Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Tách, xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH XUÂN CHUNG TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ VI NẤM BIỂN Paraconiothyrium sp. VK-13 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN-2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH XUÂN CHUNG TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ VI NẤM BIỂN Paraconiothyrium sp. VK-13 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 844.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. TRẦN HỒNG QUANG

THÁI NGUYÊN-2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ,

chuyên ngành Hóa phân tích, Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học

– Đại học Thái Nguyên, tôi đã luôn nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ của các

thầy cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.

Lời đầu tiên với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời

cảm ơn tới TS Trần Hồng Quang ( Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm khoa

học và Công nghệ Việt Nam ) - người đã truyền cho tôi tri thức cũng như tâm

huyết nghiên cứu khoa học, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều

kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo Khoa

Hóa Học, các thầy cô trong Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa Học - Đại

học Thái Nguyên đã giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và

thời gian ,đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn

thành luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã

luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Luận văn được sự đồng ý sử dụng một phần nội dung của Nhiệm vụ hợp

tác quốc tế cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (mã số

Nhiệm vụ: VAST.HTQT.HANQUOC.03/17-18)

Trong quá trình thực hiện luận văn do còn hạn chế về mặt thời gian cũng

như trình độ chuyên môn của bản thân nên không tránh khỏi những thiếu sót.

Rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô, bạn bè và

đồng nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Đinh Xuân Chung

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... a

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... B

DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. C

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Chương 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3

1. Sơ lược về phương pháp sắc ký : ............................................................... 3

1.1. Định nghĩa ................................................................................................. 3

1.2. Nguyên tắc của sắc ký .............................................................................. 3

1.3 Các giai đoạn của quá trình sắc ký ……………………………………….3

1.4. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng ...................................................... 4

2.Sơ lược về phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............. 11

2.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H ........................ 15

2.1.1. Cường độ vạch phổ ............................................................................... 15

2.1.2. Phân loại phổ ......................................................................................... 16

2.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C ............................................. 21

2.2.1. Phổ 13C tương tác 1H ........................................................................... 22

2.2.2. Phương pháp phổ 13C xóa tương tác 1H .............................................. 23

3. Tình hình nghiên cứu vi nấm biển trên thế giới ..................................... 24

Chương 2: THỰC NGHIỆM ........................................................................... 29

2.1. Thực nghiệm: .......................................................................................... 29

2.1.1. Mẫu nghiên cứu: ................................................................................. 29

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 29

2.2. Dụng cụ và hóa chất ................................................................................. 31

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết và phân tích sắc ký ................................ 31

2.2.2. Thiết bị phân tích xác định cấu trúc ...................................................... 31

2.2.3. Hóa chất sử dụng phân tích sắc ký và cấu trúc ..................................... 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2.3. Thực nghiệm phân tích sắc ký các hợp chất ............................................ 32

2.4. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất ......................................... 33

2.4.1. Hợp chất VK-13-1 (modiolide D): ..................................................... 33

2.4.2. Hợp chất VK-13-2 (modiolide E):...................................................... 34

2.4.3. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR ........................................................ 34

Chương 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................... 36

3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất VK-13-1 ....................................................... 36

3.2 Phân tích cấu trúc của hợp chất VK-13-2 ............................................ 39

KẾT LUẬN ..................................................................................................... 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

13C NMR

1H NMR

2D-NMR

CC

DAD

DEPT EtOAc HMBC HSQC HRESITOFMS

HPLC

MeOH PDA TLC

a

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR Spectroscopy Sắc ký cột Column Chromatography Bộ phát hiện mảng điot Diode array detector Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Ethylacetate Heteronuclear Multiple Bond Connectivity Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử thời gian bay High Resolution Electronspray Ionization Time-Of- Flight Mass Spectroscopy Sắc ký lỏng hiệu năng cao High-performance liquid chromatography Methanol Potato Dextrose Agar Sắc ký lớp mỏng Thin layer chromatography

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC ....................................................................... 4

Hình 1.2: Phổ 1H NMR của 1-xiclopentylbut-1-en-3-on ............................... 14

Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của etylbenzen. Chiều cao bậc

thang đường cong tích phân tỷ lệ với số proton ở mỗi nhóm ......... 15

Hình 1.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của một số hợp chất ............... 17

Hình 1.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của 3-brom-2-tert-

butoxithiophen ................................................................................ 18

Hình 1.6. Phổ lý thuyết A2B ........................................................................... 18

Hình 1.7. Phổ 1H-NMR của 1,3,4-tribrombut-1-in ........................................ 19

Hình 1.8. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của stirenoxit ......................... 19

Hình 1.9 Phổ lí thuyết hệ ABX với JAX và JBX a) ngược dấu, b) cùng dấu .. 20

Hình 1.10. Phổ lý thuyết A2B2 ....................................................................... 21

Hình 1.11. Phổ CHTN–13C có tương tác C–H (a) và xóa tương tác C–H (b) ... 23

Hình 1.12 Một số hình ảnh về bốn loài vi nấm mới ....................................... 25

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ Paraconiothyrium sp. VK-13 ............ 32

Hình 2.2. Sắc ký đồ HPLC phân tách hợp chất VK-13-2 ............................... 33

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-1 ......................................... 36

Hình 3.2. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-1 ...... 37

Hình 3.3. Các tương tác NOESY chính của hợp chất VK-13-1 ..................... 37

Hình 3.4. Hiệu số H của VK-13-1a và VK-13-1b ........................................ 38

Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-2 ......................................... 39

Hình 3.6. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-2 ...... 40

b

Hình 3.7. Hiệu số H của VK-13-2a và VK-13-2b ........................................ 41

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 . Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-1 ...................................... 37

c

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-2 ....................................... 40

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu các loài nấm trên cạn được biết đến như nguồn cung cấp các

hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Kể từ khi penicillin được phát hiện bởi

Alexander Fleming vào năm 1928 tạo ra bước đột phá trong điều trị các bệnh

nhiễm khuẩn, vi nấm đã trở thành một nguồn phát triển thuốc quan trọng cho

y học. Bên cạnh các hoạt chất kháng khuẩn phổ biến có nguồn gốc từ vi nấm

như fusidic acid và griseofulvin, một số loại thuốc kháng nấm mới như

Eraxis, Cancidas, và Altabax được bán tổng hợp từ các hợp chất phân lập từ

vi nấm. Các hoạt chất hạ mỡ máu statin sử dụng trong điều trị bệnh mạch

vành từ mevastitin và lovastatin . Tuy nhiên việc phát hiện lặp lại với tần suất

cao các hợp chất đã biết đã cản trở việc nghiên cứu phát triển thuốc từ nguồn

nấm trên cạn truyền thống. Do đó hiện nay việc nghiên cứu nấm trên thế giới

đã chuyển hướng sang khu vực có hệ sinh thái và môi trường còn ít được biết

đến, đó là các đại dương. Các đại dương bao phủ ba phần tư diện tích bề mặt

trái đất và là nơi trú ngụ của tất cả các loài vi sinh vật thiết yếu. Các ổ sinh

thái như trầm tích, rừng ngập mặn, tảo, và các sinh vật biển cung cấp các điều

kiện sống riêng biệt cho các vi sinh vật[1].

Hiện nay, việc nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi

khuẩn, vi nấm, vi tảo-các đối tượng có khả năng nhân sinh khối lượng lớn,

phục vụ cho phát triển thuốc đang được các nhà khoa học trên thế giới rất

quan tâm. Trong đó, các hợp chất thứ cấp sản sinh từ vi nấm có sự đa dạng

cao về cấu trúc và hoạt tính sinh học và tiềm năng khai thác còn rất lớn. Với

nguồn thực vật và động vật biển dồi dào và phong phú, cùng với sự đa dạng

về hệ sinh thái và môi trường sống, sự đa dạng về sinh học của các chủng vi

nấm ở biển Việt Nam được đánh giá rất cao và tiềm năng khai thác các hợp

chất có hoạt tính sinh học có giá trị là rất khả quan. Tuy nhiên, cho đến nay

hướng nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chủng

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

vi nấm từ biển hầu như chưa được tiến hành ở Việt Nam. Do đó việc nghiên

cứu một cách hệ thống nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về hóa học và hoạt tính

sinh học của các loài vi nấm phân lập từ biển ở Việt Nam, qua đó tìm ra các

hoạt chất sinh học phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo là cần thiết.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên thế giới cho thấy chi vi nấm

Paraconiothyrium là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất thứ cấp có nhiều

hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, ở nước ta việc nghiên cứu về thành phần hóa

học, tác dụng dược lý của các loài vi nấm biển nói chung và vi nấm

Paraconiothyrium còn rất mới mẻ và giàu tiềm năng. Vì vậy, em đã lựa chọn

đề tài: “Tách, xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển

Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại”

Mục tiêu của đề tài :

Phân tích cấu trúc hóa học của một số hợp chất thứ cấp phân tách từ

chủng vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng các phương pháp phổ

như: phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HRESIMS), phổ cộng

hưởng từ nhân 1 chiều (1D NMR) và 2 chiều (2D NMR).

