Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thiên nhiên từ cây Đại hoàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Hoàng Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ

HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT

THIÊN NHIÊN TỪ CÂY ĐẠI HOÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Hà Nội, 2021

Lời cam đoan

Luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học

của TS.DS. Phạm Ngọc Khanh và TS. Ngũ Trường Nhân.

Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực.

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Ngọc Ánh

Lời cảm ơn

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.DS. Phạm Ngọc Khanh và TS. Ngũ Trường Nhân, người cô, người thầy bằng cả tâm huyết của mình đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thiện luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (VAST), GS.TS. Nguyễn Mạnh Cường và các anh chị - phòng Hoạt chất sinh học- Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp tôi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, các kiến thức thực nghiệm…để tôi hoàn thành tốt luận văn của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thầy cô trong Học Viện Khoa học và Công nghệ và Khoa Hóa học đã giảng dạy, hỗ trợ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn

động viên để tôi có động lực trong công việc và hoàn thành tốt luận văn này.

Xin chân thành cảm ơn!

iii

Danh mục kí hiệu và chữ viết tắt

Kí hiệu Tiếng anh Tiếng việt

TLC Thin-Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

CC Column Chromatography Sắc ký cột dưới trọng lực dung môi

1H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR

Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Phổ DEPT DEPT Disstortionless Enhancement by Polarition Transfer

Density Functional Theory Thuyết phiếm hàm mật độ DFT

NO Nitric oxide inhibition

tumor necrosis factor TNF-

IL-6 interleukin-6

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

Danh mục bảng

Bảng 1.1. Các hợp chất anthraquinon phân lập từ chi Đại hoàng ........................ 5

Bảng 1.2: Các hợp chất anthron phân lập từ chi Đại hoàng .................................. 9

Bảng 1.3: Các hợp chất stilben phân lập từ chi Đại hoàng................................. 12

Bảng 1.4: Các flavonoid phân lập từ chi Đại hoàng ........................................... 18

Bảng 1.5: Các hợp chất acylglucoside phân lập từ chi Đại hoàng ..................... 22

Bảng 2.1: Các amino axit trong vùng hoạt động của protein ............................. 36

Bảng 3.2: Dữ kiện phổ của hợp chất MC566 so sánh với tài liệu tham khảo .... 43

Bảng 3.4: Đánh giá tiêu chí giống thuốc của các hợp chất nghiên cứu .............. 48

Bảng 3.5: Tính toán năng lượng liên kết tự do của 3 hợp chất với hai protein 1ALU và 2AZ5 .................................................................................................... 50

Bảng 3.6: Các amino axit tham gia tương tác của 3 hợp chất phân lập được với hai protein 1ALU và 2AZ5 ................................................................................. 51

Bảng 3.7: Khả năng ức chế sản sinh NO của các chất phân lập được ............... 53

Danh mục hình

Hình 1.1: Một số hình ảnh của chi Đại hoàng – Rheum L ................................... 4

Hình 1.2: Cấu trúc các anthraquinon phân lập từ chi Đại hoàng ......................... 5

Hình 1.3: Cấu trúc các anthron phân lập từ chi Đại hoàng .................................. 8

Hình 1.4. Cấu trúc các stilben phân lập từ chi Đại hoàng .................................. 10

Hình 1.5 Cấu trúc các flavonoid phân lập từ chi Đại hoàng .............................. 15

Hình 1.6. Cấu trúc các acylglucoside phân lập được từ chi Đại hoàng ............. 21

Hình 2.1: Mẫu tiêu bản của thân rễ cây Đại hoàng ............................................ 30

Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách mẫu Đại hoàng ......................................................... 38

Hình 3.1: Cấu trúc các phối tử đã được tối ưu của các chất nghiên cứu ........... 46

Hình 3.2: Cấu trúc hai protein đã được tối ưu hóa ............................................. 49

MỤC LỤC

Danh mục kí hiệu và chữ viết tắt ...................................................................... iii

Danh mục bảng ................................................................................................... iv

Danh mục hình .................................................................................................... v

MỤC LỤC ........................................................................................................... vi

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI ĐẠI HOÀNG – RHEUM L. ...................................... 3

1.1.1. Phân loại ...................................................................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 3

1.1.3. Phân bố và thu hái ....................................................................................... 4

1.1.4. Thành phần hóa học .................................................................................... 4

1.1.4.1. Anthraquinon ............................................................................................ 5

1.1.4.2. Anthron ..................................................................................................... 8

1.1.4.3. Stilben ..................................................................................................... 10

1.1.4.4. Flavonoid ................................................................................................ 15

1.1.4.5. Acylglucoside ......................................................................................... 21

1.1.4.6. Các hợp chất khác .................................................................................. 22

1.1.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học ....................................................... 22

1.1.5.1. Tác dụng nhuận tràng ............................................................................. 22

1.1.5.2. Tác dụng kháng ung thư ........................................................................ 23

1.1.5.3. Tác dụng kháng viêm và giảm đau ........................................................ 23

1.1.5.4. Tác dụng bảo vệ gan............................................................................... 24

1.1.5.5. Tác dụng kháng vi-rut ............................................................................ 24

1.2. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI RHEUM OFFICINALE BAILL. ........................... 24

vii

1.2.1. Đặc điểm thực vật ..................................................................................... 24

1.2.2. Phân bố ...................................................................................................... 25

1.2.3. Thành phần hóa học .................................................................................. 25

1.2.4. Hoạt tính sinh học ..................................................................................... 25

1.3. GIỚI THIỆU VỀ LĨNH VỰC DOCKING PHÂN TỬ ................................ 26

1.3.1. Docking phân tử ........................................................................................ 26

1.3.2. Các đích nghiên cứu tác dụng kháng viêm ............................................... 27

1.3.3. Các tiêu chí giống thuốc của các hợp chất ................................................ 29

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................................................................................................ 30

2.1. NGUYÊN LIỆU ........................................................................................... 30

2.2. PHƯƠNG PHÁP .......................................................................................... 30

2.2.1. Thu thập mẫu thực vật ............................................................................... 30

2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ............................................................... 31

2.2.3. Nghiên cứu về khả năng kháng viêm ........................................................ 31

2.2.4. Phương pháp docking phân tử ................................................................... 34

2.2.5. Mô tả tiến trình thí nghiệm docking ......................................................... 35

2.2.5.1. Xử lý cấu trúc phối tử............................................................................. 35

2.2.5.2. Xử lý cấu trúc protein ............................................................................. 35

2.2.5.3. Xác định vùng họat động của protein .................................................... 35

2.2.5.4. Mô phỏng tương tác phân tử bằng Autodock 4.2.6 ............................... 36

2.3. THỰC NGHIỆM .......................................................................................... 36

2.3.1. Hóa chất và dụng cụ .................................................................................. 36

2.3.2. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách ............................................................... 36

2.3.3. Tính chất vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .............. 38

viii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 40

3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT SẠCH TỪ CÂY ĐẠI HOÀNG ............................................................................................................... 40

3.1.1. Cấu trúc hợp chất MC565 ........................................................................ 40

3.1.2. Cấu trúc của hợp chất MC566 .................................................................. 42

3.1.3. Cấu trúc của hợp chất MC567 ................................................................... 44

3.2. ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HỢP CHẤT SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING PHÂN TỬ .............................................. 46

3.2.1. Tối ưu hóa cấu trúc hợp chất nghiên cứu .................................................. 46

3.2.2. Đánh giá các tiêu chí giống thuốc của các hợp chất nghiên cứu .............. 48

3.2.3. Xử lý tối ưu hóa cấu trúc protein nghiên cứu ........................................... 49

3.3.4. Kết quả mô phỏng tương tác ..................................................................... 50

3.3. HOẠT TÍNH ỨC CHẾ SỰ SẢN SINH NO CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP .......................................................................................................... 52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 56

MỞ ĐẦU

Viêm là một đáp ứng sinh học phức tạp của cơ thể khi có các tác nhân gây bệnh xâm nhập như vi khuẩn, vi rút hoặc các yếu tố kích thích như vật lý, hóa học. Về bản chất viêm là một phản ứng tự bảo vệ của cơ thể tuy nhiên nếu quá trình viêm diễn ra trường kỳ, theo chiều hướng mất kiểm soát sẽ dẫn đến nhiều bệnh lý mạn tính như viêm khớp, bệnh tim mạch, huyết áp, ung thư, tiểu đường, rối loạn hoạt động thần kinh như bệnh Parkinson, Alzheimer’s. Các phát hiện trên dựa trên các thử nghiệm ức chế các chất trung gian gây viêm như là các cytokine (IL-1α, IL-6, IL-12), TNF -α, yếu tố phiên mã NF-kB và các enzym COX-1, COX-2, COX-3, NOS).

Gần đây virut SARS-CoV-2 gây ra đại dịch toàn cầu có tên là COVID-19. Các nghiên cứu dịch tễ trên người nhiễm virus đã chỉ ra mối liên hệ quan trọng giữa sự tiến triển của bệnh viêm phổi cấp tính với dấu hiệu cơ thể bị cơn bão viêm, dẫn đến các phản ứng miễn dịch quá mẫn của cơ thể và cuối cùng là gây tử vong. Vì vậy, việc nghiên cứu tác dụng kháng viêm của các hoạt chất, các cây thuốc đang là một trong những hướng nghiên cứu được đẩy mạnh cả trong nước và trên thế giới nhằm tìm kiếm những biện pháp hữu hiệu để phòng và điều trị bệnh virut COVID-19.

Từ thời xa xưa, người ta đã phát hiện rất nhiều các cây thuốc và bài thuốc điều trị các bệnh viêm nhiễm đã được sử dụng nhiều trong nền y học cổ truyền trên thế giới. Nhiều dạng hợp chất thiên nhiên khác nhau đã được phát hiện có tác dụng kháng viêm, ví dụ như các hợp chất phenolic, flavonoid và đặc biệt là các hợp chất khung anthraquinon như rubiadin-3-methyl ether, aloe-emodin, morindone và nhiều hợp chất khác.

Trong số các cây thuốc của Việt Nam, cây Đại hoàng là một trong cây đã được sử dụng điều trị các bệnh viêm nhiễm trong dân gian và có thành phần hóa học chính là các hợp chất anthraquinon. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thiên nhiên từ cây Đại hoàng” với mục đích tìm kiếm các hợp chất kháng viêm tiềm năng từ cây Đại hoàng, định hướng trong phát triển phòng bệnh COVID-19 trong tương lai.

Đề tài đặt ra mục tiêu nghiên cứu là nghiên cứu thành phần hóa học và tác

dụng kháng viêm của cây Đại Hoàng, với các nội dung nghiên cứu cụ thể là:

- Phân lập các chất tinh khiết từ cây Đại hoàng (Rheum officinale Baill.).

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được.

- Đánh giá khả năng kháng viêm của các chất phân lập bằng in silico.

- Đánh giá tác dụng kháng viêm qua phép thử ức chế sản sinh NO in vitro của các chất phân lập được.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI ĐẠI HOÀNG – Rheum L.

1.1.1. Phân loại

Các loài thuộc chi Rheum L. (Đại hoàng) là những cây thân thảo lâu năm, phân bố ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới. Theo cơ sở dữ liệu The Plant List (plantlist.com) chi Đại hoàng có đến 121 tên gọi trong đó có 44 tên được chấp nhận. Trung Quốc là nước có số lượng loài Đại hoàng phân bố nhiều chiếm khoảng 3/4 số chi. Chi Đại hoàng chủ yếu được tìm thấy ở các khu vực Tây Bắc và Tây Nam của Trung Quốc [1].

Vị thuốc Đại hoàng (Rhubarb) ở Ấn Độ bao gồm các loài là R. emodi và R. webbianum, R. moorcroftianum và R. spiciforme [2]. Trong khi đó ở Nhật Bản chủ yếu gồm Rheum tangutium Max., R. coreanum Nakai, R. palmatum L., và R. officinale Baill. hoặc các loài lai giữa chúng [3].

Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ mô tả trong quyển Cây cỏ Việt Nam, Đại Hoàng có 4 loài gồm: R. palmatum L., R. tanguticum Maxim. ex Regel., R. officinale Baill. và R. rhaponticum [4]. Theo tác giả Võ Văn Chi trong quyển từ điển cây thuốc Việt Nam, Đại hoàng gồm R. officinale Baill. và R. palmatum L. [5].

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Chi Đại hoàng gồm các loài thân thảo sống lâu năm, rễ dài thường phình to dạng củ, thân thường rỗng, có rãnh, nhẵn hoặc có lông, lá đơn, có mép lá dạng lƣợn sóng, răng cưa hay xẻ thùy chân vịt. Những lá phía dưới thưa, dày, hoặc xếp hình hoa thị, lớn hơn những lá phía trên, bẹ lá thường lớn; dạng màng mép thường nguyên. Hoa mọc thành chùm đơn hoặc chùm kép, thường hình chùy, hình cầu hoặc hình bông, cuống hoa có đốt, hoa lưỡng tính hoặc đơn tính cùng gốc. Bao hoa sống dai, lá đài 6. Nhị thường 9 (6 + 3), hiếm khi 7 hoặc 8. Nhụy ngắn, 3 ô nằm ngang; đầu nhụy phình to, mép uốn ngược xuống. Quả bế ba cạnh, có cánh [6].

Hình 1.1: Một số hình ảnh của chi Đại hoàng – Rheum L

R. officinale R. palmatum L R. tanguticum

1.1.3. Phân bố và thu hái

Cây có nguồn gốc ở Trung Quốc được dùng từ lâu đời và dần dần thâm nhập vào châu Âu. Ở Trung Quốc cây mọc hoang hoặc trồng ở Cam Túc, Thanh Hải, Tứ Xuyên. Đại hoàng mọc ở tỉnh Tứ xuyên được chuộng và được gọi là Xuyên đại hoàng. Hiện nay Đại hoàng cũng đã được di nhập trồng ở nhiều nước như: Hà Lan, Pháp, Mỹ, Nhật, Nga, Việt Nam.

