Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn này.

Nha Trang, ngày 12 tháng 12 năm 2019

Tác giả luận văn

Lê Đỗ Thùy Vi

Lời cảm ơn

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè.

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Phạm Đức Thịnh đã gợi mở cho tôi các ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thông qua đề tài Hợp tác quốc tế mã số QTRU04.06/18-19 đã hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tổ chức công tác giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện luận văn và các thủ tục cần thiết.

Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng nhƣ các anh chị em công tác tại phòng Hóa Phân tích đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên, giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trƣờng Đại học Khánh Hòa, Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những

ngƣời thân luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Nha Trang, ngày 12 tháng 12 năm 2019

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Đỗ Thùy Vi

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

13C-NMR

Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN Carbon 13

Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid DMSO

Ethanol Ethanol EtOH

Fucose Đƣờng fucose Fuc

Fucofuranose Fucofuranose Fucf

Fucopyranose Fucopyranose Fucp

Galactose Đƣờng galactose Gal

Gel permeation chromatography Sắc ký lọc gel GPC

Glucose Đƣờng glucose Gluc

Glucuronic Axit Axit glucuronic GlucA

Sắc ký lỏng cao áp HPLC

High Performance Liquid Chromatography

1H-NMR

Phổ CHTHN proton

Proton NMR Spectroscopy

Phổ hồng ngoại IR

Infrared Spectroscopy desorption/ionization

Mannose Đƣờng mannose Man

Methanol Methanol MeOH

Nuclear Magnetic Cộng hƣởng từ hạt nhân NMR

Resonance (CHTHN)

TFA Trifluoroacetic axit Axit trifluoroacetic

Xyl Xylose Đƣờng xylose

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. ...................... 10

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan ..................................... 21

Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lƣợng phân tử của fucoidan .............................. 29

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu ........... 39

Bảng 1.5. Hàm lƣợng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam .............................................. 48

Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD ............................................ 50

Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trƣng của fucoidan trên phổ hồng ngoại ............ 59

Bảng 3.1. Hiệu quả thu nhận fucoidan chiết trong các dung môi khác nhau . 67

Bảng 3.2. Hàm lƣợng fucoidan thu nhận từ 08 loài rong nâu Việt Nam ........ 69

Bảng 3.3.Hàm lƣợng thu nhận fucoidan tổng và các phân đoạn .................... 76

Bảng 3.4. Thành phần hóa học fucoidan thu nhận từ rong S. oligocystum.....76 Bảng 3.5. Thành phần hóa học các phân đoạn chiết từ rong S. oligocystum..79

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh Hòa ...................................................................................................... 14

Hình 1.2. Cấu trúc của fucoidan từ F. vesiculosus đƣợc mô tả vào năm 1950 ......................................................................................................................... 22

Hình 1.3. Cấu trúc của fucoidan có sunfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome đƣợc mô tả vào năm 1991 ........................................... 23

Hình 1.4. Cấu trúc fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme

......................................................................................................................... 25

Hình 1.5. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A.nodusum ....................................................................................................... 25

Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus ................................................................................ 26

Hình 1.7. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Chorda filum ................................................................................................... 27

Hình 1.8. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus. .............................................. 28

Hình 1.9. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum. .......................... 45

Hình 1.10. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết tách từ rong Turbinaria decurrens ......................................................................................................... 49

Hình 1.11. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium .51

Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum oligocystum .................................................. 54

Hình 2.2. Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) ........... 56

Hình 2.3. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide ....... 60

Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum.. ......................................................................................................................... 70

Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan đƣợc chiết từ rong S.oligocystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose .......................................................... 72

Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn ............................ 74

Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC mẫu fucoidan chiết tách từ rong S.oligocystum .. 74

Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đƣờng đơn phân đoạn F4 ... 75

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đƣờng đơn phân đoạn F5 ... 75

Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4(Sargassum oligocystum) .... 81

Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F5(Sargassum oligocystum) .... 82

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F4 ..................................................... 84

Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F5 ................................................... 84

Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 ................................................. 85

Hình 3.12. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 ................................................. 85

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 6

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU ............................................................. 6

1.1.1. Giới thiệu về rong biển ...................................................................... 6

1.1.2. Giới thiệu về rong nâu ..................................................................... 10

1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới ............................ 11

1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam .............................. 12

1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu .................................................. 15

1.1.3.1. Polysaccharide .......................................................................... 15

1.1.3.2. Một số hợp chất khác................................................................. 18

1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN ........................................................... 19

1.2.1. Giới thiệu chung về fucoidan .......................................................... 19

1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu ....... 20

1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan ........................................................ 22

1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan ......................................................... 28

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan ................................. 29

1.2.5.1. oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối ................... 29

1.2.5.2. oạt t nh chống virus ................................................................ 32

1.2.5.3. oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch .................................. 33

1.2.5.4. oạt t nh chống ox hóa............................................................ 34

1.2.5.5. Giảm lipid máu .......................................................................... 35

1.2.5.6. Kháng viêm ................................................................................ 35

1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan ........................................................ 36

1.2.5.8. oạt t nh kháng khuẩn .............................................................. 36

2

1.2.5.9. ác d ng giảm l ợng ng hu ết trong máu. ......................... 37

1.2.5.1 . Các ng d ng c a fucoidan ..................................................... 37

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN ......... 38

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................. 38

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ................................................... 43

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 53

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 55

2.2.1. Phƣơng pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan ............................. 55

2.2.1.1. Ph ơng pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu .......................... 55

2.2.1.2. Ph ơng pháp phân oạn fucoidan ............................................ 55

2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan ............................. 57

2.2.2.1. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate ............. 57

2.2.2.2. Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide ................ 57

2.2.2.3. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate ................................ 57

2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axít.......................... 57

2.2.2.5. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ...................................................... 57

2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR .............................................. 58

2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR ..................... 60

2.3. THỰC NGHIỆM ................................................................................... 62

2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu .................. 62

2.3.2. Phân tích hàm lƣợng tổng carbohydrate.......................................... 64

2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide ............................................ 64

2.3.4. Phân tích hàm lƣợng sulfate ............................................................ 65

3

2.3.5. Phân tích hàm lƣợng uronic axít ..................................................... 65

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 66

3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU ........ 66

3.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN ............................................................... 70

3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC TRƢNG CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN ............. 80

3.3.1. Các đặc trƣng cấu trúc thu đƣợc từ phổ hồng ngoại IR............... 80

3.3.2. Các đặc trƣng cấu trúc thu đƣợc từ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR .......................................................................................................... 83

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 87

4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 87

4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 92

4

MỞ ĐẦU

Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dƣơng, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lƣu ý nhất mà con ngƣời đã phát hiện ra. Rong nâu chứa rất nhiều polysaccharide sinh học quí nhƣ alginate, laminaran, fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1,2].

Trong số đó, fucoidan là hợp chất đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Fucoidan là tên gọi chung cho các polysaccharide sulfate có trong thành phần của rong nâu. Từ hơn 100 năm qua kể từ lần đầu tiên fucoidan đƣợc phát hiện trong thành phần của rong nâu bởi Kylin và cộng sự vào năm 1913, cho tới nay fucoidan vẫn đang là hợp chất đặc biệt thu hút đƣợc sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nhờ sự đa dạng về cấu trúc cũng nhƣ phổ rộng các hoạt tính sinh học nhƣ: kháng ung thƣ, kháng viêm, chống đông máu, kháng virut, chống tạo mạch (antiangiogenic), chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, [3,4].... Vì vậy, fucoidan đã trở thành một nguồn dƣợc liệu đầy tiềm năng cho các ứng dụng làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, thực phẩm bổ dƣỡng và thuốc.

Fucoidan rong nâu là một polymer dị thể có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng về thành phần đƣờng đơn, khả năng phân nhánh cũng nhƣ các vị trí nhóm sulfate trên các gốc đƣờng biến đổi không theo quy luật. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đƣờng, chủ yếu là fucose và một số các gốc đƣờng khác nhƣ galactose, glucose, manose, xylose..., bên cạnh đó trong một số trƣờng hợp còn phát hiện thấy sự có mặt của các nhóm uronic axit và acetyl. Ngoài ra, các nghiên cứu trƣớc đây còn chỉ ra rằng sự biến đổi về cấu trúc của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, mùa vụ thu hoạch, vùng địa lý thu mẫu cũng nhƣ các kỹ thuật chiết tách.

Việt Nam có nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú với hơn 100 loài đã đƣợc phát hiện gồm nhiều chi rong khác nhau, trong đó riêng chi Sargassum chiếm khoảng hơn 60 loài, ƣớc tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [5,6]. Đây đƣợc coi là nguồn tiềm năng rất lớn cho các nghiên cứu về fucoidan theo hƣớng phát triển thành các sản phẩm có giá trị cao ứng dụng trong lĩnh vực y dƣợc. Fucoidan đã đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam trong hơn

5

một thập kỷ qua, các kết quả mà các nhà khoa học trong nƣớc thu đƣợc là rất có ý nghĩa, bƣớc đầu đã đƣa đƣợc sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam vào phục vụ cuộc sống... Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu nói chung và chi rong Sargassum nói riêng ở Việt Nam vẫn còn rất ít, theo các tài liệu tham khảo cho thấy các nghiên cứu về fucoidan từ loài rong Sargassum oligocystum ở Việt Nam vẫn chƣa đầy đủ, mới chỉ có các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của mẫu fucoidan chiết thô.Trong khi đó, đây là một trong số các loài rong tƣơng đối phổ biến và có trữ lƣợng tự nhiên lớn so với một số loài rong khác trong cùng chi Sargassum, có khả năng khai thác để sử dụng làm nguyên liệu cho việc sản xuất fucoidan vào mục đích làm thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc. Vì vậy, thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum” là cần thiết nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu ở Việt Nam theo hƣớng phát triển các hoạt chất mới cũng nhƣ khả năng ứng dụng hiệu quả fucoidan trong lĩnh vực y dƣợc.

Mục tiêu của luận văn:

- Nghiên cứu tinh chế và phân đoạn fucoidan từ rong nâu Sargassum

oligocystum Việt Nam.

- Phân tích thành phần hóa học và các đặc trƣng cấu trúc của fucoidan

thu nhận đƣợc sau quá trình chiết tách.

Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao

gồm:

- Thu thập rong nâu Sargassum oligocystum tại vùng biển Nha Trang. - Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ rong nâu thu đƣợc. - Phân tích thành phần hóa học của fucoidan và các phân đoạn của chúng. - Xác định các đặc trƣng cấu trúc của phân đoạn fucoidan có hàm lƣợng

quan tâm.

6

1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU

1.1.1. Giới thiệu về rong biển

Rong biển hay còn gọi là tảo, là những loài thực vật bậc thấp sinh sống ở biển, sống tự dƣỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản, thuộc nhóm tảo biển. Chúng là loại thực phẩm lành mạnh, tốt cho sức khỏe và còn đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc thảo dƣợc. Rong biển sinh trƣởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trƣởng không quá một năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn. Tổng số loài rong biển trên thế giới đƣợc phân loại chủ yếu thuộc 3 ngành chính:

Ngành rong lục (Chlorophyta): 900 loài

Ngành rong nâu (Phaeophyta): 1800 loài

Ngành rong đỏ (Rhodophyta): 4000 loài

Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới. Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữ lƣợng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã đƣợc phân loại.

Tại các vùng biển ở Việt Nam, tổng số loài rong biển ƣớc tính khoảng 1.000 loài, trong đó có khoảng 639 loài có trữ lƣợng lớn với 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [6]. Trong tất cả các loài này, 310 loài phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 loài hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố ở cả hai vùng [6,7].

Đại dƣơng cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm. Các nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất đƣợc tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển. Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, ngƣời Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trƣớc. Trong

7

nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển đƣợc coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới đƣợc thƣởng thức. Rong biển cũng đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan...), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp ... Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào đƣợc đề cập đến. Vì vậy, ngày nay rong biển đƣợc xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những quốc gia tiêu thụ lƣợng rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu sử dụng của họ là cơ sở của nghề nuôi trồng rong biển với sản lƣợng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tƣơi, trị giá lên đến 5 tỉ USD. Các nƣớc cung cấp rong biển làm thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nƣớc cung cấp chính rong biển cho các ngành công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật.

*Thành phần hóa học có trong rong biển

là violaxanthin,

Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dƣỡng và dƣợc dụng cao. Hàm lƣợng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trƣởng và phát triển của rong. Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã đƣợc nghiên cứu, thành phần trong rong biển gồm có : nƣớc chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lƣợng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino axit thiết yếu, hàm lƣợng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu (fucoxanhthin), các sắc antheraxanthin, neoxanthin, tố xanthophyll khác diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lƣợng ( K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lƣợng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…). Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng

8

đƣợc chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide. Nhóm monosaccharide gồm các đƣờng đơn nhƣ : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol. Mannitol thuộc nhóm đƣờng kép của rong nâu, đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913. Các nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc. Hàm lƣợng mannitol trong rong biển thƣờng cao vào các tháng mùa hè và có xu hƣớng tăng dần theo thời gian sinh trƣởng của rong... Mannitol đƣợc sử dụng nhiều trong dƣợc phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhƣng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [8,9,10]. Nhóm polysaccharides gồm có : fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan. Fucoidan là hợp chất đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các tính chất sinh học đa dạng và đặc thù của nó nhƣ khả năng tăng cƣờng miễn dịch, chống đông tụ máu, chống viêm nhiễm, kháng virus, điều trị rối loạn đƣờng huyết và hỗ trợ trong điều trị ung thƣ. Laminaran đóng vai trò nhƣ chất dự trữ trong rong nâu. Laminaran là chất tạo hệ miễn dịch ở động vật có vú, laminaran sulfate hóa đã đƣợc chứng minh là có đặc tính giống heparin.. Laminaran có hoạt tính chống đông tụ máu và chống ung thƣ. Agar và alginate đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm : đƣợc sử dụng làm chất ổn định trong bánh kẹo, kem, nƣớc ngọt hay làm chất làm đông đặc và tạo gel trong sản xuất thịt đông lạnh; trong công nghệ sinh học đƣợc dùng làm môi trƣờng nuôi cấy, trong y học dùng làm vải băng bó vết thƣơng truyền thống, lấy dấu răng, pha thuốc, pha huyết thanh, trong một số công thức chống chảy máu dạ dày, trong việc cấy ghép tế bào, tác động vào các tế bào sản xuất insulin để điều trị bệnh tiểu đƣờng loại 1. Vỏ nang bằng alginate không bị dịch tiêu hóa phân hủy và chỉ tan trong ruột. Màng đƣợc tạo thành từ alginate và gelatin kết hợp với một số chất nhƣ tinh dầu tràm, rau má, nghệ, dầu mù u có tác dụng trong điều trị vết thƣơng nhƣ vết bỏng, làm giảm sự nhiễm khuẩn, làm nhanh lành vết thƣơng; trong công nghiệp giấy : alginate đƣợc trộn lẫn với bột giấy rồi xử lý sẽ cho bề mặt giấy nhẵn, mịn không xù xì; trong công nghiệp dệt và tơ nhân tạo:

9

alginate cho nhũ tƣơng mịn và bền nên đƣợc dùng trong kỹ nghệ sơn, xà phòng, cao su, phim ảnh, vải lợp nhuộm vecni và sơn để tăng độ bền của màu. Màu vẽ có alginate dễ tan đều trong nƣớc. Carrageenan là một ionic polysaccharide, mạch thẳng đƣợc sulfate hóa, chúng mang đầy đủ tính chất đặc trƣng của polysaccharide. Carrageenan là polysaccharide có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch, chúng tồn tại trong một số loài rong đỏ thuộc họ Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thƣờng đƣợc chiết từ một số loài rong nhƣ Gigartina, Chondrus, Iridea, Eucheuma. Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc cũng nhƣ khả năng tạo gel khác nhau. Tính chất và khả năng tạo gel của carrageenan phụ thuộc vào độ lặp lại của các mắt xích, vị trí và số lƣợng nhóm sulfate và đặc biệt là sự có mặt của vòng 3,6 anhyđro D – galactose. Cầu 3,6 anhyđro D – galactose cho phép tạo nên cấu trúc xoắn, là điều kiện chủ yếu để tạo gel của carrageenan.

Ngoài ra, rong biển còn đƣợc sử dụng để làm thức ăn cho nuôi tôm, thức ăn gia súc, đƣợc dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn điện, lọc và hấp thụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh. Rong biển cũng là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp nƣớc giải khát, đồ hộp, socola, mỹ phẩm cao cấp. Rong biển cũng đƣợc sử dụng chữa trị ung thƣ theo các bài thuốc gia truyền dƣới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác. Polyphenol trong rong nâu cũng đƣợc dùng làm trà chống lão hóa. Năm 2007, tại Mỹ đã có quy trình sản xuất biodiesel từ rong biển. Thực tế còn cho thấy rong biển có tiềm năng sử dụng trong xử lý nƣớc thải. Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng nhƣ : Zn và Cd từ nƣớc bị ô nhiễm. Do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lƣợng có trong rong khá cao nên rong đƣợc dùng làm thức ăn bổ sung để phòng bệnh thiếu một số chất nhƣ sắt, iod,.. [1,11,12,13,14].

10

Bảng 1.1. Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển.

Ascophylm

Laminariad

Alariaes

Palmaria

Porpha

Porphyra

Ulva

nodosum

igitata

culenta

palmata

sp.

yezoensis

sp.

Ngành

Nâu

Nâu

Nâu

Đỏ

Đỏ

Đỏ

Lục

rong

Nƣớc

70-

73-90

73-86

79-88

86

70

78

85

Tro

15-

10-25

14-27

15-30

8-16

7,8

13-22

25

Alginic

15-

20-45

21-42

0

0

0

0

axít

30

Xylan

0

0

29-45

0

0

0

0

Laminaran

0-10

0

0-18

0-34

0

0

0

Mannitol

5-10

0

4-16

4-13

0

0

0

Fucoidan

4-10

0

2-4

nd

0

0

0

Floridosid

0

0

0

0

2-20

nd

nd

Protein

5-10

8-15

9-18

8-25

33-47

43,6

15-25

1-2

0,7

Chất béo

2-7

1-2

0,3-0,8

2,1

0,6-0,7

0,1

nd

nd

nd

nd

Tannin

2-10

0,5-6,0

1,3-3,8

nd

7-9

3,3

2,4

0,7

Kali

2-3

0,9-2,2

nd

2,0-2,5

Nd

0,6

3,3

Natri

3-4

nd

0,4-0,5

2,0

nd

nd

Magie

0,5-0,9

0,5-0,8

nd

nd

Iod

0,01-0,1

0,3-1,1

0,05

0,0005

0,01- 0,1

Nd : Không phát hiện thấy

1.1.2. Giới thiệu về rong nâu

Rong nâu là nhóm rong có kích thƣớc lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, chi Turbinaria, chi Dictyota, chi Padina, sản lƣợng tự nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác. Đặc biệt chi rong Sargassum, chúng

11

hình thành các thảm rong biển rộng từ vài hecta cho đến cả vài chục hecta, các chi còn lại mật độ vừa phải, chúng mọc trên các bãi triều và rạn ngầm có nền đáy đá hoặc san hô. Chúng phân bố rộng, chiếm ƣu thế ở các bãi triều ven biển ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới. Rong nâu nơi sâu phát triển muộn hơn nơi cạn; sinh lƣợng cao vào tháng 3 và kéo dài đến tháng 6. Đặc biệt, những vùng có nền đáy cứng, nƣớc trong, sóng mạnh, những bãi triều có độ dốc 5-25% rong phát triển tốt nhất [1,6,7,10,11,12].

1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới

Việc phân loại tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học...ngƣời ta chia rong thành một số ngành riêng biệt. Con số các ngành rong hiện nay vẫn chƣa thống nhất tùy theo các tác giả khác nhau.

Một trong những tác giả có các công trình nghiên cứu quan trọng về bộ rong nâu này là J. Agardh. Năm 1820, ông đã lập ra một hệ thống phân loại về chi rong Mơ và đã mô tả 62 loài. Ông chia chi này thành 7 nhóm và sắp xếp vào một bộ Fucoideae. Năm 1824, ông bổ sung thêm số lƣợng lên 67 loài. Sau đó một số tác giả khác nhƣ Greville, Gaudichaud, Montagne… có mô tả thêm loài nhƣng vẫn sắp xếp vào hệ thống J. Agardh. Năm 1889, ông đã bổ sung thêm vào hệ thống phân loại với nhiều chi, nhóm… trong đó có 180 loài. Hệ thống phân loại của J. Agardh đƣa ra năm 1889 đã đƣợc nhiều tác giả đồng tình và sử dụng. Quan trọng nhất là Grunow (1915-1916), đã triển khai và sử dụng hệ thống phân loại của J. Agardh, mô tả 230 loài với nhiều thứ và dạng trên cơ sở thu mẫu ở nhiều nƣớc trên thế giới. Một số tác giả khác đã góp phần vào việc nghiên cứu họ này nhƣ ở Nhật Bản đã mô tả 41 loài, 45 loài ở vùng biển Ấn Độ.

