Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:96

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài Râu mèo nhằm xác định đúng loài cây phục vụ bảo tồn và phát triển cây dược liệu. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP CHU SỸ CƯỜNG XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY RÂU MÈO (ORTHOSIPHON ARISTATUS (BLUME) MIQ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Văn Việt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ. Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn. Học viên Chu Sỹ Cường
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Việt đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Học viên Chu Sỹ Cường
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Râu mèo .......................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại .................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Râu mèo................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây Râu mèo ......................................................... 4 1.1.4. Giá trị dược liệu, công dụng ....................................................................... 4 1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào ................................................................ 8 1.2.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật..... 8 1.2.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ..... 9 1.3. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu và Cây Râu mèo ........... 10 1.3.1.Nghiên cứu trong nước .............................................................................. 11 1.3.2. Thế giới ...................................................................................................... 13 1.4. Tổng quan về mã vạch ADN................................................................ 15 1.4.1. Giới thiệu về mã vạch ADN (DNA barcode) ........................................... 15 1.4.2. Một số mã vạch ADN thường được sử dụng ........................................... 18 1.4.3. Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN ở thực vật ...................................... 23 Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................... 28 2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 28 2.3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ........................................................... 28 2.3.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 28
iv 2.3.2. Hóa chất ..................................................................................................... 28 2.3.3. Dụng cụ - máy móc ................................................................................... 29 2.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................. 30 2.4.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 30 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 30 2.4.3. Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá ........................................................................ 36 2.4.4. Phương pháp theo dõi ............................................................................... 37 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 37 2.5. Địa điểm và thời gian bố trí thí nghiệm ............................................... 37 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 38 3.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cây Râu mèo ........................ 38 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................... 38 3.1.2. Kết quả nhân bản các đoạn ADN mã vạch ............................................. 39 3.1.3. Phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN với các đoạn mồi khác nhau ......................................................................................................... 43 3.1.4. So sánh hiệu quả giám định loài của ba trình tự ADN mã vạch ITS, psbA - trnH,và rbcL ........................................................................................... 53 3.2. Kết quả nhân giống Râu mèo bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ............ 54 3.2.1. Kết quả tạo mẫu sạch in vitro Râu mèo ................................................... 54 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi. ........................................................................................................... 57 3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây Râu mèo khi ra ngôi........................................................................... 61 3.2.5. Nghiên chứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây con......................................................................................................................... 64 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ ........................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69 PHỤ BIỂU
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ TT Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt viết tắt 1 -Naphthalene Acetic 1 -NAA 1 -Naphthalene Acetic Acid Acid Axit deoxyribonucleic 2 ADN Axit deoxyribonucleic acid 3 ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat 4 BAP 6-Bezyl amino purine 6-Bezyl amino purine 5 BME ß-mereaptoethanol ß-mereaptoethanol Barcode of Life Data 6 BOLD Cơ sở dữ liệu mã vạch ADN Systems 7 Bp Base pair Cặp base Consortium for the Hiệp hội mã vạch của sự 8 CBOL Barcode of Life sống Convention on International Trade in Công ước về buôn bán quốc 9 CITES Endangered Species of tế các loài nguy cấp Wild Fauna Flora 10 cpDNA Chloroplast DNA Bộ gen lục lạp 11 CT Công thức Cetyl Cetyl trimethylammonium 12 CTAB trimethylammonium bromide bromide 13 ĐC Đối chứng Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid 14 dNTP triphosphate triphosphate Ethylenediamine axit ethylenediamine 15 EDTA tetraacetic acid tetraacetic 16 IBA Indole -3 -Butyric Acid Indole -3 -Butyric Acid
vi Các chữ TT Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt viết tắt 17 IGS intergenic Vùng liên kết gen 18 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base Kinetin (6 -furfurol amino Kinetin (6 -furfurol amino 19 KIN purine) purine) Murashige & Skoog, 10 MS Murashige & Skoog, 1962 1962 21 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể Trung tâm Quốc gia về NAD(P) Nicontinamide adenine 22 Thông tin Công nghệ sinh H dinucleotide phosphate học National Center for Trung tâm thông tin Công 23 NCBI Biotechnology Information nghệ sinh học Hoa Kỳ 24 ORF Open Reading Frame khung đọc mở Polymerase Chain 25 PCR Phản ứng chuỗi polymerase Reaction 26 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 27 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 29 SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate 30 Ta Nhiệt độ gắn mồi Tris – Acetic acide – 31 TAE Tris – Acetic acide – EDTA EDTA 32 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 33 UV Untraviolet Tia cực tím
