Vieira GA, Hense H (2016) Extraction and

evaluation of antioxidant potential of the extracts obtained from tamarind seeds

(Tamarindus indica), sweet variety. Journal of Food Engineering 173: 116-123.

Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern CJ. (2002) Estimation of Total Flavonoid Content

in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods. Journal of Food and Drug

Analysis 10: 178-182.

Kurutas EB (2016) The importance of antioxidants which play the role in cellular response

against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutrition Journal 15: 71.

Mustafa RA, Hamid AA, Mohamed S, Bakar FA (2010) Total phenolic compounds,

flavonoids, and radical scavenging activity of 21 selected tropical plants. J Food Sci 75:

C28-35.

Razali N, Junit SM, Ariffin A, Ramli NS, Aziz AA (2015) Polyphenols from the extract

and fraction of T. indica seeds protected HepG2 cells against oxidative stress. BMC

Complement Altern Med 15: 438.

Ronald LP, Guohua C (2000) Antioxidant Phytochemicals in Fruits and Vegetables: Diet

and Health Implications. HortScience HortSci 35: 588-592.

Sim K, Malek SNA, Wahab N (2010) Phenolic content and antioxidant activity of crude

and fractionated extracts of Pereskia bleo (Kunth) DC. (Cactaceae). African Journal of

Pharmacy and Pharmacology 4.

Soobrattee MA, Neergheen VS, Luximon-Ramma A, Aruoma OI, Bahorun T (2005)

Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions. Mutat Res

579: 200-213.

Sudjaroen Y, Haubner R, Wurtele G, Hull WE, Erben G, Spiegelhalder B, Changbumrung

S, Bartsch H, Owen RW (2005) Isolation and structure elucidation of phenolic antioxidants

from Tamarind (Tamarindus indica L.) seeds and pericarp. Food Chem Toxicol 43: 1673-

1682.

Truong DH, Nguyen DH, Ta NTA, Bui AV, Do TH, Nguyen HC (2019) Evaluation of the

Use of Different Solvents for Phytochemical Constituents, Antioxidants, and In Vitro Anti-

Inflammatory Activities of Severinia buxifolia. Journal of Food Quality 2019: 8178294.

Tsuda, T., M. Watanabe, K. Ohshima, A. Yamamoto, S. Kawakishi and T. Osawa (1994)

Antioxidative Components Isolated from the Seed of Tamarind (Tamarindus indica L.).

Journal of Agricultural and Food Chemistry 42: 2671-2674.

Tungmunnithum, D., A. Thongboonyou, A. Pholboon and A. Yangsabai (2018) Flavonoids

and Other Phenolic Compounds from Medicinal Plants for Pharmaceutical and Medical

Aspects: An Overview. Medicines (Basel) 5.

Young, I. S. and J. V. Woodside (2001) Antioxidants in health and disease. J Clin Pathol

54: 176-186.

Zargoosh, Z., M. Ghavam, G. Bacchetta and A. Tavili (2019) Effects of ecological factors

on the antioxidant potential and total phenol content of Scrophularia striata Boiss. Sci Rep

9: 16021.

TOTAL PHENOLIC CONTENT, FLAVONOID CONTENT AND ANTIOXIDANT

ACTIVITIES OF TAMARIND SEED EXTRACTS

Le Phuong Ha1, Nguyen Van Ngoc2, Nguyen Thi Trang Huyen1, Le Thi Thu Hang1, Nguyen Thi Kieu Oanh1, Nguyen Thi Mai Phuong2,3, Nguyen Thi Hong Minh1,*

1Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam. 2Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18

Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam. 3Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng

Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam.

*Tác giả liên hệ: Nguyễn Thị Hồng Minh; tel. +84 943936511; e-mail: nguyen-thi-

hong.minh@usth.edu.vn

TÓM TẮT

Nền tảng nghiên cứu: Cây me (Tamarindus indica) đã được biết đến từ lâu bởi hàm lượng

dinh dưỡng cao và tiềm năng sử dụng làm dược phẩm. Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều

nghiên cứu về hàm lượng chất chống oxy hóa, hàm lượng phenolic và flavonoid trong quả

me trồng ở Việt Nam. Mục đích của nghiên cứu này là so sánh dịch chiết hạt và thịt quả

(trong nước hoặc methanol) của cây me từ ba vùng khác nhau ở Việt Nam (Sài Gòn, Sơn

La, Hải Phòng) về tổng hàm lượng phenolic (TPC), tổng hàm lượng flavonoid (TFC) và

khả năng chống oxy hóa, đồng thời đánh giá độc tính của chúng trên dòng tế bào BHK- 21.

Vật liệu và phương pháp: TPC và TFC được đánh giá lần lượt bằng thuốc thử Folin -

Ciocalteu và aluminium chloride. Các thí nghiệm quét gốc tự do 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH) và 2,20-azinobis (ABTS) được sử dụng để khảo sát khả năng chống

oxy hóa của các dịch chiết. Độ an toàn của các dịch chiết từ T. indica được đánh giá bằng

phương pháp MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide).

Kết quả: Dữ liệu cho thấy dịch chiết methanol có TPC (742,919 ± 50,360 mg GAE/g

extract), TFC (68,492 ± 0,023 mg QE/g extract) cao nhất và có khả năng quét gốc tự do

mạnh hơn (IC50 là 52,5 µg /mL) so với dịch chiết nước. Hạt T. indica từ cả ba vùng có

TPC, TFC và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với thịt quả me. Về tính an toàn của các

chiết này, thí nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết methanol có thể gây độc cho các tế bào

được thử nghiệm bắt đầu từ nồng độ 32 µg/mL, trong khi các dịch chiết nước không ảnh

hưởng đến khả năng sống sót của tế bào BHK-21 ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm.

Kết luận: Dữ liệu từ nghiên cứu này cho thấy hạt và thịt quả me có thể dùng làm thực

phẩm chức năng cũng như là chất chống oxy hóa tiềm năng trong dược phẩm.

Từ khóa: ABTS, chất chống oxi hóa, DPPH, Tamarindus indica.