Đến năm 1931-1936, Setchell nghiên cứu rong biển ở Hồng Kông, Trung Quốc đã đặc biệt chú ý đến họ Sargassaceae, ông đã mô tả thêm 32 loài. Từ đó đến nay, nhiều tác giả ở Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Philippin, Úc, Ấn Độ, Mỹ… đã có nhiều nghiên cứu bổ sung, đã có nhiều hội

12

nghị quốc tế về rong biển kinh tế, trong đó các loài rong nâu mới cũng đƣợc bổ sung, nâng tổng số loài đƣợc biết hiện nay trên thế giới khoảng 1500 loài.

Nhƣ vậy đến thời điểm này rong nâu đƣợc phân chia thành 9 bộ, 265 chi và hơn 1500 loài trong đó số lƣợng thành phần loài một số chi rong nâu trên thế giới nhƣ:

Chi Sargassum C.Agardh, 1820. thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng 873 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 562 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại Chi Turbinaria J.V.Lamouroux, 1825. thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng 53 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 28 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại.

Chi Dictyota J.V.Lamouroux, 1809. thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales có khoảng 316 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 76 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại.

Chi Padina Adanson, 1763. thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales. Hiện nay số lƣợng loài chi Padina có khoảng 62 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhƣng trong đó 39 loài đƣợc chấp nhận sự phân loại (Tsutsui Isao et al, 2005).

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ai-len, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chi Lê, Argentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ Fucales, đối tƣợng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. Sản lƣợng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum . Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn.

1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam

Đối với rong nâu Việt Nam, các tác giả trong nƣớc và nƣớc ngoài đã nghiên cứu tƣơng đối đầy đủ về mặt phân loại. Việc phân loại đƣợc thực hiện

13

theo phƣơng pháp hình thái so sánh, trong đó các tiêu chí phân loại là đặc điểm của cơ quan sinh sản vì đây là cơ quan ít biến đổi theo các điều kiện sinh thái, đƣợc sử dụng phổ biến ở Việt Nam và trên thế giới. Theo một số tác giả con số thành phần loài hiện có thể dự báo khoảng 800 loài. So với các nƣớc trong khu vực thì thành phần loài của rong biển Việt Nam đa dạng phong phú giữa tự nhiên và nuôi trồng, có nhiều tiềm năng, góp phần lớn về sản lƣợng khai thác nguồn lợi rong biển khu vực Đông Nam Á. Hiện nay, một số chi rong nâu đƣợc thống kê bao gồm: Chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài, chi Sargassum 68 loài trong đó ở Khánh Hòa hiện nay khảo sát có 39 loài [5,6,7,8,9,10].

Năm 2013, theo công bố của Nguyễn Văn Tú, Lê Nhƣ Hậu và cộng sự đã có tổng số 827 loài đƣợc công bố, trong đó chi rong nâu Chlorophyta (180 loài). So với các nƣớc Philippin, Đài Loan, Thái Lan hay Malaysia, rong biển Việt Nam rất đa dạng về số lƣợng loài.

Nguồn lợi rong nâu đƣợc tập trung phân bố trên 4 khu vực ven biển

Khánh Hòa theo trình tự từ Bắc đến Nam (Hình 1.1)

+ Khu vực 1: Vịnh Vân Phong (Hòn Bịp, Hòn Ó, Hòn Dút, Cù Meo, Rạn Trào, Rạn Tƣớng, Mũi Dù, Mũi Đá Son, Sủng Rong, Lạch Cổ Cò, Sủng Ké..).

+

Khu vực 2: ven biển xã Ninh Thuỷ, xã Ninh Phƣớc, xã Ninh Vân, Đầm Nha Phu (Bãi Đá lát, Mỹ Giang, Hòn khô, Bãi Đá nọc, Bãi Cây Tra, Bãi Cỏ, Bãi Cây Bàn, Bãi Vũng Tàu, Hòn Thị, Đảo Khỉ... và vài bãi cạn ngầm Bãi Cỏ - Thị xã Ninh Hòa.

+

Khu vực 3: Vịnh Nha Trang (Mũi Kê Gà, Bãi tiên Đƣờng Đệ, Hòn Chồng, khu vực Hòn Đỏ, Hòn Rùa, Đảo Hòn Tre - Mũi Nam Bãi Trủ, Bãi Rạn, Bãi Ngéo, Hòn Một, Hòn Mun, Bãi rạn ngầm Lớn, Mũi Cá sấu Trí Nguyên, Sông Lô, Mũi Cầu.

+ Khu vực 4: Đảo Bình Ba, xã Cam Lập ( dọc theo bờ Đông bán

đảo Cam Lập, từ mũi Sốp đến mũi Cà Tiên) – Thành phố Cam Ranh.

14

Qua quá trình khảo sát thực địa các khu vực ven biển Khánh Hòa, đã xác định số lƣợng thành phần loài riêng một số chi rong nâu có tần suất xuất hiện tại 4 khu vực: chi Dictyota 9 loài, chi Padina 3 loài, chi Turbinaria 4 loài, chi Sargassum 21 loài.

Hình 1.1.Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh Hòa

15

1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu

1.1.3.1. Polysaccharide

Polysaccharide là thành phần chính và có nhiều ứng dụng quan trọng nhất trong rong nâu, bao gồm fucoidan, alginate, laminaran và dẫn xuất của chúng. Một số thành phần khác nhƣ porphyran, axít alginic và ascophyllan đã đƣợc tìm thấy ở một số loài rong nâu [15,16,17]. Ascophyllan đã đƣợc tách chiết từ rong nâu Ascophyllum nodosum ức chế sự phát triển và tiêu diệt tế bào ung thƣ.

*Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa dị thể nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này đƣợc Kylin mô tả đầu tiên vào năm 1913 từ loài rong nâu Laminaria digitata. Thành phần cấu tạo rất phức tạp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7% đến 32,9%, ngoài ra còn có mặt các thành phần đƣờng khác nhƣ galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose ,..và uronic axit. Từ kết quả các số liệu trong bảng 1.1, ta thấy fucoidan chỉ có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của hai ngành rong đỏ và rong lục [16].

*Alginate là anionic polysaccharide, là co-polymer mạch thẳng đƣợc tạo thành từ liên kết (1→4) glycosid của axít β-D-mannuronic (M) và axít α- L-guluronic axit (G). Natri alginate tách từ rong nâu Sargassum fulvellum có khả năng ức chế sự phát triển của khối u. Axít β-D-mannuronic (M) và axít α- L-guluronic axit (G) có cấu hình khác nhau: axít mannuronic có cấu hình 4C1 còn axít guluronic là 1C4 . Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [17]. Trong phân tử alginate, tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate. Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block: Block homopolymeric guluronic (Poly-G) gồm các gốc axít guluronic nối tiếp nhau (GGGG); Block homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc axít mannuronic nối tiếp nhau (MMMM) ; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai gốc axít guluronic và axít mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (MGMGMGMG)[18].

16

Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng trong mạch phân tử thay đổi tùy theo nguồn gốc của alginate. Do cấu trúc của các gốc G và M khác nhau nên hình dạng của các khối cũng khác nhau: Poly – M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên sự mềm mại của mạch phân tử, trong khi poly - G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền chặt hơn. Cấu trúc hóa học của alginate có tính chất quyết định đến các tính chất vật lý, hóa học và sinh học của nó [18].

Tùy theo thành phần hóa học và khối lƣợng phân tử mà alginate có ảnh hƣởng khác nhau đến hệ sinh học . Hoạt tính sinh học của alginate cho thấy sự tăng trƣởng quá nhanh các thực bào và nguyên bào sợi, tƣơng tự nhƣ một phản ứng viêm với dị vật. Các thí nghiệm cho thấy mức độ cảm ứng các yếu tố gây ra hoại tử khối u và interleukin 1 phụ thuộc hàm lƣợng axit mannuronic trong mẫu alginate. Kết quả này giải thích các phân đoạn giàu mannuronat không tham gia vào việc tạo gel sẽ thoát ra ngoài các viên nang và khởi động một phần phản ứng miễn dịch này có thể có liên quan một phần với các liên kết (1 → 4) glycoside, vì các polyuronat hormopolymer diequartorial khác nhƣ axít D– glucuronic cũng thể hiện tính chất này. Khả năng miễn dịch của các polymannuronat đến nay đã đƣợc chứng minh trong các thử nghiệm lâm sàng để ngăn ngừa các bệnh nhiễm khuẩn, để làm tăng khả năng miễn dịch không đặc hiệu.

Ngoài ra, alginate có tính tẩy xạ, khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng con đƣờng tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đƣa chất phóng xạ này ra khỏi cơ thể. Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó ngăn ngừa đƣợc sự hấp thu strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ đƣợc thải theo phân ra ngoài. Việc dùng alginate làm chất tẩy xạ không ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi ion Ca2+ và khả năng phát triển bình thƣờng của cơ thể. Ngoài ra một số nghiên cứu cũng cho thấy alginate còn có khả năng chống oxy hóa, tác dụng chống đông tụ máu, phòng xơ vữa động mạch ở trẻ em [18].

Alginate còn có rất nhiều ứng dụng khác trong cuộc sống. Các ứng dụng của alginate đều dựa trên ba đặc điểm đó là khả năng tạo dung dịch có độ nhớt cao; khả năng tạo gel khi thêm muối canxi vào dung dịch natri

17

alginate trong nƣớc; khả năng tạo màng natri hay canxi alginate và sợi canxi alginate. Ngày nay các alginate đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, các ngành công nghiệp dệt may và các lĩnh vực bao gồm cả giấy mạ, dƣợc phẩm và hàn…Ví dụ kỹ nghệ thức ăn, ngƣời ta dùng rất nhiều alginate để làm kem, socola, bánh, món tráng miệng. Trong công nghiệp, alginate đƣợc sử dụng rất nhiều trong kỹ nghệ giấy, dệt, vải hồ, kỹ nghệ cao su. Nhu cầu alginate dùng trong in vải sợi chiếm khoảng 50% tổng lƣợng alginate sản xuất trên toàn thế giới . Trong công nghệ dƣợc phẩm, alginate thƣờng dùng làm chất nhũ hóa và chất gây thấm trong các dạng thuốc có cấu trúc nhũ tƣơng và hỗn dịch, dùng trong tá dƣợc bao của viên nén hay tham gia vào thành phần của vỏ nang. Alginate có thể đƣợc sử dụng để kết hợp để làm màng bao của viên tan trong ruột, điều này rất có lợi cho việc bào chế các thuốc ảnh hƣởng đến đƣờng tiêu hóa. Alginate dùng để sản xuất lớp màng chống chất phóng xạ, nó thƣờng dùng để chỉ thị độ ô nhiễm phóng xạ của vùng biển. Màng đƣợc tạo thành từ gelatin và alginate đƣợc ứng dụng trong điều trị tổn thƣơng bỏng. Màng này có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm, giảm viêm đẩy mạnh quá trình lành hóa vết thƣơng, đặc biệt có hiệu quả ở dạng bỏng khô [18].

*Laminaran là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thƣờng gọi là laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là : 1,3 – β – D – glucan. Laminaran là một polysaccharide dự trữ của rong nâu, hàm lƣợng từ 1 – 15% trọng lƣợng rong khô tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí địa lý và môi trƣờng sinh sống của từng loại rong. Thƣờng vào mùa hè hàm lƣợng laminaran giảm vì phải tiêu hao cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây rong. Laminaran đƣợc hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết β-(1→3) và một ít liên kết β-(1→6), gốc đƣờng cuối mạch của một số phân tử có thể có các gốc mannitol hay vẫn là glucose. Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của các liên kết β-(1→3) và liên kết β-(1→6) cũng nhƣ cách thức nối của các liên kết này trong chuỗi glucan[15,18]. Laminaran là thực phẩm chức năng có giá trị dƣợc lý đƣợc FDA chấp thuận trong việc chống đông máu, làm giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu và kích thích miễn dịch bẩm sinh. Khả năng chống tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên nhiên này đem lại niềm hy vọng cho những

18

ngƣời đang dùng tia phóng xạ chữa trị các khối u gây ung thƣ trong cơ thể. Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng sức đề kháng với nhiễm trùng và thúc đẩy sự lành của vết thƣơng. Laminaran với những đặc tính của một alpha – amylase gây ra kích hoạt các enzyme có mặt trong quá trình tăng trƣởng ở thực vật và sự kích thích của hoạt động phân giải protein của các tế bào đƣợc xử lý. Hiện nay, laminaran đƣợc nghiên cứu để sử dụng nhƣ là một chất thúc đẩy hạt giống nảy mầm và tăng tốc độ tăng trƣởng cây trồng [15,18].

1.1.3.2. Một số hợp chất khác

*Hợp chất phenolic : Hợp chất phenolic là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của thành phần hóa học rong nâu, là hợp chất chứa các nhóm - OH gắn trực tiếp vào nhân bezen, bao gồm các hợp chất flavonoid, lignnin, tannin và phlorotannin. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính khác nhau. *Hợp chất Carotenoid : Carotenoid là các hợp chất màu tự nhiên đƣợc tìm thấy ở nhiều loài thực vật và động vật. Trong thành phần hóa học của rong nâu có chứa các hợp chất catatonic bao gồm lutein, zeaxanthin và fucoxanthin. Rong nâu đƣợc coi là giàu có hợp chất chuyển hóa thứ cấp đặc biệt nhƣ carotenoid có nhiều hoạt tính sinh học nhƣ hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thƣ, chống viêm và chống virus. Các hợp chất a-carotene, b- carotene, chlorophyll a và phaeophytin a đều có những hoạt tính sinh học vô cùng quý giá [17].

*Hợp chất Terpenoid: Một số terpenoid đƣợc tách từ rong nâu Sargassum fallax, sargaquinone, axít sargaquinoic, axít sargahydroquinoic, axít fallachromonoic, fallahydroquinone, fallaquinone, sargachromenol . Các hợp chất này có họat tính chống oxi hóa và ngăn ngừa ung thƣ. Các hợp chất atomarianone A , và atomarianone B đã đƣợc tách từ Taonia atomania có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ [17].

Hợp chất diterpenoid tách từ rong nâu Cystoseira mediterranea nhƣ taondiol , isoepitaondiol , stypodiol , stypoldione và sargaol , các hợp chất này có hoạt tính chống oxi hóa và chống ung thƣ. Hợp chất 2β,3α-epitaondiol,

19

flabellinol đã đƣợc tách từ rong nâu Styporodium flabelliforme có hoạt tính gây một số tế bào ung thƣ [17]

Ngoài các hợp chất đƣợc nêu trên đây, một số nhà khoa học còn tiến hành nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein đƣợc nghiên cứu tách chiết từ một số loài rong nâu. Các aminoaxit đã đƣợc nghiên cứu nhiều gồm : Deoxylapachol a 1,4 - Naphthoquinone và dẫn xuất đã đƣợc tách từ rong nâu Landsburgia quercifolia hay Sargachromanol E tách từ rong Sargassum siliquastrum, các hợp chất này có khả năng gây độc tế bào ung thƣ. Hợp chất ergosterol tách từ rong nâu Lyengaria stellata, Fucosterol tách từ rong nâu Pelvetia siliquosa, Cystoseira foeniculacea và Sargassum angustifolium. Các hợp chất axít α-linolenic, axít γ-linolenic và axít docosahexaenoic ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thƣ [18]

1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN

1.2.1. Giới thiệu chung về fucoidan

Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này đƣợc phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [16], khi đó nó đƣợc đặt tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đƣờng fucose là thành phần chính cấu tạo nên polysaccharide này. Nhƣng theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt, thuật ngữ này là không chính xác, vì các polysaccharide đƣợc tạo nên bởi fucose và sulfate đƣợc đặt tên là sulfate fucan. Các polysaccharide nhƣ vậy trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm. Ngƣợc lại, thành phần và cấu trúc của các polysaccharide rong nâu phức tạp hơn nhiều. Ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của fucoidan còn có thể chứa thêm các đƣờng đơn khác nhƣ: galactose, xylose, manose, glucuronic axít , đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các polyme sinh học phức tạp này trong nhiều trƣờng hợp còn chƣa đƣợc biết đến. Chính vì vậy, tên gọi phổ thông “fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các polysaccharide sulfate hóa của rong nâu, nó không liên quan đến thành phần của chúng, nhƣng hiển nhiên không đƣợc sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật. Nhờ sự đa dạng về thành phần và

20

cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị nhƣ: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch thể (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v... Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tƣợng thu hút đƣợc nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực nhƣ thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dƣỡng và dƣợc liệu. Cùng với đó số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng hơn 20 năm trở lại đây.

1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu

Hàm lƣợng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong. Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố rằng hàm lƣợng fucoidan từ 1-20% trọng lƣợng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [19]. Năm 1994, Koo đã báo cáo rằng các loài rong L. religiosa, U. pinnatifida, H. fusiforme và S. fulvellum có chứa hàm lƣợng fucoidan tinh khiết lần lƣợt là 2.7%, 6.7%, 2.5% và 1.6% [20].

Fucoidan là một polysaccharide sulfate dị thể, nên có thành phần hết sức phức tạp. Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nƣớc đƣợc xác định là một polysaccharide có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và uronic axit đƣợc xem nhƣ là tạp chất [21].

Tuy nhiên, Percival và Ross đã báo cáo rằng fucoidan trong dịch chiết nƣớc nóng của các loài rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7% fucose, 4% galactose, 1.5% xylose, 3% uronic axit và 8% khoáng [22]. Các loài rong khác nhau thì tỉ lệ fucose/galactose cũng khác nhau [23]. Dillon và cộng sự đã phân lập fucoidan từ loài rong A. nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [24], trong khi fucoidan chiết từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [22]. Ngoài ra, các thành phần đƣờng khác (nhƣ xylose) cũng đƣợc xác nhận là thành phần của fucoidan [22]. Thành phần của fucoidan từ rong F. vesiculosus là 44.1% fucose, 26.3% sulfate, 31.1% tro và một lƣợng nhỏ

21

amino-glucose [22,23]. Do vậy, thành phần của fucoidan có thể biến đổi theo các loài rong (bảng 1.2) và phƣơng pháp chiết khác nhau [20,21,24].

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan Rong nâu Thành phần hóa học

F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1.20)

F. evanescens fucose/sulfate/acetate (1/1.23/0.36)

F. distichus fucose/sulfate/acetate (1/1.21/0.08)

F. serratus L. fucose/sulfate/acetate (1/1/0.1)

Lessonia vadosa fucose/sulfate (1/1.12)

Macrocytis pyrifera fucose/galactose (18/1), sulfate

Pelvetia wrightii fucose/galactose (10/1), sulfate

Undariapinnatifida fucose/galactose (1/1.1), sulfate (10.4 %)

(Mekabu)

Fucose/xylose/GlcA (4.9/1/1.1), sulfate (12%)

Ascophyllum nodosum

Himanthalia lorea Fucose/xylose/GlcA (2.2/1.0/2.2), sulfate (13%)

và Bifurcaria bifurcate

Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose

(1.5/1.5/1.2/1.2/1), sulfate (17.6 %)

fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Laminaria angustata Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose

22

1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan

-)

Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đƣờng . Cấu trúc của fucoidan đƣợc chiết xuất từ rong biển vô cùng phức tạp và không đồng nhất với những thay đổi trong trật tự liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đƣờng khác nhau trong polysaccharide, phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [12,25,26,27,28]. Chính vì vậy việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật quang phổ NMR phân giải cao mới nhất. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã đƣợc công bố, nhƣng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện đƣợc tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan.

α -L-fucp-4(SO3



3

2)- α -L-fucp-(12)- α -L-fucp-(12)- α -L-fucp-(1 -

4 4

-

-

 

SO3

SO3

Hình 1.2. Cấu trúc của fucoidan từ Fucus vesiculosus đƣợc mô tả vào năm 1950

Năm 1950 Percival, Ross và cộng sự đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong nâu thƣờng gặp Fucus vesiculosus là một polysaccharide có bộ khung

chính là α -L-fucose(12), vị trí nhánh là α -L-fucose(13) và các nhóm

sulfate ở vị trí 4 của gốc đƣờng L-fucospynanose. Mô hình cấu trúc này của fucoidan đã tồn tại 43 năm [29]. Đến năm 1993, cấu trúc fucoidan của rong F.vesiculosus đã đƣợc nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của fucoidan này với

23

mạch chính là α -L-fucose(13) thay vì α - L-fucose(12), nhóm sulfate

đƣợc tìm thấy chủ yếu ở vị trí C4, phù hợp với mô hình đã công bố trƣớc. Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của Percival và Ross đƣợc Pantakar giải thích nhƣ sau: đầu tiên là kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan đƣợc Percival và Ross chiết trong dung môi nƣớc nóng, thay vì đƣợc chiết trong dung môi axít nhƣ Pantakar; thứ hai là sự khác nhau về phƣơng pháp methyl hóa và cuối cùng là sự khác nhau về phƣơng pháp phân tích cấu trúc. Percival và Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa trên các tính chất về sắc ký và hóa học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl hóa đƣợc Patankar phân tích bằng phƣơng pháp GC-EI/MS.