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự và thông tin về cặp mồi đặc hiệu .............................. 29 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR .................................................... 32 Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ............................................. 33 Bảng 3.1. Bảng so sánh kết quả giám định loài Râu mèo của các đoạn trình tự ITS, psbA - trnH và rbcL........................................................... 53 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh chồi ................................................................................................ 55 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi..... 58 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ................... 60 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống ........ 62 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống ......... 65
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái cây Râu mèo ............................................................. 4 Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng số của 4 mẫu Râu mèo .................. 38 Hình 3.2. Kết quả nhân đoạn gen ITS từ các mẫu Râu mèo dùng mồi ITS_F và ITS_R ..................................................................................... 40 Hình 3.3. Kết quả nhân đoạn gen psbA-trnH từ các mẫu Râu mèo thu được dùng mồi psbA-trnH_F và psbA-trnH_R ...................................... 41 Hình 3.4. Kết quả nhân đoạn gen rbcL từ các mẫu Râu mèo thu được dùng mồi rbcL_F và rbcL_R ................................................................. 42 Hình 3.5. Trình tự nucleotide của đoạn mã vạch ITS ở các mẫu Râu mèo . 44 Hình 3.6. So sánh trình tự ITS của Râu mèo (query) với loài Râu mèo (FJ593403.1) trên ngân hàng gen NCBI (sbjct) ...................................... 46 Hình 3.7. Cây quan hệ di truyền của loài Râu mèo với 06 loài có trình tự ITS tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI ................................. 47 Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn mã vạch psbA – trnH ở các mẫu Râu mèo ................................................................................................ 47 Hình 3.9. So sánh trình tự psbA – trnH của Râu mèo (query) với loài Râu mèo (LC456393.1) trên ngân hàng gen NCBI (sbjct) ............................. 49 Hình 3.10. Cây quan hệ di truyền của loài Râu mèo với 06 loài có trình tự psbA - trnH tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI .................... 49 Hình 3.11. Trình tự nucleotide của đoạn mã vạch rbcL ở các mẫu Râu mèo ....................................................................................................... 50 Hình 3.12. So sánh trình tự rbcL của Râu mèo (query) với loài Râu mèo (LC456392.1) trên ngân hàng gen NCBI (sbjct) ..................................... 52 Hình 3.13. Cây quan hệ di truyền của loài Râu mèo với 06 loài có trình tự rbcL tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI ............................... 53 Hình 3.14. Mẫu sạch nảy chồi ở CT4 sau 4 tuần .................................... 56
ix Hình 3.15. Cụm chồi Râu mèo (A) và bình chồi Râu mèo (B) trên môi trường RM2 ........................................................................................... 59 Hình 3.16. Rễ cây Râu mèo của công thức R2 (0,3 mg/l NAA) .............. 61 Hình 3.17. Cây con Râu mèo hoàn chỉnh trong các môi trường R1, R2, R3 và R4 ..................................................................................................... 61 Hình 3.18. Cây Râu mèo trồng trong bầu sau 7 ngày ở công thức T0 (A) và T3 (B) ............................................................................................... 64 Hình 3.19. Cây Râu mèo mới trồng (A) và sau 1 tháng trồng (B) ở công thức RB1 ............................................................................................... 66 Hình 3.20. Cây Râu mèo mới trồng (A) và sau khi trồng 1 tháng (B) ở công thức RB3 ....................................................................................... 66
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Nhiều loài thực vật trong tự nhiên đã và đang được con người biết đến với nhiều giá trị sử dụng về kinh tế, y học, nghiên cứu,…Trong đó không thể không nhắc đến nhóm thực vật có tác dụng dược lý, được sử dụng phổ biến trong nhiều bài thuốc dân gian và cả trong y học hiện đại. Tuy nhiên, tình trạng khai thác quá mức và khai khác rừng bừa bãi đã làm một số loài cây thuốc quý đang ngày càng khan hiếm, trong đó có cây Râu mèo. Râu mèo được biết đến như là vị thuốc làm tăng lượng nước tiểu và thúc đẩy sự bài tiết urê, các chlorua và acid uric, có tác dụng tốt đối với các chứng rối loạn đường tiêu hóa, bệnh thấp khớp, đau lưng, đau nhức khớp xương. Ngoài ra, Râu mèo còn có tác dụng tốt đối với bệnh xung huyết gan và bệnh đường ruột. Hiệu quả của nó là do tác dụng kết hợp của glycosid với các muối kiềm, các chất giống như tanin của dầu thơm và của một saponin. Hiện nay nhu cầu của con người về nguồn dược liệu trên ngày càng tăng, tuy nhiên loài cây này trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức, các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên, nên việc nghiên cứu nhân giống và bảo tồn là rất cần thiết, cấp bách đối với việc lưu giữ nguồn gen quý này. Mã vạch ADN là những đoạn ADN ngắn, nằm trong hệ gen (nhân, lục lạp và ty thể) đặc trưng của mỗi loài sinh vật. Do đó việc xác định loài bằng mã vạch ADN có độ chính xác rất cao. Phương pháp này trở thành công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền các loài. Cây Râu mèo có thể được nhân giống bằng các phương pháp, gieo hạt và giâm hom, những biện pháp nhân giống này đều có những ưu điểm nhất
2 định nhưng không tránh khỏi những nhược điểm như cây sinh trưởng không đồng đều, hệ số nhân thấp, phụ thuộc mùa vụ. Để giải quyết những nhược điểm trên, phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã rút ngắn được thời gian và cho phép nhân nhanh để tạo được số lượng rất lớn cây giống Râu mèo trong thời gian ngắn, vẫn đảm bảo hàm lượng hoạt chất ổn định, không nhiễm bệnh, ưu việt hơn so với các phương pháp truyền thống trên. Với mục tiêu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài Râu mèo nhằm xác định đúng loài cây phục vụ bảo tồn và phát triển cây dược liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”.