Cây ưa mọc ở khí hậu mát, ẩm, ở độ cao trên 1000m. Người ta thu hoạch thân rễ của nhữmg cây đã mọc trên 3-4 năm (ở những vùng có cây mọc hoang thì có thể 6 – 10 năm) vào mùa thu, khi cây bắt đầu lụi. Thân rễ tươi to có thể có chiều dài 20-30cm, rộng 8-10cm, có nhiều nhánh rễ hình trụ đường kính 2-3cm. Sau khi đào về thì cắt bỏ rễ, còn thân rễ đem gọt bỏ vỏ ngoài, bổ nhỏ (dọc hoặc ngang) rồi phơi hoặc sấy khô. Cất giữ sau một năm mới dùng [7].

1.1.4. Thành phần hóa học

Trên thế giới, các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc nhiều hợp chất từ cây Đại hoàng. Cho đến năm 2013, có khoảng 200 hợp chất chủ yếu thuộc sáu bộ khung (anthraquinon, anthrone, stilben, flavonoid, acylglucosid và pyrone) đã được phân lập từ mười tám loài thuộc chi Rheum L. [8].

1.1.4.1. Anthraquinon

Anthraquinon là một thành phần quan trọng trong cây Đại hoàng. Các anthraquinon như rhein, emodin, physcion, và chrysophanol, có mặt trong gần như tất cả các loài Rheum L.[8]. Đã có 31 hợp chất anthraquinon được phân lập từ chi Rheum L. và hầu hết trong số đó cho thấy tác dụng dược lý tốt.

1 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 2 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝OCH3 3 R1＝R6＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 4 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH2OH

5 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝COOH 6 R1＝R2＝R5＝R8＝H R3＝R4＝R6＝OH R7＝CH3 7 R1＝CH3 R2＝COOH R3＝R6＝R8＝OH R4＝R5＝R7＝H 8 R1＝R3＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R6＝CH2OH 9 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝OH 10 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OCH3 11 R1＝OGlc R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OH 12 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OGlc 13 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OGlc-G 14 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OGlc-B

15 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OGlc-A

16 R1＝OGlc R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝R8＝OH 17 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝OGlc 18 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OGlc 19 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝OSO3H R8＝ OGlc 20 R1＝R6＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R8＝OGlc-Glc 21 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH2OH R6＝CH3 22 R1＝OGlc R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH2OH R8＝OH 23 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH2OH R8＝OGlc 24 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝CH2OGlc 25 R1＝R8＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝COOH R6＝CH33 26 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝COOH R8＝OGlc 27 R1＝OGlc R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝OCH3 R8＝OH 28 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝OCH3 R8＝OGlc 29 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R7＝H R3＝CH3 R6＝OCH3 R8＝ OGlc-Glc 30 R1＝OH R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H R3＝COOH R8＝OA 31 R1＝CH3 R2＝COOH R3＝OB R4＝R5＝R6＝R7＝H R8＝OH

Hình 1.2: Cấu trúc các anthraquinon phân lập từ chi Đại hoàng

Bảng 1.1. Các hợp chất anthraquinon phân lập từ chi Đại hoàng

STT Tên hợp chất Nguồn thực vật

1 Chrysophanol

a, b, c, d, e, g, h, i, j, k, l, m, n, o

2 Physcion

a, b, c, d, e, f, g, i, k, l, m, n, o

3 Emodin

a, b, c, d, e, f g, h, i, j, k, l, m, n, o

4 Aloe-emodin

a, b, c, f, h, k, l, m, n, o

a, b, c, h, m, n, o 5 Rhein

6 Chrysaron q

7 Laccaic acid D r

8 Citreorosein i, e, l

9 Revandchinone-3 d

l 10 Chrysophanol-8-Metylether

11 Chrysophanol-1-O-β-D-Glccopyranoside a, c, h, j

12 Chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside a, b, c, d, e, g, h, l, k, n

13 Chrysophanol-8-O-β-D-(6′-O-galloyl)- h, n

glucopyranoside

f 14 Chrysophanol-8-O-β-D-(6′-O-malonyl)-

glucopyranoside

d 15 Chrysophanol-8-O-β-D-(6′-O-acetyl)-

glucopyranoside

16 Emodin-1-O-β-D-glucopyranoside c, n

17 Emodin-6-O-β-D-glucopyranoside a

18 emodin-8-O-β-D-glucopyranoside d, l, g, i, k, m, n

19 Emodin-8-O-β-D-glucopyranosyl-6-O-sulfate d

20 Emodin-gentiobioside e

21 6-methyl-aloe-emodin d

22 Aloe-emodin-1-O-β-D-glucopyranoside n

23 Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside f, h, b, i, n

24 Aloe-emodin-3-(hydroxymethyl)-O-β-D a, l

glucopyranoside

25 6-methyl-rhein d

26 6-methyl-rhein a

27 Physcion-1-O-β-D-glucopyranoside d

28 Physcion-8-O-β-D-glucopyranoside a, c, d, f, h, m, n

29 Physcion-8-O-β-D-gentiobioside c

30 Rhein-8-O-β-D-[6′-O-(3′′-methoxy malonyl)] a

glucopyranoside

31 1-methyl-8-hydroxy-9,10-anthraquinone3-O-β- a

D-(6′-O-cinnamoyl) glucopyranoside

Chú ý: a: R. palmatum; b: R. tanguticum; c: R. officinale; d: R. emodi; e: R. nanum; f: R. qinjingense; g: R. wittrochii; h: R. hotaoense; i: R. sublanceolatum; j: R. rhizastachyum; k: R. uninrrre; l: R. glabrucaule; m: R. franzenbachil; n: R. undulatum; o: R. Spiciforme; q: R. rhaponticum; r: Shin-Shu Daio (loài chưa xác định giữa R. coreanum và R. palmatum)

1.1.4.2. Anthron

Cho đến nay có khoảng 26 Anthron đã được phân lập từ chi Đại hoàng

(Hợp chất 32-57).

32. R1 = R2 = Glc R3= OH R4 = H

33. R1 = R3 = Glc R2= OH R4 = H

34. R1 = R2= H R3= R4 = Glc

35. R1 = R2= Glc R3= R4 = H

36. R1 = R3= Glc R2= R4 = H

37. R1 = R4= H R2= OH R3 = Glc

42. R1=COOH R2=H 10-10’ trans

38. R1 = R2= Glc R2= OH R4 = H

43. R1=COOH R2=H 10-10’ meso

39. R1 = R3= Glc R2= OH R4 = H

44. R1=CH2OH R2=H 10-10’ trans

45. R1=CH2OH R2=H 10-10’ meso

40. R1 = R3= Glc R2= R4 = H 41. R1 = R3= Glc R2= R4 = H

46. R1=COOH R2 =Oxalyl 10-10’ trans 47. R1=COOH R2 =Oxalyl 10-10’ meso

55. R1=OCH3 R2=H R3=CH3 R4=OCO(CH2)7CH3

56. R1=R2=H R3=CH3 R4= OCO(CH2)26CH3 57. R1=R2=OH R3=CH2OH R4= OCO(CH2)16CH3

48. R1=CH3 R2=CH2OH R3=OH

49. R1=CH3 R2=CH2OH R3=H

50. R1=CH3 R2=CH3 R3=OH

51. R1=CH3 R2=COOH R3=OH

Hình 1.3: Cấu trúc các anthron phân lập từ chi Đại hoàng

52. R1=CH3 R2=COOH R3=H

53. R1=CH3 R2=COOH R3=OCH3

54. R1=COOH R2=CH2OH R3=OH

Bảng 1.2: Các hợp chất anthron phân lập từ chi Đại hoàng

STT Tên hợp chất Nguồn thực vật

10-hydroxycascaroside C 32 d

10-hydroxycascaroside D 33 d

10R-chrysaloin 1-O-β-D-glucopyranoside 34 d

35 Cascaroside C d

36 Cascaroside D d

37 Cassialoin b

38 Rheinoside A a

39 Rheinoside B a

40 Rheinoside C a

41 Rheinoside D a

42 Sennoside A a

43 Sennoside B a

44 Sennoside C a

45 Sennoside D a

46 Sennoside E a

47 Sennoside F a

48 Palmidin A a

49 Palmidin B a

50 Palmidin C a

51 Rendin A a

52 Rendin B a

53 Rendin C a

54 Sennidin C a

55 Revandchinone-1 d

56 Revandchinone-2 d

57 Revandchinone-4 d

Chú ý: a: R.palmatum; d: R.emodi

1.1.4.3. Stilben

Có 35 hợp chất stilben đã được phân lập từ chi Đại hoàng (Hợp chất 54-92).

58 R1= CH3 R2= OH

65 R1 = R2 = R3= R4=H

59 R1= H R2= OH

66 R1=G R2=H R3=CH3 R4=OH

Hình 1.4. Cấu trúc các stilben phân lập từ chi Đại hoàng

67 R1= R2=R3 = H, R4=OH

60 R1= CH3 R2= H

68 R1= G R2=H R3 = CH3 R4=OH

61 R1= H R2= H

69 R1= H R2=G R3=CH3 R4 = OH

62 R1= Glc R2 =H

70 R1=H R2= p- coum R3 = CH3 R4=OH

63 R1= Glc-G R2-H

71 R1 =R2=R4=H R3=CH3

72 R1= R2=R3 = H, R4=OCH3

73 R1 =R2=R4=H R3=CH3

74 R1=G R2=R4=H R3=CH3 75 R1=R2=H R3=Glc R4=O

64 76 R1= OCH3 R2-H

77 R1= H R2= H

78 R1= H R2 = G

80 R-H 81 R-G

79

82. R1= OH R2= R3=H

86 R1=OH R2= R3=H

83 R1=OH R2=G R3= H

87 R1=OH R2=G R3=H

88 R1=R2=R3=H

89 R1=OH R2=H R3=G

84 R1=R3=H R2=p-coum 85 R1=R2=H R3=G

90

91

92

Bảng 1.3: Các hợp chất stilben phân lập từ chi Đại hoàng

STT Tên hợp chất Nguồn

58 Rhapontigenin

a, b, c, d, h, m, n

59 Piceatannol d, g, m, n, y

60 Desoxyrhapontigenin d, m, n

61 Resveratrol g, k

62 Resveratrol 4′-O-β-D-glucopyranoside b

63 Resveratrol 4′-O-β-D-(6′′-O-galloyl)-glucopyranoside b

64 y

5-[(Z)-2-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)ethenyl]benzene-1,3- diol 65 Resveratrol-3-O-β-D-glucoside x

66 Rhaponticin

b, c, h, m, n, x, y

67 Piceatannol 3-O-β-D-glucopyranoside y

68 Rhaponticin 6′′-O-gallate b, n, y

69 Rhaponticin 2′′-O-gallate b, n, y

70 Rhaponticin 2′′-p-coumarate y

71 Desoxyrhaponticin c, d, g, m, n, y

72 Isorhapontin n

73 Deoxyrhaponticin h, n

74 Desoxyrhaponticin 6′′-O-gallate y

75 Piceatannol-3,4'-O-β-D-diglucopyranoside n

76 Rhapontidenin 3′-3-O-β-D-glucopyranoside y

77 Piceatannol 3′-O-β-D-glucopyranoside h, m, n, y

78 Piceatannol 3-O-β-D-(6′′-O-galloyl) glucopyranoside y

79 Piceatannol 3′-O-β-D-xylopyranoside y

80 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-glucopyranoside a, b, c

81 a, b, c, y 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-(6′′-O-galloyl) glucopyranoside

82 Piceatannol 4′-O-β-D-glucopyranoside d, h, o

83 Piceatannol 4′-O-(6′′-O-galloyl) β-D-glucopyranoside o

84 Piceatannol 4′-O-(6′′-p-coumaroyl) β-D-glucopyranoside d

85 o 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-(2′′-O-galloyl) glucopyranoside

86 y 3,3′,5-trihydroxy-4′-methoxystilbene 3-O-β-D- glucopyranoside

87 y 3,3′,5-trihydroxy-4′-methoxystilbene 3-O-β-D-(6′′-O-galloyl) glucopyranoside

88 3,5-dihydroxy-4′-methoxystilbene 3-O-β-D-glucopyranoside y

89 y 3,3′,5-trihydroxy-4′-methoxystilbene 3-O-β-D-(2′′-O-galloyl) glucopyranoside

90 Gentin C e

91 Maximol A x

92 Maximol B x

Chú ý: a: R. palmatum; b: R. tanguticum; c: R. officinale; d: R. emodi; e: R. nanum; g: R. wittrochii; h: R. hotaoense; m: R. franzenbachil; n: R. undulatum; o: R. Spiciforme; x: R. palaestinum; y: commercial rhubarbs (Rheum rhabarbarum)

1.1.4.4. Flavonoid

Các hợp chất flavonoid (Hợp chất 93-137) phân lập được từ chi Đại hoàng

được trình bày trong hình 1.5.