Các bước thực hiện của đề tài:

1. Nghiên vứu phân tách một số hợp chất bằng các phương pháp phân tích sắc

ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC), và sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC) từ sinh khối của chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. VK-13.

2. Nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất thứ

cấp bằng các phương pháp phổ như: phổ khối lượng phun mù điện tử phân

giải cao (HRESIMS), phổ cộng hưởng từ nhân 1 chiều (1D NMR) và 2 chiều

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(2D NMR).

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1. Sơ lược về phương pháp sắc ký :[22.23]

1.1. Định nghĩa

Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự

phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua

pha tĩnh.

Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động.

1.2. Nguyên tắc của sắc ký

Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố

ác chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha ĩnh(stationaryphase)

và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa

hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha

động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai

pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách

khỏi nhau sau một thời gian nhất định.

1.3. Các giai đoạn của quá trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn

chính:

a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột

canxi cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.

b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha

động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách

khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromato-

gram). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký.

Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra

ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá trình rửa giải và dung môi dùng

được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

giải (eluate).

Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy

từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất.

Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng

thu lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích.

c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất

không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử.

Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột

bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detec-

tor đặt sau cột.

1.4. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng [24]

1.4.1. Cơ sở lý thuyết

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố

khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một

chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột.

Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối

lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể.

1.4.2. Cấu trúc

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC

Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một

hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha

động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường

với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector.

1.4.2.1 Hệ thống bơm

Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với

một lưu lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ

cho dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải

là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp

với thiết bị loại bỏ bọt khí.

Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động

hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải

gradient) theo một chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải gradient,

hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể

được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao.

1.4.2.2. Bộ phận tiêm mẫu

Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu

hoặc đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao.

Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích

thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động. Khi tiêm mẫu bằng tay có

thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ.

1.4.2.3. Pha tĩnh

Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm:

- Silica (silica dioxyd), alumina trioxyd hoặc graphit xốp thường được

dùng trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về

khả năng hấp phụ hoặc (và) phân bố khối lượng;

- Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng

trong sắc ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cạnh tranh giữa các ion cần tách và các ion trong pha động;

- Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia

tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ

không gian;

- Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica

gel hoặc graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia

tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động

và pha tĩnh;

- Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose

hoặc amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v.v... dùng để tách các đồng

phân đối quang (sắc ký đối quang).

Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi

hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động. Bề mặt của

chất mang, ví dụ như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc

thử silan khác nhau tạo thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che

phủ một số lượng khác nhau các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang. Bản

chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định các tính chất tách

của hệ sắc ký.

Các pha liên kết dùng phổ biến là:

Octyl = Si–(CH2)7–CH3

Octadecyl = Si–(CH2)17–CH3

Phenyl = Si–(CH2)n–(C6H5)

Cyanopropyl = Si–(CH2)3–CN

Aminopropyl = Si–(CH2)3–NH2

Diol = Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH

Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc

6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ký pha đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0

tới 8,0. Cột chứa graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divi-

nylbenzen copolymer ổn định ở một khoảng pH rộng hơn.

Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến

đổi, graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cy-

anopropyl hoặc diol) và pha động không phân cực được sử dụng trong một số

trường hợp.

Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh

phổ biến nhất từ 3 µm đến 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình

dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những

tham số này cấu thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể. Trong

trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ

liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề

mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không. Sự kéo đuôi peak, đặc biệt

của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt của silica.

Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên

luận riêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng cho

phân tích sắc ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là

vi cột. Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời

gian phân tích. Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng,

nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên,

nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60 °C vì khả năng phân hủy của

pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra.

1.4.2.4. Pha động

Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực. Sự có

mặt của nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm

thu được kết quả tái lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động

7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ.

Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu

phân lớn hơn 0,45 m. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị

bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng)

của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau. Ngoài ra, dung

môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng các van

chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn. Dung môi thường

được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí heli, lắc siêu âm hoặc sử

dụng hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt

khí trong cốc đo của detector.

Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất

làm ổn định và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát

hiện, nếu như sử dụng detector tử ngoại. Dung môi và những thành phần khác

được dùng phải có chất lượng phù hợp. Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện

với thành phần nước của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu sử

dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi

hữu cơ nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc quá trình sắc ký.

Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một ion trái dấu

trong sắc ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp

sắc ký sử dụng pha tĩnh không chọn lọc đối quang.

1.4.2.5. Detector

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu

ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của

các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại detector phù hợp. Tín hiệu detec-

tor thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế,

độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Trên cơ sở đó, người ta sản xuất rất nhiều lọai detector khác nhau, trong

đó Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm, mỹ phẩm Thái Nguyên đang áp

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

dụng Detector mảng diod (DAD) trong máy HPLC.

Detector DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để

định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.

1.4.3. Phương pháp tiến hành

Làm cân bằng cột với pha động và tốc độ dòng theo qui định, ở nhiệt độ

phòng hoặc nhiệt độ qui định trong chuyên luận riêng, cho đến khi đường nền

ổn định. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch thử theo yêu cầu. Các

dung dịch phải không được có các tiểu phân rắn.

1.4.4. Hiệu năng

Thành phần và tốc độ dòng của pha động được qui định trong chuyên

luận riêng. Pha động là hỗn hợp dung môi được đuổi khí bằng bơm chân

không hoặc bằng một thiết bị đuổi khí khác phù hợp nhưng không ảnh hưởng

đến thành phần của hỗn hợp.

Trong quá trình định lượng, khi trong chuyên luận riêng không qui định

dùng chuẩn nội, nên sử dụng bộ phận tiêm mẫu có thể tích cố định. Trong một

số trường hợp ngoại lệ, khi trong chuyên luận chỉ dẫn tính theo chiều cao

peak thì không cần quan tâm đến hệ số đối xứng.

Cột sắc ký thường được làm bằng thép không gỉ có kích thước (chiều dài

× đường kính trong) được qui định trong chuyên luận riêng. Trong chuyên

luận riêng, khi pha tĩnh được ký hiệu bằng một chữ cái thì tra cứu ở phần

Nguyên vật liệu nêu ở dưới đây. Đường kính danh nghĩa của hạt pha tĩnh

được để trong ngoặc đơn ngay sau ký hiệu chữ cái cụ thể. Nếu không có chỉ

dẫn khác trong chuyên luận riêng, quá trình sắc ký được tiến hành ở điều kiện

nhiệt độ không đổi trong môi trường phòng thí nghiệm. Khi sử dụng các pha

động có pH cao với cột có bản chất là silica nên sử dụng một tiền cột ở trước

9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cột phân tích.

Trừ khi có các chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, hệ thống detector

gồm một detector đo quang gắn với một cốc đo có thể tích nhỏ (khoảng 10 L

là phù hợp). Phải đặt bước sóng theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng.

Khi dùng một máy sắc ký có thiết kế riêng biệt có thể phải thay đổi các

điều kiện sắc ký đã ghi trong chuyên luận riêng. Trong trường hợp này, người

phân tích cần đảm bảo rằng những thay đổi đó cho kết quả tương đương.

1.4.5. Thể tích tiêm

Khi thể tích tiêm không qui định trong chuyên luận riêng, nên chọn một

thể tích tiêm phù hợp để áp dụng. Chọn thể tích tiêm phụ thuộc vào đáp ứng

của phép phân tích, detector sử dụng, hiệu lực cột và toàn bộ hiệu năng của hệ

thống sắc ký. Khi không có chỉ dẫn, thường dùng thể tích tiêm là 20 L, tuy

nhiên cần kiểm tra sự thích hợp trong điều kiện cụ thể.

1.4.6. Peak phụ (Peak thứ cấp)

Có thể cần chất đối chiếu để xác định peak phụ. Peak phụ là một peak có

trên sắc ký đồ nhưng không phải là peak chính hay peak của chuẩn nội hoặc

peak của dung môi hay của các thuốc thử tạo dẫn xuất.

1.4.7. Nguyên vật liệu

Các dung môi và thuốc thử dùng để pha các dung dịch sử dụng trong

phân tích phải có chất lượng thích hợp cho sắc ký lỏng.

Khi chuyên luận riêng quy định pha tĩnh được gán với một chữ cái (A

hoặc B hoặc C) là muốn nói tới các pha tĩnh như mô tả dưới đây:

Pha tĩnh A, hạt silica;

Pha tĩnh B, hạt silica được biến đổi hóa học, gắn với nhóm octylsilyl (C8);

Pha tĩnh C, hạt silica được biến đổi hóa học, gắn với nhóm octade-

10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cylsilyl (C18).