3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Râu mèo 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại Cây Râu mèo hay còn gọi là Cây Bông Bạc, với danh pháp khoa học là Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq., Họ: Bạc hà (Lamiaceae), Bộ: Hoa môi (Lamiales), Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida), Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta). Ở Việt Nam, chi Orthosiphon có khoảng 40 loài trên thế giới, phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi và Châu Dại Dương. Vùng nhiệt đới Đông Nam Á được coi là nơi tập trung và có tính đa dạng cao về thành phần loài của chi, trong đó Việt Nam có 8 loài [1]. Phân loại: Giới (regnum) Plantae Bộ (ordo) Lamiales Họ (familia) Lamiaceae Chi (genus) Orthosiphon Loài (species) O.stamineus 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Râu mèo. Râu mèo là cây thảo, sống lâu năm, cao khoảng 0,3 - 0,5m, có khi hơn. Thân mảnh cứng, hình vuông, mọc đứng, thường có màu nâu tím, nhẵn hoặc có ít lông, ít phân cành. Lá mọc đối, hình trứng, dài 4 - 6 cm, rộng 2,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu nhọn, mép khía răng to, gân lá hơi nổi rõ ở mặt dưới, cuống lá dài 3 - 4 cm [1]. Cụm hoa mọc thẳng ở ngọn thân và đầu cành, dài 8 - 10 cm, gồm 6 - 10 vòng, mỗi vòng có 6 hoa màu trắng hoặc hơi tím; lá bắc nhỏ rụng sớm; đài hình chuông có 5 răng, răng trên rộng, tõe ra ngoài; tràng hình ống hẹp, thẳng hoặc hơi cong, dài 2 cm, môi trên chia 3 thùy, môi dưới nguyên; nhị mọc thò ra ngời hoa, dài gấp 2 - 3 lần tràng, chỉ nhị mảnh, nhẵn; vòi nhụy dài hơn nhị [1]. Quả bế, tự, nhỏ, nhẵn. Mùa hoa quả: tháng 4 – 7.
4 (FI. Hain.1977) Hình 1.1. Hình thái cây Râu mèo (A)_ Hoa Râu mèo; (B)_ Ảnh vẽ các bộ phân chi tiết của hoa Râu mèo: 1. Gốc thân và cành mang hoa; 2. Hoa; 3. Đài; 4. Đài mở với các tuyến; 5. Tràng mở; 6. Nhụy; 7. Quả 1.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây Râu mèo Râu mèo thích hợp với mọi loại đất, ưa khí hậu nóng, ẩm, sinh trưởng mạnh vào mua hè và mùa thu nhưng không chịu được úng. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc trên đất giàu chất mùn ở ven rừng, gần bờ nước hoặc trong thung lũng. Độ cao phân bố của cây từ khoảng 10m (ở Phú Yên) đến 600m (ở Cao Bằng). Cây sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa đông có hiện tượng bán tàn lụi ở phần thân cành trên mặt đất. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt nhưng tỷ lệ nảy mầm thường rất thấp. Râu mèo tái sinh chồi khỏe, nhất là những phần còn lại sau khi bị cắt [1]. 1.1.4. Giá trị dược liệu, công dụng Cây Râu mèo dược thu hái các bộ phận của toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô. Lá Râu mèo chứa một saponin, một alcaloid, tinh dầu 0,2 - 0,6%, tanin, acid hữu cơ (acid tartric, acid citric và acid glycolic) và dầu béo.