93. R1＝R2＝R3＝R4＝R6＝OH R5＝R7＝H

106. R1＝R3＝OH R2＝R4＝R6＝H R5＝β-OH R7＝Glc R8＝α-OH

94. R1＝R2＝R3＝R6＝OH R4＝O-Glc R5＝R7＝H

107. R1＝R3＝OH R2＝R4＝R7＝H R5＝β-OH R6＝Glc R8＝α-OH

95. R1＝R2＝R3＝R4＝OH R5＝R7＝H R6＝O-Glc

108. R1＝OH R2＝R4＝R6＝H R3＝OH R5＝R7＝α-OH R8＝Glc

96. R1＝O-Glc R2＝R3＝R4＝R6＝OH R5＝R7＝H

109. R1＝R3＝OH R2＝R4＝R7＝H R5＝R8＝α-OH R6＝Glc

97. R1＝R3＝R4＝R6＝OH R2＝O-Glc R5＝R7＝H

110. R1＝R3＝R6＝R7＝H R2＝R4＝OH R5＝β-OH R8＝α-OH

98. R1＝R6＝O-Glc R2＝R3＝R4＝OH R5＝R7＝H

111. R1＝R3＝R6＝R7＝H R2＝R4＝OH R5＝R8＝α-OH

99. R1＝R4＝O-Glc R2＝R3＝R6＝OH R5＝R7＝H

112. R1＝R3＝R6＝R7＝H R2＝R4＝OH R5＝R8＝α-OH

100. R1＝R3＝R6＝OH R2＝R4＝O-Glc R5＝R7＝H

113. R1＝R3＝R6＝R7＝H R2＝R4＝OH R5＝R8＝α-OH

101. R1＝R2＝O-Glc R3＝R4＝R6＝OH R5＝R7＝H

114. R1＝R3＝R6＝R7＝H R2＝R4＝OH R5＝R8＝α-OG

102. R1＝R2＝R3＝R6＝OH R5＝H R7＝-Glc 103. R1＝R2＝R3＝R4＝R6＝OH R5＝Glc R7＝H

Hình 1.5 Cấu trúc các flavonoid phân lập từ chi Đại hoàng

104. R=H

105. R=OH

115. R1＝R3＝OH R2＝R4＝H R=5＝β-OH R6＝Glc

119. R1＝OH R2＝β-OH

116. R1＝R3＝R6＝H R2＝R4＝OH R5＝β-OH

120. R1＝OG R2＝β-OH

117. R1＝R3＝R6＝H R2＝R4＝OH R5＝α-OH

121. R1＝OG R2＝α-OG

122. R1＝OH R2＝α-OH

118. R1＝R3＝R6＝H R2＝R4＝OH R5＝α-OG

128. R=H

123. R1＝R2＝H R3＝β-OH

129. R=G

124. R1＝R2＝G R3＝α-OG

125. R1＝R2＝G R3＝α-OG

126. R1＝R2＝G R3＝β-OH

127. R1＝R2＝H R3＝α-OH

130. R=H

131. R=G

134 132. R=H

133. R=G

135

137

136

Bảng 1.4: Các flavonoid phân lập từ chi Đại hoàng

STT Tên hợp chất

Nguồn thực vật

93 (+)-Catechin a, b, m, r

94 (+)-catechin-5-O-β-D-glucopyranoside w

95 (+)-catechin-7-O-β-D-glucopyranosid w

96 (+)-catechin-3′-O-β-D-glucopyranoside w

97 (+)-catechin-4′-O-β-D-glucopyranoside w

98 (+)-catechin-3′,7-di-O-β-D-glucopyranoside w

99 (+)-catechin-3′,5-di-O-β-D-glucopyranoside w

100 (+)-catechin-4′,5-di-O-β-D-glucopyranoside w

101 (+)-catechin-3′,4′-di-O-β-D-glucopyranoside w

102 (+)-catechin-8-C-β-D-glucopyranoside w

103 (+)-catechin-6-C-β-D-glucopyranoside w

104 (−)epicatechin-3-O-gallate b, c, r

105 (−)epigallocatechin-3-O-gallate c

106 Procyanidin B-1-8-C-β-D-glucopyranoside w

107 Procyanidin B-1-6-C-β-D-glucopyranoside w

108 Procyanidin B-2-8-C-β-D-glucopyranoside w

109 Procyanidin B-2-6-C-β-D-glucopyranoside w

110 Procyanidin B-1 w

111 Procyanidin B-2 w

112 Procyanidin B-1-3-O-gallate w

113 Procyanidin B-2-3′-O-gallate w, r

114 Procyanidin B-2-3,3′-di-O-gallate w, r

w 115 Procyanidin B-3-7-O-β-D-glucopyranoside

w 116 Procyanidin B-3

w 117 Procyanidin B-4

w 118 Procyanidin B-4-3′-O-gallate

w 119 Procyanidin B-7

w 120 Procyanidin B-7-3-O-gallate

w 121 Procyanidin B-5-3,3′-di-O-gallate

w 122 Procyanidin B-5

w 123 Epicatechin-(4β→8)-epicatechin-(4β→8)-catechin

w 124 Procyanidin C-1-3,3′-di-O-gallate

w 125 Procyanidin C-1-3,3′,3″-tri-O-gallate

126 3-O-galloylepicatechin-(4β→8)-3-O-galloylepicatechin- w

(4β→8)-catechin

w 127 Procyanidin C-1

w 128 Epicatechin-(4β→6)-epicatechin-(4β→8)-catechin

129 3-O-galloylepicatechin-(4β→6)-3-O-galloylepicatechin- w

(4β→8)-catechin

130 Epicatechin-(4β→6)-epicatechin-(4β→6)-catechin w

131 3-O-galloylepicatechin-(4β→6)-3-O-galloylepicatechin- w

(4β→6)-catechin

132 Epicatechin-(4β→8)-epicatechin-(4β→6)-catechin w

133 3-O-galloylepicatechin-(4β→8)-3-O-galloylepicatechin- w

(4β→6)-catechin

134 3-O-galloylepicatechin-(4β→6)-3-O-galloylepicatechin- w

(4β→8)-catechin

135 Rhatannin g

136 RG-tannin g

137 Gallic acid a, j, m, r

Chú ý: a: R. palmatum; b: R. tanguticum; c: R. officinale; j: R. rhizastachyum; m R. franzenbachil; r: Shin- Shu Daio (loài chưa xác định giữa R. coreanum và R. palmatum); w: Choukichio

1.1.4.5. Acylglucoside

Các acylglucoside đã được phân lập từ chi Đại hoàng (138-172) được trình

bày trong hình 1.6.

Hình 1.6. Cấu trúc các acylglucoside phân lập được từ chi Đại hoàng

139

138

143. R1=R2=R3=R4=R5=H

140. R1= H R2= G

141. R1=G R2= H

144. R1=R4=H R2=R3=R5 =G 145. R1= G R2=R3=R4 = R5 =G

142. R1= H R2= H

Bảng 1.5: Các hợp chất acylglucoside phân lập từ chi Đại hoàng

STT Tên hợp chất

Nguồn thực vật

138 Gallic acid 3-O-β-D-glucopyranoside c

139 Gallic acid 4-O-β-D-glucopyranoside c

140 Lindleyin a, d

141 4-(4′-hydtoxyphenyl)-2-butanone-4′-O-β-D- a, d

glucopyranoside

142 6′-O-galloylsucrose b

143 6-O-galloylsucrose b

144 1′-O-galloylsucrose b

145 2-O-galloylsucrose b

Chú ý: a: R. tanguticum; b: R. coreanum; c: R. palmatum; d: commercial rhubarbs

1.1.4.6. Các hợp chất khác

Ngoài trong cây Đại hoàng còn có tinh dầu với mùi đặc trưng, một số pyrone, các loại axit hữu cơ, anthocianin và dẫn xuất của chúng một lượng lớn các hợp chất polyphenol và nhiều loại hợp chất khác [8]

1.1.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Các thử nghiệm in vitro cho thấy Đại hoàng có tác dụng nhuận tràng, phòng

chống ung thư, bảo vệ gan, chống viêm, giảm đau, kháng khuẩn, chống oxy hóa,

tác dụng chống đột biến gen, điểu trị bệnh tiểu đường [8], [9].

1.1.5.1. Tác dụng nhuận tràng

Theo đông y Đại hoàng được sử dụng để giúp nhuận tràng hoặc điều trị kiết lỵ, tiêu chảy. Những nghiên cứu gần đây cho thấy có sự liên hệ giữa tác dụng

nhuận tràng và lợi tiểu với các hợp chất anthraquinon (rhein, emodin, chrysophanol) [10].

1.1.5.2. Tác dụng kháng ung thư

Các thử nghiệm cho thấy dịch chiết metanol và nước của thân và rễ Đại hoàng có hiệu quả trong điều trị ung thư vú (MDA MB-435S) và ung thư gan (Hep3B) [11]. Nghiên cứu sâu hơn người ta đã phát hiện ra nhiều hợp chất anthraquinon như emodin, aloe- emodin, rhein, physcion và chrysophanol có độc tính đến nhiều dòng tế bào ung thư như phổi, gan, buồng trứng, bệnh bạch cầu,.. Năm 2005 Dong Ung Lee và cộng sự đã chứng minh được chrysophanol có tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư phổi ở người (A549), ung thư buồng trứng (SK-OV-3), u ác tính (SK-MEL-2), tế bào thần kinh trung ương (XF498) và tế bào ruột kết (HCT-15) với các giá trị IC50 lần lượt là 24,76; 7,28; 5,83; 30; 30 µg/ml. Năm 2007, Bingxiu Xiao phát hiện aloe- emodin có tác dụng hoạt hóa phosphatas kiềm trong tế bào KB ung thư miệng [12].

1.1.5.3. Tác dụng kháng viêm và giảm đau

Trong dịch chiết EtOH của thân rễ cây Đại hoàng có chứa nhiều hợp chất như tanin, phenolic và flavonoid. Năm 2016, Farouk K. El-Baz và cộng sự đã chỉ ra rằng hợp chất phenolic trong dịch chiết EtOH của cây Đại hoàng có tiềm năng chống viêm và chống oxi hóa tốt [13]. Nghiên cứu sâu hơn về lớp chất phenolic người ta đã chứng minh rằng các hợp chất anthraquinon có khả tác dụng kháng viêm cao với hàng loạt các thử nghiệm in vitro, in vivo. Năm 2012, Xuming Deng cùng cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính kháng viêm của hợp chất emodin trên mô hình chuột bị nhiễm bệnh hen suyễn. Kết quả cho thấy rằng, emodin ức chế đáng kể sự tăng của bạch cầu ái toan trong mô phổi và sự tăng tiết chất nhầy trong đường thở và giúp làm ngăn chặn quá trình viêm đường hô hấp một cách hiệu quả [14]. Năm 2017, bằng thử nghiệm in vitro, Kim và cộng sự đã chứng minh emodin ức chế đáng kể sự tăng các yếu tố viêm như oxit nitric, IL-1α, IL-6, GM-CSF, G- CSF, M-CSF, MCP-1, MIP-1α [15].

Ngoài ra, hợp chất stilben cũng được đánh giá là có tác dụng kháng viêm. Chẳng hạn như hợp chất rhapontigenin đã được Fan cùng cộng sự chứng minh có

tác dụng ức chế đáng kể sự tăng các yếu tố viêm (TNF-α, IL-6, MD, SOD, p38, and iNOS) [16].

1.1.5.4. Tác dụng bảo vệ gan

Dịch chiết etanol của Đại hoàng có thể ngăn chặn và điều trị tăng lipid máu và gan nhiễm mỡ ở thỏ qua giảm lipid máu [17]. Ngoài ra, dịch chiết etanol và dịch chiết nước của thân và rễ Đại hoàng giúp giảm tổn thương gan gây bởi CCl4 hoặc paracetamol ở chuột Swiss và chuột bạch tạng [18] [19] Thử nghiệm với cao nước của cây Đại hoàng ở liều cao (40 g/kg) cho thấy cao nước của cây có tác dụng phục hồi đáng kể các chỉ số sinh hóa và mô bệnh học trên gan tổn thương bởi CCl4 [20].

1.1.5.5. Tác dụng kháng vi-rut

Emodin là một hợp chất anthraquinon được nghiên cứu đánh giá nhiều về tác dụng kháng các dòng virut khác nhau như virut HSV (Herpes simplex virus) viêm gan B, Emodin có tác dụng kháng virut HSV cả trên mô hình in vitro và in vivo. Trên mô hình in vivo thử nghiêm trên chuột qua đường uống, emodin ức chế mạnh sự sao chép của HSV-1 và HSV-2 ở nồng độ 50 g/ml với chỉ số kháng virut là 2,07 và 3,53, tương ứng. Điều trị với emodin làm tăng tỷ lệ sống của chuột bị nhiễm HSV, kéo dài thời gian sống và có hiệu quả cao trong việc loại trừ virut HSV ở nhiều bộ phận của cơ thể người bị nhiễm như não, tim, gan và hạch so với đối chứng. Hơn nữa các tác giả đã chỉ ra emodin có tác dụng kháng virut HSV in vivo tương đương với acyclovir thương mại. Emodin là một tác nhân đầy hứa hẹn trong điều trị lâm sàng nhiễm virut HSV [21].

1.2. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI RHEUM OFFICINALE BAILL.

1.2.1. đặc điểm thực vật

Rheum officinale Baill (Đại hoàng dược dụng, Rhuarb): Cây thảo sống lâu năm. Thân rỗng, có rãnh mảnh, phủ lông tơ ngắn, màu trắng, đáy thân phù thành củ tròn tròn. Rễ to, ngắn, ruột màu vàng. Lá rất to, phiến dài 40-70 cm, đáy hình tim, không lông, bìa có thùy sâu 1/4 phiến, mặt dưới có lông tơ màu xám. Cuống lá dạng trục tròn, dài bằng phiến lá hoặc ngắn hơn. Bẹ chìa to, dài tới 15 cm. Cụm hoa chùy to, phân cành trải ra, mọc ở đỉnh cành hoặc các nách lá phía trên. Hoa

nhiều, 4-10 hoa mọc tụm trên cành hoa. Hoa tự lớn hình viên chùy màu xanh nhạt hoặc màu trắng, cuống dài 3-3,5mm [6].

1.2.2. Phân bố

Cây mọc tự nhiên ở vùng núi cao khoảng 1200-4000 m, dưới tán rừng. Phần lớn là cây được trồng ở Trung Quốc như Hồ Bắc, Vân Nam, Hà Nam, Phúc Kiến, Quý Châu, Tứ Xuyên. Ở việt Nam cây chủ yếu được trồng ở nơi có khí hậu vùng núi cao như Lào Cai.

1.2.3. Thành phần hóa học

Trong và ngoài nước đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của

loài Rhuem officinale Baill. trong đó có một số lớp chất tiêu biểu như:

1.2.3.1. Anthraquinone

Một số hợp chất anthraquinon được phân lập trong loài R. officinale như Chrysophanol, physcion, emodin, aloe-emodin, rhein, chrysophanol-1-O-β-D- glucopyranoside, chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside, emodin-1-O-β-D- physcion-8-O-β-D- physcion-8-O-β-D-glucopyranoside, glucopyranoside, gentiobioside (Bảng 1.1 và Hình 1.2).

1.2.3.2. Stilben

desoxyrhaponticin,

Hợp chất stilben được phân lập từ loài R. officinale như Rhapontigenin, 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D- 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-(6′′-O-galloyl)

rhaponticin, glucopyranoside, glucopyranoside (Bảng 1.3 và Hình 1.4).