2.Sơ lược về phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ CHTHN) viết tắt của tiếng Anh là

NMR (nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp vật lý hiện đại

nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, nó có ý nghĩa quan trọng để xác

định cấu tạo các hợp chất hữu cơ phức tạp như các hợp chất thiên nhiên, các

thuốc chữa bệnh, các chất trong thành phần dầu mỏ. Phương pháp phổ biến

1H và 13C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment

được sử dụng là CHTHN- 1H và phổ CHTHN- 13C. Hạt nhân của nguyên tử

từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là

spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [26]

Độ chuyển dịch hoá học

Hằng số chắn và từ trường hiệu dụng:

Hằng số chắn xuất hiện do hai nguyên nhân:

- Hiệu ứng nghịch từ: các điện tử bao quanh nguyên tử sinh ra một từ

trường riêng, ngược chiều với từ trường ngoài nên làm giảm tác dụng của nó

lên hạt nhân nguyên tử. Lớp vỏ điện tử càng dày đặc thì từ trường riêng

ngược chiều với từ trường ngoài càng lớn tức hằng số chắn càng lớn.

- Hiệu ứng thuận từ: bao quanh phân tử là lớp vỏ điện tử, các điện tử này

chuyển động sinh ra một dòng điện vòng, do đó xuất diện một từ trường riêng

có hướng thay đổi ngược hướng hoặc cùng hướng với từ trường ngoài. Tập

hợp tất cả các điểm trên các đường sức mà tại đó tiếp tuyến vuông góc với từ

trường ngoài sẽ tạo nên một mặt parabol. Phía trong mặt parabol, từ trường

tổng hợp nhỏ hơn B0 vì từ trường riêng ngược hướng với từ trường ngoài,

còn phía ngoài parabol thì từ trường tổng hợp lớn hơn B0 vì từ trường riêng

cùng hướng với từ trường ngoài. Do đó hằng số chắn phía ngoài parabol nhỏ

còn phía trong thì có hằng số chắn lớn nghĩa là độ chuyển dịch học cùng các

11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

proton nằm phía ngoài parabol sẽ lớn còn phía trong sẽ nhỏ.

Độ chuyển dịch hóa học : Đối với các hạt nhân trong phân tử càng phức

tạp trong nguyên tử do ảnh hưỏng của các đám mây electron của các nguyên

tử bên cạnh. Độ chuyển dịch hóa học của 13C trong các hợp chất hữu cơ biến

đổi trong khoảng từ 0-230ppm (so với TMS) tức là lớn gấp 20 lần so với sự

biến đổi độ chuyển dịch hóa học của 1H.

TMS là chất có hằng số chắn lớn nhất nên dùng nó làm chất chuẩn để đo

độ chuyển dịch hoá học.Đối với hạt nhân 1H thì: 0 H TMS TMS H

 Ở đây, σ TMS là hằng số chắn của chất chuẩn TMS

(tetrametylsilan), σH là hằng số chắn của hạt nhân mẫu đo, ν TMS ν H là tần

số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo. Hằng số chắn σ xuất

hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do

đó tuỳ thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà

mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số

chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hoá học của mỗi hạt nhân khác

nhau. Tổng quát: δ = σTMS – σX σX: hằng số chắn của chất cần đo. δ không

có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với phổ CHTHN 1H

thì δ có giá trị từ 1 đến 12 ppm còn phổ 13C thì δ có giá trị từ 0 đến 220ppm.

Vậy độ chuyển dịch hoá học δ là đại lượng đặc trưng cho những hạt nhân

cùng loại của một đồng vị bị che chắn tương đương nhau trong một hợp chất.

Nó không phụ thuộc vào thiết bị bên ngoài (cường độ từ trường hay tần số

sóng) không có thứ nguyên và được tính bằng ppm

Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử

có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong

12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt

nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.

Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa

một các tổng quát như sau:

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân

mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao

quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C

trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến

chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học

của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu

hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn .[25]

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt

trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12

ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân

phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách

tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên

13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

kết ngăn giữa các tương tác .[25]

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các

hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra

kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau .[26]

Ở hợp chất VIII, hai proton Hc và Hd ứng với kí hiệu A và B, proton Hb ứng

với kí hiệu X. Vân cộng hưởng của proton Hd ở 6,67 ppm bị tách thành 4 hợp

phần với Jcd=16Hz và Jbd= 8Hz. Proton Hc cộng hưởng ở trường mạnh hơn ,6,05

ppm . Tín hiệu của Hc cũng là một vân bốn. Ở vân này cũng xác định được

Jcd=16 Hz và Jbc= 1Hz. Sở dĩ giá trị Jbc nhỏ vì đó là tương tác truyền qua 4 liên

kết (trong đó có một liên kết đôi). Proton Hb không những tương tác với Hc, Hd

mà còn tương tac với hai nhóm metylen trong vòng xiclopentan. Tín hiệu của Hb

thể hiện ở vân bội ở khoảng 2,6 ppm.Tín hiệu của proton khác trong vòng xiclo-

pentan thể hiện bởi một vân “béo” ở khoảng 1,7 ppm. Tín hiệu của nhóm metyl

(a) thể hiện bởi một vân đơn ở 2,23 ppm.(hình bên dưới)

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2: Phổ 1H NMR của 1-xiclopentylbut-1-en-3-on

2.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H

2.1.1. Cường độ vạch phổ

Diện tích giới hạn bởi đường cong phổ tỷ lệ với số proton của mỗi nhóm,

nhưng việc đo diện tích này khó chính xác. Người ta sử dụng đường cong tích

phân để xác định tỷ lệ số proton của mỗi nhóm, vì chiều cao của bậc thang tỷ

lệ với số proton ở mỗi nhóm. Ngoài ra, chiều cao bậc thang còn tỷ lệ với nồng

độ chất trong dung dịch, do đó người ta có thể tính được nồng độ chất dựa

vào đường chuẩn và chất chuẩn.[27]

Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của etylbenzen. Chiều cao

bậc thang đường cong tích phân tỷ lệ với số proton ở mỗi nhóm

Các phổ cộng hưởng từ nhân 1H hiện nay, thay vì đường cong tích phân

cho số liệu tỷ lệ proton của mỗi nhóm ở chân mỗi tín hiệu phía dưới phổ, nhìn

các số liệu này có thể dự đoán được số proton có mặt ở mỗi nhóm trong phân

tử và xác định tổng số proton trên phổ có phù hợp với tổng số proton trong

công thức dự đoán không.

Các chữ số ở phía dưới phổ chỉ số proton tương ứng của mỗi nhóm tín

hiệu phổ, tương đương với tỷ lệ chiều cao bậc thang ở đường cong tích phân.

15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Các chữ số phía trên cho các giá trị độ chuyển dịch hóa học của các tín hiệu,

các nhóm tín hiệu cộng hưởng trên phổ đều là multiplet (bội đỉnh) do sự

tương tác của các nhóm proton ở nguyên tử cacbon gần nhau gây ra .

2.1.2. Phân loại phổ

Khi trong phân tử có các nhóm hạt nhân tương tác với nhau, người ta kí

hiệu các hạt nhân đó bằng các chữ cái A, B, C,..., M, X. Các hạt nhân có độ

chuyển dịch hoá học như nhau gọi là các hạt nhân tương đương và được kí hiệu

bằng một loại chữ cái, có chỉ số ở dưới bên phi chữ cái đó để chỉ số hạt tương

đương.

Nếu tỷ số thì các hạt nhân được kí hiệu bằng các chữ cái

cách xa nhau, như AX, AX2,... còn trường hợp khác được kí hiệu bằng các

chữ cái liền nhau như AB, A2B, ABC,...

Trường hợp thì xếp vào phổ bậc 1, còn lại xếp vào phổ bậc cao.

Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân là để tìm các giá trị độ chuyển

dịch hoá học và hằng số tương tác J cho mỗi proton.

a) Phân tích phổ bậc 1

Đối với phổ bậc 1, có thể áp dụng quy tắc số vạch tối đa bằng n + 1 (n là

số hạt nhân nhóm bên cạnh tương tác) và tỷ lệ chiều cao các đỉnh trong một

Tû lÖ chiÒu cao c¸c v¹ch trong mçi nhãm

Sè v¹ch trong nhãm cã t ¬ng t¸c

0 1

2

3

nhóm tuân theo quy tắc Pascan:

4

1 3 6

1 4

Hệ phổ bậc 1 thường gặp có dạng AmXn và AmMnXy. Các hệ phổ AX có

5

1 1 1 1 1 1

1 2 3 4 5

10

10

1 5

1

16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thể tìm thấy số đỉnh của mỗi nhóm dễ dàng và hằng số tương tác J (khoảng

cách giữa hai đỉnh liền nhau), và tần số A hay X (điểm giữa hai đỉnh xa nhau

nhất trong nhóm). Dưới đây là một số ví dụ (hình 1.5).