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã đƣợc công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo. Phổ NMR của polysaccharide là quá phức tạp để cho phép giải thích cấu trúc một cách trực tiếp, có thể do tính dị thể của cấu trúc. Cấu trúc của fucoidan này chủ yếu là α -L-fucose(1→3) với các nhóm sulfate ở C-4, không loại trừ sự có mặt của các nhóm sulfate khác hoặc các nhánh ở vị trí 2 [30].

Hình 1.3. Cấu trúc của fucoidan có sunfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome đƣợc mô tả vào năm 1991

-)(1→3)fuc(1→ [31]. Một phân đoạn fucoidan F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme chứa thành phần chính fucose, galactose, mannose, xylose và GlcA, sulfate chiếm 21.8%, khối lƣợng trung bình là 92.7 kDa. Cấu trúc của fucoidan phân doạn F32 bao gồm →2)-α-D-Man(1→ và →4)-β-D-GlcA(1→ luân phiên nhau, một lƣợng ít →4)-β-D-Gal(1→ đã đƣợc trộn lẫn. Nhóm sulfate ở vị trí C-6

Fucoidan từ Sargassum binderi là →3)fuc(2-OSO3

24

của →2,3)Man(1→, C-4 và C-6 của →2)Man(1→, C-3 của →6)Gal(1→, C- 2, C-3 hoặc C-4 của fucose.

Hình 1.4. Cấu trúc fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme

Năm 2001, Chevolt và cộng sự đã phân lập đƣợc fucoidan từ rong nâu Ascorphylum nodosum [27,32, 33,34], cấu trúc fucoidan oligosaccharide (bậc polyme hóa từ 8-14) của loài rong này đƣợc cấu thành bởi các liên kết luân

phiên α- (13) và α- (14). Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum cũng đã đƣợc

Daniel và cộng sự nghiên cứu khi sử dụng các enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosaccharide, kết quả cho thấy sự có

mặt của lƣợng lớn các liên kết glycoside của gốc α -L-fucose(13) và α -L-

fucose(14) [34].

25

-)-

-)-(14)-α-L-Fucp (2,3SO3

[3)-α-L-Fucp (2SO3

1]n

Hình 1.5. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A.nodusum

Năm 1999, cấu trúc fucoidan của 3 loài rong Cladosiphon Okamuranus (Chordariales) [35], Chorda filum (Laminariales) và Ascophyllum nodosum (Fucales) [32,36] đã đƣợc công bố. Cấu trúc fucoidan của rong Cladosiphonokamuranus và Chorda filum đƣợc tạo thành bởi các gốc α-L-

fucose(13) lặp lại đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 (2-O-

sulfateation) hoặc vị trí C-4 (4- O-sulfateation) . Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng làm tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng.

26

R R

Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus

27

- hoặc H

-, H hoặc COCH3

R1 : SO3 R2 : SO3

Hình 1.7. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Chorda filum

Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lƣợng phân tử cao đƣợc phân lập từ rong Fucus evanescens đã đƣợc nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, kết quả họ đã phát hiện thấy có sự tƣơng đồng giữa cấu trúc fucoidan này với cấu trúc fucoidan của rong A.nodosum [37]. Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus đƣợc tạo thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C-2 và C-2,4 [28,38].

28

-)-(1→]n

-)-(1→4)- α -L-Fucp-(2SO3

-)-(1→

[→3)- α -L-Fucp-(2,4 SO3

→3)- α -L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)- α -L-Fucp(2SO3

Trong đó:

-, R2 = H chiếm 50%

-)-

-)-(1→3) α -L-fucp(2SO3

R1 = SO3

R1 = H, R2 = α -L-fucp-(1→4)- α -L-fucp(2SO3 (1→ chiếm 50%

Hình 1.8. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus.

Nhƣ vậy, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa các loài rong và cấu trúc fucoidan, nhƣng chƣa đủ bằng chứng để thiết lập bất cứ mối tƣơng quan hệ thống nhất giữa cấu trúc fucoidan với các Bộ rong (algal order). Hầu hết các công bố về cấu trúc của fucoidan đƣợc phân lập từ các loài rong ở vùng ôn đới, thành phần hóa học của các loại fucoidan này nhìn chung tƣơng đối đơn giản với chỉ một gốc đƣờng fucose và sulfate. Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thì thành phần hóa học của chúng phức tạp hơn nhiều vì trong phân tử của chúng thƣờng tồn tại đồng thời nhiều gốc đƣờng khác nhau, điều đó gây ra rất nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc của những loại fucoidan này. Đó cũng là lý do tại sao không có nhiều công bố về cấu trúc của fucoidan rong biển ở vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh học của chúng vô cùng thú vị.

1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan

Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate, có độ nhớt thấp và tính hút ẩm cao [22,23], fucoidan tan tốt trong nƣớc và trong dung môi axít. Nhìn chung, fucoidan có trọng lƣợng phân tử không cao. Trọng lƣợng phân tử của

29

fucoidan chiết từ loài rong A.nodosum là từ 417-1.323 kDa, trong khi đó với loài rong F. vesiculosus là 529-887 kDa, nhƣng Patankar và cộng sự (1993) lại cho rằng trọng lƣợng phân tử của fucoidan từ loài rong này là 100 kDa. Rupérez và cộng sự (2002) đã chiết hai phân đoạn fucoidan với trọng lƣợng phân tử khác nhau là 1.600 kDa và 43 kDa. Thêm vào đó, galactofucoidan một loại fucoidan đƣợc phân lập từ loài rong Saccharina longicruris có trọng lƣợng phân tử là 765 kDa và 1.529 kDa biến đổi tùy thuộc vào thời điểm thu hoạch rong. Nhìn chung trọng lƣợng phân tử của fucoidan thay đổi tùy thuộc vào loài rong (bảng 1.3), phƣơng pháp chiết và điều kiện môi trƣờng.

Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lƣợng phân tử của fucoidan

Trọng lƣợng phân tử (kDa)

Nguồn rong

13

Ascophyllum nodosum

Ascophyllum nodosum

16 25

Hizikia fusiforme

Fucus vesiculosus (Sigma)

Fucus vesiculosus

100-180 160 189

Laminaria japonica

Cladosiphon okamuranus

200 950

Hizikia fusiforme

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan

1.2.5.1. oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối

Fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhƣng hoạt tính chống đông tụ máu của chúng đƣợc nghiên cứu sớm nhất. Nishino và cộng sự, đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu của fucoidan đƣợc phân lập từ chín loài rong nâu. Trong số các fucoidan thử nghiệm, fucoidan từ E. kurome thể hiện hoạt tính cao nhất đối với APTT (38 đơn vị/mg) và TT (35 đơn vị/mg), với fucoidan từ H.fusiforme hoạt tính APTT (activated partial thromboplastin time) và TT (thromboplastin time) tƣơng ứng là 25 đơn vị/mg

30

và 22 đơn vị/mg. Hoạt tính chống huyết khối của phân đoạn F4 của fucoidan từ L.angustata var. longissima là 200 đơn vị/mg, so với heparin (140 đơn vị/mg) [1,15].

Các nghiên cứu về hoạt tính chống đông tụ máu của fucoidan từ một số loài rong (E.kurome, H.fusiforme, vv…) đã chỉ ra rằng hàm lƣợng sulfate có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính chống đông tụ máu, hàm lƣợng sulfate càng cao thì hoạt tính chống đông tụ càng lớn. Fucoidan sulfate hóa toàn phần bằng biến đổi hóa học fucoidan tự nhiên cũng làm tăng hoạt tính này. Nishino và cộng sự, đã điều chế ba loại fucan sulfate hóa toàn phần (fucans oversulfated) có hàm lƣợng sulfate khác nhau (tỷ lệ sulfate/đƣờng: 1,38-1,98) bằng sulfate hóa hóa học của một sulfate fucan (tỷ lệ sulfate/ đƣờng 1,28 ) phân lập từ rong E. kurome. Các kết quả cho thấy fucan sulfate hóa toàn phần thể hiện hoạt tính chống đông tụ máu tăng đáng kể so với fucoidan tự nhiên . Qiu và cộng sự công bố rằng fucoidan sulfate hóa toàn phần cho thấy hoạt tính chống đông tụ máu cao gấp bốn lần so với fucoidan tự nhiên [39]. Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đƣờng cũng rất quan trọng với hoạt tính chống đông tụ của fucoidan. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng fucoidan sulfate hóa nếu ở vị trí C-2 hoặc C-3 thể hiện hoạt tính chống đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này [39,40,41]

Duarte cùng với các cộng sự của ông đã công bố rằng các đặc tính chống đông tụ máu của fucoidan chủ yếu đƣợc xác định dựa trên các chuỗi sulfate fucose, đặc biệt các đơn vị fucosyl disulfated. Silva và cộng sự đã công bố rằng hoạt tính chống đông tụ máu của fucoidan từ Padina gymnospora đƣợc quyết định bởi 3-O-sulfat tại C-3 của đơn vị đƣờng 4-α-L- fucose-1→ [42]. Để có đƣợc hoạt tính chống đông tụ máu fucoidan cần một mạch đƣờng đủ dài và một dạng cấu trúc linh động để liên kết với thrombin. Fucoidan tự nhiên từ Lessonia vadosa (Phaeophyta) có khối lƣợng phân tử (320.000 Da MW) cho thấy hoạt tính chống đông tụ máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lƣợng phân tử (32.000 MW) [43]. Các thử nghiệm với fucoidan trọng lƣợng phân tử thấp (LMWF) thu đƣợc từ A. nodosum bằng thủy phân xít, có cấu trúc lặp lại chủ yếu là [→3)-α-L-

31

-)-(1→4)-α-L-Fuc(2,3diSO3

-)-(1]n và có trọng lƣợng phân tử (Mw) Fuc(2SO3 là 3.090 Da, chỉ ra rằng cấu trúc phân nhánh không thực sự ảnh hƣởng đến hoạt tính chống đông tụ máu [15,39].

Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đƣờng (fucose, galactose, v.v) của fucoidan có ảnh hƣởng đến hoạt tính chống đông tụ máu [44,45]. Các kết quả của Pereira và cộng sự chỉ ra rằng nhóm 2-sulfate của α-L- galactan liên kết 3, là tác nhân ức chế thrombin mạnh qua trung gian antithrombin hoặc heparin cofactor II chứ không phải là gốc α-L-fucan. Axit uronic không có ảnh hƣởng trực tiếp lên hoạt tính chống đông tụ máu, nhƣng nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống đông tụ máu thông qua việc làm cho chuỗi đƣờng trở nên linh động hơn [46,12].

Mourao đã tổng kết các hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối của fucan sulfate. Các fucan sulfate của rong biển và động vật không xƣơng sống biển có hoạt tính chống đông tụ máu mạnh gián tiếp bởi antithrombin và heparin cofactor II. Những nghiên cứu này khẳng định rõ ràng rằng hoạt tính chống đông tụ máu của α-L-fucans sulfate và α-L- galactans sulfate mạch thẳng không chỉ phụ thuộc vào mật độ và mô hình sulfate hóa mà còn bị ảnh hƣởng bởi thành phần các monosaccharide [47].

Hoạt tính chống huyết khối của fucoidan cũng đã đƣợc thử nghiệm in vivo theo mô hình nghẽn tĩnh mạch và động mạch ở động vật thực nghiệm. Galactofucan sulfate đƣợc phân lập từ rong nâu Spatoglossum schroederi cho thấy không có hoạt tính chống đông tụ máu trên một số thử nghiệm in vitro. Tuy nhiên, nó lại thể hiện hoạt tính chống huyết khối mạnh khi thực hiện thí nghiệm về sự nghẽn tĩnh mạch trên mô hình động vật, điều này có thể đƣợc giải thích do ảnh hƣởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính chống huyết khối của fucoidan. Tác dụng này đạt tối đa 8 giờ sau khi theo dõi thí nghiệm và nhanh hơn so với heparin. Hoạt tính này không đƣợc phát hiện với các phân tử fucoidan khử sulfate. Hơn nữa, galactofucan sulfate còn có tác dụng kích thích sự tổng hợp heparan sulfate, một tác nhân chống huyết khối bằng các tế bào nội mô mạnh hơn heparin 2 lần. Tác dụng này cũng không xảy ra với các polysaccharide bị khử nhóm sulfate [47].

32

Nhƣ vậy có thể thấy rằng fucoidan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm thuốc chống đông tụ máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng và dƣợc liệu mà hầu nhƣ không có tác dụng phụ.

1.2.5.2. oạt t nh chống virus

Trong những năm gần đây, ngƣời

ta đã chứng minh rằng polysaccharide sulfate trong đó bao gồm fucoidan thể hiện các hoạt tính kháng virus đƣợc thử nghiệm cả trên động vật thực nghiệm (in vivo) và trong ống nghiệm (in vitro), yếu tố gây độc tế bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang đƣợc quan tâm xem xét sử dụng trong y học lâm sàng. Fucoidan từ Laminaria japonica có chức năng kháng RNA và DNA của virus. Hiệu quả chống virus của fucoidan trên bệnh nhiễm trùng do poliovirus III, adenovirus III, ECHO6 virus, virus coxsackie B3 virus và virus coxsackie A16 rất đáng kể. Fucoidan có thể ức chế sự phát triển của hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE) và bảo vệ các tế bào đƣợc cấy ghép khỏi sự nhiễm trùng gây ra bởi các virus ở trên. Herpes là một bệnh nhiễm trùng gây ra bởi virus herpes simplex (HSV). Fucoidan đƣợc tách chiết từ các loài rong Adenocytis utriculari, Undaria pinnatifida(Mekabu), Stoechospermum marginatum, Undaria pinnatifida, Cystoseira indica và Undaria pinnatifida cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây độc cho tế bào Vero. Hơn nữa, các fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của ngƣời và cytomegalovirus [48,49,50,51].

Dohura và cộng sự, công bố rằng sử dụng fucoidan từ rong nâu có hoạt tính antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị nhiễm trùng prion đƣờng ruột. Fucoidan của rong biển có tác dụng làm giảm những cơn đau của những con chuột bị nhiễm trùng đƣờng ruột (scrapie) khi cho uống trong 6 ngày sau khi nhiễm bệnh. Ăn chế độ ăn hàng ngày đƣợc bổ sung fucoidan có thể phòng ngừa chống lại các bệnh prion do ăn phải thức ăn nhiễm prion, mặc dù sự đánh giá sâu hơn về dƣợc lý của nó vẫn còn tiếp tục đƣợc thực hiện [48,52].

33

1.2.5.3. oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch

Hoạt tính kháng u của nhiều polysaccharide đã đƣợc công bố trong những năm gần đây. Fucoidan từ Eisenia bicyclics và L. japonica có tác dụng chống u báng 180. Fucoidan của L. japonica có thể ức chế tế bào gan QGY7703 đến phase Log, theo đó kiềm chế sự tăng trƣởng của khối u [53]. Fucoidan đã đƣợc phát hiện ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của ngƣời [54]. Fucoidan từ L. saccharina, L. digitata, F. serratus, F. distichus và F. vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thƣ vú MDA-MB-231 ngăn kết dính với các tiểu cầu, một hiệu ứng mà có thể có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u [47,55].

Dựa trên nghiên cứu fucoidan liên kết với fibronectin, Liu và cộng sự đƣa ra giả thuyết rằng fucoidan ức chế sự bám dính của tế bào MDA-MB-231 với fibronectin theo các cách sau:

- Bằng cách ngăn chặn heparin của protein và vùng liên kết tế bào.

- Bằng cách điều chỉnh việc tổ chức lại cấu trúc dƣới phân tử intergrin

alpha5.

Điều chỉnh giảm sự biểu hiện của vinculin [56]. Bệnh bạch cầu T-cell khi trƣởng thành (ATL) bị gây ra bởi vi rút gây bệnh bạch cầu tế bào T typ 1 (HTLV-1) và đến nay căn bệnh này vẫn chƣa có thuốc chữa Fucoidan ức chế đáng kể sự tăng trƣởng của tế bào máu đơn nhân ngoại biên của bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu (ATL) và các dòng tế bào T bị nhiễm HTLV-1 nhƣng không phải là của các tế bào máu đơn nhân ngoại biên bình thƣờng. Fucoidan từ Mekabu có khả năng ức chế khối u tới 65,4 % [47,56,57]

Fucoidan của L. japonica có thể phục hồi các chức năng miễn dịch của chuột bị ức chế miễn dịch, và đó là một miễn dịch tác động trực tiếp trên đại thực bào và tế bào lympho T [58]. Ngoài ra, nó cũng có thể thúc đẩy sự phục hồi chức năng miễn dịch trên các con chuột bị chiếu xạ. Cơ chế này liên quan đến sự kìm hãm quá trình giáng hóa tế bào lympho bởi fucoidan [47,59]. Fucoidan có thể làm tăng khả năng sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interferon- γ (IFN-γ) trong thử nghiệm in vitro, tăng cƣờng các chức năng của tế bào

34

lympho T, tế bào B, đại thực bào và tế bào giết tự nhiên (NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại với tế bào hồng cầu cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo. Fucoidan trọng lƣợng phân tử lớn đƣợc điều chế từ Okinawa Mozuku (Cladosiphon okamuranus) thúc đẩy sự gia tăng tỷ lệ gây độc tế bào T ở chuột [47]. Fucoidan từ rong F.vesiculosus có các tác dụng lên sự trƣởng thành và điều hòa miễn dịch trên các tế bào tua (DCs), đây là các tế bào có kháng nguyên mạnh mẽ, thông qua con đƣờng liên quan ít nhất đến yếu tố nhân tế bào [47,59].

Bên cạnh việc trực tiếp ức chế sự tăng trƣởng của tế bào khối u, fucoidan cũng có thể hạn chế sự phát triển và lan truyền của các tế bào khối u nhờ các hoạt tính tăng cƣờng miễn dịch của cơ thể. Fucoidan có thể trực tiếp giết chết các tế bào ung thƣ [45], nó có tác dụng chống ung thƣ trực tiếp trên các tế bào HS-Sultan của con ngƣời thông qua con đƣờng caspase và ERK [44]. Fucoidan làm tăng số lƣợng đại thực bào, và gián tiếp phá hủy khối u thông qua tế bào type 1 T-helper (Th1) và phản ứng của tế bào giết tự nhiên (NK) [57].

1.2.5.4. oạt t nh chống ox hóa

Bằng các thí nghiệm in vitro,các nhà khoa học đã chứng minh rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất quan trọng. Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên tuyệt vời và có khả năng ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do rất cao. Fucoidan từ L. japonica có thể ngăn chặn sự tăng peroxide lipid (LPO) trong huyết thanh, gan và lá lách của chuột bị tiểu đƣờng một cách rõ ràng. Tuy nhiên, không phát hiện thấy hiệu quả ức chế trên cả peroxy lipid của homogenates và cả hiệu quả ức chế gây ra bởi Cys/FeSO4 trong thử nghiệm in vitro[59]. Fucoidan có hiệu quả làm mất gốc peoxit mạnh mẽ, ảnh hƣởng của nó trên gốc hydroxyl là yếu, nó ít có ảnh hƣởng trên 1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH). Fucoidan giúp cho hồng cầu chuột đƣợc bảo vệ đáng kể trên lipid peroxy của đồng trong gan chuột gây ra bởi axit FeSO4-ascorbic [60]. Micheline và cộng sự công bố rằng fucoidan (homofucan) từ F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã có một tác dụng ức chế sự hình thành các gốc tự do hydroxyl

35

và gốc peoxit. Fucan cho thấy hoạt tính chống oxy hóa thấp so với fucoidan [61].

1.2.5.5. Giảm lipid máu

Tƣơng tự nhƣ axit sialic, fucoidan là hợp chất có thể làm tăng các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lƣợng cholesterol trong huyết thanh. Fucoidan của L. japonica giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-C, làm tăng HDL-C trong huyết thanh của chuột với sự tăng cholesterol (hypercholesterolemia) và thỏ với tăng mỡ máu (hyperlipidaemia), ngăn chặn hiệu quả sự hình thành của tăng cholesterol (hypercholesterol) trong máu ở chuột thí nghiệm [62,63]. Fucoidan có khả năng làm giảm đáng kể lƣợng cholesterol và triglyceride trong huyết thanh của bệnh nhân với chứng tăng mỡ máu (hyperlipidaemia), mà không có tác dụng phụ nhƣ gây tổn hại cho gan và thận. Sulfate fucan có trọng lƣợng phân tử thấp (trung bình Mw = 8.000 Da) đƣợc phân lập từ L.japonica có khả năng làm giảm rõ rệt lipít máu của những con chuột có lipít cao. Fucoidan oligosaccharide cho thấy tác dụng hạ huyết áp tốt trên chuột cao huyết áp và một trong những cơ chế tác dụng hạ huyết áp cơ bản là chúng có thể ức chế sự sản xuất angiotensin II trong huyết tƣơng (anti angiotensin II) [47,64].