5 Saponin khi thủy phân cho sapogenin và đường là arabinose và glucose (hoặc fructose). Phần không xà phòng hóa của dầu béo gồm β- sitosterol và α- amyrin. Hoạt tính của lá do có hàm lượng Kali cao (0,7 - 0,8%) và một lượng glycosid đắng là orthosiphonin [1]. Lá khô và ngọn tươi có hoa chứa các chất vô cơ khoảng 12% với hàm lượng Kali cao (600 - 700 mg/100g lá tươi), favonoid (sinensetin, 3’- hydroxy - 3, 6, 7, 4’-tetramethoxy flavon, tetramethylscutelarein), các dẫn chất của acid cafeic (chủ yếu là acid rosmarinic, acid 2,3- dicafeoyltartaric), inositol, phytosterol (β-sitosterol), saponin, tinh dầu 0,7% [1]. Theo Schmidt S. et al (1985), tinh dầu lá, cành và thân chứa β- caryophylen, β-elemen, humulen, β-bourbonen và 1-octen-3-ol, caryophyllen oxyd [1]. Cây râu mèo còn chứa methylripariochromen A, orthosiphol A 16,75%, carotenoid (α-caroten, β-caroten, 3-zeacaroten và cryptoxanthin). Theo Takeda Yoshio et al (1993), cây Râu mèo có orthosiphol A, B, D, salvigenin và một số hợp chất khác. Cây Râu mèo là một dược liệu đã dùng lâu đời ở Ấn Độ, Indonesia trong các bệnh về thận và bàng quang. Ở Châu Âu nhập và sử dụng vào cuối thế kỷ XIX. Theo tác giả Chow S. Y, Liao J. F (Đài Loan), dịch chiết từ cây Râu mèo trên chó thí nghiệm bằng đường tiêm truyền tĩnh mạch với liều 18,8 mg/kg/phút có tác dụng tăng cường bài tiết nước tiểu và các chất điện giải Na+, K+, Cl-. Trên chuột nhắt trắng, Râu mèo bằng đường tiêm xoang bụng với liều 2- 4 g/kg làm giảm hoạt động vận động của chuột. Trên chó, bằng đường tiêm tĩnh mạch với liều 0,179 g/kg có tác dụng hạ huyết áp và làm giảm tần số hô hấp. Dịch chiết bằng cồn của Râu mèo trên chuột nhắt trắng bằng đường tiêm xoang bụng có LD50= 196 g/kg.
6 Các tác giả Schut G.A và Zwavinng J.H (Hà Lan) đã xác định tác dụng lợi tiểu của 2 flavon sinensetin và 3’-hydroxy-3,6,7,4’ tetramethoxyflavon của Râu mèo. Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, chất 3’-hydroxy-3,6,7,4’ tetramethoxyflavon bằng đường tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg, lượng nước tiểu thu được sau 140 phút là 410 mg, còn sinensetin dùng cùng liều trên, lượng nước tiểu thu được sau 160 phút là 614 mg, trong khi đó ở lô chuột đối chứng, sau 120 phút, không thu được một lượng nước tiểu nào. Hai flavon trên dùng với liều 1 mg/kg có so sánh với tác dụng của hydrochlorothiazid thấy tác dụng lợi tiểu yếu hơn và xuất hiện chậm. Đồng thời, các tác giả cũng khẳng định 2 flavon trên với liều 10 mg/kg trên chuột cóng trắng khoog thể hiện tác dụng lợi mật tuy trong y học cổ có ghi nhận là Râu mèo có tác dụng lợi mật. Xuất phát từ tác dụng điều trị của Râu mèo, 2 tác giả trên ddaxx tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm và tác dụng kháng khuẩn của các flavon chiết tách từ Râu mèo. Kết quả cho thấy trên thí nghiệm gây viêm bằng phương pháp cấy viên bông (cotton- pellet), sinensetin không thể hiện tác dụng chống viêm. Về tác dụng kháng khuẩn, đã nghiên cứu với các chủng Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Enterococcus là những chủng có thể gây nhiễm đường tiết niệu, kết quả cho thấy cả 3 flavon sinensetin, tetramethylscutellarein và 3’- hydro - 3,6,7,4’ tetramethoxyflavon đều không có tác dụng kháng khuẩn đối với những chủng đã nêu [1]. Về dược lý lâm sàng, theo các tác giả Ấn Độ, Râu mèo rất có ích cho điều trị bệnh thận và phù thũng. Trên bệnh nhân, Râu mèo có tác dụng làm kiềm hóa máu, sự có mặt của hoạt chất orthosiphonin và muối kali trong dược liệu có tác dụng giữ cho acid uric và muối urat ở dạng hòa tan, do đó phòng ngừa được sự lắng đọng của chúng để tạo thành sỏi thận. Ở Thái Lan, thí nghiệm trên những người tình nguyện khỏe mạnh, dịch chiết Râu mèo có tác dụng làm tăng sự bài tiết citrat và oxalat; Oxalat với hàm lượng cao có thể