Hình 1.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của một số hợp chất

b) Phổ bậc cao AB, AB2, và ABX

Phổ AB

Các phổ được xếp vào hệ phổ bậc cao có đơn giản nhất là hệ

AB và ABX. Để tìm các thông số  và J trực tiếp trên phổ như hệ phổ bậc 1,

ta xét ví dụ phổ cộng hưởng từ nhân proton của 3–brom–2-tert–butoxitiophen

(hình 1.6) thuộc hệ phổ AB gồm hai cặp nhóm đỉnh, các thông số được tính

theo công thức:

AB = 0,5(2 + 3 )

17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

A = AB + AB / 2 (Hz) A = AB – AB / 2 (Hz)

Hình 1.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của 3-brom-2-tert-

butoxithiophen

Phổ A2B

Hình 1.6. Phổ lý thuyết A2B

Phổ A2B là hệ phổ gồm 3 hạt nhân tương tác với nhau trong đó có hai hạt

nhân tương đương. Phổ gồm hai phần, về lý thuyết phần A có 8 đỉnh và phần B

có 6 đỉnh (hình 1.8) nhưng phổ thực thì số đỉnh ít hơn, ví dụ phổ 1H–NMR của

1,3,4-tribrombut-1-in phần A chỉ xuất hiện 4 đỉnh và phần B 4 đỉnh (hình 1.8).

Có thể phân tích phổ A2B như trên hình 1.8, tính các giá trị như sau:

18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

B = 3 ; A = ½ ( 5 + 7 )

JAB = 1/3  ( 1,4 + 5,8 ) 

Hình 1.7. Phổ 1H-NMR của 1,3,4-tribrombut-1-in

Phổ ABX

Phổ ABX thường gặp trong phổ cộng hưởng proton đặc biệt các hợp chất

thơm và anken cũng như các hợp chất chứa hạt nhân từ khác (19F, 31P) gồm ba hạt

nhân không tương đương tương tác với nhau phân tách phổ thành hai phần riêng

biệt. Để phân tích phổ cần tách riêng biệt phần AB và phần X, ví dụ phổ 1H-NMR

của stirenoxit ở dưới, phần AB có 8 đỉnh và phần X có 4 đỉnh (hình 1.9).

19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.8. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của stirenoxit

Về lý thuyết hệ phổ ABX gồm hai phần, phần AB có 8 đỉnh còn phần X

có 6 đỉnh, để thực hiện ta tạm chia phần AB thành AB’ và AB’’, từ phần này

có thể tìm được JAB và các giá trị:

’A =  A + ½JAX ’B = B + ½JBX

’’A = A + ½JAX ’’B= B + ½JBX

Tuỳ theo sự cùng dấu hay trái dấu của JAX và JBX mà dạng phổ thay đổi

như ở hình 1.10.

Hình 1.9 Phổ lí thuyết hệ ABX với JAX và JBX a) ngược dấu, b) cùng dấu

Trong phần AB có hai nhóm bốn đỉnh, từ đây tìm được A, B, JAB, JAX

và JBX , trong phần X chỉ tìm được X.

Phổ A2B2

Hệ phổ A2B2 của các hệ gồm bốn hạt nhân tương tác với nhau trong đó

có hai cặp hạt nhân tương đương nhau. Về lý thuyết hệ phổ A2B2 có cấu trúc

phụ thuộc vào tỷ số J/ (hình 1.11). Về lý thuyết phổ A2B2 có tất cả 14 đỉnh

chia làm hai phần đối xứng, khoảng cách hai đỉnh ngoài của mỗi phần là 2JAB

20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

còn hai đỉnh phía ngoài có cường độ cao nhất là A và B.

Hình 1.10. Phổ lý thuyết A2B2

2.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

Vì tất cả các hợp chất hữu cơ đều chứa nguyên tử cacbon mà trong tự

13C (CHTN–13C) hiện nay có ý nghĩa quan trọng, nó cho nhiều thông tin hơn

nhiên, nguyên tử cacbon-13 chiếm tỷ lệ 1,1% nên phổ cộng hưởng từ nhân

phổ CHTN–1H, ví dụ ở hợp chất hữu cơ không chứa hiđro thì không có tín

hiệu trong phổ CHTN–1H nhưng nó cho tín hiệu của phổ CHTN–13C. Vì tỷ lệ

21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

của 13C nhỏ và hằng số tỷ lệ gyromagnetic thấp nên tín hiệu cộng hưởng từ

thường nhỏ, người ta phải đo trên phổ kế cộng hưởng từ biến đổi Fourier

(FT). Khi dùng máy này có thể ghi phổ CHTN–13C theo một số cách khác

nhau, nhưng quan trọng nhất là phương pháp phổ 13C tương tác 1H và xóa

tương tác 1H. Cả hai phương pháp đều cho các thông tin có giá trị trong việc

phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ. [27]

2.2.1. Phổ 13C tương tác 1H

Trên phổ tương tác 13C–1H nhận được các nhóm đỉnh khác nhau có thể là

đỉnh đơn hay bội đỉnh. Vì 13C và 1H đều có I = 1/2 nên quy tắc đa vạch được

áp dụng giống như ở tương tác 1H–1H của phổ CHTN–1H:

singlet (1 vạch) không có C

duplet (2 vạch) có 1 H CH

triplet (3 vạch) có 2 H CH2

quartet (4 vạch) có 3 H CH3

Hằng số tương tác J(13C–H) phụ thuộc vào đặc trưng s của obitan lai hoá

ở nguyên tử cacbon. Đặc trưng s càng lớn thì hằng số tương tác càng lớn:

Lai hóa JC–H (Hz)

sp3 125

sp2 160

sp 250

Khi có nhóm thế âm điện gắn vào nguyên tử cacbon thì 1JC–H thường tăng:

CH4 125 Hz, CH3Cl 151 Hz, CH2Cl2 178 Hz, CHCl3 209 Hz

H = 5 Hz, thường không thấy.

Tương tác C và H ở cách xa nhau hơn 1 liên kết thường rất nhỏ, ví dụ 2JC–

Tương tác giữa 13C và 13C cạnh nhau ít có ý nghĩa cho việc chứng minh

22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cấu tạo.

2.2.2. Phương pháp phổ 13C xóa tương tác 1H

Phổ 13C tương tác 1H cho nhiều nhóm đỉnh do sự khác nhau về số proton

trong các nhóm CH, CH2 và CH3, nhưng cường độ của nhiều đỉnh quá nhỏ lẫn

với cả nhiễu của máy, do đó việc giải phổ gặp khó khăn, vì vậy người ta đã đưa

ra cách làm đơn giản hoá bản phổ để chọn một số thông tin cần thiết, bằng cách

xóa đi các vạch tương tác C–H. Bây giờ ứng với mỗi nguyên tử cacbon chỉ có

a)

b)

1 vạch phổ. Ví dụ:

Hình 1.11. Phổ CHTN–13C có tương tác C–H (a) và xóa tương tác C–H (b)

13C{1H}. Thực tế phổ CHTN–13C tương tác C–H ngày nay ít đo. Thay cho

Trong tạp chí, loại phổ CHTN–13C xóa tương tác C–H được kí hiệu là

phương pháp đó, người ta dùng các phương pháp kĩ thuật hiện đại như APT

(Attached Proton Test) có thể phân biệt được C, CH, CH2 và CH3.

Khi dùng kĩ thuật này thì tín hiệu của nhóm C và CH2 nằm ở phía trên,

còn tín hiệu của nhóm CH và CH3 nằm ở phía dưới đường nằm ngang như

hình 4.19.

Ngoài ra còn sử dụng phương pháp DEPT (Distortioness Enhancement

by Polarization Transfer) để ghi phổ, theo phương pháp này tín hiệu CH3 và

CH ở phía trên còn CH2 ở phía dưới. Ví dụ phổ CHTN–13C ghi theo DEPT

23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

của 2-butanol ở dưới:

Cường độ các vạch phổ trong phổ xóa tương tác 13C–1H tỷ lệ với:

1- Số nguyên tử hiđro gắn với nguyên tử cacbon.

2- Số nguyên tử cacbon tương đương.

Thường thì nhóm CH3 và CH2 cho cường độ vạch phổ như nhau, nhưng

nhóm CH và C cho cường độ yếu hơn.

3. Tình hình nghiên cứu vi nấm biển trên thế giới

Trong khoảng thời gian 3 thập kỷ trở lại đây, các nghiên cứu về vi nấm

biển đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng. Đã có nhiều hợp chất mới, có

hoạt tính sinh học cao từ vi nấm đã được phát hiện và xác định, tạo cơ sở để

phát triển thành các sản phẩm thuốc phục vụ điều trị bệnh và tăng cường sức

khỏe. Một số dược phẩm có nguồn gốc từ vi nấm đã được nghiên cứu, phát

triển, và được phép lưu hành trên thị trường như: thuốc kháng khuẩn fusidic

acid (1) và griseofulvin (2) [2], thuốc kháng nấm anidulafungin (3),

caspofungin (4), và retapamulin (5) [3, 4]. Thuốc giảm mỡ máu statin điều trị

bệnh mạch vành được bán tổng hợp từ các hợp chất mevastitin (6) và

lovastatin (7) phân lập từ các loài nấm Penicillium citrinum và Aspergillus

terreus [3, 5]. Từ vi nấm biển, nhóm hợp chất kháng sinh cephalosporine như

cephalosporine C (8) được phát hiện từ chủng nấm biển Acremonium

chrysogenum vào năm 1945 [6]. Từ vi nấm biển, một số nhóm hoạt chất khác

đã được phát triển thành dược phẩm như halovir-chất ức chế mạnh virus

Herpes simplex [7, 8], sorbicillactone A (9) ở vi nấm biển Penicillium

24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chrysogenum chữa bệnh bạch cầu [7, 9]…

Chi vi nấm Paraconiothyrium lần đầu tiên được Verkley G. J. M. và

cộng sự (2004) công bố thông qua phân lập và định danh bốn loài vi nấm mới,

bao gồm P. estuarinum, P. brasiliense, P. cyclothyrioides, và P. fungicola từ

P. estuarinum (oatmeal)

P. estuarinum (malt extract agar)

P. brasiliense (oatmeal)

P. brasiliense (malt extract agar)

P. cyclothyrioides (oatmeal)

P. cyclothyrioides (malt extract agar)

P. fungicola (oatmeal)

P. fungicola (malt extract agar)

đất [10].