1.2.5.6. Kháng viêm

Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của fucoidan thu nhận đƣợc từ chín loài rong nâu. Kết quả cho thấy tất cả fucoidan của 9 loài rong đều có khả năng ức chế sự tăng số lƣợng bạch cầu trên mô hình chuột bị viêm, hiệu quả chống viêm của fucoidan trong mô hình này không bị ảnh hƣởng nhiều bởi hàm lƣợng của gốc fucose và sulfate cũng nhƣ các đặc tính cấu trúc khác của bộ khung mạch polysaccharide của chúng [55,65]. Fucoidan Mekabu có thể làm giảm tình trạng viêm phổi và điều chỉnh giảm (down-regulated) các phản ứng phản vệ bị chi phối bởi Th2, tác dụng này có thể hữu ích trong điều trị viêm dị ứng [57].

36

Yang và các cộng sự, đã đánh giá tác dụng của fucoidan lên sự biểu hiện của nitric oxide synthetase (iNOS) trong một dòng tế bào đại thực bào, RAW264.7. Fucoidan ở nồng độ thấp (10 μg/mL) đã làm tăng mức độ biểu hiện cơ bản của iNOS trong các đại thực bào không hoạt động. Lần đầu tiên họ phát hiện thấy rằng, fucoidan ức chế sự giải phóng của nitric oxide (NO) trong tế bào RAW264.7 bị kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS). Ảnh hƣởng ức chế này lên protein hoạt hóa 1 (Actived Protein-1; AP-1) đƣợc kích hoạt bởi fucoidan có thể liên quan với sự ức chế NO và tác dụng chống viêm.

1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan

Bằng việc gián tiếp sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm (proinflammatory cytokine) ở chuột, fucoidan ngăn chặn tổn thƣơng gan gây ra bởi concanavalin A [65]. Các chất xơ trong rong nâu (Laminaria sp., Sargassum fulvellum và Eisenia bicyclis) có tác dụng chống lại bệnh gan gây ra bởi D-galactosamine (D- GalN) và tác dụng bảo vệ này đƣợc gây ra ít nhất một phần nhờ fucoidan [66]. Kết quả xơ gan do tổn thƣơng mãn tính gan cùng với sự tích lũy tăng dần các protein hình sợi nhỏ. Trên thế giới có hơn 100 triệu ngƣời bị xơ gan. Sự có mặt của fucoidan làm giảm suy gan cấp tính và mãn tính gây ra bởi CCl4. Gan xơ hóa gây ra bởi CCl4 cũng giảm bớt bằng cách tiêm fucoidan. Nguyên nhân chính gây ra xơ gan là do những thƣơng tổn tế bào gan và sự kích hoạt các tế bào gan hình sao và điều thú vị là fucoidan có khả năng ngăn chặn tế bào chết do CCl4 gây ra và ức chế các tế bào gan phát triển. Vì vậy, fucoidan có thể là một chất chống xơ có tiềm năng nhờ sở hữu chức năng kép, cụ thể là: bảo vệ tế bào gan và ức chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao [47,67].

1.2.5.8. oạt t nh kháng khuẩn

Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não, một biến chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra. Fucoidan tăng khả năng sản xuất các dạng interferon kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để phòng nhiễm trùng và bệnh tật [1,17,47].

37

1.2.5.9. ác d ng giảm l ợng ng hu ết trong máu.

Các nhà nghiên cứu đã công bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong biển tác động dƣơng tính lên phản ứng insulin và đƣờng huyết trong các động vật thí nghiệm. Việc đƣa thêm các polysacharide này vào cơ thể động vật đã dẫn đến giảm một cách đột ngột cân bằng hấp thụ đƣờng. Điều này giả thiết rằng các hợp chất polysaccharide giống fucoidan làm chậm việc truyền glucose vào máu từ ruột, nhờ vậy giúp giữ mức đƣờng máu ổn định và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức [1,17,47].

1.2.5.10. Các ng d ng c a fucoidan

Trong suốt những thập niên vừa qua có rất nhiều những nghiên cứu đã đƣa ra số lƣợng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một hợp chất sulfated polysaccharide hóa giàu fucose từ rong nâu. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm dinh dƣỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Hiện nay, trên thị trƣờng đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác nhau nhƣ: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị các bệnh ung thƣ vú, ruột kết, buồng trứng, cũng nhƣ tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đƣờng, giảm cholesterol, loét dạ dày,… Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cƣờng miễn dịch, … U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra sự giáng hóa các tế bào ung thƣ,… Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi Import Export Co.,Ltd., Trung Quốc đƣợc sử dụng để phục hồi khả năng kháng ung thƣ, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thƣ và tim mạch,. Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thƣ, ngăn ngừa lão hóa, tăng cƣờng hệ miễn dịch.

Ở nƣớc ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trƣờng dƣới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh

38

ung thƣ và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nƣớc yến fucoidan của Công ty Sannet Khánh Hòa.

Nhƣ vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng nhƣ tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Qua tham khảo các tài liệu đã công bố về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan trên thế giới, chúng tôi nhận thấy fucoidan từ rong nâu là một polymer sinh học có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và sự không đồng nhất về thành phần đƣờng cũng nhƣ vị trí nhóm sulfate trên các gốc đƣờng [26,28,38,68,69]. Vì vậy, dù đã có rất nhiều công trình công bố về cấu trúc của fucoidan, nhƣng chỉ có một số công bố đƣa ra đƣợc cấu trúc một cách rõ ràng mà phần lớn chỉ đƣa ra cấu trúc của một phân đoạn có độ lặp lại cao của chúng. Cho đến nay những công bố về cấu trúc của fucoidan một cách rõ ràng nhất là fucoidan đƣợc phân lập từ các loài rong nâu sinh trƣởng ở vùng ôn đới nhƣ Fucus evnescens C.Ag, Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Ascophyllum nodosum,…

Cấu trúc của fucoidan có thể khác nhau giữa các loài rong nâu khác nhau và có thể thay đổi khác nhau ngay trong cùng một loài.. Về cơ bản chia làm hai nhóm, một nhóm fucoidan từ Laminaria saccharina, L. digitata, Analipus japonicus, Cladosiphon okamuranus, và Chorda filum có mạch chính đƣợc tạo thành bởi liên kết lặp lại đều đặn của các gốc (1→3)-α-L- fucopyranose, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 hoặc vị trí C-4. Nhóm thứ hai bao gồm fucoidan từ các lòai rong Fucus và Ascophyllum nodosum có liên

39

kết chính lặp lại một cách tuần tự các gốc (1→3)-α-L-fucopyranose và (1→4)-α-L-fucopyranose . Các fucoidan này đƣợc miêu tả ở bảng 1.4.

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu Cấu trúc hóa học của các Fucoidan TLTK

Loài rong nâu

-)

Analipus japonicus 3(4Fucp) và 1 (2Fucp) /10 (1→3)-α-L- Fucp(2/4SO3

-)-(1→4)-α-L-

Bilan et al.,2007 [70]

-)-(1→]n

Ascophyllum nodosum [→3)-α-L-Fucp(2SO3 Fucp(2,3-điSO3

Chevolot etal.,2011[27]

A.nodosum

Mariais etal.,[71]

Chorda filum

-)-(1→4)-α-L-

-)-(1→

Chizhov et al.,1999[72]

-)-(1→4)-α-L-

Bilan et al.,[28] (1→3)-α-L-Fucp và một ít (1→4)-α-L-Fucp cùng (1→3)-α-L-(2 và hoặc 4 Fucp) -[→3)-α-L-Fucp-(1-]3→3)-α-L- Fucp(2Fucp)-(1→ →3)-α-L-Fucp-(2,4-diSO3 Fucp-(2SO3

-)-(1→

Fucusdistichus L F.evanescens →3)-α-L-Fucp(2SO3

Bilan et al.,[37] Fucp(2SO3

-)-(1→

F.serratus L →3)-α-L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)-α-L-

- , R2 = H

-)-(1→3)-α-L-Fucp(2SO3

-)-(1→ -)-(1→ và thêm →3) )-

-hoặc 2Fucp)-(1→

Bilan et al.,2006

-)-(1→ và →4-α-L-

-)-(1→

Laminaria sacharina Usov et al.,1998 [73]

Stoechosperm ummarginatum Adhikari et al.,2006 [74] Fucp(2SO3 a. (~50%): R1 = SO3 b. (~50%): R1 = H, R2 = α-L-Fucp-(1→4) )- α-L- Fucp(2SO3 →3)-α-L-Fucp(4SO3 α-L-Fucp(4SO3 →3)-α-L-Fucp(2/4SO3 Fucp(2SO3

40

Daniel và cộng sự chiết tách fucoidan từ rong nâu A.nodosum đã sử dụng các enzyme đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosaccharide và khẳng định sự có mặt của lƣợng lớn các liên kết glycoside của gốc α -L-fucose(1→3) và α -L-fucose (1→4)[75].

-)(1→]n [1].

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã đƣợc công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo. Phổ NMR của polysaccharide là quá phức tạp để cho phép giải thích cấu trúc một cách trực tiếp, có thể do tính dị thể của cấu trúc. Cấu trúc của fucoidan này chủ yếu là α -L-fucose(1→3) với các nhóm sulfate ở C-4, không loại trừ sự có mặt của các nhóm sulfate khác hoặc - các nhánh ở vị trí 2 [76]. Fucoidan từ Sargassum binderi là →3)fuc(2-OSO3 )(1→3)fuc(1→ [77].

-)(1→3)-L-Fuc (m

-)(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3

Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Pelvetia canaliculata bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide bao gồm tetrasaccharide và hexasaccharide có chứa các đơn - -)(1→4)-α-L-Fucp-2,3 (đi SO3 vị lặp lại disaccharide →3)-α-L-Fucp (2SO3 )(1→, dùng enzyme đặc hiệu này chỉ thủy phân liên kết (1→4) do đó xác định - đƣợc cấu trúc hoàn thiện của fucoidan này là [→4)-α-L-Fucp-2,3(đi SO3 )(1→3)-α-L-Fucp(2SO3

-)(1→3)]-α-D-Manp-(1→}n [1].

Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan - oligosaccharide có cấu trúc là {→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3 -)(1→3)-[α-D-GlcpA-(1→2)]-α-L-Fucp-(1→}m-3)- )(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3 α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3 =0, 1, 2, 3) [1].

Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide có đơn vị cấu trúc cơ bản lặp lại là trisaccharide {→4)-β-D- GlcpA-(1→2)-[α-L-Fucp(3SO3

Trong thành phần của các fucoidan ngoài fucose và sulfate còn có một lƣợng nhỏ các monosaccharide nhƣ galactose, glucose, mannose, xylose,

41

uronic axit. Cùng với sự xuất hiện của nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. Một số fucoidan mà thành phần chủ yếu là galactose, fucose và sulfate hay còn gọi là galactofucan sulfate đƣợc tách từ một số loài rong nâu nhƣ Laminaria angustata, Laminaria longissima, Alaria fistulosa, Undaria pinnatifida, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Laminaria gurjanovae và Sargassum patens. Trong khi đó có rất nhiều fucoidan có cấu trúc rất phức tạp đƣợc tách chiết và phân lập từ một số loài rong nâu Dictyota menstrualis, Padina gymnospora, Spatoglossum schroederi, Hizikia fusiforme, Sargassum fusiforme, Kjellmaniella crassifolia. Thành phần hóa học của chúng chứa rất nhiều các đƣờng đơn nhƣ fucose, galactose, glucose, mannose, xylose, còn có uronic axit và sulfate, ngoài ra có thể có nhóm acetyl hóa. Vì vậy việc xác định cấu trúc của chúng đang là một thách thức đối với các nhà khoa học nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng, tuy vậy chúng ta có thể xác định đƣợc đặc điểm cấu trúc đặc trƣng của fucoidan. Trong trƣờng hợp này các nhà khoa học phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhƣ phân tích methyl hóa, đề sulfate hóa, tự thủy phân, enzyme thủy phân fucoidan,… kết hợp cùng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại nhƣ NMR 2D, 3D, MALDI-TOF/MS/MS, SAXS để giải quyết bài toán cấu trúc phức tạp của fucoidan.

Việc áp dụng các phƣơng pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI- TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng đã tạo ra một bƣớc đột phá mới trong phân tích cấu trúc phức tạp của polysaccharide rong biển. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng nhƣ trật tự giữa các gốc đƣờng trong phân tử fucoidan. Việc áp dụng thành công phƣơng pháp này nhóm nghiên cứu của Anastyuk ở Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga đã công bố lại cấu trúc fucoidan từ loài rong Fucus evanescens và thêm 03 loại cấu trúc fucoidan mới từ các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii đã đƣợc công bố. Nhóm nghiên cứu do Giáo sƣ Usov đứng đầu thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện

42

Hàn lâm Khoa học Nga đi tiên phong trong việc sử dụng các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều 1D và hai chiều 2D để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Kết quả đã có 04 loại cấu trúc của fucoidan từ các loài rong nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus L. của Nga đƣợc công bố. Do sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực công nghiệp dƣợc liệu. Vì vậy dù đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ hơn 100 năm trƣớc, hiện nay fucoidan vẫn luôn thu hút đƣợc sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới. Cho đến nay, phần lớn các công bố về hoạt tính sinh học của fucoidan đƣợc thực hiện trên các sản phẩm fucoidan thƣơng mại hoặc chiết thô nên mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu một cách rõ ràng. Vì vậy, để có thể sử dụng fucoidan làm thuốc thì yếu tố tiên quyết và quan trọng nhất là phải xác định đƣợc cấu trúc chi tiết của chúng.

Năm 2017, nhóm nghiên cứu do Roza V. Usoltseva đứng đầu cùng với các cộng sự thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga bằng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều 1D, hai chiều 2D và khối phổ đã xác định đƣợc cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum duplicatum với thành phần chủ yếu là galactose, fucose và sulfate hay còn gọi là galactofucan sulfate. Trong đó, hàm lƣợng sunfate chiếm 31,7%, tỉ lệ giữa các gốc đƣờng Fuc:Gal ~ 1:1. Cấu trúc mạch chính của fucoidan đƣợc chiết từ rong Sargassum duplicatum đƣợc tạo ra từ các đơn vị lặp lại {→4)-α-L-Fuc- (1→4)-β-D-Gal- 1→}n

Cấu trúc của fucoidan này chủ yếu là liên kết α -L-fucose(1→3) và α- L-fucose(2→4), với các nhóm sunfate chủ yếu ở vị trí C2, C4 và ít hơn ở C3 trên gốc đƣờng fucose, nhóm sunfate chủ yếu tại vị trí C2, C3 và ít hơn ở C4, C6 trên gốc đƣờng glactose [78].

Đến khoảng cuối năm 2017, nhóm nghiên cứu do Roza V. Usoltseva đứng đầu cùng với các cộng sự thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đã có những công bố mới về đặc điểm thành phần và cấu trúc fucoidan thu nhận từ rong nâu Padina boryana. Về thành phần, fucoidan đƣợc

43

thu nhận từ rong nâu Padina boryana có hàm lƣợng sunfat là 18,6%, trong thành phần có chứa các gốc đƣờng gồm fucose (39,8%mol), galactose (36,7%mol), manose (17,4%mol), glucose (6%mol) [79]. Trƣớc đây, rong nâu Padina boryana cũng đã đƣợc nhóm nghiên cứu do giáo sƣ Shevchenko đứng đầu công bố trong thành phần chứa hàm lƣợng sunfate 18,2%, fucose (61%mol), galactose (31%mol), manose (4%mol), glucose (3%mol), ngoài ra còn có nhóm axetyl. Sự khác nhau về thành phần này đƣợc giải thích là do sự khác nhau về phƣơng pháp chiết. Việc xác định chính xác cấu trúc của fucoidan là vô cùng khó khăn, vì vậy tác giả đã tiến hành một số phản ứng phụ nhằm tách nhóm sunfate và axetyl. Sau khi thực hiện các phản ứng phụ này, fucoidan mới đƣợc phân lập trong thành phần chỉ chứa 2 loại gốc đƣờng galactose và fucose đƣợc gọi là galactofucan. Bằng phƣơng pháp phổ NMR, fucoidan mới đƣợc phân lập trong thành phần mạch chính có liên kết 1,4-α-L- fucopyranose và 1,3-β-D-Galactopyranose. Để làm sáng tỏ cấu trúc, các nhà khoa học đã tiến hành phản ứng tự thủy phân nhằm mục đích thu đƣợc các mảnh oligosaccharide và xác định chúng bằng khối phổ. Kết quả thu nhận đƣợc các mảnh disaccharide gồm fucose và galactose liên kết với nhau bằng liên kết 1,3 hoặc 1,4. Nhóm chức sunfate đính vào các vị trí C2,C3 và C4 trên cả 2 gốc đƣờng fucose và galactose [79].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Fucoidan mới chỉ đƣợc biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đƣa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên đƣợc hoạt tính sinh học tự nhiên vốn có của chúng.

Nƣớc ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong

44

nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Các nghiên cứu công bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đƣa ra các đặc điểm về cấu trúc nhƣ thành phần đƣờng, vị trí nhóm sulfate và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thô. Năm 2008, NCS Nguyễn Duy Nhứt đã công bố thành phần và cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 đƣợc phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đƣờng đơn khác nhƣ rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lƣợng đáng kể (10,81 - 22,07%), tác giả đã đƣa ra trình tự liên kết giữa các gốc đƣờng hexose, uronic axít và fucose, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [69].

Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố fucoidan từ rong Turbina ornata có hàm lƣợng sulfate cao và thành phần đƣờng rất đơn giản chỉ gồm fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhóm sulfate cũng đƣợc phát hiện thấy chiếm ƣu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh đƣợc tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [26,80]. Hàm lƣợng fucoidan trong rong Nâu Việt Nam chiếm từ 0,5-2,7 % khối lƣợng khô và chúng thuộc về nhóm galactofucan sunfate. Các fucoidan chiết từ 05 loài rong S. polycystum, S. oligocystum, S. swatzii, S. denticarpum và Turbinaria ornata có hoạt tính chống ung thƣ gan (Hep-2), ung thƣ màng tim (RD) và fucoidan chiết từ rong S.mcclurei có hoạt tính chống ung thƣ vú cả 06 loại fucoidan này đều có hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính chống kháng trực khuẩn mủ xanh là P. Aeruginosa. Trong số fucoidan đem thử hoạt tính thì fucoidan từ rong S.polycystum và Turbinaria ornata có hoạt tính cao nhất. Sử dụng các phƣơng pháp phân tích hóa học, GLC, IR, NMR và ESI-MS nhóm tác giả đã bƣớc đầu đƣa ra đƣợc đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn fucoidan từ loài rong S.polycystum; S.swartzii và Turbina ornata [26,80].

Vị trí nhóm sunfate trong fucoidan chiết từ 03 loài rong thuộc chi rong Sargassum và loài rong Turbina ornata nằm ở vị trí C4 của vòng pyranosse và chỉ một phần H4 bị sulfate hóa. Nhóm sulfate ở vị trí C4 của cả 02 monome: fucose và galactose đối với fucoidan từ rong Turbina ornata. Liên

45

kết glycoside chính trong mạch là liên kết (1→3) và có thể có mạch nhánh. Tuy nhiên các cấu trúc đƣa ra trên vẫn chỉ là dự đoán và còn một số vấn đề chƣa giải quyết thỏa đáng đó là các dữ liệu phổ về các kiểu liên kết và các chuỗi oligosaccharide trong mạch chính và mạch nhánh của fucoidan.

Năm 2013, các tác giả Bùi Minh Lý, Thành Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Usov và cộng sự đã tìm ra đƣợc cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum Việt Nam :

Hình 1.9. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum

Phạm Đức Thịnh và cộng sự [46] đã chiết tách fucoidan từ 05 loài rong S. denticapum, S. polycystum, S. swartzii, S. mcclurei và Turbina ornata và nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc của các phân đoạn đại diện cho fucoidan của mỗi loài rong, thu đƣợc những kết quả chính sau:

- Phân đoạn fucoidan SdF3 từ rong S.denticapum có thành phần là fucose (51,9%), galactose (34,4%), mannose (5,8%) và xylose (8,9%). Hàm

46

lƣợng sulfate (39,14%). Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là liên kết 1→3, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4.

- Phân đoạn fucoidan SpF3 từ rong S.polycystum có thành phần là fucose (68,8%), galactose (26,9%) và xylose (4,5%), hàm lƣợng sulfate (33,99%). Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là liên kết →3)-α-L- Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4.

- Phân đoạn fucoidan SwF5 từ rong S.swartzii có thành phần là fucose (57,1%), galactose (27,4%), mannose (4,0%), xylose (0,9%), rhamnose (2,0%) và glucose (2,0%), hàm lƣợng sulfate (42,3%). Liên kết đƣờng chủ yếu trong mạch là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)- α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2.