1.2.3.3. Một số hợp chất khác

Ngoài trong loài rheum officinale còn có một số hợp chất flavonoid, acylglucoside như: (−)epicatechin-3-O-gallate, (−)epigallocatechin-3-O-gallate, Gallic acid 3-O-β-D-glucopyranoside, Gallic acid 4-O-β-D-glucopyranoside.

1.2.4. Hoạt tính sinh học

R. officinale là một trong những dược liệu truyền thống nhất, đã được sử dụng trong hàng nghìn năm. Hơn nữa, R. officinale đã được đưa vào dược điển Trung Quốc, dược điển Anh, dược điển Châu Âu, dược điển Hàn Quốc và dược

điển Nhật Bản do tác dụng chống kích động và kháng khuẩn rộng rãi của nó [22]. Emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone) là thành phần hoạt tính sinh học chính của R. officinale. Qua nhiều cuộc điều tra, các nhà nghiên cứu đã chứng minh tác dụng dược lý phổ rộng của emodin, bao gồm chống ung thư [23], chống di căn [24], chống oxi hóa [25], chống vi rút [26], chống vi khuẩn [27-28], v.v. Hơn nữa, các dẫn xuất thu được bằng cách thay đổi cấu trúc của emodin cũng đã được quan sát là có tác dụng hoạt tính sinh học có lợi [29-30]. Ngoài ra, các hợp chất chiết xuất từ rễ loài R. officinale như các phenolic và axit gallic có tác dụng đáng kể khả năng quét gốc tự do chống oxy hóa [31].

1.3. GIỚI THIỆU VỀ LĨNH VỰC DOCKING PHÂN TỬ

1.3.1. Docking phân tử

Trong lĩnh vực hóa sinh tính toán, docking là một phương pháp dự đoán định hướng ưu tiên gắn kết (binding site/active site) của một hay nhiều cơ chất (ligand) vào đối tượng được nghiên cứu như protein, enzyme, DNA,.. trong không gian ba chiều [32]. Protein thường có kích thước lớn và mềm dẻo nên rất khó để khảo sát hết tất cả các khả năng tương tác giữa protein và cơ chất. Phân tử protein thường được đưa vào dưới dạng cấu trúc cứng, cơ chất có thể chuyển động tương đối so với protein và dịch chuyển trong không gian bao quanh của hộp khảo sát vùng hoạt động của protein. Khi cơ chất gắn kết lên một phân tử protein mục tiêu, hai yếu tố cần chú ý là sự phù hợp về hình dạng, kích thước và năng lượng tương tác giữa cơ chất với protein. Ngoài ra còn có những tương tác khác như tương tác Van der Waals, tương tác tĩnh điện, từ đó dự đoán tâm hoạt động và vị trí, cấu hình thuận lợi của cơ chất tham gia gắn kết với protein.[33]. Docking có ý nghĩa quan trọng trong việc dự đoán ái lực gắn kết cũng như cơ chế hoạt động của các cơ chất, từ đó dự đoán khả năng hoạt hóa hoặc ức chế của cơ chất lên protein chức năng.

Những năm gần đây, việc sử dụng mô hình docking để đánh giá mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng sinh học đang ngày càng được quan tâm. Trong nước và trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng mô hình docking phân tử để thực hiện nghiên cứu dự đoán cấu trúc và dẫn xuất của có hoạt tính sinh học.

Mặc dù phương pháp sàng lọc ảo in silico vẫn cần phải được xác thực lại bằng các thử nghiệm in vitro và in vivo, tuy nhiên các phương pháp tính toán này đã ngày càng trở nên phổ biến trong lĩnh vực thiết kế thuốc thông qua những bằng chứng rất thuyết phục trong việc phù hợp giữa các tính toán in silico với thử nghiệm in vitro và in vivo. Một số loại thuốc hiện đang lưu hành trên thị trường dùng điều trị các bệnh khác nhau đã được phát triển dựa trên phương pháp in silico. Ví dụ: Zanamivir các tác dụng điều trị cúm được phát triển bằng thiết kế dưới sự trợ giúp của máy tính. Thông qua các nghiên cứu này Zanamivir được xác định là chất ức chế có tương tác thuận lợi nhất với influenza neuraminidase. Kết qả từ nghiên cứu docking của Zanamir đã đủ thuyết phục để tiến tới thử nghiệm in vivo; kết quả nghiên cứu in vivo sau đó đã khẳng định lại kết quả của các thử nghiệm in silico. Nelfinavir và Saquinavar được sử dụng trong điều trị HIV và cũng là sản phẩm phát triển bằng phương pháp tính toán. Các nghiên cứu docking cũng tiết lộ cơ chế làm thế nào để HIV protease phát triển đề kháng với Nelfinavir và Saquinavar, điều này giúp ích cho việc cải thiện hiệu lực của thuốc trong tương lai. Những ví dụ thành công này đã chứng minh tính khả dụng của các phương pháp tính toán có khả năng phát triển dược phẩm mới, với những đích hoạt tính sinh học khác như ung thư, kháng viêm, kháng oxi hóa và cung cấp bằng chứng cho các nhà nghiên cứu rằng đây là một kỹ thuật đáng tin cậy và hiệu quả trong phát hiện thuốc mới trong tương lai.

1.3.2. Các đích nghiên cứu tác dụng kháng viêm

Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể để chống lại các yếu tố gây bệnh như vi khuẩn, virus, các phân tử lạ (các chất độc vô cơ, hữu cơ) và các mô cơ quan cấy ghép. Viêm (cấp tính, mạn tính) là một quá trình bệnh lý phức tạp đặc trưng bởi các hiện tượng: sưng, nóng đỏ, đau, tế bào tăng sinh. Viêm được đánh giá qua các đích như khả năng ức chế NO, TNFα, NF-kβ, COX-2, các cytokin như interleukin-1β (IL1-β)., interleukin 2 (IL-2), interleukin 6 (IL-6), IL-8, IL-10.

Trên thế giới, cho đến nay mô hình in silico cho các đích kháng viêm đã được nghiên cứu khá nhiều. Năm 2017, Bhimapaka China Raju và cộng sự đã tiến hành docking phân tử gắn kết giữa hợp chất (1-((1-(3,4-Dimethylphenyl)-3- phenyl-1H-pyrazol-4-yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methanol với 2 đích

protein 1ALU và 2AZ5 tương ứng. Kết quả phân tích gắn kết hợp chất này có khả

năng ức chế cytokin IL-6 (PDB: 1ALU) và TNF- (PDB: 2AZ5) do hiển thị năng

lượng liên kết âm nhiều hơn so với các chất chuẩn. Đồng thời, các nhà nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm hoạt động chống viêm in vitro và in vivo trên cytokin IL-

6 và TNF- của hợp chất (1-((1-(3,4-Dimethylphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-

yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methanol cho thấy rằng hợp chất này có hiệu quả thử nghiệm chống lại IL-6 (IC50 6.23 lM). Để chứng minh hợp chất (1-((1- (3,4-Dimethylphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-4- yl)methanol có hoạt động kháng viêm, các nhà nghiên cứu đã thưc hiện thử nghiệm in vivo của hợp chất đối với mô hình chuột gây ra LPS chỉ ra rằng hợp

chất trên làm giảm đáng kể yếu tố viêm TNF-[34].

Đặc biệt trong đầu năm 2020, sự bùng phát của đại dịch mang tên COVID- 19 đã làm thiệt hại lớn về người và của. Trước tình hình đó, các nhà khoa học nhanh chóng thực hiện các phương pháp sàng lọc trên các loại thuốc kháng HIV, sốt rét, virut, một số hợp chất thiên nhiên trên các đích khác nhau với hi vọng tìm ra loại thuốc có hiệu quả trong điều trị, hạn chế bệnh nhân tử vong do SARS - CoV-2 [35]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, trên những người nhiễm virus SARS-CoV-2 có mối liên hệ giữa sự tiến triển của bệnh viêm phổi cấp tính gây tử vong với dấu hiệu cơ thể bị cơn bão viêm dẫn đến các phản ứng miễn dịch quá mẫn của cơ thể, nó thể hiện qua sự thay đổi đáng kể các chỉ số viêm/miễn dịch trong huyết tương người bệnh. Trong đó, các yếu tố TNFα và các cytokin (IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10) tăng lên. Đặc biệt, chỉ số interleukin 6 (IL-6) có sự khác biệt rõ ràng ở bệnh nhân nhiễm virus SARS-CoV-2 thể nhẹ, nặng, rất nặng, phải thở máy với nồng độ IL-6 (pg/mL) là <7, 7-30, 31-100 và > 100, tương ứng. Theo nghiên cứu của Zhou và cộng sự [36] đã chỉ ra nồng độ IL-6 trong máu ở những bệnh nhân tử vong so với bệnh nhân sống sót trong suốt quá trình điều trị lâm sàng của bệnh COVID-19. Một thí nghiệm khác tại Trung Quốc đã thử nghiêm lâm sàng dòng kháng thể nhắm mục tiêu đến thụ thể IL-6, và đã có báo cáo cải thiện chức năng hô hấp và kiểm soát sốt nhanh ở 21 bệnh nhân mắc COVID-19. Chính vì vậy, điều trước mắt là tìm những hợp chất tách được từ cây Đại hoàng có khả

năng ức chế IL-6, TNF-α bằng phương pháp in silico để đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng viêm.

1.3.3. Các tiêu chí giống thuốc của các hợp chất

Trong lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc mới, quy tắc 5 tiêu chí (Rule of Five) của Lipinski được sử dụng để đánh giá các đặc tính giống thuốc của một hợp chất hoặc xác định xem một hợp chất hóa học có thể có hoạt tính dược lý nào hay không hoặc với một hoạt tính sinh học nhất định thì hợp chất có tính chất hóa học và tính chất vật lý nào giúp cho nó trở thành một thuốc uống an toàn với con người. Quy tắc này được Christopher A. Lipinski đưa ra vào năm 1997, dựa trên quan sát rằng hầu hết các loại thuốc uống đều có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và khả năng tan trong lipid ở mức trung bình. Quy tắc này mô tả các đặc tính phân tử quan trọng đối với dược động học của thuốc trong cơ thể người, bao gồm sự hấp thụ (Absorption), phân phối (Distribution), chuyển hóa (Metabolism) và bài tiết (excretion) (ADME). Tuy nhiên, quy tắc này không dự đoán việc một hợp chất có hoạt tính dược lý hay không.

Quy tắc này đóng vai trò quan trọng và được sử dụng xuyên suốt trong quá trình phát triển thuốc khi một hợp chất có hoạt tính dược lý được tối ưu hóa theo từng bước với mục tiêu tăng hoạt tính và tính chọn lọc của hợp chất nhưng vẫn cần đảm bảo các đặc tính hóa lý của hợp chất phù hợp với tiêu chí trở thành thuốc. Các hợp chất phù hợp với quy tắc Lipinski có xu hướng ít phải thử nghiệm lâm sàng hơn và do đó cơ hội trở thành thuốc thương mại cao hơn.

Bộ quy tắc Lipinski bao gồm năm tiêu chí như sau:

- Khối lượng phân tử nhỏ hơn 500 Dalton

- Khả năng ưa chất béo cao (được biểu thị bằng chỉ số LogP nhỏ hơn 5)

- Có ít hơn 5 liên kết hydrogen cho

- Có ít hơn 10 liên kết hydrogen nhận

- Chỉ số phân cực của phân tử (Molar refractivity) nằm trong khoảng 40-130

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. NGUYÊN LIỆU

Mẫu Đại Hoàng – thân rễ (Rheum officinale Baill) (Code: MC 664) được thu mua tại phố Lãn Ông – Hà Nội. Mẫu nghiên cứu được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình – Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam và được lưu tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.

Hình 2.1: Mẫu tiêu bản của thân rễ cây Đại hoàng

2.2. PHƯƠNG PHÁP

Để thực hiện các nội dung nghiên cứu và đạt được mục tiêu nghiên cứu như

trên, các bước thực hiện đề tài như sau:

2.2.1. Thu thập mẫu thực vật

Phương pháp thu thập mẫu thực vật tuân thủ theo các phương pháp, tiêu chuẩn và yêu cầu về thực vật học để tiện cho lưu trữ, phân loại và giám định thực vật.

Mẫu thu có các thông tin về địa điểm, tên mẫu, bộ phận thu, ảnh mẫu…

Tạo tiêu bản mẫu. Các tiêu bản được lưu trữ trong kho bảo quản để đảm bảo mẫu không bị hỏng và mất tiêu bản, tiện cho việc tra cứu và tìm thông tin sau này. Xác định đặc điểm hình thái của mẫu.

Tiến hành làm vi phẫu với các bộ phận mẫu.

2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học

Phương pháp xử lý mẫu: Mẫu thực vật được làm sạch, thái nhỏ, phơi khô,

sau đó gắn ký hiệu và bảo quản trong kho có hút ẩm.

Tạo dịch chiết và phân đoạn: Mẫu thực vật được chiết với methanol (MeOH) ở nhiệt độ thích hợp, có sử dụng siêu âm. Sau khi cô quay đuổi dung môi dưới áp suất giảm, cặn chiết thu được được chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-hexane, diclomethan (CH2Cl2), ethylacetate (EtOAc) và butanol (BuOH). Các dịch chiết phân đoạn cũng được cô quay đuổi dung môi dưới áp suất giảm để thu được các cao chiết tương ứng.

Phương pháp phân lập các hợp chất: các cao chiết được phân tích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), phân lập sử dụng sắc ký cột (CC) với các chất hấp phụ khác nhau: silicagel pha thuận, pha đảo C-18, diaion HP-20, sephadex LH-20, sắc ký lỏng trung áp (MPLC), và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)…ngoài ra sử dụng kết hợp các phương pháp kỹ thuật chiết và kết tinh để tinh chế các hợp chất.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được xác định bằng việc sử dụng các phương pháp vật lý và hóa lý (IR, UV, [α]D, CD…), kết hợp sử dụng các phương pháp phổ NMR (1 chiều và 2 chiều), phổ khối lượng (MS),…

2.2.3. Nghiên cứu về khả năng kháng viêm

- Vật liệu

+ Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia- coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA). Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and

dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.