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.12 Một số hình ảnh về bốn loài vi nấm mới

Các chủng vi nấm thuộc chi Paraconiothyrium phân bố rất rộng rãi, từ

môi trường đất, nước, đến cộng sinh ở thực vật và động vật. Các nghiên cứu

trên thế giới về thành phần hóa học về vi nấm Paraconiothyrium còn chưa

được thực hiện nhiều, tuy nhiên cũng cho thấy chi vi nấm này sản sinh các

hợp chất có cấu trúc rất đa dạng, như sesquiterpenoid, diterpenoid, isoprenoid

decalin, furanone, polyketide, và dihydrocoumarin. Mohamed và cộng sự

(2010) đã phân lập được 5 hợp chất mới với tên gọi là epoxyphomalin A-E

(10-14) từ chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. phân lập từ hải miên

Ectyplasia perox Duch. & Mich. 1864 (Dominica). Hợp chất 13 thể hiện hoạt

tính độc tế bào mạnh với dòng tế bào ung thư PC3M (IC50 = 0.72 μM) và

BXF 1218 (IC50 = 1.43 μM), trong khi hợp chất 10 và 11 thể hiện hoạt tính ức

chế mạnh proteasome 20S [11]. Năm 2011, Shiono và cộng sự đã phân lập

được 6 hợp chất isopimarane diterpene

(15-20) từ chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. MY-42 phân lập từ gỗ sồi

(Nhật Bản), trong đó hợp chất 16 và 17 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối

với dòng tế bào ung thư HL60, với IC50 = 6.7 và 9.8 M [12]. Chen và cộng

sự (2014) đã phân lập 4 hợp chất diterpenoid mới với tên gọi là hawaiinolide

A−D (21-24) từ chủng vi nấm Paraconiothyrium hawaiiense (Yunnan, Trung

Quốc), trong đó cấu hình tuyệt đối của hợp chất 21 và 23 được xác định bằng

phương pháp nhiễu xạ tia X. Hợp chất 21 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối

26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

với 5 dòng tế bào ung thư, bao gồm A549, T24, HeLa, HCT116, và MCF-7

[13]. Năm 2015, Liu và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất bisabolane

sesquiterpenoid mới, tên là brasilamide E−J (25-30) từ Paraconiothynium

brasiliense Verkley, trong đó hợp chất 25 và 26 có dạng 3-cyclohexylfuran,

hợp chất 27-30 có dạng cyclohexylfuranone. Hợp chất 25 ức chế sự tăng sinh

của tế bào ung thư MCF-7 và MGC, với IC50 = 8.4 và 14.7 M [14].

Guo và cộng sự (2015) thông báo phân lập và xác định cấu trúc một số

hợp chất bergamotane sesquiterpenoid [Brasilamides K-N (31–34)] từ

Paraconiothyrium brasiliense phân lập từ cây Acer truncatum (Trung Quốc)

[15]. Cho và cộng sự (2017) đã phân lập được 8 hợp chất versiol mới (35-42)

từ chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. phân lập từ đất (Arizona), trong đó

27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hợp chất 41 ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư COLO205 và KM12 [16].

Xu và cộng sự (2017) đã phân lập được 2 hợp chất polyketide mới, ethyl 8-

hydroxy-9-oxo-9H-xanthene-1-carboxylate (43) và 1,8-dihydroxy-2-(1-

hydroxyethyl)anthracene-9,10-dione (44) từ vi nấm Paraconiothyrium

brasiliense [17]. Amand và cộng sự (2017) đã phân lập được 2 hợp chất mới,

bao gồm 4-epi-microsphaeropsisin (45) và một hợp chất có khung carbon mới

là dihydrofurano-2(1H)-naphthalenone (variabilone, 46) từ chủng vi nấm

Paraconiothyrium variabile, trong đó hợp chất 44 thể hiện hoạt tính kháng vi

khuẩn Bacillus subtilis chọn lọc [18].

Như vậy, các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy vi nấm

Paraconiothyrium sp. là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất thứ cấp có sự

đa dạng cao về cấu trúc hóa học và thể hiện một số hoạt tính sinh học có giá

trị như kháng sinh, gây độc tế bào ung thư... Tuy nhiên, thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học các chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. phân bố ở Việt

Nam vẫn còn chưa được biết đến. Do đó, việc nghiên cứu một cách có hệ

28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thống vi nấm này ở Việt Nam là cần thiết và giàu tiềm năng.

Chương 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Thực nghiệm:

2.1.1. Mẫu nghiên cứu:

Chủng nấm VK-13 được phân lập từ hải sâm Việt Nam thu thập ở

vùng biển tỉnh Quảng Nam vào tháng 7 năm 2016. Mô hải sâm được cắt

thành từng mảnh nhỏ, nghiền và cấy trải trên môi trường thạch khoai tây

dextrose (PDA). Đĩa nuôi cấy được ủ ở 25 oC trong 15 ngày, sau đó tiến

hành phân lập và làm sạch nhiều lần để thu được chủng vi nấm sạch. Tên

khoa học của chủng vi nấm được xác định bằng kỹ thuật PCR và phân tích

vùng ITS của chuỗi rDNA. Tìm kiếm mức độ tương đồng trên GenBank

của trình tự gen ITS rDNA của VK-13 (số đăng ký GenBank MG765384)

cho thấy trình tự tương đồng cao với các chủng Paraconiothyrium

thysanolaenae (KP744453.1) và Paraconiothyrium estuarinum

(NR_137669.1), với kết quả trùng khớp là 99%. Do đó, chủng vi nấm VK-

13 được xác định là Paraconiothyrium sp. [19].

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Phương pháp tạo dịch chiết vi nấm:

Chủng vi nấm VK-13 được nuôi cấy nhân sinh khối ở môi trường PDA

trong thời gian 15 ngày ở nhiệt độ 25 oC. Sinh khối vi nấm được ngâm chiết

trong EtOAc trong điều kiện siêu âm và nhiệt độ phòng (25 oC). Dịch chiết

EtOAc được cô đặc dưới áp suất giảm thu được cặn chiết vi nấm.

2.1.2.2. Phương pháp phân tích sắc ký các hợp chất

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-

Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằng

đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung

dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến

29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khi hiện màu.

+ Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC): thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn

Silica gel 60G F254 (Merck, 105875).

+ Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha

thường, silica gel pha đảo ODS (30 - 50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.), Diaion

HP-20, và Sephadex LH-20.

+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): thực hiện trên hệ thống máy

HPLC bán điều chế YL9100, Synergi semipreparative C18 column (21.2 ×

150 mm; 4 μm particle size; 80 Å pore size, 5 mL/min), UV-Vis detector:

210 và 254 nm..

2.1.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất:

+ Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS): Phổ khối lượng phun mù điện

tử phân giải cao được đo trên máy ESI Q-TOF MS/MS system (AB SCIEX

Triple)

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): được đo trên máy JEOL JNM

ECP-400 spectrometer.

+ Độ quay cực []D: đo trên máy Jasco P-2000 digital polarimeter.

+ Phương pháp Mosher (bán tổng hợp các (S)- và (R)-MTPA ester của

các hợp chất VK-13-1VK-13-2) [20]: Hợp chất VK-13-1 (2 mg) được hòa

tan hoàn toàn trong 0.4 mL CH2Cl2, sau đó thêm vào 5 L (R)-()--

methoxy--(trifluoromethyl)phenylacetyl chloride (MTPA chloride) và 3 mg

4-dimethylaminopyridine (DMAP). Hỗn hợp phản ứng được duy trì qua đêm

ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, sản phẩm phản ứng được tinh sạch bởi sắc ký

lớp mỏng điều chế (pTLC), sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexane-EtOAc

(5:1) thu được sản phẩm (S)-MTPA ester của hợp chất VK-13-1 (VK-13-1a,

1.5 mg). Bằng phương pháp tương tự, sản phẩm (R)-MTPA ester của hợp chất

VK-13-1 (VK-13-1b, 1.6 mg) được tinh sạch từ hỗn hợp phản ứng của hợp

chất VK-13-1 với (S)-(+)-MTPA chloride. Tương tự như vậy, các dẫn xuất

30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(S)-MTPA ester (VK-13-2a) và (R)-MTPA ester (VK-13-2b) được bán tổng

hợp lần lượt từ các hợp chất VK-13-2 . Vị trí của các proton được quy kết bởi

phân tích phổ 1H NMR của các dẫn xuất bán tổng hợp được.