7 tăng nguy cơ hình thành sỏi thận, sự bài tiết citrat được tăng cường giúp ngăn ngừa sự hình thành sỏi thận [1]. Ngoài ra, dịch chiết lá Râu mèo có tác dụng hạ đường huyết ở những bệnh nhân tiểu đường, nhưng tác dụng này không hằng định, cơ chế tác dụng có thể là do kích thích sự hình thành glycogen ở gan. Các chất sinensetin và tetramethylscutellarein có tác dụng ức chế tế bào u báng [1]. Râu mèo có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, tiêu viêm, trừ thấp. Râu mèo làm tăng lượng nước tiểu và thúc đẩy sự bài tiết ure, các chlorua và acid uric. Có tác dụng tốt đối với các chứng rối loạn đường tiêu hóa, bệnh thấp khớp, đau lưng, đau nhức khớp xương. Còn có tác dụng tốt đối với bệnh xung huyết gan và bệnh đường ruột. Hiệu quả của nó là do tác dụng kết hợp của glycosid với các muối kiềm, các chất giống như tanin của dầu thơm và của một saponin. Dịch chiết bằng nước giàu hoạt chất hơn (28,8%) [2]. Theo kinh nghiệm dân gian, Râu mèo được dùng làm thuốc lợi tiểu trong điều trị bệnh viêm thận, sỏi thận, sỏi mật, tê thấp, phù thũng, viêm gan. Tài liệu Ấn Độ coi nước hãm lá Râu mèo là thuốc điều trị đặc hiệu các bệnh thận và bàng quang, ngoài ra còn điều trị bệnh thấp khớp và bệnh gút [1]. Liều dùng: 5 - 12 gr lá hãm với nước sôi, chia làm 2 lần uống trước khi ăn cơm 15 - 30 phút. Nên uống lúc dịch hãm còn nóng. Hoặc cũng có thể sắc nước uống. Thường dùng liên tục 8 ngày, nghỉ 2 - 4 ngày lại tiếp tục nếu cần thiết. Có thể nấu thành cao lỏng, mỗi ngày dùng 2 - 5g cao. Cao lỏng Râu mèo được dùng làm thuốc hạ đường huyết trong bênh tiểu đường. Nếu dùng cả cây Râu mèo thì liều lượng hàng ngày là 30- 40g, dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác [1]. Có tài liệu cho rằng, khi cây Râu mèo ra hoa phải ngắt bỏ hoa vì hoa sẽ làm giảm lượng hoạt chất trong lá. Gần đây, một số bác sĩ Việt Nam và Thụy Điển đã sử dụng Râu mèo trên lâm sàng cho bệnh nhân ở Bệnh viện Việt
8 Nam - Thụy Điển ở Uông Bí và thấy thuốc không làm tăng lượng nước tiểu bài tiết trong vòng 12 - 24 giờ và cũng không ảnh hưởng đến bài tiết Na+ [1]. 1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây [26] đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật. 1.2.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Khái niệm: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [24]. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlt vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20: “Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Ngày nay các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là
9 IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus) [22]. 1.2.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Giai đoạn chuẩn bị: Là bước đầu tiên của quy trình nhân giống. Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu. Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Sau đó chọn chế độ khử trùng thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các tác nhân hoá học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl 2, NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2,... để khử trùng mẫu. Nồng độ chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng độ thấp, mô già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khử trùng với nhau. Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng. Thời gian khử trùng được xác định bằng thực nghiệm đối với từng loài cây hoặc mô nuôi cấy. Nhìn chung, mô non khử trùng trong thời gian ngắn, mô già trong thời gian dài hơn. Giai đoạn nuôi cấy khởi động: Là giai đoạn ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy. Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trình nhân nhanh tiếp sau đó.
10 Giai đoạn nhân nhanh: Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi, các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân nhanh. Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1 - 2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh là vào khoảng 10 - 36 tháng. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ, ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống. Giai đoạn vườn ươm: Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in vitro khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Khi đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc” do thay đổi về điều kiện môi trường cần có giai đoạn thích nghi. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao. 1.3. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu và Cây Râu mèo Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt là đối với những cây khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật nói chung và nguồn gen cây thuốc nói riêng.