- Phương pháp nuôi cấy in vitro

+ Thử nghiệm tác dụng ức chế sản sinh NO được thực hiện theo phương pháp đã công bố [37]. Trong đó đại thực bào RAW 264.7 (do GS. TS. Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp) được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).

+ Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2 và thu hoạch ở pha tăng trưởng log và gieo trên các đĩa giếng 96-well plate (105 tế bào / giếng).

- Đánh giá độ sống sót của tế bào RAW 264.7 với các hợp chất thử nghiệm bằng phương pháp MTT [38]

+ Chất thử (20 L) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ

+ Tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% heat-inactivated FBS, 100 U/ mL penicillin và 100 mg/ mL streptomycin với mật độ 5×105 tế bào/ giếng.

tương tự nồng độ của thí nghiệm NO.

+ Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 l tế bào vào các giếng

của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để

làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%.

+ Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2, nuôi trong thời

gian 72 giờ.

+ Sau 72 giờ, 10 µL thuốc thử MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium bromid) (nồng độ cuối cùng là 5 mg/mL) được cho vào mỗi giếng.

+ Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formazan được hòa tan bằng 50 µL (DMSO)

100%.

+ Giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ.

+ Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:

% tế bào sống sót = x 100%

OD (DMSO) - OD (đối chứng trắng)

OD (chất thử) - OD (đối chứng trắng)

- Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage

RAW 264.7 [39]

+ Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h.

+ Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h.

+ Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1 μg/mL) trong 24h.

-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ + Nitrite (NO2 Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước.

+ Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG-Methyl-L- arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/mL.

+ Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng làm mẫu trắng (blank).

+ Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS). Thử nghiệm luôn được tiến hành với chứng dương là N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride (L-NMMA) với nồng độ khác nhau.

+ Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :

+ Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

% ức chế =100%- [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS]x100

2.2.4. Phương pháp docking phân tử

- Cấu hình của hệ thống máy tính được sử dụng cho mô phỏng như sau:

+ Intel®CoreTM i7-9700K CPU @ 3.60 GHz, 32 GB DDR4 RAM.

+ hệ điều hành - Ubuntu-Linux 14.04.6 LTS.

- Phần mềm:

+ Nghiên cứu thực hiện trên phần mềm AutoDock 4.2.6 (http://scripps.edu) và AutoDockTools

+ Discovery Studio Visualizer. Discovery Studio 2017 R2 Client (Dassault Systèmes BIOVIA, Discovery Studio Modeling Environment, Release 2017, San Diego: Dassault Systèmes, 2016).

+ ChemBioDraw Ultra 12.0 (HyperChem (TM) Professional 7.51, Hypercube, Inc., USA)

+ Gaussian 09 (Gaussian 09, Revision A.02, M. J. Frisch và cộng sự).

+ Pymol, LigPlus, Maestro

- Cấu trúc protein / cytokine và chất nghiên cứu:

+ Cấu trúc tinh thể của cytokin IL-6, IL1-β, TNF-α, được tải về từ cơ sở dữ liệu Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb).

+ Cấu trúc của các hợp chất thử nghiệm (ligand) được chuẩn bị bằng phần mềm ChemBioDraw Ultra 12.0 và tối ưu hóa năng lượng được thực hiện trên Gaussian 09.

+ Tệp cấu trúc cho docking phân tử được ghi lại dưới dạng *.pdbqt nhờ công cụ AutoDockTools. Đánh giá tiềm năng ức chế đích sinh học được xác định nhờ so

sánh ái lực liên kết và kiểu tương tác liên kết (binding mode of interaction). Các kết quả thu được của quá trình mô phỏng và phân tích các vị trí liên kết được thực hiện trên phần mềm Discovery Studio Visualizer.

2.2.5. Mô tả tiến trình thí nghiệm docking

2.2.5.1. Xử lý cấu trúc phối tử

Các cấu trúc hợp chất ban đầu được vẽ bằng các phần mềm hóa học như ChemBioDraw Ultra 12.0 và được lưu ở dạng 3D (mol.2). Sử dụng phần mềm GaussView để đọc file 3D và lưu dưới dạng file đuôi .gjf. Sau đó cấu trúc sẽ được tối ưu hóa từng phần và tổng thể về năng lượng. Bằng phần mềm Gauusian 09 với mục đích chọn ra một cấu trúc có mức năng lượng thấp nhất và có các đặc trưng về độ dài liên kết, góc liên kết. Chương trình tối ưu hóa năng lượng và cấu trúc sử dụng phương pháp tính toán phiếm hàm mật độ (DFT) [40] với mức lý thuyết bộ hàm cơ sở B3LYP/6-311G(d,p).

2.2.5.2. Xử lý cấu trúc protein

Cấu trúc tinh thể protease chính của IL-6, TNF-α có PDB ID lần lượt là (1ALU, 2AZ5). Các thông tin này được thu thập từ ngân hàng cơ sở dữ liệu Protein (PDB). Phần mềm AutoDock Tools (MGL Tools) được sử dụng để chuẩn bị cấu trúc protein cho mô phỏng. Để khiến protein trở thành đích tác dụng tự do, các phân tử nước đã được loại bỏ. Phân tử protein được bổ sung các nguyên tử hydro phân cực, tham số solvat hóa và tính năng lượng Kollman. Thông tin tọa độ của các nguyên tử trong protein được trích xuất dưới định dạng PDBQT và được dùng để chạy AutoGrid và AutoDock.

2.2.5.3. Xác định vùng họat động của protein

Trước khi tiến hành mô phỏng tương tác phân tử, cần xác định được vùng hoạt động của protein [34][41]. Theo đó, vùng hoạt động của các protein nghiên cứu được cấu thành bởi các amino axit như sau:

Bảng 2.1: Các amino axit trong vùng hoạt động của protein

STT Protein PDB ID Các amino axit trong vùng hoạt động

1 IL-6 1ALU

Lys66, Glu172, Lys171, Gln175, Arg179, Arg182

2 2AZ5 Lys98, Ser60, Tyr119, Gly121, Tyr151 TNF-

2.2.5.4. Mô phỏng tương tác phân tử bằng Autodock 4.2.6

Kết quả tối ưu thu được sẽ dùng để thực hiện quá trình gắn kết giữa protein (1ALU và 2AZ5) và ligand. Sử dụng phần mềm Pymol, Discovery để phân tích kết quả mô phỏng, biểu diễn độ dài liên kết hydro giữa phối tử và protei. Hộp lưới được xây dựng để bao gồm các amino axit cấu thành vùng hoạt động protease của 1ALU và 2AZ5 có kích thước (x, y, z) lần lượt là (54, 64, 50) và (60 ,60, 60) với khoảng cách điểm lưới là 0,375 Å (Phụ lục 3). AutoGrid và AutoDock được sử dụng để tính toán ái lực liên kết giữa phối tử và protein. Các tham số của thuật toán di truyền Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) [42] được thiết lập với 50 lần mô phỏng cho mỗi phối tử. Các thông số đi kèm cho chạy mô phỏng hiệu năng cao được thiết lập bao gồm: population size 300, maximum number of energy evaluations 25,000,000, maximum number of top individuals 1, mutation rate 0,02, crossover rate 0,8, root-mean-square cluster tolerance 2,0 Å. Theo ý nghĩa của thuật toán phần mềm AutDock 4.2.6 cấu hình liên kết có điểm năng lượng giá trị âm nhiều nhất được tính là cấu hình khả dĩ nhất và được lựa chọn để phân tích tiếp theo.

2.3. THỰC NGHIỆM

2.3.1. Hóa chất và dụng cụ

Hóa chất: Methanol, hexan, diclomethan, ethyl acetate, nước cất, hạt silica gel

Dụng cụ: Máy cô quay chân không, máy hứng phân đoạn, cột sắc ký, bản mỏng silica gel, phễu chiết, cốc thủy tinh, bình thủy tinh, ống nghiệm.

2.3.2. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách

Mẫu Đại hoàng thu mua ở dạng khô và được nghiền nhỏ. Sau đó, mẫu được ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (2 lít x 3 lần), mỗi lần 2 ngày. Lọc lấy dịch chiết và loại bỏ dung môi bằng cách cô quay với thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết tổng. Cao chiết methanol tổng thu được thêm nước cất và chiết phân bố bằng các dung môi hữu cơ có tính phân cực tăng dần lần lượt: n_hexan 4,6 g), diclomethan (6,9 g), ethyl acetate (50 g), và nước (70 gam).

Từ 6.9 gam cao chiết diclometan sử dụng sắc ký cột pha thường với silica gel (40-63 µm) và hệ dung môi hexan: ethyl acetat (6:1, 4:1, 2:1, 1:1) thu được 3 phân đoạn C1, C2, C3. Tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với phân đoạn C1 (400 mg) trong hệ dung môi hexan: ethyl acetat (50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 1:1) thu được hợp chất MC565 (13mg). Tiến hành chạy sắc ký cột pha thường với silica gel với phân đoạn C2 (700 mg) trong hệ dung môi hexan: ethyl acetate (8:1, 6:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1) thu được hợp chất MC567 (10 mg).

Từ 50 gam cao chiết etyl acetat lấy ra 35 gam chạy sắc ký thường với silica gel (40-63 µm) và hệ dung môi hexan: ethyl acetate (3:1, 2:1, 1:1) thu được 5 phân đoạn E1 –E5. Tiếp tục chạy sắc ký cột pha thường silica gel với phân đoạn E3 (900mg) trong hệ dung môi hexan: ethyl acetate (3:1, 2:1, 1:1) thu được hai phân doạn E3.1 và E3.2. Kết tinh lại E3.1 thu được MC566 (12mg)

Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách mẫu Đại hoàng

2.3.3. Tính chất vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được

2.3.3.1. Hợp chất MC565

Tính chất vật lý: Chất rắn màu vàng nhạt, tan trong dung môi hữu cơ (MeOH, CH2Cl2, …)

Dữ liệu phổ:

13C-NMR (CDCl3,125 MHz, δ ppm): 192,58 (s, C-9); 182,01 (s, C-9); 162,76 (s, C-1); 162,46 (C-8); 149,36 (d, C-3); 136,96 (s, C-6); 133,33 (s, C-4a);

C15H10O4(M = 254.24); 1H-NMR (CDCl3,500 MHz, δ ppm): 12,10 (1H, s, 1-OH); 1,99 (1H, s, 8-OH); 7,81 (1H, dd, J=1,0 &7,5 Hz, H-5); 7,64 -7,66 (2H, m, H-6 & H-4);7,28 (1H, dd, J=1,0 & 8,5 Hz, H-7); 7,09 (1H, dd, J=1,0 & 1,5 Hz, H-2); 2,46 (3H, s, 3-CH3).

124,57 (d, C-7); 124,38 (s, C-2); 121,37 (d, C-4); 115,91 (s, C-8a); 121,37 (d, C- 4); 133,96 (s, C-10a); 113,78 (s, C-9a); 22,27 (q, 3-CH3).

2.3.3.2. Hợp chất MC566

Tính chất vật lý: Chất rắn, kết tinh màu trắng ngà, tan trong các dung môi hữu cơ

Dữ liệu phổ:

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz ,δ ppm): 159,66 (s, C-5 & C-3); 147,72 (s, C-4´); 148,99 (s, C-3´); 141,12 (s, C-1); 132,25 (s, C-1´); 129,37 (d, C-7); 127,88 (s, C- 8); 120,02 (s, C-2´); 113,62 (s, C-6´); 112,78 (d, C-5´); 105,88 (d, C-2 & C-6); 102,83 (d, C-4); 56,44 ( 4´-OCH3).

C15H14O4(M = 258.27): 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz ,δ ppm): 7,02 (1H, d, J=2,0Hz, H-2´); 6,94 (3H, m, H-8, H-5´ và H-6´);6,81 (1H, d, J=2,0, H-7); 6,47 (2H, d, J=2Hz, H-2 & H-6); 6,19 (1H, t, J=2,5Hz, H-4 ); 3,87 (3H, s, 4´- OCH3);

2.3.3.3. Hợp chất MC567

Tính chất vật lý: tinh thể rắn màu cam, tan trong dung môi hữu cơ (MeOH, CH2Cl2)

Tính chất hóa học

13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ,δ ppm): 189,56 (s, C-9); 181,22 (s, C-10); 165,55 (s, C-3); 164,38 (s, C-1); 161.34 (s, C-8); 148,12 (s, C-6); 134,6 (s, C-4a); 132,7 (s, C-10a); 124,0 (d, C-7); 120.35 ( d, C-5); 113,25 (s, C-8a); 108,82 (s, C-9a); 108.73 (d, C-2); 107,83 (d, C-4); 21,42 (q, 6-CH3).

C15H10O5(M = 254.24); 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz ,δ ppm): 12,04 (1H, s, 1-OH); 11,96 (1H, s, 8-OH); 7,43( t, 1H, H-5); 7,11 (1H, dd,J=1.0 & 1.5 Hz, H-7); 7,07 (d, 1H, J=2Hz, H-4); 6,55 (d, J = 2,5Hz); 2,38 (s, 3H, 6-CH3).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT SẠCH TỪ CÂY ĐẠI HOÀNG

3.1.1. Cấu trúc hợp chất MC565

Cấu trúc của hợp chất MC565

Phổ 13C-NMR của MC565 cho tín hiệu của 15 carbon, kết hợp với phổ DEPT cho thấy hợp chất có 5 nhóm –CH thơm, 1 nhóm -CH3 và có 9 carbon không có liên kết hidro. Tín hiệu ở δC 192,58 (C-9, s) và 182,01 (C-10, s) đặc trưng cho 2 carbon carbonyl (quinon) và hai tín hiệu ở δC 162,46 (C-8) và 162,76 (C-1) đặc trưng cho carbon thơm có liên kết với oxy. Và một tín hiệu ở δC 22,27 đặc trưng của nhóm CH3

Phổ 1H-NMR của hợp chất MC565 cho thấy có 5 tín hiệu proton thơm δH (7,09 – 7,81 ppm) và một nhóm CH3 singlet, tương đồng với dữ kiện phổ DEPT ở trên. Hai proton ở δ 7,09 (dd, J=1 Hz & J=1,5 Hz, H-2) và δH 7,64 (d, J=1,5 Hz, H-4) có tương tác meta với nhau. Các tín hiệu ở δH 7,81 (dd; J=1,5 &7,5 Hz H-5), δH 7,64 (t, J=8 Hz, H-6), δ 7,28 (dd; J=1,0 & 8,5 Hz, H-7) cho thấy phân tử có nhóm vòng phenyl thế 1,2,3-. Ngoài ra MC565 có 1 nhóm CH3 singlet ở δH 2,46.