2.2. Dụng cụ và hóa chất

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết và phân tích sắc ký

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử

dụng bao gồm:

+ Máy cô quay chân không

+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm

+ Máy sấy

+ Micropipet

+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế

+ Cột sắc ký pha thường và pha đảo với các kích cỡ khác nhau

+ Bình tam giác các loại 2L, 1L, 500 mL, 250 mL.

+ Bình cầu sử dụng cất quay loại dung môi các loại 1L, 500 mL, 250

mL, 100 mL.

+ Dung dịch thuốc thử H2SO4 10%

+ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế YL9100.

2.2.2. Thiết bị phân tích xác định cấu trúc

+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân JEOL JNM ECP-400 spectrometer.

+ Máy đo phổ khối lượng ESI Q-TOF MS/MS system (AB SCIEX

Triple).

2.2.3. Hóa chất sử dụng phân tích sắc ký và cấu trúc

+ Silica gel pha thường (0.04-0.063 mm) Merck.

+ Silica gel pha đảo ODS (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).

+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck

1.05715).

+ Bản mỏng tráng sẵn pha đảo RP18 F254s (Merck).

+ Các loại dung môi hữu cơ như MeOH, EtOAc, CH2Cl2, n-hexane,

31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

acetone, ...

+ (S)-MTPA chloride và (R)-MTPA chloride (Sigma)

+ 4-dimethylaminopyridine (DMAP) (Sigma)

2.3. Thực nghiệm phân tích sắc ký các hợp chất

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ Paraconiothyrium sp. VK-13

Dịch chiết EtOAc của vi nấm Paraconiothyrium sp. VK-13 được phân

tách qua cột sắc ký pha đảo (RP) C18 (CC), rửa giải gradient với 20, 40, 60,

80, và 100 % MeOH trong H2O thu được lần lượt 6 phân đoạn F1 − F6. F3

được đưa lên cột sephadex LH-20 CC, dung hệ dung môi rửa giải là MeOH-

H2O (4:1) cho kết quả 3 phân đoạn nhỏ (F3.1 - F3.3). F3.1 tiếp tục được phân

tách qua cột pha đảo RP C18, rửa giải với MeOH-H2O (10:18) thu được chất

VK-13-1 (8 mg) và 3 phân đoạn nhỏ (F3.1.1 - F3.1.3). Hợp chất VK-13-2 (8

mg) được phân lập từ F3.1.3 bằng sắc ký lỏng HPLC pha đảo RP-18 bán điều

chế, sử dụng hệ dung môi rửa giải gradient 30100 % MeOH trong H2O (0.1

% formic acid) trong 60 phút.

*. Phân tích sắc ký hợp chất VK-13-2 bằng phương pháp HPLC

32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Pha tĩnh: Capcell Pak C18 (5uM, size: 20 mml.dx150mm)

Pha động: MeOH - H2O (formic acid 0.1%)

Phương pháp (gradient): 0 min: 40% MeOH; 30 min: 70% MeOH

Tốc độ dòng: 3 mL/min

Bước sóng UV: Dual wavelength 210 / 254 nm

Hình 2.2. Sắc ký đồ HPLC phân tách hợp chất VK-13-2

2.4. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất

2.4.1. Hợp chất VK-13-1 (modiolide D):

- Mô tả: chất rắn không màu

- Công thức phân tử: C12H16O5

20 = +65.3 (c = 0.8, MeOH)

- Khối lượng phân tử: M = 240

- Góc quay cực: []D

+, 263.0890)

- Phổ khối lượng phân giải cao HRESIMS: m/z 263.0890 [M+Na]+ (tính

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

toán lý thuyết cho C12H16NaO5

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: số liệu phổ 1H (CD3OD, 400 MHz) và 13C

NMR (CD3OD, 100 MHz): Bảng 3.1.

2.4.2. Hợp chất VK-13-2 (modiolide E):

- Mô tả: chất rắn không màu

- Công thức phân tử: C12H16O5

20 = +14.0 (c = 0.6, MeOH)

- Khối lượng phân tử: M = 240

- Góc quay cực: []D

+, 263.0890)

- Phổ khối lượng phân giải cao HRESIMS: m/z 263.0892 [M+Na]+ (tính

toán lý thuyết cho C12H16NaO5

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: số liệu phổ 1H (CD3OD, 400 MHz) và 13C

NMR (CD3OD, 100 MHz): Bảng 3.2.

2.4.3. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR

1H NMR (CDCl3, 400 MHz) H 5.976 (dd, J = 1.6, 12.4 Hz, H-2), 5.800

2.4.3.1. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR của dẫn xuất VK-13-1a:

(dd, J = 3.6, 12.4 Hz, H-3), 5.848 (ddd, J = 1.6, 3.6, 8.8 Hz, H-4), 5.745 (dd, J

= 8.8, 16.0 Hz, H-5), 5.940 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, H-6), 5.528 (m, H-7), 1.895

(br, H2-8), 5.383 (m, H-9), 1.262 (d, J = 6.4 Hz, H3-10).

1H NMR (CDCl3, 400 MHz) H 5.970 (dd, J = 1.6, 12.4 Hz, H-2), 5.792

2.4.3.2. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR của dẫn xuất VK-13-1b:

(dd, J = 3.6, 12.4 Hz, H-3), 5.822 (ddd, J = 1.6, 3.6, 8.8 Hz, H-4), 5.638 (dd, J

= 8.8, 16.0 Hz, H-5), 5.928 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, H-6), 5.500 (m, H-7), 1.991

(br, H2-8), 5.396 (m, H-9), 1.289 (d, J = 6.8 Hz, H3-10).

1H NMR (CDCl3, 400 MHz) H 5.969 (dd, J = 2.0, 12.4 Hz, H-2), 5.701

2.4.3.3. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR của dẫn xuất VK-13-2a:

(dd, J = 3.2, 12.4 Hz, H-3), 6.077 (ddd, J = 2.0, 3.2, 8.0 Hz, H-4), 5.836 (dd, J

= 8.0, 16.0 Hz, H-5), 5.888 (dd, J = 9.2, 16.0 Hz, H-6), 5.268 (m, H-7), 1.974

(ddd, J = 2.0, 3.2, 14.0 Hz, Ha-8), 1.881 (dt, J = 3.2, 14.0 Hz, Hb-8), 5.361

34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(m, H-9), 1.265 (d, J = 6.4 Hz, H3-10).

1H NMR (CDCl3, 400 MHz) H 6.023 (dd, J = 2.0, 12.4 Hz, H-2), 5.839

2.4.3.4. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR của dẫn xuất VK-13-2b:

(dd, J = 3.2, 12.4 Hz, H-3), 6.054 (ddd, J = 2.0, 3.2, 8.0 Hz, H-4), 5.746 (dd, J

= 8.0, 16.0 Hz, H-5), 5.856 (dd, J = 9.2, 16.0 Hz, H-6), 5.235 (m, H-7), 1.968

(ddd, J = 2.0, 3.2, 14.0 Hz, Ha-8), 1.872 (dt, J = 3.2, 14.0 Hz, Hb-8), 5.348

35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(m, H-9), 1.265 (d, J = 6.4 Hz, H3-10).

Chương 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất VK-13-1

Hợp chất VK-13-1 được phân lập ở dạng chất rắn không màu (Hình 3.1).

Bằng phương pháp phân tích phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao

(HRESIMS), công thức phân tử được xác định là C12H16O5 thông qua ion giả

+, 263.0890), cho thấy có 5 liên kết đôi tương đương.

phân tử [M+Na]+ ở m/z 263.0890 (tính toán lý thuyết cho công thức

C12H16NaO5

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-1

Phân tích phổ cộng hưởng từ nhân 1H NMR của hợp chất VK-13-1 cho

thấy tín hiệu của 4 proton olefinic tại H 6.03 (dd, J = 1.6, 12.4 Hz, H-2), 5.79

(dd, J = 3.6, 12.4 Hz, H-3), 5.60 (dd, J = 8.4, 16.0 Hz, H-5), và 5.71 (dd, J =

8.8, 16.0 Hz, H-6). Hằng số tương tác (J = 12.4 Hz) và (J = 16.0 Hz) của các

proton olefin này cho phép xác dịnh lần lượt cấu hình cis- và trans của các

nối đôi. Phổ 1H NMR bổ sung thêm tín hiệu của 2 oxymethine proton tại H

5.81 (ddd, J = 1.6, 3.2, 8.0 Hz, H-4) và 5.26 (m, H-9), 2 protons với hằng số

tương tác germinal H 1.90 (ddd, J = 2.0, 3.2, 14.0 Hz, H-8a) và 1.74 (dt, J =

3.2, 14.0 Hz, H-8b), và 2 nhóm methyl tại H 1.24 (d, J = 6.4 Hz, H3-10) và

2.04 (s, OCOCH3).