-

Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong S.mcclurei có thành phần là fucose (58,5%), galactose (41,5%), hàm lƣợng sulfate (35%) . Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)- α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và/hoặc C4.

-

-)-(1→3)-Fuc(2,4SO3

Phân đoạn fucoidan ToF2 từ rong Turbina ornata có thành phần là fucose (69,6%), galactose (27,7%) và rhamnose (2,7%), hàm lƣợng sulfate (43,26%). Liên kết đƣờng chủ yếu trong mạch là →3)-α-L- Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)-α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2.

- Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong Sargassum mcclurei, cấu trúc của -)-(1→ chèn thêm -) liên kết 4 và gốc galactose liên kết 6 ở đầu

-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc -)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc-(1→3)-Fuc

chúng gồm: →3)-Fuc(2,4SO3 vào gốc α-L-Fucp(3SO3 cuối khử.

-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc(2SO3 -)-(1→3)-Fuc(2SO3

Fuc(2SO3 Gal(2SO3

Lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L- Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong Sargassum

47

Trong luận án của Hồ Đức Cƣờng [18] fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum henslowianum đã đƣợc xác định với thành phần đƣờng chính là fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α-(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C-2, C-4 và một phần của C-3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C-4 và liên kết với mạch chính qua liên kết glycoside (1 - 4). Đây là một fucoidan có cấu trúc mới vì đa số các fucoidan chỉ bị sulfate hóa ở vị trí 1 hoặc 2 của gốc đƣờng fucose, trong khi fucoidan này cả 3 vị trí C-2, C-3 và C-4 đều bị sulafte hóa. Đã xác định fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thƣớc cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng các phƣơng pháp hiện đại nhƣ tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan đƣợc nghiên cứu . Hồ Đức Cƣờng và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm nhƣng không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày đã có tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh hoá mỡ máu, khối lƣợng mỡ trên mô hình chuột béo phì.

Đến năm 2017, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã chiết xuất, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lƣợng phân tử trung bình của các fucoidan từ 06 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss), và T. ornata (Fto)[81].

48

Bảng 1.5. Hàm lƣợng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam

Thành phần đƣờng trung bình

M

Gluc

Tên loài

HS (%)

(% mol)

Sulfate (%)

A (%)

W kDa

(ký hiệu mẫu fucoidan)

Fuc Man Gal Xyl Glc

6,8 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 25,7 52

S. polycystum (Fsp)

2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 26

S. mcclurei (Fsm)

1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 38

S. oligocystum (Fso)

2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 41

S. denticarpum (Fsd)

0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 41

S. swatzii (Fss)

2,75 30,3 vết 9,0 vết vết 7,8 25,6 88

T. ornata (Fto)

Điểm nổi bật nhất trong luận án của tác giả Bùi Văn Nguyên là đã nghiên cứu và mô tả đƣợc đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ hai loài rong Sargassum duplicatum và Sargassum binderi. Kết quả cho thấy các fucoidan từ hai loài rong này là các galactofucan sulfate. Kết quả này một lần nữa góp phần khẳng định đại đa số các fucoidan tách từ các loài rong nâu sinh trƣởng ở vùng nhiệt đới thƣờng gặp dạng galactofucan sulfate.

Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS chothấy phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một galactofucan tạo thành từ 2 loại đƣờng (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C-2 và β -D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C-6. Galactose nối

49

-)-1→]n

với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N đƣợc đề xuất nhƣ sau:

-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3

[→3-α-L-Fucp2(OSO3

Hình 1.10. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết tách từ rong Turbinaria decurrens

Bùi Văn Nguyên và cộng sự [81] đã tiến hành nghiên cứu hình dáng và kích thƣớc của các mẫu fucoidan bằng phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính toán cho các mô hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đƣờng.

Ngoài ra, tác giả Bùi Văn Nguyên đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên hai dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu α đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7 µg/mL).

50

Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD

Hep-G2 Mẫu Fucoidan

IC50 (µg/mL) RD IC50 (µg/mL) CS% CS%

S. polycystum (Fsp) 29.7 5.5 11.8 5.7

S. mcclurei (Fsm) 39.3 14.2 64.8 > 20

S. oligocystum (Fso) 35.3 15.8 11.2 11.4

S. denticarpum (Fsd) 37.5 7.3 27.9 15.9

S. swatzii (Fss) 31.1 5.8 16.5 18.7

T. ornata (Fto) 21.8 3.1 4.5 1.6

Khảo sát mối liên hệ giữa hoạt tính gây độc tế bào với một số đặc điểm

cấu tạo và cấu trúc của các mẫu fucoidan sơ bộ cho thấy:

- Khối lƣợng phân tử trung bình có tƣơng quan rõ rệt nhất với hoạt tính gây độc tế bào. Các mẫu có khối lƣợng phân tử trung bình cao nhất cũng có hoạt tính cao nhất. Các mẫu có khối lƣợng phân tử trung bình thấp nhất cũng có hoạt tính thấp nhất;

- Mức độ sulfate hóa của các đƣờng cũng thể hiện ở một mức độ nhất định tƣơng quan với hoạt tính gây độc tế bào. Tỉ lệ sulfate/đƣờng cao gắn liền với hoạt tính cao và ngƣợc lại;

- Không thấy có biểu hiện tƣơng quan rõ rệt giữa mức độ cồng kềnh (độ dài) của các mạch nhánh (thể hiện qua bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc) với hoạt tính gây độc tế bào. Các dữ kiện trên gợi ý rằng khối lƣợng phân tử cao và cấu trúc phân nhánh với tỉ lệ sulfate/đƣờng cao là các yếu tố cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan.

Năm 2017, Bilan và cộng sự đã công bố cấu trúc của fucoidan từ Sargassum aquifolium Việt Nam, bằng phƣơng pháp phân tích methyl hóa kết

51

hợp phổ NMR các tác giả này đã xác định đƣợc 03 polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sunfate deS-2, deS-4, deS-6.

Ngoài ra, nhóm các nhà khoa học này đã sử dụng thêm phƣơng pháp đo phổ NMR, HSQC và chứng minh đƣợc rằng fucoidan thu nhận từ rong Sargassum aquifolium là một polysaccharide sulfate có cấu trúc vô cùng phức tạp. Thành phần mạch chính đƣợc bắt đầu với fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, mức độ phân nhánh cao và bất thƣờng. Trong thành phần cấu trúc có chƣa các gốc đƣờng mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic axit và một số lƣợng lớn nhóm sunfate đính tại các vị trí khác nhau.

Hình 1.11. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium

52

Kết luận:

Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú [9,10,11,14]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các công bố về thành phần, cấu trúc của fucoidan phân lập từ các loài rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Do vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tinh

chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum” là cần thiết nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam theo hƣớng phát triển các hoạt chất mới cũng nhƣ khả năng ứng dụng hiệu quả của fucoidan trong lĩnh vực y dƣợc.

53

CHƢƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Việc nghiên cứu thành phần hóa học và cấu trúc của fucoidan có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn dƣợc liệu mới từ tài nguyên rong biển, từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng một cách hợp lý nguồn tài nguyên rong biển ở Nha Trang nói riêng và ở khu vực Nam Trung Bộ của Việt Nam nói chung. Vì vậy, trong khuôn khổ thực hiện đề tài, tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và các cấu trúc đặc trƣng của fucoidan đƣợc chiết tách từ rong nâu.

Dựa vào danh mục thành phần loài và trữ lƣợng các loài rong nâu phân bố ở Việt Nam đã công bố [9,10,11], cùng với tình hình nghiên cứu thực tế về các loài rong nâu, tôi đã chọn loài rong Sargassum oligocystum để nghiên cứu. Đây là một trong những loài rong phổ biến, có trữ lƣợng lớn, có giá trị kinh tế cao và có thể khai thác ở quy mô công nghiệp ở vùng biển vịnh Nha Trang tỉnh Khánh Hòa nhƣng lại chƣa đƣợc tác giả nào nghiên cứu . Mẫu rong nâu Sargassum oligocystum đƣợc thu ngay sau thời kỳ sinh sản tại các vùng ven biển tỉnh Khánh Hòa. Thời gian thu hoạch tùy thuộc vào từng loài rong nhƣng thông thƣờng vào khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hàng năm. Các mẫu rong đƣợc thu thập và phân loại bởi PGS.TS. Nguyễn Hữu Đại (chuyên gia phân loài rong biển thuộc Viện Hải Dƣơng học Nha Trang). Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch khỏi tạp chất bằng nƣớc biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khối lƣợng mỗi mẫu thu tối thiểu là 10kg rong tƣơi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô đƣợc lƣu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.

*Mô tả thực vật học của rong nâu Sargassum oligocystum (Hình 2.1)

Sargassum oligocystum thuộc ngành rong nâu đƣợc phân loại:

- Ngành: Ochrophyta

- Lớp: Phaeophyceae

- Bộ: Fucales

54

- Họ: Sargassaceae

- Chi: Sargassum

- Loài: Sargassum oligocystum

Rong nâu Sargassum oligocystum có tản hình sợi, chiều dài trung bình của rong trƣởng thành khoảng từ 40cm đến 70cm. Phiến lá dạng mỏng có hình bầu dục kéo dài hay mũi giáo, lá dài và dai, chắc, dài khoảng 2-5.5cm, mép lá có hình răng cƣa nhọn, cuống lá hơi ngắn. Phao (túi khí) có hình cầu, hình elip hay hình trái xoan có lông gai xung quanh, có đƣờng kính 3-4mm. Đĩa bám xẻ thùy không sâu có trục chính ngắn từ 0.5cm. Nhánh rong hình trụ to từ 0,3-0,7cm, khoảng cách giữa các nhánh 2-3cm, dài 4-10cm [8,10].

Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum oligocystum

55

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phƣơng pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan

2.2.1.1. Ph ơng pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu

Dựa trên cơ sở tham khảo tài liệu đã công bố về các phƣơng pháp chiết tách fucoidan cho mục đích nghiên cứu cấu trúc, chúng tôi tiến hành chiết theo phƣơng pháp sử dụng dung dịch axít loãng (sơ đồ hình 2.2) vì phƣơng pháp này ít ảnh hƣởng đến cấu trúc phân tử tự nhiên của fucoidan, đơn giản và dễ thực hiện. Phƣơng pháp này cũng đã đƣợc chọn làm phƣơng pháp chính để chiết fucoidan có hoạt tính theo Patent của Nga (Patent WO 2005/014657). Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành chiết với 2 dung môi khác là H2O và CaCl2 để khảo sát hàm lƣợng thu nhận fucoidan và một số thành phần hóa học từ fucoidan thu nhận đƣợc[83].

2.2.1.2.Ph ơng pháp phân oạn fucoidan

Fucoidan đƣợc tiến hành phân đoạn tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (hình 2.2). Mẫu bột fucoidan thô (gồm fucoidan, laminaran và polyuronan) đƣợc hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần không tan (polyuronan), phần dịch trong đƣợc cho chạy qua cột sắc ký DEAE-cellulose. Hợp chất laminaran (hợp chất không có nhóm mang điện tích) không bị hấp thụ trên cột sẽ đƣợc rửa giải đầu tiên bằng dung dịch HCl loãng (0,04N) hoặc nƣớc cất. Tiếp theo các phân đoạn fucoidan sẽ đƣợc rửa giải bằng dung dịch muối NaCl ở các nồng độ khác nhau [83].

56

Hình 2.2. Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657)

57

2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan

2.2.2.1. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate

Phân tích hàm lƣợng tổng carbohydrate: Hàm lƣợng đƣờng tổng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phenol-axít sulfuric [84].

2.2.2.2. Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide

Phân tích thành phần đƣờng đơn của fucoidan: Thành phần đƣờng đơn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC, sau khi fucoidan đƣợc thủy phân axít về các monomer [84].

2.2.2.3. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate

Hàm lƣợng sulfate đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp đo độ đục với BaCl2/gelatine, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [85].

2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axit

Hàm lƣợng uronic axít đƣợc xác định sử dụng phƣơng pháp Carbazole,

sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [86].

2.2.2.5. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

Khối lƣợng phân tử trung bình của fucoidan xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC). GPC là một kỹ thuật sắc ký để phân tách các phân tử kích thƣớc lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lƣợng trung bình Mw, trọng lƣợng phân tử trung bình số Mn, và đặc trƣng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lƣợng phân tử của nó. GPC đƣợc sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn nhƣ polymer tổng hợp hay các polymer tự nhiên nhƣ polysaccharide. Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố trọng lƣợng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần của nó nhƣ polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia [87].

Tác giả Descamps và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel đƣợc áp dụng để tinh chế và phân đoạn fucoidan theo trọng lƣợng phân tử. Áp dụng sắc ký thẩm thấu gel sau khi thực hiện sắc ký trao đổi ion là phƣơng

58

pháp đặc trƣng để loại bỏ muối đƣợc sử dụng để giải hấp chất quan tâm khỏi nhựa trao đổi ion. Mặc dù, thẩm tách và kết tủa trong cồn cũng đƣợc sử dụng cho mục đích loại muối và các hợp chất trọng lƣợng phân tử thấp. Tuy nhiên, sắc ký thẩm thấu gel là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này cho phép phân đoạn fucoidan theo trọng lƣợng phân tử, đồng thời loại bỏ đƣợc muối cũng nhƣ các tạp chất trọng lƣợng phân tử thấp khác. Các loại nhựa đƣợc sử dụng cho việc tinh chế và phân đoạn polysaccharide là Sephadex G-50 và G-100, Sepharose CL-6B, CL-48 và Sephacryl S-400 [87]. Sắc ký thẩm thấu gel và sắc ký trao đổi anion không gây ảnh hƣởng lên nhóm este sulfate của polysaccharide. Tuy nhiên, sự thay đổi mạnh về lực ion có thể ảnh hƣởng đến cấu hình không gian của các polysaccharide. Những sự thay đổi về cấu hình phân tử này có thể cũng ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học của chúng.

Phép đo GPC đƣợc thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent 1100, với cột Shodex SB-806HQ và detector RID (refractive index detector) tại Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nhiệt độ của cột đƣợc giữ ở 60oC. Fucoidan nồng độ 1mg/mL. Thể tích mẫu bơm là 0,5mL với tốc độ 1,0mL/phút. Dung dịch NaCl (1mg/mL) đƣợc sử dụng làm chất rửa giải [87].

2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR

Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trƣng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định đƣợc vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đƣờng ở vị trí axial hay equatorial (bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này.

59

Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trƣng của fucoidan trên phổ hồng ngoại

Đỉnh Dao động

775 Dao động dãn vòng của - anome

802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí

C6

822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí

equatorial

845

Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial

847 Dao động của liên kết C1-H của - anome

893 Dao động của liên kết C1-H của  anomer

917 Dao động vòng của -anome

1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal

1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C

1255-1264 Dao động hoá trị của S=O

1420 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-O

1430 Dao dộng gấp của C-H

1730 Dao động hoá trị của C=O

3300-3440 Dao động hoá trị của O-H

Mẫu fucoidan đƣợc ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr.

60

Phổ hồng ngoại FT-IR của fucoidan đƣợc ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga), trong vùng số sóng 4000-400 cm-1. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định đƣợc các nhóm sulfate trong các phân tử đƣờng nằm ở vị trí axial hay equatorial.

2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR

Trong phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysaccharide-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosaccharide có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α - anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton đƣợc coi nhƣ một phƣơng pháp đặc trƣng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín

hiệu  từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trƣng H-6 của nhóm methyl,

các tín hiệu có độ dịch chuyển hóa học  từ 5,0 đến 5,5ppm là vùng của H-

1 (H- α) của fucoidan.

Hình 2.3. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhƣng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysaccharide do

61

các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H- NMR. Vì vùng giá trị  lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau nhƣ trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thƣờng xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm. Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trƣng để nhận biết trong phổ 13C-NMR là vùng trƣờng cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vòng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thƣờng xuất hiện trong vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ xuất hiện ở vùng trƣờng thấp hơn từ 170-180 ppm. Các tín hiệu của nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, nhƣ C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trƣờng cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm.

Nhƣ vậy, có thể thấy việc đánh giá và phân tích cấu trúc của các polysaccharide là rất khó khăn và với polysaccharide sulfate hóa từ rong biển còn khó khăn hơn rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại không cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR là không đủ. Để đánh giá phân tích cấu trúc các polysaccharide phức tạp này các nhà khoa học thƣờng kết hợp phƣơng pháp hóa học nhƣ chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phƣơng pháp phổ NMR, đôi khi cả phƣơng pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR đƣợc ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu fucoidan đƣợc pha trong D2O với nồng độ 20

62

μg/mL, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt độ 35oC.

2.3. THỰC NGHIỆM

2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu

* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung

môi HCl 0,01N

Các mẫu rong đƣợc cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lƣợng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 : 10) theo tỉ lệ w/v= 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp đƣợc lọc tách, rong đƣợc phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) đƣợc tiến hành chiết 3 lần với 15 lít dung dịch HCl 0,01N (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết đƣợc lọc tách thô qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nƣớc của 3 lần chiết đƣợc gộp lại và trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hòa đƣợc loại bớt nƣớc bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 50-60oC. Sau đó, chúng tôi lại tiến hành cô đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa để thẩm tách loại muối, các hợp chất màu và các tạp chất trọng lƣợng phân tử thấp trong thời gian kéo dài (48 giờ). Dịch chiết sau khi đƣợc làm sạch và cô đặc tới 1/10 thể tích ban đầu và đƣợc kết tủa bằng EtOH 98% theo tỉ lệ thể tích Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô bằng cách sử dụng máy đông khô chân không ta thu đƣợc bột polysaccharide dạng thô chứa fucoidan.

* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung

môi CaCl2 2%

Chiết tách fucoidan trong dung môi CaCl2 2% thực hiện dựa trên nền tảng phƣơng pháp của Bilan và cộng sự. Rong nâu Sargassum oligocystum đƣợc xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp Me-OH – CHCl3 – H2O theo tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với aceton, sấy khô. Sau khi sấy khô rong nâu đƣợc chiết với dung môi CaCl2 2% ở 85oC trong 3 giờ (chiết lặp lại

63

3 lần). Dịch chiết đƣợc gộp lại, sau đó đem cô quay chân không đến còn 1/4 thể tích ban đầu. Dịch sau cô quay sẽ thêm từ từ hexadecyltrimethylammo- niumbrommide nồng độ 10% trong nƣớc vào để kết tủa polysaccharide sulfate (fucoidan). Kết tủa tạo thành đƣợc ly tâm, rửa với nƣớc cất nhiều lần để loại bỏ cetavlon dƣ. Kết tủa sau đó đƣợc hòa tan bằng cách khuấy trộn với dung môi NaCl bão hòa trong cồn 20% ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, khi kết tủa đƣợc hòa tan hết bổ sung thêm 3 lần thể tích cồn 98% để kết tủa fucoidan. Rửa kết tủa với cồn 75% vài lần và sau đó hòa tan lại trong nƣớc cất. Dung môi đƣợc thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu đƣợc fucoidan (polysaccharide sulfate) thô dƣới dạng muối Natri.

* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung

môi n ớc

Quy trình chiết fucoidan bằng nƣớc đƣợc thực hiện dựa trên nền tảng

của Percival và Ross từ rong Fucus vesiculosus năm 1950 [22]. Chiết với

nƣớc sôi trong 24 giờ. Sau đó loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate.

Fucoidan đƣợc kết tủa bằng Ba(OH)2, tủa dƣới dạng tạo phức với

hydroxide, sau đó đem phức đi thủy phân trong H2SO4 loãng. Cuối cùng

fucoidan đƣợc tách ra là làm sạch bằng màn thẩm tách trong thời gian kéo

dài.

* Phân oạn tinh chế fucoidan bằng sắc ký trao ổi anion

Cân 0,5g bột polysaccharide thô gồm (fucoidan, laminaran và polyuronan) hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần tủa không tan ta loại đƣợc polyuronan (PA) dƣới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đƣa lên cột DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch HCl 0,04N đến khi thử âm tính với hydrate cacbon bằng phƣơng pháp phenol-axít sulfuric ta thu đƣợc phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan (F1, F2, F3, F4, F5) đƣợc tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu

64

đƣợc cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa trong nƣớc cất sau thời gian 24h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột [83].

2.3.2. Phân tích hàm lƣợng tổng carbohydrate

Cân 5 (mg) bột fucoidan thô hòa tan vào H2O cất thành 1mL. Lấy 200 µL dung dịch cần xác định có hàm lƣợng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200µL thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 490 nm. Sử dụng D-glucose làm chất chuẩn [84].

2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide

Phân tích thành phần các đƣờng đơn của fucoidan là bƣớc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Quy trình chung để xác định các đƣờng đơn là thủy phân fucoidan thành các monosaccharide và sau đó phân tích thành phần của từng monosaccharide bằng phƣơng pháp sắc ký. Hai phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích thành phần các đƣờng đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích gián tiếp thông qua các dẫn xuất acetyl hóa của chúng bằng sắc ký khí (GC): Fucoidan đƣợc thủy phân → Khử → Acetyl hóa → Sắc ký [84].

Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung tích 5mL, thêm 1mL TFA (Triflorua acetic axít) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dƣ. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 mL nƣớc đề ion, dung dịch này đƣợc dùng để phân tích thành phần đƣờng trên thiết bị phân tích carbohydrate IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm Borat kali, tốc độ rửa giải 0,6 mL/phút. Đƣờng đơn đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C-R2 AX. Các đƣờng đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose đƣợc sử dụng làm chất

65

chuẩn. Hàm lƣợng các đƣờng đơn đƣợc tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn.

2.3.4. Phân tích hàm lƣợng sulfate

Cân 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5mL, thêm vào 2 mL HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, trong thời gian 6 giờ. Lấy 10 μL dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 μL TCA (Trichlorua acetic axít ) và 100μL hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ= 360 nm. Hàm lƣợng sulfate đƣợc tính dựa vào đƣờng chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 0,25-1 μg/mL [85].

2.3.5. Phân tích hàm lƣợng uronic axit

Cân 5 (mg) bột fucoidan thô hòa tan vào H2O cất thành 1mL. Lấy 250 μL dung dịch mẫu (mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic axit)) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 mL dung dịch A (0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 mL nƣớc cất, thêm vào từ từ 90 mL dung dịch axít sulfuric 98% đã đƣợc làm lạnh), phản ứng đƣợc tiến hành ở 100oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nƣớc đá, thêm tiếp 50 μL dung dịch B (100 mg Carbazole đƣợc hòa tan trong 100 mL cồn tuyệt đối) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo quang ở bƣớc sóng λ = 525 nm. Sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [86].

66

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU

Kể từ khi fucoidan đƣợc phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 cho đến ngày nay, đã có rất nhiều các quy trình chiết tách fucoidan khác nhau đƣợc công bố ứng dụng trong nghiên cấu trúc hóa học cũng nhƣ trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Mỗi một phƣơng pháp đều có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng. Tùy vào mục đích khác nhau mà ta có thể chọn phƣơng pháp khác nhau để phục vụ cho tách chiết có hàm lƣợng cao, chi phí giảm, không gây ô nhiễm môi trƣờng, hay tách chiết để nghiên cứu cấu trúc làm sao tránh ảnh hƣởng tối đa đến cấu trúc tự nhiên của fucoidan.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát chiết fucoidan trong ba dung môi khác nhau: trung tính (H2O), axit (dung dịch HCl 0,01N), dung dịch muối CaCl2 2%, đánh giá mức độ ảnh hƣởng của dung môi chiết lên sự biến đổi một số thành phần hóa học cơ bản của fucoidan . Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 3.1.

67

Bảng 3.1. Hàm lƣợng thu nhận fucoidan chiết trong các dung môi khác nhau

Các kết quả Dung môi chiết

thu nhận HCl 0,01N H2O CaCl2 2%

500 500 500

Khối lƣợng rong khô đã chiết(g)

11,50 9,00 7,200

Khối lƣợng fuoidan thô thu đƣợc(g)

1,80 1,44 Hàm lƣợng thu nhận(%) 2,30

27,780 32,130 35,820

Hàm lƣợng carbohydrate tổng(%)(**)

Hàmlƣợng sulfate 16,880 22,300 22,800

(%)(**)

23,750 20,900 14,260

Hàm lƣợng uronic axit(%)(**)

** Hàm lƣợng tính theo khối lƣợng mẫu fucoidan

Fucoidan thô đã đƣợc chiết tách thu nhận từ rong nâu Sargassum oligocystum trong ba dung môi H2O, axít HCl 0,01N, CaCl2 2% với hàm lƣợng thu nhận lần lƣợt 2,30%, 1,80% và 1,44% so với trọng lƣợng rong khô đã đƣợc xử lý loại bỏ các hợp chất màu và lipid. Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lƣợng fucoidan thô đối với mỗi dung môi chiết khác nhau sẽ khác nhau. Hàm lƣợng thu nhận fucoidan cao nhất khi chiết trong môi trƣờng trung tính (H2O) và thấp nhất khi chiết với dung dịch muối CaCl2 2%. Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hàm lƣợng thu nhận fucoidan là do mỗi dung môi khác nhau sẽ có độ phân cực, moment lƣỡng cực, hệ số phân cực và liên kết hidro khác nhau dẫn đến quá trình phá vỡ vách tế bào để trích li chất cần chiết vào trong dung môi của rong nâu khác nhau. Mặt khác, khi tiến hành chiết với dung môi CaCl2 2%, CaCl2 đã kết tủa với các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu về dạng muối canxi alginate

68

không tan, do đó chúng cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc. Bên cạnh đó, CaCl2 còn liên kết với các hợp chất polyphenol hình thành phức không tan và cố định trên bã rong, do đó sản phẩm fucoidan thô thu nhận đƣợc khi chiết bằng phƣơng pháp này cũng tinh khiết hơn.

Ngoài sự khác nhau về hàm lƣợng thu nhận fucoidan thô, thành phần hóa học các mẫu fucoidan này cũng có sự khác nhau. Theo kết quả phân tích bảng 3.1, mẫu fucoidan đƣợc chiết bằng CaCl2 2% có hàm lƣợng sulfate 22,80% có cao hơn một ít so với mẫu fucoidan đƣợc chiết bằng axit loãng 22,03%, nhƣng sự khác biệt này là không đáng kể. Mặt khác, hàm lƣợng uronic axit của mẫu fucoidan chiết bằng axit loãng cao hơn rất nhiều so với mẫu fucoidan chiết bằng CaCl2 2%. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trƣớc đây cho thấy sulfate và uronic axit là hai trong những yếu tố có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính sinh học của fucoidan. Và do mục đích thu nhận sản phẩm để nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc nên mẫu fucoidan đƣợc chiết trong dung dịch axit loãng ở nhiệt độ 60oC đƣợc chúng tôi lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Phƣơng pháp chiết fucoidan bằng dung môi axit loãng cũng là phƣơng pháp đƣợc lựa chọn trong nhiều nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan đã đƣợc công bố.

So với các kết quả về hàm lƣợng fucoidan đã đƣợc công bố trƣớc đó của các loài rong S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum, Turbinaria ornata [18,46,69] lần lƣợt là 2,88 %, 3,92 %, 3,74 %, 3,56 %, 2,94 %, 4,22 % có thể thấy hàm lƣợng fucoidan trong cùng một chi rong cũng khác nhau, theo các nhà nghiên cứu trƣớc đây sự khác nhau về hàm lƣợng fucoidan trong các loài rong này có thể đƣợc giải thích là do sự khác nhau về thời gian thu rong, vị trí địa lý và phƣơng pháp chiết. So với các loài rong nâu thuộc chi Sargassum của các nƣớc khác trên thế giới nhƣ Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc,… hàm lƣợng fucoidan của rong nâu Việt Nam cao hơn so với loài rong Sargassum stenophyllum (Brazil) 0,4% [88] và các loài rong Sargassum ringgoldianum 0,13 % [89], Sargassum thunbergii 0,88 % [90], Sargassum fusiformis còn đƣợc gọi là

69

Hizikia fusiformis 1,30 % [91] của Nhật Bản và thấp hơn các loài rong, Sargassum myriocystum 5,34 %, Sargassum wightii 6,72% (Ấn Độ) [92], Sargassum horneri 4,3 % (Mexico) [93].

Bảng 3.2. Hàm lƣợng fucoidan thu nhận từ 08 loài rong nâu Việt Nam

Stt Loài rong

Tài liệu tham khảo

1 S.swartzii Hàm lƣợng fucoidan % 0,82 [68]

1,8 2 S.oligocystum

3 S.denticapum 2,00 [46]

4 S.mcclurei 2,37 [46]

5 S.polycystum 2,57 [46]

6 S.binderi 1,13 [46]

7 T.ornata 1,23 [46]

8 Padina 1,93 [46]

australis

Tóm lại, sự khác biệt về hàm lƣợng fucoidan trong các loài rong rất khó để đƣa ra so sánh, bởi hàm lƣợng fucoidan thu đƣợc nhìn chung thay đổi rất nhiều (0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trƣởng và phát triển, cũng nhƣ phƣơng pháp chiết tách để thu nhận fucoidan.

Chất lƣợng sản phẩm fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum thu nhận đƣợc theo quy trình chiết tách fucoidan thuộc bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) [83] để nghiên cứu cấu trúc đƣợc đánh giá qua đƣờng cong phân bố KLPT của các polysaccharide xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC (Gel Permeation Chromatography).

70

Khối lƣợng phân tử (D)

Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum

Sắc ký đồ GPC của hai fucoidan này trên hình 3.1 chỉ cho một peak với chỉ số đa phân tán PI = Mw/Mn = 3,88 cho thấy mức độ phân tán về khối lƣợng phân tử của các polysaccharide là không lớn và không lẫn với các thành phần khác.

Kết quả khảo sát trên cho thấy phƣơng pháp phân lập fucoidan từ rong nâu thuộc bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) cho hàm lƣợng chiết tách tƣơng đối cao, khối lƣợng phân tử phân bố tập trung, độ phân tán không nhiều và hoàn toàn thích hợp để áp dụng trong nghiên cứu các đối tƣợng rong nâu ở vùng biển Việt Nam.

3.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN

Theo những nghiên cứu của các nhà khoa học trƣớc đây cùng với những công trình khoa học đã đƣợc công bố trên thế giới và ở Việt Nam, cấu trúc phân tử fucoidan chiết từ các loài rong có chứa thành phần các gốc đƣờng fucose, galactose, mannose, xylose, glucose có thể giống nhau hoặc không giống nhau và tỉ lệ này khác nhau ở mỗi loài, điều này giúp ta có thể dự đoán về bộ khung monosaccharide các hợp chất fucoidan cấu trúc rất phức tạp và độ lặp lại không cao. Cấu trúc của fucoidan có thể khác nhau giữa các loài rong nâu khác nhau và có thể thay đổi khác nhau ngay trong

71

cùng một loài. Do sự không đồng nhất cấu trúc của fucoidan trong các loài rong nâu, các điều kiện tách chiết khác nhau, làm gia tăng đáng kể các fucoidan. Có thể cơ bản chia làm hai nhóm, một nhóm fucoidan từ Laminaria saccharina, L. digitata, Analipus japonicus, Cladosiphon okamuranus, và Chorda filum có mạch chính đƣợc tạo thành bởi liên kết lặp lại đều đặn của các gốc (1→3)-α-L-fucopyranose, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 hoặc vị trí C-4. Nhóm thứ hai bao gồm fucoidan từ các lòai rong Fucus và Ascophyllum nodosum có liên kết chính lặp lại một cách tuần tự các gốc (1→3)-α-L-Fucopyranose và (1→4)-α-L-Fucopyranose. Do sự phức tạp trong thành phần cũng nhƣ cấu trúc, nên việc xác định các đặc trƣng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bƣớc quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tích các đặc trƣng cấu của chúng. Fucoidan thô (0,5g) đƣợc hòa tan trong 5mL dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần tủa không tan là axít polyuronic (PA), phần dịch trong đƣa lên cột DEAE- cellulose (3,2x32 cm) với trung tâm hoạt động là nhóm amin mang điện tích dƣơng (+1). Đầu tiên rửa cột với dung dịch HCl 0,04N đến khi thử âm tính với cacbonhydrate bằng phƣơng pháp phenol-axit sulfuric[84], tiếp theo rửa cột với dung dịch NaCl gradient nồng độ từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan thu đƣợc theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl đƣợc thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa trong nƣớc cất với thời gian 48h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột.

Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) (hình 2.1) đƣợc chỉ ra trên hình 3.2

72

F1

Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan đƣợc chiết từ rong S.oligocystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose

Bảng 3.3. Hàm lƣợng thu nhận các phân đoạn fucoidan

Kí hiệu mẫu Khối lƣợng mẫu Hàm lƣợng Công thức tính

thu nhận thu nhận(%)

F1 16,5(mg) 3,30 (16,5x100):500

F2 22,4(mg) 4,48 (22,4x100):500

F3 8,15(mg) 1,63 (8,15x100): 500

F4 140(mg) 28,00 (140x100):500

F5 127,5(mg) 25,50 (127,5x100):500

Kết quả tách phân đoạn fucoidan từ rong S. oligocystum (hình 3.2) ta thấy có 05 phân đoạn F1, F2, F3, F4 và F5 đƣợc tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lƣợt là 0,5N; 0,8N; 1,0N; 1,2N và 1,5N. Với 05 phân đoạn thu đƣợc sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.oligocystum sinh tổng hợp nên 5 loại fucoidan khác nhau. So với kết quả phân đoạn thu đƣợc của fucoidan từ các loài rong khác thuộc chi Sagassum có thể thấy mỗi loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn fucoidan đƣợc tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích

73

(nhóm sulfate). Điều này có thể đƣợc giải thích là do hàm lƣợng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, vì vậy để giải phóng phân đoạn fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Chính vì lý do này mà các phân đoạn fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau sẽ đƣợc rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau. Hàm lƣợng và thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan rong S. oligocystum đƣợc trình bày trong bảng 3.2. Kết quả cho thấy hàm lƣợng của các phân đoạn fucoidan F1-F5 dao động từ 1,63 -28,00%, trong đó cao nhất là phân đoạn F4 (28,00 %) và thấp nhất là phân đoạn F3 (1,63 %). Vì các phân đoạn F1, F2, F3 hàm lƣợng thu đƣợc rất thấp nên chúng tôi không tiến hành phân tích thành phần hóa học của phân đoạn này. Hai phân đoạn F4 và F5 có hàm lƣợng cao nhất đƣợc lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và các đặc điểm cấu trúc.

Phân tích xác định thành phần của các monosaccharide là việc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharide nói chung và của fucoidan nói riêng. Fucoidan là một polymer dị thể có thành phần hóa học phức tạp, ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, chúng còn chứa các đƣờng đơn khác nhƣ galactose, mannose, xylose, glucose,... và uronic axit. Vì vậy, để xác định thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hành thủy phân fucoidan thành các monomer trong môi trƣờng axít. Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần các đƣờng đơn của fucoidan trên thực tế rất khó xảy ra, do đó chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ mol giữa các gốc đƣờng đã đƣợc thủy phân và dựa vào tổng carbohydrate để tính thành phần của mỗi đƣờng đơn trong mẫu fucoidan. Sắc ký đồ của các mẫu đƣờng chuẩn đƣợc trình bày trên hình 3.3.

74

Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn

Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC mẫu fucoidan chiết tách từ rong S.oligocystum

75

Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đƣờng đơn phân đoạn F4

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đƣờng đơn phân đoạn F5

76

Kết quả phân tích thành phần monosaccharide, hàm lƣợng sulfate và

uronic axít của mẫu fucoidan thô đƣợc trình bày trên bảng 3.4.

Bảng 3.4. Thành phần hóa học mẫu fucoidan chiết từ rong S.oligocystum

Kí hiệu mẫu

Thành phần đƣờng đơn của

Cacbo

Uronic

2-

SO4

fucoidan (mol %)

hydrate

axit

% w/w**

%

Fuc

Gal

Xyl Man Gluc

% w/w**

w/w**

53,40 23,70 11,40 11,50 nd

32,130 22,300 20,900

PS- S.oligocystum

PS-

42,30 38,30 7,10 8,90 3,40

Chƣa

22,460 21,540

khảo sát

S.oligocystum

(Tác giả Phạm

Đức Thịnh)

** Hàm lƣợng tính theo khối lƣợng của fucoidan;

Các kết quả phân tích trong bảng 3.4 cho thấy hàm lƣợng sulfate và uronic axit của mẫu fucoidan đƣợc chiết tách từ rong S.oligocystum tƣơng ứng là 22,300 % và 20,900 %, kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trƣớc đó đã đƣợc công bố cho loài rong này của tác giả Phạm Đức Thịnh [46]. Kết quả này cho thấy hàm lƣợng uronic axit của polysacharide sunfate từ loài rong này cao hơn nhiều so với hàm lƣợng uronic axit của polysacharide sunfate từ các loài rong nâu nói chung và rong nâu thuộc cùng chi rong Sargassum nói riêng đã nghiên cứu trƣớc đây, điều này có thể đƣợc lý giải là do polysaccharide từ mỗi loài rong khác nhau thƣờng có sự khác biệt về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc.

Kết quả bảng 3.4 cho thấy mẫu fucoidan đƣợc thu nhận từ rong nâu

Sargassum oligocystum trƣớc khi chạy sắc kí phân đoạn ngoài hai thành phần

chính là fucose (53,40%) và galactose (23,70%) còn có thêm các đƣờng đơn

khác với hàm lƣợng nhỏ hơn là mannose (11,50%), xylose (11,40%), không

77

chứa glucose. So với kết quả đã đƣợc công bố về fucoidan của loài rong này,

Phạm Đức Thịnh và cộng sự đã thu nhận đƣợc trong mẫu fucoidan có chứa

các gốc đƣờng fucose (42,30%) và galactose (38,30%), mannose (8,90%),

xylose (7,10%) và đặc biệt có chứa thêm một lƣợng nhỏ glucose (3,40%).

Nhƣ vậy, chúng ta có thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đƣờng trong cùng một

loài rong nhƣng ở những thời điểm nghiên cứu khác nhau là không giống

nhau và đặc biệt theo nhóm tác giả này, thành phần đƣờng của các phân đoạn

của fucoidan rong S. oligocystum có chứa gốc đƣờng glucose, trong khi đó,

thành phần đƣờng đơn từ mẫu fucoidan của cùng loài rong này, tôi không

nhận thấy sự có mặt của gốc đƣờng glucose. Nhƣ vậy, hàm lƣợng các gốc

đƣờng này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong khác nhau. Các kết

quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trƣớc đó về sự đa dạng của

thành phần hóa học của fucoidan. Kết quả phân tích thành phần đƣờng chỉ ra

rằng fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau,

các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng

khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đƣờng đơn. Những đặc

điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng nhƣ hoạt tính sinh học của fucoidan,

nhƣng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của fucoidan

trở nên vô cùng phức tạp. Đó chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới

mới chỉ có một vài công bố về cấu trúc hoàn chỉnh của fucoidan, nhƣng

không một công bố nào đƣa ra đƣợc mối liên hệ có tính quy luật cho cấu trúc

fucoidan với các bộ rong.

Sự khác nhau này có thể đƣợc giải thích do sự khác nhau về vị trí và

thời gian thu mẫu.Điều này cho thấy thành phần cũng nhƣ đặc điểm cấu trúc

của fucoidan vô cùng phức tạp.

Tuy nhiên, phần lớn các fucoidan của các loài rong tại các vùng biển

Việt Nam đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lƣợng sulfate cao, hai

78

gốc đƣờng fucose và galactose luôn chiếm hàm lƣợng lớn hơn so với các gốc

đƣờng khác, với đặc điểm này chúng đƣợc gọi là các galactofucan sulfate

hóa.

So với fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới nhƣ Nga,

Nhật Bản, Hàn Quốc,... thì fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác

biệt lớn về thành phần các đƣờng đơn. Đó là hàm lƣợng fucose thấp hơn.

Fucoidan phân lập từ một số loài rong nâu của vùng Viễn Đông, L.B.Nga có

hàm lƣợng fucose cao hơn rất nhiều nhƣ fucoidan chiết tách từ rong Fucus

evanescens, Laminaria japonica và Laminaria cichorioides có hàm lƣợng

fucose lần lƣợt là 88%, 86% và 100% [37,53], hay fucoidan chiết từ rong

Hizikia fusiformis (Nhật Bản) hàm lƣợng fucose chiếm 80% [94], fucoidan

của từ rong Sargassum stenophyllum (Brazil) hàm lƣợng fucose chiếm

67,8%, hiện nay loại fucoidan duy nhất đƣợc bán thƣơng mại bởi hãng hóa

chất Sigma (Mỹ) đƣợc chiết từ rong Fucus vesiculosus có hàm lƣợng fucose

chiếm 100%. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của

fucoidan trong các loài rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong

Sargassum của Việt Nam và của Brazil cũng có thành phần rất khác nhau.

Nhìn chung fucoidan của rong nâu sinh trƣởng ở vùng biển ôn đới thƣờng có

thành phần đƣờng tƣơng đối đơn giản, chúng hầu nhƣ chỉ có một gốc đƣờng

fucose và một lƣợng rất nhỏ các đƣờng đơn khác. Trong khi đó fucoidan của

rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn

thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đƣờng

fucose và galactose cùng với một lƣợng nhỏ các gốc đƣờng khác nhƣ

rhamnose, xylose, mannose, glucose, [18,46,69,80,81]. Sự khác nhau về thành

phần và hàm lƣợng các đƣờng đơn của fucoidan từ các loài rong khác nhau

một lần nữa khẳng định rằng điều kiện môi trƣờng có ảnh hƣởng rất lớn đến

quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong nâu.