So sánh với tư liệu [43] hợp chất MC565 được xác định là Chrysophanol. Hợp chất này đã được phân lập từ nhiều loài từ chi Đại hoàng như R. palmatum; R. tanguticum; R. officinale và có tác dụng kháng ung thư.

Bảng 3.1: Dữ kiện phổ của hợp chất MC565 so sánh với tài liệu tham khảo

Position δH, ppm δH, ppm δC, ppm δC, ppm

CDCl3, 500 MHz CDCl3, 500 MHz CDCl3, 125 MHz CDCl3, 125 MHz

[43] [43]

162,76 - 1 -

1-OH 12,10; s - -

7,09; s 124,38 124,4 2 7,09; dd; J=1 Hz & 1,5Hz

2,46; s 2,46; s 22,27 22,3 3-CH3

149,36 149,3 3 -

7,68; m 121,37 121,4 4 7,64; d; J=1,5 Hz

133,33 133,7 4a -

7,82; d; J=9 Hz 119,94 119,9 5 7,81; dd; J=1,5 &7,5 Hz

7,66; t; J=8 Hz 7,68; m 136,96 136,9 6

124,57 124,6 7 7,28; dd; J=1,0 &8,5 Hz 7,29; d; J=8,5Hz

162,46 162,4 8 -

8-OH 11,99; s - - -

8a - 115,91 115,9

9 - 192,58 192,6

9a - 113,78 113,8

10 - 182,01 182,0

10a - - 133,69 133,3

3.1.2. Cấu trúc của hợp chất MC566

Cấu trúc của hợp chất MC566

Phổ 1H-NMR của MC566 cho biết có 14 tín hiệu proton cho thấy có 14 loại nguyên tử hydro trong cấu trúc của chất cần xác định. Các tín hiệu cho biết có thể cấu trúc của hoạt chất có 2 vòng thơm độc lập và có mặt của 1 nhóm methoxy – OCH3, ở vị trí δ = 3,83 ppm có đường cong tích phân là 3, singlet là tín hiệu của nhóm - CH3 có gắn với nguyên tử có độ âm điện lớn và đây chính là nhóm methoxy. Tín hiệu ở vị trí có δ = 6,93ppm (1H; d; J =16,5 Hz, H-7) và 6,81 ppm (1H; d; J = 16,5 Hz; H-8) cho biết trong cấu trúc có nhóm proton nối đôi và có cấu hình trans. Các tín hiệu còn lại thuộc về proton của hai vòng thơm, hằng số tương tác J= 2 & 2,5 Hz cho biết tín hiệu bị thế ở vị trí meta.

Phổ 13C-NMR có 13 tín hiệu cho thấy 13 loại Carbon trong cấu trúc, và trong đó có 2 tín hiệu có dấu hiệu cộng hưởng ở vị trí δC 159,66 ppm và 105,83 ppm. . Trên phổ DEPT cho thấy 7 tín hiệu của nhóm –CH và 1 nhóm CH3 còn lại là tín hiệu của cacbon bậc 4. Tại vị trí δC 56,44 ppm là tín hiệu của nhóm –OCH3.

Hai tín hiệu cacbon ở δC 129,37 ppm và 127,88 ppm thuộc về C của nhóm olefin (tran-olefin). Các tín hiệu còn lại là C của hai vòng thơm.

Các dự kiện phổ thu được cho thấy đây là chất có khung stilben và so sánh

với tài liệu tham khảo [44] kết luận đây là hợp chất Rhapontigenin.

Bảng 3.2: Dữ kiện phổ của hợp chất MC566 so sánh với tài liệu tham khảo

Position δH, ppm δH, ppm δC, ppm δC, ppm

CD3OD, 500 CD3OD, 500 CD3OD, 125 CD3OD, 125

MHz MHz MHz MHz

[44] [44]

- - 1 141,12 139,7

6,44; d; J=2,0 6,47; d; J=2Hz 2 105,88 104,5 Hz

- - 3 159,66 158,3

6,19; t; J=2,5 6,16; d; J=2,0 4 102,83 101,4 Hz Hz

- - 5 159,66 158,3

6,44; d; 6,47; d; J=2Hz 6 105,88 104,5 J=2,0Hz

6,81; d; J=16,5 6,79; d; J=16,0 7 129,37 129,7 Hz Hz

6,94; d; J=16,5 6;91; d; J=19,0 8 127,88 126,5 Hz Hz

- - 1´ 132,25 130,8

6,99; d; J=1,5 7,02; d; J=2Hz 2´ 120,02 118,7 Hz

- - 3´ 147,72 146,3

- - 4´ 148,99 147,6

4´- 3,87; s 3,83; s 56,44 55,02 OCH3

5´ 6,94; m 6,93; m 112,78 112,2

6´ 6,94; m 6,93; m 113,62 111,3

3.1.3. Cấu trúc của hợp chất MC567

Hình 3: Cấu trúc của hợp chất MC 567

Phổ 13C-NMR của MC 567 cho tín hiệu của 15 carbon, kết hợp với phổ DEPT cho thấy có 4 tín hiệu của nhóm –CH và 1 tín hiệu của nhóm –CH3, các tín hiệu còn lại là của carbon không liên kết với hidro. Tín hiệu ở δC 189,56 (C-9) và 181,22 (C-10) đặc trưng cho 2 carbon carbonyl (quinon) và ba tín hiệu ở δC 165,55 (C-3); δC 161,34 (C-8) và 164,38 (C-1) đặc trưng của carbon trên nhân thơm mang nhóm thế có oxy. Độ chuyển dịch hóa học ở vùng trường cao δC 21,42 là đặc trưng của nhóm methyl bị thế vào vòng thơm, ở cấu trúc này bị gắn vào cacbon số 6.

Phổ 1H-NMR của hợp chất MC 567 cho thấy có 5 tín hiệu proton trong đó có 4 proton thơm trong vùng chuyển dịch δH (6,55 – 7,43) và một nhóm CH3 singlet, tương đồng với dữ kiện phổ DEPT ở trên. Hai proton ở δH 6,55 (d, J=2,5 Hz, H-2) và δH 7,07 (d, J=2 Hz, H-4) có tương tác meta với nhau. Hai protton ở δH 7,43 (t; J=1 Hz) và δH 7,11 (d; J=1 Hz) có tương tác meta với nhau. Và có 1 nhóm CH3 singlet δH 2,46.

Từ các số liệu phổ trên và tài liệu tham khảo [45,46,47] khẳng định đây là hợp chất có tên là Emodin. Được phân lập nhiều từ các loài R. palmatum; R. tanguticum; R. officinale và có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng viêm, chống ưng thư.

Bảng 3.3: Dữ kiện phổ của hợp chất MC567 so sánh với tài liệu tham khảo

δH; ppm δH; ppm δC; ppm δC; ppm

Positio n

DMSO-d6, 500 MHz DMSO-d6, 500 MHz DMSO-d6, 125 MHz DMSO-d6, 125 MHz

[45] [45]

- 1 - 164,38 164,54

1-OH 12,04; s 12,08

2 6,59 108,73 108,02

6,55; d; J= 2,5 Hz

- 11,37 - 3- OH

- 3 - 165,55 165,64

4 7,07; d; J=2Hz 7,12 107,83 108,84

- 4a - 134,6 135,21

5 7,43; t; J=1 Hz 7,49 120,35 120,58

- 6 - 148,12 148,35

2,38; s 2,41 21,42 21,60 6- CH3

7 7,11; d; J=1 Hz 7,16 124,0 124,23

- 8 - 161,34 161,51

8-OH 12;01 - -

11,96; 1H; s; 1H

- 8a - 113,25 113,46

9 - - 189,56 189,83

9a - - 108,82 109,06

10 - - 181,22 181,48

10a - - 132,7 132,91

Trong nội dung nghiên cứu về thành phần hóa học của thân rễ cây Đại hoàng đã tách được hợp chất thuộc lớp chất anthraquinon và sillben. Hợp chất anthraquinon là lớp chất có nhiều hoạt tính thú vị như: hoạt tính kháng nấm; hoạt tính kháng ung thư và hoạt tính kháng viêm.

3.2. ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HỢP CHẤT SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING PHÂN TỬ

3.2.1. Tối ưu hóa cấu trúc hợp chất nghiên cứu

Sử dụng các phần mềm ChemDraw; Gaussview; Gaussian 09 cấu trúc của ba hợp chất chrysophanol; emodin; rhapontigenin đã được tối ưu và được mô tả ở hình 3.2. Các cấu trúc tối ưu này sẽ được sử dụng để docking đánh giá tác dụng kháng viêm với các đích protein khác nhau. Kết quả tối ưu cấu trúc được biểu thị trong hình 3.1

Hình 3.1: Cấu trúc các phối tử đã được tối ưu của các chất nghiên cứu

Cấu trúc 3D tối ưu Cấu trúc 2D Tên chất

Chrysophanol

Rhapontigenin

Emodin

Rolipram

Indomethacin

Celecoxib

3.2.2. Đánh giá các tiêu chí giống thuốc của các hợp chất nghiên cứu

Sử dụng phần mềm free Lipinski, đặc tính theo 5 tiêu chí Lipinski của ba

hợp chất chrysophanol, emodin, rhapontigenin, đã được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4: Đánh giá tiêu chí giống thuốc của các hợp chất nghiên cứu

STT Tên chất Thống số theo tiêu chí Lipinski

1 Chrysophanol

Mass: 250 Hydrogen bond donor: 2 Hydrogen bond acceptors: 4 LOGP: 2,18162 Molar Refractivity: 67,815582

2 Emodin

Mass: 270 Hydrogen bond donor: 3 Hydrogen bond acceptors: 5 LOGP: 1,88722 Molar Refractivity: 69,480385

3 Rhapontigenin

Mass: 258 Hydrogen bond donor: 3 Hydrogen bond acceptors: 4

LOGP: 2,982399 Molar Refractivity: 73,358376

4 Rolipram

Mass: 275 Hydrogen bond donor: 1 Hydrogen bond acceptors: 4 LOGP: 2,620100 Molar Refractivity: 76,245682

5 Celecoxib

Mass: 381 Hydrogen bond donor: 2 Hydrogen bond acceptors: 4 LOGP: 4,785320 Molar Refractivity: 90,319389

Kết quả đánh giá các tiêu chí giống thuốc theo quy tắc Lipinski cho thấy ba chất chrysophanol, emodin và rhapontigenin đều có khả năng phát triển thành thuốc biệt dược.

3.2.3. Xử lý tối ưu hóa cấu trúc protein nghiên cứu

Sử dụng phần mềm Disscovery để chuẩn bị các phân tử tinh thể protease chính của IL-6 và TNF-α có PDB ID tương ứng là (1ALU và 2AZ5). Các bước chuẩn bị bao gồm: loại bỏ phân tử nước liên kết với protein, bổ sung các nguyên tử hydro phân cực, thiết lập tọa độ (3 chiều) vùng đánh giá tương tác giữa protein và hoạt chất (Phụ lục 3). Hình 3.3 mô tả cấu trúc của hai protein 1ALU và 2AZ5 đã được tối ưu hóa.

Hình 3.2: Cấu trúc hai protein đã được tối ưu hóa

TNF- (2AZ5) IL-6 (1ALU)

3.3.4. Kết quả mô phỏng tương tác

Tiến hành mô phỏng tương tác giữa 3 hợp chất sạch tinh chế được của cây Đại Hoàng với protein 1ALU và 2AZ5 bằng phần mềm Autodock4.2.6 sử dụng thuật toán Lamarckian Genetic Algorithm [48]. Vị trí của vùng mô phỏng được định vị là vùng không gian xung quanh tâm hoạt động của protein 1ALU và 2AZ5. Trong quá trình docking phân tử, thuật toán tạo ra 50 mô phỏng tương tác khác nhau với protein cho mỗi hợp chất.

Qua nghiên cứu các tài liệu, hợp chất rolipram và celecoxib đã được chứng minh qua thực nghiệm là có tác dụng kháng viêm[49][50]. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng rolipram và celecoxib làm chất đối chứng.

Bảng 3.6 cho thấy năng lượng liên kết của chất đối chứng rolipram và celecoxib với hai protein 1ALU và 2AZ5 lần lượt là (– 6,77; -5,56 kcal/mol) và (-5,76; -6,04 kcal/mol), tương ứng. Hợp chất nào có năng lượng liên kết gần hoặc âm nhiều hơn được coi là tiềm năng tương tác tốt với đích thụ thể.