Tiến hành phân tích các tín hiệu phổ cộng hưởng từ nhân 13C NMR và

DEPT ghi nhận 12 tín hiệu cacbon, bao gồm 2 cacbon carbonyl tại C 169.8 (C-1) và 171.6 (OC-CH3), 4 cacbon methine sp2 [125.6 (C-2), 133.3 (C-3), 126.6 (C-5), và 140.9 (C-6)], 3 cacbon methine sp3 mang oxy [73.9 (C-4),

36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

72.7 (C-7), và 70.3 (C-9)], một sp3 methylene tại 43.8 (C-8), và 2 nhóm

methyl tại 21.5 (C-10) và 20.9 (OC-CH3) (Bảng 3.1 ). Với những minh chứng

phổ này, hợp chất VK-13-1 được gợi ý thuộc lớp chất 10-membered

macrolide [21].

C

DEPT

a,c mult. (J = Hz)

a

1 2 3 4 5 6 7 8

#δC 170.9 123.7 138.7 73.0 131.8 139.4 73.6 44.7

a,b δC 169.8 125.6 133.3 73.9 126.6 140.9 72.7 43.8

HMBC (HC) 1, 3, 4 1 2, 3, Ac 3, 6, 7 4, 5, 8 5, 8, 9 6, 7, 9, 10

C CH CH CH CH CH CH CH2

δH 6.03 (dd, 1.6, 12.4) 5.79 (dd, 3.6, 12.4) 5.81 (ddd, 1.6, 3.2, 8.0) 5.60 (dd, 8.4, 16.0) 5.71 (dd, 8.8, 16.0) 4.12 (m) 1.90 (ddd, 2.0, 3.2, 14.0) 1.74 (dt, 3.2, 14.0) 5.26 (m) 1.24 (d, 6.4) 2.04 (s)

70.9 22.4

70.3 21.5 171.6 20.9

9 CH 1, 7, 8, 10 10 CH3 8, 9 4-O-Ac C CH3 C=O #δC của modiolide A [21], a đo trong CD3OD, b100 MHz, c 400MHz

Bảng 3.1 . Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-1

Hình 3.2. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-1

37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.3. Các tương tác NOESY chính của hợp chất VK-13-1

Phân tích phổ HSQC và COSY, hệ spin từ H-2 đến H3-10 được khẳng

định (Hình 3.2). Tiến hành so sánh phổ 13C NMR của VK-13-1 với số liệu

phổ của hợp chất 10-membered macrolide đã biết là modiolide A cho thấy cấu

trúc của 2 hợp chất này khá tương đồng, ngoại trừ sự xuất hiện của tín hiệu

một nhóm acetyl ở hợp chất VK-13-1 (Bảng 3.1 ) [21]. Vị trí của nhóm acetyl

này ở C-4 được xác định thông qua tương tác HMBC từ H 5.81 (H-4) đến C

171.6 (Hình 3.2). Cấu hình tương đối của VK-13-1 được xác định thông qua

phân tích phổ NOESY. Trên phổ NOESY, H-9 thể hiện tương tác NOE với

H-7, cho thấy H-7 và H-9 đều quay về cùng một hướng trong không gian của

của phân tử (Hình 3.3). Hướng quay đối diện của Ha-8 và H3-10 được xác

định thông qua tương tác NOE giữa các proton này. Ngoài ra, H-7 tương tác

NOE với H-5, trong khi H-6 tương tác với H-4, điều này cho thấy H-4 và H-7

có hướng quay ngược chiều nhau. Các tương tác NOE này là tương tự với các

tương tác của hợp chất đã công bố là modiolide A, cho thấy cấu hình tương

đối của 2 hợp chất này tương đồng với nhau [21].

Hình 3.4. Hiệu số H của VK-13-1a và VK-13-1b

Cuối cùng, cấu hình tuyệt đối của hợp chất VK-13-1 được xác định bằng

phương pháp Mosher [20]. Các dẫn xuất (S)- MTPA ester (VK-13-1a) và (R)-

MTPA ester (VK-13-1b) của hợp chất VK-13-1 được bán tổng hợp lần lượt

38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

với (R)- và (S)-MTPA chloride. Tiến hành phân tích phổ 1H NMR và tính

toán giá trị Δδ = (δS - δR) của các vị trí proton trong phân tử cho phép xác

định cấu hình tuyệt đối của vị trí C-7 là S (Hình 3.4). Với những minh chứng

phổ và kết quả phân tích hóa lý thu được như đã trình bày, cấu trúc của hợp

chất VK-13-1 được xác định là (2Z,4R,5E,7S,9R)-4-O-acetyl-7-hydroxy-9-

methyl-2,5-nonadien-9-olide, với tên gọi là modiolide D [19].

3.2 Phân tích cấu trúc của hợp chất VK-13-2

Hợp chất VK-13-2 có dạng chất rắn không màu (Hình 3.5), với công

thức phân tử được xác định là C12H16O5 thông qua sự có mặt của ion [M+Na]+

+, 263.0890)

tại m/z 263.0892 (tính toán lý thuyết cho công thức C12H16NaO5

thông qua phân tích phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao

HRESIMS.

Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-2

Tiến hành phân tích phổ 1H, 13C NMR, và DEPT của hợp chất VK-13-2

cho thấy sự xuất hiện của 2 nối đôi (bao gồm một cis- và trans), 2 cacbon

carbonyl, 3 nhóm oxymethine, một methylene, và 2 nhóm methyl (Bảng 3.2).

Phân tích so sánh phổ 1H và 13C NMR của VK-13-2 với hợp chất VK-13-1

cho thấy hai hợp chất này là dẫn xuất của nhau. Điểm khác biệt giữa 2 hợp

chất này là vị trí của nhóm acetyl trong phân tử (Bảng 3.2). Dựa vào các phân

tích phổ HSQC và COSY, cùng với tương tác HMBC từ tín hiệu H 5.22 (H-

7) tới C 171.6 cho thấy nhóm acetyl liên kết với vị trí C-7 (Hình 3.6).

Phân tích các tương tác xa trong không gian trên phổ NOESY cho thấy

39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

các tương tác NOE của VK-13-2 khá tương đồng so với VK-13-1 gợi ý sự

tương tự về cấu hình tương đối của 2 hợp chất này. Các tương tác NOE giữa

H-7 với H-5 và H-9 cho thấy các proton này quay về cùng một hướng trong

không gian (Bảng 3.2). Tương tác NOE giữa H-4 và H-6, giữa H-6 và Ha-8,

và giữa Ha-8 và H3-10 cho thấy H-4, Ha-8, và H3-10 cùng nằm trên một mặt

phẳng trong không gian. Từ những phân tích trên, cấu hình tương đối của hợp

chất VK-13-2 được xác định.

C

a,b

a,c (mult., J = Hz)

HMBC

NOESY

#δC

a

δC

DEPT δH

(HC)

(HH)

1

170.9

169.9 C

2

123.7

122.9 CH

5.90 (dd, 1.6, 12.8)

1, 3, 4

3

3

138.7

137.8 CH

5.84 (dd, 3.6, 12.8)

1, 4, 5

2

4

73.0

71.9

CH

4.69 (br d, 8.0)

2, 3, 6

6

5

131.8

134.0 CH

5.77 (dd, 8.4, 16.0)

3, 6, 7

7

6

139.4

133.9 CH

5.60 (dd, 9.2, 16.0)

4, 5, 8

4, 8a

7

73.6

75.2

CH

5.22 (m)

5, 6, 8, 9, Ac

5, 8b, 9

8

44.7

40.7

1.95 (ddd, 1.6, 2.8, 13.6)

6, 7, 9, 10

10

CH2

1.85 (dt, 2.8, 13.6)

7, 9

9

70.9

69.8

CH

5.30 (m)

1, 7, 8, 10

7, 8b

10

22.4

21.5

1.24 (d, 6.4)

8, 9

8a

CH3

4-O-Ac

171.6 C

21.1

1.99 (s)

C=O

CH3

#δC của modiolide A [21], a đo trong CD3OD, b100 MHz, c 400 MHz

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-2

40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-2

Tiếp theo, cấu hình tuyệt đối của C-4 được xác định là R thông qua

phương pháp Mosher, dựa vào phân tích phổ 1H NMR và tính toán giá trị Δδ

của các vị trí proton trong phân tử của 2 dẫn xuất (S)- MTPA ester (VK-13-

2a) và (R)-MTPA ester (VK-13-2b) (Hình 3.7). Từ những phân tích phổ nêu

trên, cấu trúc hóa học của VK-13-2 được xác định là (2Z,4R,5E,7S,9R)-4-

hydroxy-7-O-acetyl-9-methyl-2,5-nonadien-9-olide, với tên gọi là modiolide

E [19].