79

Bảng 3.5. Thành phần hóa học các phân đoạn chiết từ rong S.oligocystum

Thành phần đƣờng đơn của fucoidan

2-

Uronic

SO4

(mol %)

Cacbo hydrate

axit

Kí hiệu mẫu

% w/w**

% w/w**

%

Fuc

Gal

Xyl Man Gluc

w/w**

F1

-

-

-

-

-

49,100 18,900 10,200

F2

-

-

-

-

-

42,900 19,400 3,200

F3

-

-

-

-

-

38,660 20,700 5,230

F4

52,00

24,00

9,00 11,00 2,00

52,800 46,200

1,20

F5

72,00

21,00

2,00 2,00 1,00

43,020 36,000 0,100

Kí hiệu - : Không khảo sát

Hàm lƣợng thu nhận 2 phân đoạn F4 và F5 lần lƣợt là 28,0 % và 25,5 % so với khối lƣợng mẫu fucoidan đƣợc tiến hành tách phân đoạn (Bảng 3.3). Về thành phần hóa học, cả hai phân đoạn này đều chứa nhiều gốc đƣờng khác nhau trong đó fucose và glactose chiếm hàm lƣợng chủ yếu. Tỉ lệ giữa Fuc:Gal trong phân đoạn F4 là (~2:1) và F5 là (~3,4:1), ngoài ra còn chứa một lƣợng nhỏ các gốc đƣờng mannose, xylose và glucose. Nhƣ vậy, có thể dự đoán về khung monosaccharide trong hai phân đoạn fucoidan này là giống nhau, cả 2 phân đoạn fucoidan đều có chứa đồng thời cả 5 gốc đƣờng với các tỉ lệ khác nhau chứng tỏ các fucoidan này có cấu trúc rất phức tạp và độ lặp lại không cao. Bên cạnh thành phần là các gốc đƣờng, hai phân đoạn này còn chứa cả các gốc sulfate và uronic axit. Tuy nhiên, so với hàm lƣợng sulfate của mẫu fucoidan thô trƣớc khi tách phân đoạn thì hàm lƣợng sulfate hai phân đoạn F4, F5 tăng cao hơn nhiều tƣơng ứng là 46,2 % và 36,0%. Ngƣợc lại hàm lƣợng uronic axit của F4, F5 lại giảm đi đáng kể so với mẫu lần lƣợt là 1,20% và 0,10%. Kết quả này cho thấy hai phân đoạn F4, F5 là các polysaccharide sulfate hóa cao hơn so với một số phân đoạn fucoidan từ các loài rong nâu khác đã công bố trƣớc đây [19,69]

80

Vì các phân đoạn F1, F2, F3 hàm lƣợng thu đƣợc rất thấp nên chúng tôi không tiến hành phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn này. Hai phân đoạn F4 (28,0%) và F5 (25,5%) có hàm lƣợng cao nhất, bên cạnh đó hàm lƣợng sunfate của hai phân đoạn này cũng cao hơn so với 3 phân đoạn F1, F2, F3 đƣợc lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và các đặc điểm cấu trúc.

3.3. ĐẶC TRƢNG CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN

3.3.1. Các đặc trƣng cấu trúc thu đƣợc từ phổ hồng ngoại IR

Theo các tài liệu đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của fucoidan nhƣ thành phần đƣờng đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đƣờng, hàm lƣợng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đƣờng,... trong đó hàm lƣợng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đƣờng là những yếu tố có ảnh hƣởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của fucoidan. Sulfate là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định hoạt tính sinh học của fucoidan, theo các nhà khoa học, hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng ung thƣ của fucoidan phụ thuộc vào mật độ và vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đƣờng [32]. Vì vậy, việc phân tích hàm lƣợng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đƣờng trong phân tử fucoidan sẽ giúp ta làm sáng tỏ về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và đặc trƣng cấu trúc của chúng. Phổ hồng ngoại IR là một trong những phƣơng pháp đơn giản nhất thƣờng đƣợc sử dụng để xác định vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đƣờng .

Phổ hồng ngoại là phƣơng pháp phân tích nhanh và thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vạch phổ dao động tƣơng ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử. Trong phân tích cấu trúc của polysaccharide, phƣơng pháp phổ IR cho biết các thông tin về vị trí nhóm sulfate tồn tại trong phân tử fucoidan, từ đó cho biết về đặc trƣng cấu trúc của chúng. Theo các tài liệu tham khảo [26,79,80], các dao động hấp thụ ở vùng số sóng 820-828 cm-1 đặc trƣng cho liên kết C-O-S ở vị trí equatorial C2 hoặc/và C3, vùng 840-848 cm-1 đặc trƣng cho liện kết C-O-S ở vị trí axial C4, vùng 1240-1272 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của S = O, vùng 1610-1625 cm-1 và 1410 cm-1 đặc trƣng cho dao động đối xứng và không đối

81

xứng của nhóm cacboxylat [26,79,80].

Khi khảo sát phổ IR hai phân đoạn F4, F5 chúng tôi nhận thấy tƣơng tự nhƣ phổ hồng ngoại của fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới và ở Việt Nam, phổ hồng ngoại của các phân đoạn F4 và F5 chiết từ rong nâu Sargassum oligocystum tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa cũng chứa những tín hiệu hấp thụ ở vùng 1240-1272 cm-1 (vùng dao động đặc trƣng của liên kết S = O) và vùng 800-848 cm-1 (vùng dao động của liên kết C - O - S) khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate.

Trên phổ IR của phân đoạn F4 (hình 3.8) xuất hiện các tín hiệu hấp thụ tại 3453,84 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ rộng tại 1254 cm-1 thuộc về các dao động hóa trị S=O của nhóm sulfate (S=O) là đặc trƣng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1643,92 cm−1 xác nhận sự có mặt của các axit uronic[80]. Dải hấp thụ tại 841,77 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C4 và/hoặc C-2, C-3 của vòng pyranose[28]. Dải hấp thụ ở 1053,77 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal [95].

Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4(Sargassum oligocystum)

Phổ IR của phân đoạn F5 (hình 3.9): Dải hấp thụ tại 3417,06 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ tại 1227,03 cm-1 (S=O) là đặc trƣng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1639,13 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic

82

axit [80]. Dải hấp thụ tại 854,86 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C-4 và/hoặc C-2, C-3 của vòng pyranose[28]. Dải hấp thụ ở 1056,76 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal [95].

Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F5(Sargassum oligocystum)

Nhƣ vậy, phổ IR cho ta biết sự có mặt của nhóm sulfate trong tất cả các mẫu fucoidan nghiên cứu và thông tin về vị trí của chúng trong các gốc đƣờng pyrannose thông qua dao động của liên kết C-O-S. Tƣơng tự nhƣ fucoidan của các loài rong nâu khác thuộc cùng chi Sargassum sinh trƣởng ở Việt Nam, nhóm sulfate của các phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum oligocystum chủ yếu ở vị trí C-4 và/hoặc C-2,C-3 của các gốc đƣờng pyranose.

Qua kết quả phân tích phổ hồng ngoại một lần nữa khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử fucoidan, điều này cũng phù hợp với các kết quả phân tích thành phần monosaccharide ở bảng 3.3. Tuy nhiên phổ IR cũng chỉ cho biết một phần thông tin về vị trí nhóm sulfate chiếm ƣu thế tại vị trí C-4, hay vị trí C-2, C-3 trên gốc đƣờng pyranose, để xác định chính xác vị trí của các nhóm sulfate chúng ta cần thêm những thông tin từ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR.

83

3.3.2. Các đặc trƣng cấu trúc thu đƣợc từ phổ cộng hƣởng từ hạt

nhân NMR

* Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR:

Kết quả đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của các mẫu phân đoạn fucoidan đƣợc chỉ ra trên hình 3.10, hình 3.11. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của các polysaccharide nói chung và của fucoidan nói riêng đều hết sức phức tạp với độ phân giải không cao do có rất nhiều pic trùng chập và chen lấn nhau. Vì vậy, rất khó để giải thích thỏa đáng các tín hiệu trên phổ 1H- NMR. Mặc dù vậy, cũng giống nhƣ các loại fucoidan đã đƣợc công bố trƣớc đó, trên phổ proton 1H-NMR có những tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng để nhận biết fucoidan, đó là các tín hiệu xuất hiện trong vùng anomeric (5,0-5,5 ppm) của H1 và ở vùng trƣờng cao 1,2-1,5 ppm của proton H6 của vòng α-L- Fucopyranose.

Để thu đƣợc phổ NMR có độ phân giải tốt mẫu fucoidan đƣợc tiến hành thủy phân nhẹ với điều kiện đƣa ra trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Phổ 1H-NMR của fucoidan phân đoạn F4 và F5 (hình 3.10, hình 3.11), tƣơng tự nhƣ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của fucoidan từ các loài rong nâu đã nghiên cứu trƣớc đây. Phổ 1H-NMR của hai phân đoạn F4, F5 thu đƣợc có các tín hiệu proton vùng anomeric ở khoảng 5,0-6,0 ppm, các tín hiệu trong vùng 4,0-5,0 ppm là thuộc về proton H2-H5 của vòng pyranose [26,27,95]. Các tín hiệu mạnh trong vùng trƣờng cao với độ dịch chuyển hóa học từ 1,6-1,7 ppm là các tín hiệu đặc trƣng cho nhóm metyl - CH3 của vòng L-fucose. Bên cạnh đó trên phổ 1H-NMR cũng xuất hiện các tín hiệu xác nhận sự có mặt của gốc đƣờng galactose thông qua các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 4,5 ppm và 5,5 ppm đặc trƣng cho proton H6 và H1 của vòng β-D-galactose.Qua đó cho thấy tất các các tín hiệu nói trên chứng minh mẫu phân đoạn F4 và F5 thu nhận đƣợc là fucoidan. Kết hợp các phổ IR và NMR cùng với kết quả phân tích thành phần hóa học có thể nhận thấy hai phân đoạn F4 và F5 thuộc nhóm galactofucan sulfate.

84

C6 α-L-Fup

C6 α-L-Fup

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F4

Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F5

* Phổ 13C-NMR:

Kết quả đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của phân đoạn F4 đƣợc đƣa ra trên hình 3.12.

85

α-L-Fucp-C2-C5

OAc(CH3)

C6-D-Galp

Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4

α-L-Fucp-C2-C5

β-D-Galp-C6

α-L-Fucp-C1

OAc(CH3)

Hình 3.12. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4

Giống nhƣ nhiều fucoidan rong biển khác trên thế giới đã đƣợc công bố, fucoidan rong nâu ở Việt Nam cũng có phổ 13C-NMR rất phức tạp với nhiều vùng tín hiệu trùng lặp lên nhau do trong phân tử của chúng đƣợc cấu

86

13

tạo bởi các gốc đƣờng fucose (C6H12O5) và hexose (C6H12O6) khác nhau, điều này rất khó để giải thích đƣợc một cách đầy đủ về cấu trúc của chúng. Trên phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 có những đặc điểm đặc trƣng cho cấu trúc của gốc α-L-Fucp đó là và các tín hiệu trong vùng trƣờng thấp 97-102 ppm đặc trƣng cho cacbon α-anomeric (C1) của gốc đƣờng 1→3)-α-L- fucopyranose, vùng tín hiệu 67-86 ppm là vùng của cacbon C2-C5 vòng

C-NMR cũng cho thấy sự có mặt của gốc pyranoid. Bên cạnh đó, phổ đƣờng β-D-Galactose thông qua các tín hiệu đặc trƣng cho cacbon C6 không liên kết và cacbon C1 của gốc β-D-Galactose tƣơng ứng ở độ dịch chuyển hóa học trong vùng 61-62 ppm và 103-104 ppm.

Nhƣ vậy, qua phân tích phổ 13C-NMR chúng tôi thấy rằng các mẫu fucoidan nghiên cứu có đặc trƣng cấu trúc đúng nhƣ dự đoán từ kết quả phân tích thành phần monosaccharide, chúng thuộc nhóm galactofucan sulfate.

Tóm lại: Bằng các phƣơng pháp chiết tách và sắc kí trao đổi ion hai phân đoạn polysaccharide sulfate F4 và F5 đã đƣợc tách chiết và phân đoạn tinh chế từ rong nâu Sargassum oligocystum. Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy hai phân đoạn này thuộc nhóm galactofucan sulfate với tỉ lệ Fuc:Gal lần lƣợt là (2:1) và (3,4:1) và hàm lƣợng sulfate tƣơng ứng là 46,2 % (F4) và 36,0 % (F5). Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại và cộng hƣởng từ hạt nhân cũng cho thấy là phổ đặc trƣng của fucoidan sulfate hóa cao với nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 của vòng pyranose và một lƣợng nhỏ ở các vị trí C2 và/hoặc C3. Kiểu liên kết chính giữa các gốc đƣờng là liên kết 1→3)-α-L-Fucp.

87

2 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu các kết quả chính của đề tài đạt đƣợc nhƣ sau:

1. Fucoidan đã đƣợc phân lập và tách phân đoạn từ loài rong nâu Sargassum oligocystum đƣợc thu hoạch ở vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Hàm lƣợng fucoidan thu nhận đƣợc theo phƣơng pháp chiết với dung môi axit nhẹ (pH = 2) là 1,8%. Kết quả tách phân đoạn bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion cho ra 05 phân đoạn fucoidan theo garadient tăng dần nồng độ của dung môi rửa giải NaCl (0-2N) lần lƣợt là F1 (NaCl 0,5N), F2 (NaCl 0,8N), F3 (NaCl 1N), F4 (NaCl 1,2N) và F5 (NaCl 1,5N). Trong đó, hai phân đoạn chiếm hàm lƣợng lớn nhất là F4 (28,00%) và F5 (25,50%).

2. Thành phần monosaccharide chính của fucoidan tổng là fucose (53,40%) và galactose (23,70%) bên cạnh đó còn có một lƣợng nhỏ các gốc đƣờng khác nhƣ xylose (11,40%), manose (11,50%). Hàm lƣợng sulfate và uronic axit lần lƣợt là 23,10%; 20,90%. Kết quả phân tích thành phần hóa học của hai phân đoạn fucoidan đại diện F4, F5 so với fucoidan tổng cho thấy tỉ lệ giữa gốc đƣờng fucose tăng lên so với các gốc đƣờng còn lại, hàm lƣợng sulfate tăng lên gấp hơn hai lần 46,20% (F4) và hơn 1,5 lần 36,00% (F5). Ngƣợc lại, hàm lƣợng uronic axit của hai phân đoạn F4 và F5 giảm đi rất nhiều so với mẫu fucoidan tổng trƣớc phân đoạn tƣơng ứng là 1,20% và 0,10%.

3. Đặc trƣng cấu trúc của hai phân đoạn fucoidan F4, F5 đã đƣợc xác định, hai phân đoạn fucoidan này thuộc nhóm galactofucan sulfate, vị trí sulfate trong cả hai phân đoạn chủ yếu ở vị trí C4 của vòng pyranose và một lƣợng nhỏ ở vị trí C2 và/hoặc C3. Kiểu liên kết chính giữa các gốc đƣờng là liên kết 1→3)-α-L-Fucp.

4.2. KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu phân tích chi tiết cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong S.oligocystum và từ các loài rong nâu khác của Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính kháng ung thƣ và

88

các hoạt tính sinh học khác từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên rong nâu của Việt Nam.

2. Nghiên cứu chuyển hóa fucoidan bằng con đƣờng xúc tác sinh học (chuyển hóa bằng enzyme) để tạo ra các sản phẩm oligo-fucoidan mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu hơn và mạnh hơn sử dụng cho mục đích làm thuốc hoặc thực phẩm chức năng.

89

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Lê Đỗ Thùy Vi, Bùi Văn Nguyên, Lê Công Hoan, Trần Thị Thanh Vân, Võ Thành Trung, Phạm Trung Sản, Phạm Đức Thịnh. Thành phần và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate tách chiết từ rong nâu Sargassum oligocystum ở Việt Nam. ạp ch hóa học, 2019, 57(4E1,2), tr.60-64.

90

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thành phần loài và phân bố chi rong nâu Sargassum tại các vùng biển Khánh Hòa

Phụ lục 2. Hình dạng rong Sargassum oligocystum

Phụ lục 3. Độ dịch chuyển hóa học của C và H trong một số gốc đƣờng

Phụ lục 4. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum

Phụ lục 5. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn

Phụ lục 6. Sắc ký đồ HPLC mẫu fucoidan chiết tách từ rong Sargassum oligocystum

Phụ lục 7. Sắc ký đồ HPLC phân đoạn F4 của fucoidan chiết tách từ rong Sargassum oligocystum

Phụ lục 8. Sắc ký đồ HPLC phân đoạn F5 của fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum oligocystum

Phụ lục 9. Phổ IR phân đoạn F4 của fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum oligocystum

Phụ lục 10. Phổ IR phân đoạn F5 của fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum oligocystum

Phụ lục 11 . Phổ 1H-NMR phân đoạn F4 của fucoidan chiết tách từ rong nâu Sargassum oligocystum

Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR phân đoạn F5 của fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum oligocystum

Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR phân đoạn F4 của fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum oligocystum

Phụ lục 14. Kết quả đo mật độ quang và công thức tính hàm lƣợng carbohydrate mẫu fucoidan thô chiết từ dung môi H2O, HCl 0,01N và CaCl2 2%

91

Phụ lục 15. Kết quả đo mật độ quang và công thức tính hàm lƣợng sulfate mẫu fucoidan thô chiết từ dung môi H2O, HCl 0,01N và CaCl2 2%

Phụ lục 16. Kết quả đo mật độ quang và công thức tính hàm lƣợng uronic axit mẫu fucoidan thô chiết từ dung môi H2O, HCl 0,01N và CaCl2 2%

Phụ lục 17. Kết quả đo mật độ quang và công thức tính hàm lƣợng carbohydrate các phân đoạn fucoidan chiết từ HCl 0,01N

Phụ lục 18. Kết quả đo mật độ quang và công thức tính hàm lƣợng sulfate các phân đoạn fucoidan chiết từ HCl 0,01N

Phụ lục 19. Kết quả đo mật độ quang và công thức tính hàm lƣợng uronic axit các phân đoạn fucoidan chiết từ HCl 0,01N

92

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Usov. A. I, Bilan. M. I, 2009, Fucoidans-sulfated polysaccharides of

brown algae, Russian Chemical Reviews, 78 (8), pp. 785-799.

2.

Park, Y.H., Jang D.S. and Kim S.B, 1997a, Utilization of marine products (2nd edition); Chapter 4, Seaweed composition, Hyoungsul press, pp. 283-336.

3. Micheline, R.S.; Cybelle, M.; Celina, G.D.; Fernando, F.S.; Hugo, O.R.;Edda, L, 2007, Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds, J. Appl. Phycol. 19, pp.153-160.

applications indusppial fucose rich of

4. Wijesinghea W.A.J.P., Jeon Y. J, 2012, Biological activities and sulfated potential polysaccharides and fucoidans isolated from brown seaweeds: A review, Carbohydrate Polymers, 88, pp. 13–20.

5. Nguyễn Hữu Dinh và Huỳnh Quang Năng, 2001, Năm loài mới thuộc chi rong Mơ - Sargassum ở ven biển Việt Nam. ạp ch Sinh học, 23 (1), tr. 1-10.

6. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí, 2003, Một số loài rong biển mới bổ sung cho Việt Nam - Phần II, u ển tập Nghiên c u biển, 13, tr. 95- 114.

7. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí , 2002, Một số loài rong biển mới bổ sung cho khu hệ rong biển Việt Nam - Phần I, u ển tập Nghiên c u biển, 12, tr. 149-158 .

8. Phạm Hoàng Hộ, 1969, Rong biển Việt Nam - Phần III.

Phaeophyceae, NXB Trung tâm học liệu Sài Gòn.

9. Nguyễn Hữu Đại, 1997, Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam: Nguồn

lợi và sử dụng, NXB N ng nghiệp P ồ Ch Minh, tr. 198.

10. Nguyễn Hữu Đĩnh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn

Tiến, 1993, Rong biển miền Bắc Việt Nam, Nhà XB KHKT, Hà Nội.

93

11. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh, 2004, Tiềm năng rong biển Việt

Nam, NXBKHKT, Hà Nội.

12. Li Bo, Fei Lu, Xinjun Wei and Ruixiang Zhao, 2008, Fucoidan:

Structure and Bioactivity, Molecules, 13, pp. 1671-1695.

13. Huynh QN, Nguyen HD, 1998, The seaweed resources of Vietnam, In

Critchley AT, Ohno M, Seaweed Resources of the World. Japan

International Cooperation Agency, Yokosuka, pp. 62-69.

14. Ngô Quốc Bƣu, Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Bùi Minh

Lý và cs, 1999, Báo cáo nghiệm thu đề tài Điều tra cơ bản: “Hiện trạng

và nguồn lợi rong biển kinh tế ven biển phía Nam Việt Nam”, Nghiệm

thu tại ội ồng cấp trung tâm K N và CNQG à Nội, tr. 1-41.