Bảng 3.5: Tính toán năng lượng liên kết tự do của 3 hợp chất với hai protein 1ALU và 2AZ5

1ALU 2AZ5

Tên chất

Ái lực liên kết Hệ số linh động Ái lực liên kết Hệ số linh động

-4,87 0,26 Chrysophanol -6,24 0,33

-6,58 0,35 Rhapontigenin -7,26 0,38

Emodin -6,36 0,32 -5,79 0,29

-5,76 0,29 Rolipram -6,77 0,34

-6,04 0,23 Celecoxib -5,56 0,21

Bảng 3.6: Các amino axit tham gia tương tác của 3 hợp chất phân lập được với hai protein 1ALU và 2AZ5

Amino axit tham gia tương tác Tên chất 1ALU 2AZ5

Chrysophanol Lys66, Glu172, Ser176 Gly121

Rhapontigenin Met67, Lys66, Arg179 Ser95, Lys98, Pro117, Gly121

Emodin Ser95, Gly121 Pro65, Lys66, Ser169, Glu172, Ser176

Rolipram Arg179, Arg182 Lys98, Gly121

Celecoxib Lys 171, Gln175 Ser60, Tyr151

Docking với protein 1ALU cho thấy rhapontigenin có năng lượng liên kết tự do (ái lực liên kết) với giá trị âm nhiều nhất -7,26 kcal/mol so với hai chất chuẩn là rolipram và celecoxib. Đồng thời rhapontigenin hình thành liên kết hydrogen với 1ALU thông qua các amino axit là Met67, Lys66, Arg179 trong đó có 2 amino axit quan trọng tại tâm hoạt động như Lys66, Arg179 (Bảng 3.7). Hợp chất chrysolphanol hình thành 3 liên kết hydro với các amino axit là Lys66, Glu172, Ser176, trong đó có 2 amino axit thiết yếu trong vị trí hoạt động. Emodin hình thành 5 liên kết hidro với các amino axit là Pro65, Lys66, Ser169, Glu172, Ser176 trong đó có 2 amino axit thiết yếu trong vị trí hoạt động. Chrysophanol và emodin có năng lượng liên kết lần lượt là (-6,24; -6,36 kcal/mol) âm nhiều hơn celecoxib nhưng lớn hơn rolipram. Ngoài ra, hệ số linh động của rhapontigenin, chrysophanol, emodin có giá trị lần lượt là 0,38; 0,33; 0,32, tương ứng. Các hệ số linh động này nằm trong biên độ chấp nhận được cho phép lựa chọn tiềm năng

cho phát triển thuốc. Những thông số trên cho thấy rhapontigenin, chysophanol và emodin đều có tiềm năng tương tác tốt với protein 1ALU.

Docking với protein 2AZ5 cho thấy rhapontigenin có năng lượng liên kết tự do là -6,58 kcal/mol âm nhiều hơn hai chất chuẩn và có 2 amino axit trong vùng hoạt động của protein 2AZ5 đó là Lys98 và Gly121. Emodin có năng lượng tự do là -5,79 âm nhiều hơn rolipram và hình thành 2 amino axit Ser95, Gly121 trong đó có một amino axit thiết yếu trong vùng hoạt động. Đồng thời hệ số linh động của rhapontigenin và emodin lần lượt bằng 0,35 và 0,29, tương ứng. Nằm trong khoảng chấp nhận cho phép tiềm năng phát triển làm thuốc. Chrysophanol có năng lượng liện kết tự do là -4,87 kcal/mol cao hơn so với cả hai chất chuẩn. Điều này chứng tỏ rằng hợp chất rhapontigenin và emodin có tiềm năng tương tác với protein 2AZ5 còn chrysophanol thì không có tiềm năng ức tương tác với protein 2AZ5.

Như vậy, ba hợp chất chrysophanol, emodin, rhapontigenein phân lập từ cây Đại hoàng đã được đánh giá in silico tác dụng kháng viêm trên hai đích 1ALU

(IL-6) và 2AZ5 (TNF-). Kết quả tính toán cho thấy hợp chất emodin và

rhapontigenin có khả năng tương tác tốt với 2 protein 1ALU (IL-6) và 2AZ5

(TNF-) tương ứng với khả năng ức chế sản sinh cytokin IL-6 và TNF-. Hợp

chrysophanol có có khả năng ức chế cytokin IL-6.

Qua tìm hiểu các thử nghiệm in vitro, in vivo các nhà nghiên cứu đã chứng minh emodin ức chế đáng kể sự tăng các yếu tố viêm trong tế bào RAW 246.7 [15] và đóng vai trò như một chất giảm đau mạnh để điều trị và ngăn ngừa bệnh

tiểu đường (DNP) thông qua việc làm giảm các yếu viêm như IL-6, TNF- IL-

1β [51]. Hợp chất rhapontigenin đã được Fan cùng cộng sự chứng minh có tác dụng bảo vệ tim mạch ức chế thông qua ức chế đáng kể sự tăng các yếu tố viêm (TNF-α, IL-6, MD, SOD, p38, and iNOs) [16]. Như vậy, việc đánh giá khả năng kháng viêm của hợp chất emodin và rhapontigenin bằng in silico là có phù hợp với các nghiên cứu trước đây.

3.3. HOẠT TÍNH ỨC CHẾ SỰ SẢN SINH NO CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP

1.5

Ba hợp chất chrysophanol, emodin và rhapontigenin đem đánh giá tác dụng kháng viêm qua phép thử ức chế sản sinh NO in vitro. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 3.3 và bảng 3.7. Ở nồng độ thử nghiệm của ba hợp chất này số lượng tế bào còn sống trên 80%.

Đường chuẩn NO

y = 0.0091x + 0.046 R² = 0.9998

0.5

100

120

Hình 3.3: Đường chuẩn NaNO2

Bảng 3.7: Khả năng ức chế sản sinh NO của các chất phân lập được

MC565 MC566 MC567 Chất đối chứng

Chrysophanol Emodin Rhapontigenin L-NMMA Nồng độ (µg/mL)

% ức chế NO % ức chế NO % ức chế NO % ức chế NO

100 32,06 97,98 91,26 96,83

20 27,35 34,75 87,22 70,76

4 13,90 28,03 50,26 34,64

0.8 -2,24 7,85 6,16 12,03

IC50 >100 32,26±1,05 5,65±0,43 7,78±0,33

Ở nồng độ 4 µg/mL các hợp chất MC565; MC566; MC567 thể hiện hoạt tính ức chế NO với giá trị lần lượt là 13;90; 28;03; 50;26% (Bảng 3.8). Với giá trị lớn hơn 50% là hợp chất đó có khả năng ức chế sản sinh NO. Điều này cho thấy; hợp chất MC567 có khả năng kháng viêm ngay ở nồng độ 4 µg/mL. Chứng tỏ; emodin có hoạt tính kháng viêm mạnh.

Ở nồng độ 20 µg/mL các hợp chất MC565; MC566; MC567 thể hiện hoạt tính ức chế NO với giá trị lần lượt là 27;35; 34;75; 87;22%. Thấy rằng MC567 ức chế tốt sự sản sinh NO với giá trị 87;22%.

Ở nồng độ 100 µg/mL hợp chất MC565; MC566; MC567 thể hiện hoạt tính ức chế NO với giá trị lần lượt là 32;06; 97;98; 91;26%. Hợp chất MC567 thể hiện hoạt tính kháng viêm tốt khi tăng nồng độ. Hợp chất MC566 có khả năng ức chế sản sinh NO khi được thử nghiệm với nồng độ cao.

Từ kết quả trên; cho thấy emodin (MC567) có khả năng ức chế sản sinh NO tốt nhất trên cả 3 nồng độ thử nghiệm với giá trị IC50 = 5.65±0.43 µg/mL. Rhapontigenin (MC566) có khả năng ức chế sản sinh NO ở nồng độ (100 µg/mL) với giá trị IC50 = 32;26±1;05 µg/mL.

Kết hợp giữa in silico và in vitro cho thấy hai hợp chất emodin và rhapontigenin đều có khả năng kháng viêm. Hai hợp chất emodin và chrysophanol đều cùng một khung anthraquinon nhưng hợp chất emodin lại có hoạt tính sinh học khác so với chrysophanol. Chứng tỏ rằng việc có thêm một nhóm OH ở vị trí C-3 của emodin chính là tác nhân gây ra sự khác biệt về hoạt tính sinh học của hai hợp chất.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Đề tài đã đạt được mục tiêu là phân lập một số hợp chất từ cây Đại hoàng (Rheum officinale Baill.) và xác định hoạt tính kháng viêm in silico và in vitro của các hợp chất. Cụ thể như sau:

Về thành phần hóa học:

Từ thân cây Đại hoàng đã phân lập được 3 chất sạch. Trong đó có 2 chất thuộc lớp anthraqunon là chrysophanol (MC565); emodin (MC567). Và 1 hợp chất stilben là rhapontigenin (MC566).

Vê docking phân tử (in silico):

Ba hợp chất thu được đã sử dụng mô hình docking phân tử để nghiên cứu về khả năng kháng viêm từ đó bước đầu đưa ra một số nhận xét lý thú về hoạt tính sinh học của hợp chất. Các thông số trong mô hình này có thể được tiếp tục tinh chỉnh để có thể có ứng dụng tốt hơn trong nghiên cứu phát triển các hoạt chất sinh học từ thiên nhiên.

Với đích cytokin IL-6 cả ba hợp chất chrysophanol; rhapontigenin và

emodin đều có ái lực liên kết cao và thể hiện khả năng kháng viêm.

Với đích cytokin TNF- hai hợp chất rhapontigenin và emodin đều thể hiện

khả năng tương tác tốt với protein 2AZ5 và thể hiện hoạt tính kháng viêm.

Về hoạt tính ức chế sản sinh NO:

Trong 3 hợp chất sạch phân lập được có: Hợp chất chrysophanol chưa thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu. Hai hợp chất còn lại là emodin và rhapontigenin đã thể hiện hoạt tính ức chế sinh NO với giá trị IC50 từ 5.65 – 32.26 µg/mL.

KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục phân lập và đánh giá tác dụng kháng viêm in vitro của các hợp chất từ

cây Đại hoàng trên với các yếu tố tiền viêm khác như IL-6; TNF-; COX-2.

- Tiếp tục tìm hiểu về vùng tương tác và các aminoaxit liên quan đến enzyme COX-2 trong docking phân tử.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang Jun-shan, Xu Xu-dong (2013), “Review of Rhubarbs: Chemistry and Pharmacology”, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.

2. Misra, D. P., Agarwal, V., & Negi, V. S. 2016. Rheumatology in India: A Bird’s Eye View on Organization, Epidemiology, Training Programs and Publications. Journal of Korean Medical Science, 31(7), 1013–1019. https://doi.org/10.3346/jkms.2016.31.7.1013

3. Takitani, Shoji, et al, 1992, The pharmacopoeia of Japan XII, The Society of

Japanese Pharmacopoeia, Tokyo.

4. Phạm Hoàng Hộ, 2000, Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ,

tập I, 743.

5. Võ Văn Chi, 2012, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Tập I,

865- 866

6. Li Anjen, Bao Bojian, Alisa E. Grabovskaya-Borodina, Suk-pyo Hong, John McNeill, Sergei L. Mosyakin, Hideaki Ohba, Chong-wook Park, 2003, Polygonaceae, Flora of China 5, 277-350.

7. Bộ môn dược liệu 2004, Bài giảng dược liệu tập I, Nhà xuất bản Đại học

dược Hà Nội.

8. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang Jun-shan, Xu Xu-dong, 2013, Review of Rhubarbs: Chemistry and Pharmacology, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.

9. Agarwal, Santosh K Singh, Sudhir S Lakshmi, Vijai Verma, Sushma Kumar, Sushil (2001 Jan), “Chemistry and Pharmacology of Rhubarb (Rheum species), Journal of Scientific & Industrial Research, 60 (1), 1-9.

10. Li F, Wang SC, Wang X, Ren QY, Wang W, Shang GW, Zhang L, Zhang SH, 2008, Novel exploration of cathartic pharmacology induced by rhubarb, China J Chin Mater Med, 33(4): 481-484.

11. Rokaya, M.B., Münzbergová, Z., Timsina, B. & Bhattarai, K.R., 2012, Rheum australe D. Don: A review of its botany, ethnobotany, phytochemistry and pharmacology, Journal of Ethnopharmacology, 141(3), 761–774.

12. Xiao. B., Guo. J., Liu. D., Zhang. S., 2007, Aloe-emodin induces in vitro G2/M arrest and alkaline phosphatase activation in human oral cancer KB cells, Oral Oncology, 43(9), 905–910.

13. Eman A. Ibrahim, Doha H. Abou Baker, Farouk K. El-Baz1, 2016, Anti- Inflammatory and Antioxidant Activities of Rhubarb Roots Extract, Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 39(2), 93-99.

14. Chu. X., Wei. M., Yang. X., Cao. Q., Xie. X., Guan. M., Wang. D. &., Deng. X., 2012, Effects of an anthraquinone derivative from Rheum officinale Baill, emodin, on airway responses in a murine model of asthma, Food and Chemical Toxicology, 50(7), 2368–2375.

15. Young-Jin Kim, Ji Young Lee, Hyun-Ju Kim, Do-Hoon Kim, Tae Hee Lee, Mi Suk Kang, You-Kyung Choi, Hye Lim Lee, Jaieun Kim, Hyo-Jin An, and Wansu Park, 2017, inhibitory effect of emodin on raw 264.7 activated with double stranded rna analogue poly i:c, Afr J Tradit Complement Altern Med., 14 (3), 157-166.

16. Fan, 2019, Cardioprotective Effect of Rhapontigenin in Isoproterenol- Induced Myocardial Infarction in a Rat Mode, Pharmacology, 103,291–302, DOI: 10.1159/000496800.

17. Akhtar MS, Amin M, Ahmad M, Alamgeer, 2009, Hepatoprotective Effect of Rheum emodi Roots Revandchini and Akseer-e-Jigar Against Par acetamol-induced Hepatotoxicity in Rats, Ethnobotanical Leaflets, 13, 310- 315.

18. Xing XY, Zhao YL, Kong WJ, Wang JB, Jia L, Zhang P, Yan D, Zhong YW, Li RS, Xiao XH, 2011, Investigation of the “dose-time- response” relationships of rhubarb on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats, J Ethnopharmacol, 135(2), 575-581.

19. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang Jun-shan, Xu Xu-dong, 2013, Review of Rhubarbs: Chemistry and Pharmacology, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.

20. Xing XY, Zhao YL, Kong WJ, Wang JB, Jia L, Zhang P, Yan D, Zhong YW, Li RS, Xiao XH, 2011, Investigation of the “dose-time- response”

relationships of rhubarb on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats, J Ethnopharmacol, 135(2), 575-581.

21. Hai-Rong Xiong, Jun Luo, Wei Hou, Hong Xiao, Zhan-Qiu Yang, 2011, The effect of emodin, an anthraquinone derivative extracted from the roots of Rheum tanguticum, against herpes simplex virus in vitro and in vivo, Journal of Ethnopharmacology, 133,718–723.

22. Min Chen, Tie-Gui Nan, Jie Xin, Li Cui, Bo Zhang, Xiao Wang, Bao-Min Wang, 2020, Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method for the Detection of Rhein in Rheum officinale, International Journal of Analytical Chemistry, DOI:10.1155/2020/4294826.