41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.7. Hiệu số H của VK-13-2a và VK-13-2b

KẾT LUẬN

1. Bằng phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết hợp với

các phương pháp sắc ký thông thường như sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột, 02

hợp chất VK-13-1 và VK-13-2 được phân tách từ dịch chiết EtOAc chủng vi

nấm biển Paraconiothyrium sp.. Giá trị Rf của hợp chất VK-13-1 là 0.4

(MeOH-H2O 10:18). Thời gian lưu (Rt) của hợp chất VK-13-2 trên sắc ký đồ

HPLC là 23.7 phút [hệ dung môi pha động: 30100 % MeOH trong H2O (0.1

% formic acid) trong 60 phút].

2. Bằng các phương pháp phân tích phổ khối lượng phun mù điện tử

thời gian bay phân giải cao (HRESITOFMS), công thức phân tử của hợp

chất VK-13-1 được xác định là C12H16O5, khối lượng phân tử: M= 240;

công thức phân tử của hợp chất VK-13-2 được xác định là C12H16O5; khối

lượng phân tử: M= 240.

VK -13-1 VK – 13-2

3. Bằng các phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ nhân 1 chiều

(như phổ 1H NMR, 13C NMR, DEPT-135) và 2 chiều (như phổ HMQC,

HSQC, HMBC, và NOESY), hợp chất VK-13-1 được xác định là modiolide

D; hợp chất VK-13-2 được xác định là modiolide E.

4. Cấu hình tuyệt đối của hợp chất VK-13-1 và VK-13-2 được xác định

bằng phân tích và so sánh các dữ kiện phổ 1H NMR của các dẫn xuất MTPA-

42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ester thông qua phương pháp Mosher.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] J. Kohlmeyer, E. Kohlmeyer, Marine Mycology, the higher fungi, Academic Press;

New York, San Francisco, London (1979) 54–69.

[2] J.F. Grove, J. MacMillan, T.P.C. Mulholland, M.A.T. Rogers, 759. Griseofulvin. Part I,

J. Chem. Soc. (1952) 3949-3958.

[3] M.S. Butler, The role of natural product chemistry in drug discovery, J. Nat. Prod. 67

(2004) 2141-2153.

[4] W. Abramovits, A. Gupta, M. Gover, Altabax (retapamulin ointment), 1%, Skinmed 6

(2007) 239–240.

[5] P.M. Dewick, Medicinal Natural Products. A Biosynthetic Approach, John Wiley &

Sons Ltd., Baffins Lane, Chichester, UK (2006)

[6] G.G. Newton, E.P. Abraham, Cephalosporin C, a new antibiotic containing sulphur and

D-alpha-aminoadipic acid, Nature 175 (1955) 548.

[7] R. Ebel, Secondary metabolites from marine derived fungi. In Frontiers in Marine

Biotechnology, Horizon Scientific Press, Norwich (2006) 73–143.

[8] A. Dalla Bona, F. Formaggio, C. Peggion, B. Kaptein, Q.B. Broxterman, S. Galdiero,

M. Galdiero, M. Vitiello, E. Benedetti, C. Toniolo, Synthesis, conformation, and

bioactivity of novel analogues of the antiviral lipopeptide halovir A, J. Pept. Sci. 12

(2006) 748-757.

[9] G. Bringmann, T.A.M. Gulder, G. Lang, S. Schmitt, R. Stöhr, J. Wiese, K. Nagel, J.F.

Imhoff, Large-scale biotechnological production of the antileukemic marine natural

product sorbicillactone A, Mar. Drugs 5 (2007) 23-30.

[10] G.J.M. Verkley, M.d. Silva, D.T. Wicklow, P.W. Crous, Paraconiothyrium, a new

genus to accommodate the mycoparasite Coniothyrium minitans, anamorphs of

Paraphaeosphaeria, and four new species, Stud. Mycol. 50 (2004) 323-335.

[11] I.E. Mohamed, S. Kehraus, A. Krick, G.M. König, G. Kelter, A. Maier, H.-H. Fiebig,

M. Kalesse, N.P. Malek, H. Gross, Mode of action of epoxyphomalins A and B and

characterization of

related metabolites

from

the marine-derived

fungus

Paraconiothyrium sp, J. Nat. Prod. 73 (2010) 2053-2056.

[12] Y. Shiono, M. Kikuchi, T. Koseki, T. Murayama, E. Kwon, N. Aburai, K.-i. Kimura,

Isopimarane diterpene glycosides, isolated from endophytic fungus Paraconiothyrium

sp. MY-42, Phytochemistry 72 (2011) 1400-1405.

43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

[13] S. Chen, Y. Zhang, S. Niu, X. Liu, Y. Che, Cytotoxic cleistanthane and cassane

diterpenoids from the entomogenous fungus Paraconiothyrium hawaiiense, J. Nat.

Prod. 77 (2014) 1513-1518.

[14] L. Liu, X. Chen, D. Li, Y. Zhang, L. Li, L. Guo, Y. Cao, Y. Che, Bisabolane

sesquiterpenoids from the plant endophytic fungus Paraconiothyrium brasiliense, J.

Nat. Prod. 78 (2015) 746-753.

[15] Z. Guo, F. Ren, Y. Che, G. Liu, L. Liu, New bergamotane sesquiterpenoids from the

plant endophytic

fungus Paraconiothyrium brasiliense, Molecules

(Basel,

Switzerland) 20 (2015) 14611-14620.

[16] N. Cho, T.T. Ransom, J. Sigmund, T. Tran, R.H. Cichewicz, M. Goetz, J.A. Beutler,

Growth inhibition of colon cancer and melanoma cells by versiol derivatives from a

Paraconiothyrium species, J. Nat. Prod. 80 (2017) 2037-2044.

[17] G.-B. Xu, J. Mi, T. Yang, L.-W. Wu, X.-H. Yuan, G.-Y. Li, Two New Polyketide

Metabolites Isolated from Paraconiothyrium brasiliense, Chem. Nat. Compd. 53

(2017) 870-873.

[18] S. Amand, M. Vallet, L. Guedon, G. Genta-Jouve, F. Wien, S. Mann, J. Dupont, S.

Prado, B. Nay, A reactive eremophilane and its antibacterial 2(1H)-naphthalenone

rearrangement product, ưitnesses of a microbial chemical warfare, Org. Lett. 19 (2017)

4038-4041.

[19] T.H. Quang, D.C. Kim, P. Van Kiem, C. Van Minh, N.X. Nhiem, B.H. Tai, P.H. Yen,

N. Thi Thanh Ngan, H.J. Kim, H. Oh, Macrolide and phenolic metabolites from the

marine-derived fungus Paraconiothyrium sp. VK-13 with anti-inflammatory activity,

J. Antibiot. 71 (2018) 826-830.

[20] I. Ohtani, T. Kusumi, Y. Kashman, H. Kakisawa, High-field FT NMR application of

Mosher's method. The absolute configurations of marine terpenoids, J. Am. Chem.

Soc. 113 (1991) 4092-4096.

[21] M. Tsuda, T. Mugishima, K. Komatsu, T. Sone, M. Tanaka, Y. Mikami, J. Kobayashi,

Modiolides A and B, two new 10-membered macrolides from a marine-derived

fungus, J. Nat. Prod. 66 (2003) 412-415.

[22] Đinh Thị Trường Giang ( chủ biên ), Đinh Thị Huyền Trang ( 2017 ), Giáo trình Hóa

phân tích,NXB Đại học Vinh

[23] Đào Hữu Vinh (chủ biên), Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mĩ Linh, Phạm Hùng Việt

(1985), Các phương pháp sắc ký , NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

[24] Phạm Luận ( 2000) Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Trường Đại học tổng

hợp Hà Nội

[25] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà, Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu

trúc phân tử (1999), Nhà xuất bản giáo dục.

[26] Nguyễn Kim Phi Phụng, Khối Phổ lý thuyết - bài tập - bài giải (2004), Nhà xuất bản

đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.

[27] Nguyễn Đình Triệu, Các phương pháp phổ trong Hóa học hữu cơ và hóa sinh (2007),

Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

PHỤ LỤC

PHỔ NMR VÀ MS CÁC HỢP CHẤT

46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

1.1. Phụ lục phổ hợp chất VK-13-1

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.a. Phổ HRESIMS của hợp chất VK-13-1

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.b. Phổ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-1

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.c. Phổ 13C NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-1

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.d. Phổ DEPT-135 (100 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-1

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.e. Phổ HMQC (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-1

6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.f. Phổ HMBC (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-1

7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.g. Phổ COSY (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-1

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1.h. Phổ NOESY (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-1

1.2. Phụ lục phổ hợp chất VK-13-2

9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.a. Phổ HRESIMS của hợp chất VK-13-2

10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.b. Phổ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-2

11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.c. Phổ 13C NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-2

12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.d. Phổ DEPT-135 (100 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-2

13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.e. Phổ HMQC (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-2

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.f. Phổ HMBC (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-2

15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.g. Phổ COSY (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-2

16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2.h. Phổ NOESY (400 MHz, CD3OD) của hợp chất VK-13-2