15. Zvyagintseva Tatiana. N, Nataliya M. Shevchenko, Alexander O.

Chizhov, Tatiana N. Krupnova, Elena V. Sundukova, Vladimir V.

Isakov, 2003, Water-soluble polysaccharides of some far-eastern

brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the

developmental conditions, J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 294, pp. 1-13.

16. Kylin, H, 1913, Zur biochemie der Meersalgen, Z. Physiol, Chem,

83, pp. 171 -197.

17. Ejaz Hussain, Li-Jun Wang, Bo Jiang, Saba Riaz, Ghazala Yasmeen

Buttd and Da-Yong Shia, 2015, Components of brown seaweeds are

potential candidate for cancer therapy - a review, RSC Advances, pp. 1-

22.

18. Hồ Đức Cƣờng, 2014, Nghiên c u cấu tr c và khảo sát hoạt t nh sinh

học c a fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu Sargassum

henslowianun và Sargassum swartzii c a Việt Nam, Luận án Tiến sĩ

Hóa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

94

19. Park, Y.H., Jang D.S. and Kim S.B, 1997, Utilization of marine

products (2nd edition); Chapter 4, Seaweed composition, Hyoungsul

press, pp. 283-336.

20. Koo Jae-Geun, 199, Structural Characterization of Purified Fucoidan

from Laminaria religiosa, Sporophylls of Undaria pinnatifida, Hizikia

fusiforme and Sagassum fulvellum in Korea, Korean Journal of

Fisheries and Aquatic Sciences, Volume 30, Issue 1, pp. 128-131.

21. Li, B.; Xu, S.Y, 2007, Structural investigation of oligosaccharides in

partial acid hydrolyzed products of fucoidan isolated from Hizikia

fusiforme, Nat. Prod. Res. Dev, 19, pp. 550-553.

22. Percival, E.G.V. and Ross, A.G, 1950, Fucoidin Part I: The isolation

and purification of fucoidin from brown seaweeds. Journal of the

Chemical Society, pp. 717-720.

23. Percival, E. and McDowell, R.H, 1967, Chemistry and enzymology of

marine algal polysaccharides, Academic Press, London and NEW

YORK, pp. 6-28 & 73-96 &157-174.

24. Dillon T., Kristensen, K. and O'hEcoha, C, 1953, The seed mucilage

of Ascophyllum nodosum, Proceedings of the Royal Irish Academy,

Section B: Biological, Geological, and Chemical Science, 55, pp. 189-

194.

25. M.I.Bilan, E.V.Vinogradova, E.A.Tsvetkova, A.A.Grachev,

A.S.Shashkov, N.E, A.I.Usov, 2008, A sulfated glucuronofucan

containing both fucofuranose and fucopyranose residues from the

brown alga Chordaria flagelliformis. Carbohydrate Research, 343

(15), pp. 2605-2612.

26. Bilan. M.I., Grachev. A.A., Shashkov. A.S, Thuy. T.T.T, Van. T.T.T,

Ly. B.M, Nifantiev. N.E, Usov. A.I, 2013, Preliminary investigation of

95

a highly sulfateed galactofucan fraction isolated from the brown alga

Sargassum polycystum, Carbohydrate Research, 377, pp. 48-57.

27. Chevolot, L.; Mulloy, B.; Racqueline, J, 2001, A disaccharide repeat

unit is the structure in fucoidans from two species of brown algae,

Carbohydrate Research, 330, pp. 529-535.

28. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Ustuzhanina, N.E.; Shashkov, A.S.;

Nifantiev, N.E.; Usov, A.I, 2004, A Highly regular fraction of a

fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L, Carbohydrate

Research, 339, pp. 511-517.

29. Nishino, T., Nishioka, C., Ura, H. and Nagumo, T, 1994, Isolation

and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan

sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan, Carbohydrate

Research, 255, pp. 213-224.

30. Nishino, T., Aizu, Y., & Nagumo, T, 1991, The influence of sulfate

content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown

seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity, Thrombosis

Research, 64(6), pp. 723-731.

31. Seng Joe Lim, Wan Mustapha, Wan AidaMohamad, Yusof Maskat

Jalifah, Latip Khairiah, Haji Badri, Osman Hassan, Bohari M.Yamin,

2016, Characterisation of fucoidan extracted from Malaysian

Sargassum binderi, Food Chemistry, 209(15), pp. 267-273.

32. Chevolot, L.; Foucault, A.; Chauber, F, 1999, Further data on the

structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant

activitity, Carbohydrate Research, 319, pp. 154-165.

33. Daniel, R., Berteau, O., Chevolot, L., Varenne, A., Gareil, P. and

Goasdoue, N, 2001, Regioselective desulfateion of sulfated L-

fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten

maximus: Application to the structural study of algal fucoidan

96

(Ascophyllum nodosum), European Journal of Biochemistry, 268, pp.

5617-5626.

34. Daniel, R.; Chevolot L.; Carrascal M.; Tissot, B.; Mourão, P.A.S.;

Abian, J, 2007, Electrosprayionization mass spectrometry of

oligosaccharides derived from fucoidan of Ascophyllum nodosum,

Carbohydrate Research. 342, pp. 826-834.

35. Nagaoka, M., Shibata, H., Kimura-Takagi, I., Hashimoto, S., Kimura,

K., Makino, T., Aiyama, R., Ueyama, S., and Yokokura, T, 1999,

Structural study of fucoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida,

Glycoconj. J. 16 (1), pp. 19-26.

36. Daniel, R.; Berteau, O.; Jozefonvicz, J.; Goasdoue, N, 1999,

Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) fucoidan by an enzymatic

activity contained in digestive glands of the marine mollusk Pecten

maximus, Carbohydrate Research, 322, pp. 291-297.

37. Bilan, M.I, Grachev A.A., Ustuzhanina N.E, 2002, Structure of a

fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C. Ag,

Carbohydrate Research, 337, pp. 719-730.

38. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.; Usov,

A.I, 2006, Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus

serratus L. Carbohydrate Research, 341, pp. 238-245.

39. Qiu, X.D.; Amarasekara, A.; Doctor, V, 2006, Effect of

oversunphation on the chemical and biological properties of fucoidan,

Carbohydrate Polymers, 63, pp. 224-228.

40. Hemmingson, J.A.; Falshaw, R.; Furneaux, R.H.; Thompson, K,

2006, Structure and antiviral activity of the galactofucan sunphates

exppacted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol, 18,

pp. 185-193.

97

41. Mandal, P.; Mateu, C.G.; Chattopadhyay, K.; Pujol, C.A.; Damonte,

E.B.; Ray, B, 2007, Structural features and antiviral activity of

sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica. Antivir,

Chem. Chemother, 18, pp. 153-162.

42. Silva, T.M.A.; Alves, L.G.; Queiroz, K.C.S.; Santos, M.G.L.;

Marques, C.T.; Chavante, S.F.; Rocha, H.A.O.; Leite, E.L, Partial

characterization and anticoagulant activity of a heterofucan from the

brown seaweed Padina gymnospora, Braz. J. Med. Biol. Res, 38, pp.

523-533.

43. Dohura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.;

Iha, M, 2007, Prophylactic effect of dietary seaweed fucoidan against

enteral prion infection, Antimicrob. Agents Chemother, 51, pp. 2274-

2277.

44. Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M, 1989, Isolation and

preliminary characterization of fucose-containing sunphated

polysaccharides with blood-anticoagulant activity from seaweed

Hizikia fusiforme, Carbohydrate Research, 194, pp. 315-320.

45. Nishino, T.; Yokoyama, G.; Dobahi, K, 1989, Isolation, purification

and characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides

from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-

anticoagulant activities, Carbohydrate Research, 186, pp. 119-129.

46. Phạm Đức Thịnh, 2015, Nghiên c u phân t ch thành phần, cấu tr c

hóa học c a fucoidan có hoạt t nh sinh học từ một số loài rong nâu ở

Vịnh Nha Trang, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

47. Mourão, P.A.S, 2004, Use of sunphated fucans as anticoagulant and

antithrombotic agents: future perspectives, Curr. Pharmaceut, Des,

10, pp. 967-981.

98

48. Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B, 2003, Fucoidans from

the brown seaweed Adenocystis uppicularis: extraction methods,

antiviral activity and structural studies, Carbohydrate Research, 338,

pp. 153-165.

49. Hemmingson, J.A., Falshaw, R, Furneaux, R.H, Thompson, K, 2006,

Structure and antiviral activity of the galactofucan sunphates

exppacted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol,

18, pp. 185-193.

50. Mandal, P.; Mateu, C.G.; Chattopadhyay, K.; Pujol, C.A.; Damonte,

E.B.; Ray, B, 2007, Structural features and antiviral activity of

sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica, Antivir,

Chem. Chemother, 18, pp. 153-162.

51. Hayashi, K.; Nakano, T.; Hashimoto, M.; Kanekiyo, K.; Hayashi, T,

2008, Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria

pinnatifida against herpes simplex virus infection, Int,

Immunopharmacol, 8, pp. 109-116.

52. Doh-ura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.;

Iha, M, 2007, Prophylactic effect of dietary seaweed fucoidan against

enteral prion infection, Antimicrob, Agents Chemother, 51, pp. 2274-

2277.

53. Shi, Z.Y.; Guo, Y.Z.; Wang, Z, 2000, Pharmacological activity of

fucoidan from Laminaria japonic, J. Shanghai Fish. Univ, 9, pp. 268-

271.

54. Aisa, Y.; Miyakawa, Y.; Nakazato, T.; Shibata, H.; Saito, K.; Ikeda,

Y.; Kizaki, M, 2004, Fucoidan induces apoptosis of human HS-Sultan

cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of

ERK pathways, Am. J. Hematol. 78, pp. 7-14.

99

55. Cumashi, A.; Ushakova, N.A.; Preobrazhenskaya, M.E.; D'Incecco,

A.; Piccoli, A.; Totani, L.; Tinari, N.; Morozevich, G.E.; Berman, A.E.;

Bilan, M.I.; Usov, A.I.; Nadezhda E.; Grachev, A.A.; Sanderson, C.J.;

Kelly, M.; Rabinovich, G.A.; Iacobelli, S, 2007, A comparative study

of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and

antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown

seaweeds, Glycobiology, 17, pp. 541-552.

56. Haneji, K.; Matsuda, T.; Tomita, M.; Kawakami, H.; Ohshiro, K.;

Uchihara, J.; Masuda, M.; Takasu, N.; Tanaka, Y.; Ohta, T.; Mori, N,

2005, Fucoidan exppacted from Cladosiphon okamuranus Tokida

induces apoptosis of human T-Cell leukemia virus type 1-infected T-

Cell lines and primary adult T-Cell leukemia cells, Nuppit, Cancer, 52,

pp. 189-201.

57. Maruyamaa, H.; Tamauchib, H.; Iizuka, M.; Nakano, T, 2006, The

role of NK cells in antitumor activity of dietary fucoidan from Undaria

pinnatifida Sporophylls (Mekabu), Planta Med, 72, pp. 1415-1417.

58. Wijesinghe, W. A. J. P., & Jeon, Y. J, 2011b, Biological activities

and potential cosmeceutical applications of bioactive components from

brown seaweeds: a review, Phytochemisppy Reviews, 10, pp. 431–443.

59. Wu, X.W.; Yang, M.L.; Huang, X.L.; Yan, J.; Luo, Q, 2004, Effect

of Laminaria japonica polysaccharides on radioprotection and splenic

lymphocyte apoptosis, Med. J. Wuhan Univ, 25, pp. 239-241.

60. Shimizu, J.; Wada-Funada, U.; Mano, H.; Matahira, Y.; Kawaguchi,

M.; Wada, M, 2005, Proportion of murine cytotoxic T cells is

increased by high molecular-weight fucoidan exppacted from

Okinawa mozuku (Cladosiphon okamuranus), J. Health Sci,51, pp.

394-397.

100

61. Kima, M.H.; Joo, H.G, 2008, Immunostimulatory effects of

fucoidan on bone marrow-derived dendritic cells, Immunol. Lett, 115,

pp. 138-143.

62. Li, D.Y.; Xu, Z.; Huang, L.M.; Wang, H.B.; Zhang, S.H, 2001,

Effect of fucoidan of L. japonica on rats with hyperlipidaemia, Food

Sci, 22, pp. 92-95.

63. Li, D.Y.; Xu, Z.; Zhang, S.H, 1999, Prevention and cure of fucoidan

of L. japonica on mice with hypercholesterolemia, Food Sci, 20, pp.

45-46.

64. Fu, X.Y.; Xue, C.H.; Ning, Y.; Li, Z.J.; Xu, J.C, 2004, Acute

antihypertensive effects of fucoidan oligosaccharides prepared from

Laminaria japonica on renovascular hypertensive rat, J. Ocean Univ.

Qingdao, 34, pp. 560-564.

65. Saito, A., Yoneda, M.,Yokohama, S, Okada, M, Haneda, M,

Nakamura, K, 2006, Fucoidan prevents concanavalin A-induced liver

injury through induction of endogenous IL-10 in mice, Hepatol

Research, 35(3), pp. 190-198.

66. Kawano, N.; Egashira, Y.; Sanada, H, 2007, Effect of dietary fiber

in edible seaweeds on the development of D-galactosamine-induced

hepatopathy in rats, J. Nupp. Sci. Vitaminol. (Tokyo), 53, pp. 446-

450.

67. Hayashi, K.; Nakano, T.; Hashimoto, M.; Kanekiyo, K.; Hayashi, T,

2008, Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria

pinnatifida against herpes simplex virus infection, Int.

Immunopharmacol, 8, pp. 109-116.

68. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Nguyễn

Mạnh Cƣờng, Trần Văn Sung, 2009, Nghiên cứu fucoidan có hoạt

101

tính gây độc tế bào tách từ rong nâu Sargasum swartzii bằng phƣơng

pháp phổ khối nhiều lần, ạp ch óa học ,47 (3), tr. 300 - 307.

69. Nguyễn Duy Nhứt, 2008, Nghiên c u thành phần hóa học và hoạt

t nh sinh học c a pol saccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh

Khánh Hòa, Luận án tiến sỹ Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.

70. M. I. BilanA. N. ZakharovaA. A. GrachevA. S. ShashkovN. E.

NifantievA. I. Usov, 2007, Polysaccharides of algae: 60. Fucoidan

from the pacific brown alga Analipus japonicus (Harv.) winne

(Ectocarpales, Scytosiphonaceae), Russian Journal of Bioorganic

Chemisppy, Volume 33, Issue 1, pp. 38–46.

71. Marais Marie-France , Jean-Paul Joseleau, 2001, A fucoidan

fraction from Ascophyllum nodosum, Carbohydrate Research, 336

(2), pp. 155-159.

72. Chizhov, A.O.; Dell, A; Morris, H.R, 1999, A study of fucoidan

from the brown seaweed Chorda filum, Carbohydrate Research, 320,

pp. 108-119.

73. Usov A. I. ; Smirnova G. P. ; Bilan M. I., 1998, Polysaccharides of

brown alga Laminaria Saccharina (l.) lam. asa source of fucoidan,

Bioorganic chemisppy, 24 (6), pp. 437-445.

74. Adhikari Utpal Cecilia, G.Mateu, KausikChattopadhyay, Carlos

A.Pujol, Elsa B.Damonte, BimalenduRay, 2006, Structure and

antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum Marginatum,

Phytochemisppy, 67(22), pp. 2474-2482.

75. Daniel, R., Berteau, O., Chevolot, L., Varenne, A., Gareil, P. and

Goasdoue, N., 2001, Regioselective desulfation of sulfated L-

fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten

maximus, European Journal of Biochemistry, 268, pp. 5617–5626.

102

76. T.NishinoY.AizuT.Nagumo, 1991, The influence of sulfate content

and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed

Ecklonia kurome on its antithrombin activity, Thrombosis Research,

64(6), pp. 723-731.

77. Seng Joe Lim, Wan Mustapha, Wan AidaMohamad, Yusof Maskat

Jalifah Latip Khairiah Haji Badri Osman Hassan Bohari M.Yamin,

2016, Characterisation of fucoidan extracted from Malaysian

Sargassum binderi, Food Chemisppy, 209(15), pp. 267-273.

78. Roza V. Usoltseva, Stanislav D. Anastyuk, Natalia M. Shevchenko, Valerii V. Surits, Artem S. Silchenko, Vladimir V. Isakov, Tatiana N. Zvyagintseva, Pham Duc Thinh, Svetlana P. Ermakova, 2017, Polysaccharides from brown algae Sargassum duplicatum: The structure and anticancer activity in vitro, Carbohydrate Research.

79. Roza V. Usoltseva, Stanislav D. Anastyuk, Irina A. Ishina, Vladimir V. Isakov, Tatiana N. Zvyagintseva , Pham Duc Thinh, Pavel A. Zadorozhny, Pavel S. Dmitrenok, Svetlana P. Ermakova, 2017, Structural characteristics and anticancer activity in vitro of fucoidan from brown alga Padina boryana, Carbohydrate Research.

80. Thuy Thi Thanh Thu, Van Thi Thanh Tran, Yoshiaki Yuguchi, Ly

Minh Bui and Tai Tien Nguyen, 2013, Structure of fucoidan from

brown seaweed Turbina ornata as Studied by Elecppospray ionization

Mass spectrometry (MSIMS) and Small Angle X-ray Scattering

(SAXS) Techniques, Mar.Drugs, 11, pp. 2431-2443.

81. Bùi Văn Nguyên, 2019, Nghiên c u ặc iểm cấu pp c và hoạt t nh sinh học c a ucoidan từ một số loài rong nâu ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

82. Bilan. M.I., Grachev. A.A., Shashkov. A.S, Thuy. T.T.T, Van. T.T.T, Ly. B.M, Nifantiev. N.E, Usov. A.I, 2013, Preliminary investigation of a highly sulfated galactofucan fraction isolated from the brown alga

103

Sargassum aquifolium, Carbohydrate Research, 377, pp. 48-57.

83. Zvyagintseva, T.N.; Shevchenko, N.M.; Popivnich, I.B, 1999, A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydrate Research, 322, pp. 32-39.

84. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., and Smith, F. 1956, Colorimeppic method for determination of sugars and related substances, Anal. Chem, 28, pp. 350-356.

85. Dodgson, K. S.; Price, R. G. A, 1962, Note on the Determination of the Ester Sulfate Content of Sulfated Polysaccharides, Biochem. J. 84, pp. 106 - 110.

86. Bitter, T.; Muir, H.M, 1962, A modified uronic acid carbazole

reaction. Anal. Biochem, 4, pp. 330–334.

87.

Peter N. Pusey, Dennis E. Koppel, Dale E. Schaefer, Rafael D. Camerini-Otero, and Seymour H. Koenig, 1974, Intensity fluctuation specpposcopy of laser light scattered by solutions of spherical viruses, R17, Q.beta., BSV, PM2, and T7. I. Light-scattering technique, Biochemisppy, 13 (5), pp. 952–960.

88. Duarate, M.; Cardoso, M.; Noseda, M, 2001, Structural studies on the brown seaweed Sargassum stenophyllum, from

fucoidans Carbohydrate. Research, 333, pp. 281-293.

the Fronds of

89. Hiroe Mori and Kazutosi Nisizawa, 1982, Sugar Constituents of Sargassum from Sulfated Polysaccharides ringgoldianum, Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries. 48 (7), pp. 981-986.

90. Cun Zhuang, Hiroko Itoh, Takashi Mizuno, and Hitoshi Ito, 1995, Antitumor Active Fucoidan from the Brown Seaweed, Umitoranoo (Sargassum thunbergii), Biosci, Biotech, Biochem. 59 (4), pp. 563-567.

91. Riki Shiroma, Teruko Konishi, Shuntoku Uechi and Masakuni Tako, 2008, Structural Study of Fucoidan from the Brown Seaweed Hizikia

104

fusiformis, Food Sci, Technol Research, 14 (2), pp. 176 - 182.

92. Eluvakkal. T, Sivakumar. S.R and Arunkumar. K, 2010, Fucoidan in Some Indian Brown Seaweeds Found along the Coast Gulf of Mannar, Inter Journal of Botany, 6 (2), pp. 176-181.

93. Virginia García-Ríos, Elvira Ríos-Lea, Daniel Robledo and Yolanda Freile-Pelegrin, 2012, Polysaccharides composition from Tropical brown seaweeds, Phycological Research, 60, pp. 305-315.

94. Riki Shiroma, Teruko Konishi, Shuntoku Uechi and Masakuni Tako. 2008, Structural Study of Fucoidan from the Brown Seaweed Hizikia fusiformis,Food Sci, Technol Research, 14 (2), pp. 176 - 182.

95. Pham, D. Thinh, Menshova R.V., Ermakova SP., Anastyuk S. D., Bui . Ly, Zvyagintseva T. N, 2013, Structural characteristics and anticancer activity of fucoidan from the brown alga Sargassum mcclurei, Mar. Drugs, 11, pp. 1456-1476.

105

106

107