23. Huang Q., Lu G., Shen H.M., Chung M.C.M., Ong C.N., 2007, Anti-cancer properties of anthraquinones from rhubarb, Medicinal Research Reviews, 27(5), 609–630.

hyperlipidemic administrated mice in

24. Jia X., Iwanowycz S., Wang J., Saaoud F., Yu F., Wang Y., Hu J., Chatterjee S., Wang Q., Fan D., 2014, Emodin attenuates systemic and liver inflammation with lipopolysaccharides, Experimental Biology and Medicine, 239(8), 1025– 1035.

25. Yao W.Y., Zhou Y.F., Qian A.H., Zhang Y.P., Qiao M.M., Zhai Z.K., Yuan, Y.Z., Yang S.L., 2015, Emodin has a protective effect in cases of severe acute pancreatitis via inhibition of nuclear factor-κB activation resulting in antioxidation, Molecular Medicine Reports, 11(2), 1416–1420.

26. Ho T., Wu S., Chen J., Li C., Hsiang C., 2007, Emodin blocks the SARS coronavirus spike protein and angiotensin-converting enzyme 2 interaction, Antiviral Research, 74(2), 92–101.

27. Dang S. S., Jia X. L., Song P., Cheng Y. A., Zhang X., Sun M. Z., Liu E. Q., 2009, Inhibitory effect of emodin and Astragalus polysaccharide on the replication of HBV, World journal of gastroenterology: WJG, 15(45), 5669. 28. Cao F., Peng W., Li X., Liu M., Li B., Qin R., Jiang W., Cen Y., Pan X., Yan Z., Xiao K., Zhou H., 2015, Emodin is identified as the active component of ether extracts from Rhizoma Polygoni Cuspidati, for anti-MRSA activity, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 93(6), 485–493.

29. Duan F., Xin, G., Niu, H. & Huang, W., 2017, Chlorinated emodin as a natural antibacterial agent against drug-resistant bacteria through dual influence on bacterial cell membranes and DNA, Scientific Reports, 7(1), 12721.

30. Wen, C., Zhang, J., Zhang, H., Dzah, C.S., Zandile, M., Duan, Y., Ma, H. & Luo, X., 2018, Advances in ultrasound assisted extraction of bioactive compounds from cash crops – A review, Ultrasonics Sonochemistry, 48, 538–549.

31. Cai Sun, M., Xing J., Corke H., 2004, Antioxidant Phenolic Constituents in Roots of Rheum officinale and Rubia cordifolia: Structure−Radical Scavenging Activity Relationships, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(26), 7884–7890.

32. Holtje H. D., Sippl W., Rognan D., Folkers G, 2003, Molecular Modeling: Basic Principles and Application, 3rd edition, Wiley-VCH, Verlag GmbH & Co. KGaA Weinheim.

33. Narsinghani, T., Sharma, M.C. & Bhargav, S., 2013, Synthesis, docking studies and antioxidant activity of some chalcone and aurone derivatives’, Medicinal Chemistry Research, 22(9), 4059–4068.

34. Cherupally Dayakar, Buddana Sudheer Kumar, Galande Sneha, Gudem Sagarika, Koneru Meghana, Sistla Ramakrishna, Reddy Shetty Prakasham,, Bhimapaka China Raju a, 2017, Synthesis, pharmacological activities and molecular docking studies of pyrazolyltriazoles as anti-bacterial and anti- inflammatory agents, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 25, 5678- 5691.

35. Yu-Chuan Chang, Yi-An Tung, Ko-Han Lee, Ting-Fu Chen, Yu-Chun Hsiao, HungChing Chang, Tsung-Ting Hsieh, Chan-Hung Su, Su-Shia Wang, Jheng-Ying Yu, Shangshung Shih, Yu-Hsiang Lin, Yin-Hung Lin, Yi-Chin Ethan Tu, Chun-Wei Tung, Chien-Yu Chen, 2020, Potential therapeutic agents for COVID-19 based on the analysis of protease and RNA polymerase docking, doi: 10.20944/preprints202002.0242.v1.

36. Nicolau L.A.D., Nolêto I.R.S.G., Medeiros J.V.R., 2020, Could a specific ACE2 activator drug improve the clinical outcome of SARS-CoV-2? A

potential pharmacological insight, Expert Review of Clinical Pharmacology, 13(8), 807–811.

37. Chang TN; Jeng SD; Yi CC; Lee CY; Liao JC; Lee MM; 2012; Ameliorative Effects of Scopoletin from Crossostephium chinensis against Inflammation Pain and Its Mechanisms in Mice. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine; vol 2012; 1-10.

38. Cheenpracha S; Park EJ; Rostama B; Pezzuto JM; Chang LC (2010) Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)- activated murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin A. Marine drugs; 8(3); 429-437.

39. Liao H; Banbury L; Liang H; Wang X; Lü X; Hu L; Wu J (2014) Effect of Honghua (Flos Carthami) on nitric oxide production in RAW 264.7 cells and α-glucosidase activity. Journal of Traditional Chinese Medicine 34(3): 362- 368.

40. Gaussian 09; Revision A.02; M. J. Frisch; G. W. Trucks; H. B. Schlegel; G. E. Scuseria; M. A. Robb; J. R. Cheeseman; G. Scalmani; V. Barone; G. A. Petersson; H. Nakatsuji; X. Li; M. Caricato; A. Marenich; J. Bloino; B. G. Janesko; R. Gomperts; B. Mennucci; H. P. Hratchian; J. V. Ortiz; A. F. Izmaylov; J. L. Sonnenberg; D. Williams-Young; F. Ding; F. Lipparini; F. Egidi; J. Goings; B. Peng; A. Petrone; T. Henderson; D. Ranasinghe; V. G. Zakrzewski; J. Gao; N. Rega; G. Zheng; W. Liang; M. Hada; M. Ehara; K. Toyota; R. Fukuda; J. Hasegawa; M. Ishida; T. Nakajima; Y. Honda; O. Kitao; H. Nakai; T. Vreven; K. Throssell; J. A. Montgomery; Jr.; J. E. Peralta; F. Ogliaro; M. Bearpark; J. J. Heyd; E. Brothers; K. N. Kudin; V. N. Staroverov; T. Keith; R. Kobayashi; J. Normand; K. Raghavachari; A. Rendell; J. C. Burant; S. S. Iyengar; J. Tomasi; M. Cossi; J. M. Millam; M. Klene; C. Adamo; R. Cammi; J. W. Ochterski; R. L. Martin; K. Morokuma; O. Farkas; J. B. Foresman; and D. J. Fox; Gaussian; Inc.; Wallingford CT; 2016.

41. Legiawati, L., Fadilah, F., Bramono, K. & Indriatmi, W., 2018, ‘In silico Study of Centella Asiatica Active Compounds as Anti-Inflammatory Agent

by Decreasing Il-1 And Il-6 Activity, Promoting Il-4 Activity’, J. Pharm. Sci., 10, 6.

42. Garrett M. Morris, David S. Goodsell, Robert S. Halliday, Ruth Huey, William E. Hart, Richard K. Belew, Arthur J. Olson, 1998, Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and an Empirical Binding Free Energy Function, Journal of Computational Chemistry, Vol. 19, No. 14, 1639-1662.

43. 43. Pham D. Q., Ba D. T., Dao N. T., Choi G. J., Vu T. T., Kim J. C., Le Dang Q., 2017, Antimicrobial efficacy of extracts and constituents fractionated from Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. rhizomes against phytopathogenic fungi and bacteria. Industrial Crops and Products, 108, 442-450.

44. Duong Quang Pham, Antimicrobial efficacy of extracts and constituents fractionated from Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. rhizomes against phytopathogenic fungi and bacteria, Industrial Crops & Products, 108 (2017) 442-480.

45. Danielsen, K., Aksnes, D. W., & Francis, G. W.,1992, NMR study of some anthraquinones from rhubarb. Magnetic Resonance in Chemistry, 30(4), 359-360.

46. Wells, J. M., Cole, R. J., & Kirksey, J. W., 1975, Emodin, a toxic metabolite of Aspergillus wentii isolated from weevil-damaged chestnuts. Applied Microbiology, 30(1), 26-28.

47. Zinaye, B. (2008). Phytochemical investigation on the root of Rumex abyssinicus (MAKMAKO) (Doctoral dissertation, Addis Ababa University). 48. Lutfiye Omur DEMIREZER, Nadire OZENVER, Mine UZU, Onur YUKSELEN Zuhal GUVENALP, Osman Ugur SEZERMAN, 2016, Molecular Docking of Anthranoids on Some Targeted Human Proteins, FABAD J. Pharm. Sci., 41, 1-16.

49. Cherupally Dayakar, Buddana Sudheer Kumar, Galande Sneha, Gudem Sagarika, Koneru Meghana, Sistla Ramakrishna, Reddy Shetty Prakasham, Bhimapaka China Raju, 2017, Synthesis, pharmacological activities and molecular docking studies of pyrazolyltiazoles as anti-bacterial and anti-

inflammatory agents, Bioorganic & Medicinal Chemistry, September. http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2017.08.042

50. Ravi Jarapula, Kiran Gangarapu, Sarangapani Manda, and Sriram Rekulapally, 2018, Synthesis, In Vivo Anti-Inflammatory Activity, and Molecular Docking Studies of New Isatin Derivative, International Immunopharmacology 54 238–244, https://doi.org/10.1155/2016/2181027. 51. Ya-Fang Chen, Yin-Hui Huang, Mei-li Yang, Zhi-Qiang Lin, 2020, Emodin ameliorates diabetic neuropathic pain through inhibiting up-regulation of TRPV1 and pro-inflammatory cytokines in dorsal root ganglions in rats, Neurology Asia, 25(3), p331-339.

PHỤ LỤC 1

Hình ảnh phổ 1H-NMR; 13C-NMR; DEPT của 3 hợp chất sạch thu được

Phổ 1H-NMR của hợp chất MC565

Phổ 13C-NMR của hợp chất MC565

Phổ DEPT của hợp chất MC565

Phổ 1H-NMR của hợp chất MC566

Phổ 13C-NMR của hợp chất MC566

Phổ DEPT của hợp chất MC566

Phổ 1H-NMR của hợp chất MC567

Phổ 13C-NMR của hợp chất MC567

Phổ DEPT của hợp chất MC567

PHỤ LỤC 2

Hình ảnh biểu diễn năng lượng tối ưu của các hợp chất bằng phương

pháp DFT với mức lý thuyết B3LYP/6-311G(d;p)

Chrysophanol Rhapontigenin

Emodin Rolipram

Celecoxib

PHỤ LỤC 3

Hình ảnh thông số hộp lưới (Grid box) cho mô phỏng tương tác phân

tử giữa protein với các phối tử

1ALU 2AZ5

PHỤ LỤC 4

Hình ảnh mô phỏng tương tác giữa các ligand với 2 đích kháng viêm 1ALU và 2AZ5

1ALU 2AZ5

Tên chất Chrysophanol

Rhapontigenin

Emodin

Rolipram

Indomethacin

Celecoxib

Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thiên nhiên từ cây Đại hoàng

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ

HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT

THIÊN NHIÊN TỪ CÂY ĐẠI HOÀNG

1H-NMR

13C-NMR

64

76 R1= OCH3 R2-H

77 R1= H R2= H

79

90

91

92

128. R=H

129. R=G

130. R=H

131. R=G

134

132. R=H

133. R=G

135

137

136

139

138

140. R1= H R2= G

Chrysophanol

Rhapontigenin

Emodin

Rolipram

Indomethacin

Celecoxib

Đường chuẩn NO

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Chế tạo và nghiên cứu tính chất điện, từ của vật liệu multiferroic Ba₀.₇Ca₀.₃TiO₃/ NiFe₂O₄

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu vật liệu biến hóa dạng chuỗi một chiều chế tạo từ kim loại đồng trên đế FR-4 hoạt động tại tần số MHz ứng dụng trong truyền năng lượng không dây

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá khả năng tác động tới môi trường biển của việc xả nước thải từ sự cố nhà máy điện hạt nhân Fukushima sử dụng công cụ ERICA

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mô hình đầu dò nơtron và gamma sử dụng nhấp nháy EJ-276 ghép nối với mảng nhân quang silicon

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá khả năng ảnh hưởng của bức xạ ion hóa đến sức khỏe cư dân khu vực mỏ đất hiếm Đông Pao, xã Bản Hon, huyện Tam Đường, tỉnh Lai Châu

Luận văn Thạc sĩ: Sử dụng phương pháp nhiễu xạ neutron khảo sát cấu trúc tinh thể và pha trật tự từ trong vật liệu Pr2FeCrO6

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính ức chế NO của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm biển Aspergillus sp. CL251

Luận văn Thạc sĩ: Phân tích một số hợp chất bisphenol thôi nhiễm từ bao bì nhựa lên một số mẫu thực phẩm nền tinh bột

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của loài hoa mộc (Osmanthus fragrans (Thunb.) Lour.) ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng viêm của loài côi Turpinia montana (Blume) Kurz

Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đặc trưng tính chất vật liệu composite có cấu trúc nano chitosan–cyclodextrin/TiO₂–Ag

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu chế tạo và khảo sát một số tính chất của màng phủ trên cơ sở nhựa epoxy gốc nước và khung cơ kim - ZIF

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất napthoquinone chứa nguyên tố flo bằng phản ứng đa thành phần

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu điều chế vật liệu Bioglass và tổ hợp lai với polymer ALG-F127 định hướng ứng dụng trong điều trị nội nha

Luận văn Thạc sĩ: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase trên một số hợp chất phân lập từ thịt quả bình bát nước (Annona glabra L.).

Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất của benzazole

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu chiết tách lignin từ vỏ sầu riêng Ri6 (Durio zibethinus Murr.) và tổng hợp vật liệu biocomposite định hướng ứng dụng trong bảo quản sau thu hoạch

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hạt nano bạc phủ acid hyaluronic mang doxorubicin định hướng ứng dụng trong điều trị ung thư

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài rau dừa nước (Ludwigia adscendens)

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