Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Dương Khánh Minh

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE

TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang - 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Dương Khánh Minh

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE

TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Phạm Đức Thịnh

Nha Trang – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh, cùng sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu công tác tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang; Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.

Khánh Hòa, ngày tháng năm

Tác giả

Dương Khánh Minh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Đức Thịnh - Phó Viện trưởng, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học và luận văn.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình giảng dạy, truyền đạt, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập.

Và cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Luận văn này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số 106.02-2019.34.

Tôi xin chân thành cám ơn.

Khánh Hòa, ngày tháng năm

Học viên

Dương Khánh Minh

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

Kí hiệu Tiếng Anh Tên đầy đủ

HPLC

High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC Ion Chromatography Sắc kí trao đổi ion

GC-FID

Gas Chromatography – Flame Ionization Detector Sắc kí khí – đầu dò ion hóa ngọn lửa

13C-NMR

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN)

1H-NMR

Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN carbon 13

Proton NMR Spectroscopy Phổ CHTHN proton

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

Fuc Fucose Đường fucose

Gal Galactose Đường galactose

Glc Glucose Đường glucose

GalNAc N-Acetyl-galactosamine Đường N-Acetyl galactosamine

GlcA Glucuronic acid Đường Glucuronic axit

PS Polysaccharide sulfate

FCS Fucosylated chondroitin sulfate

FS Fucan sulfate

CS Chondroitin sulfate

EtOH Ethanol

TCA Triclorua acetic acid

TFA Triflorua acetic acid

Cetavlon

Hexadecyl trimethyl ammonium bromide

Diethylaminoethyl - Macro prep DEAE – Macro prep

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Hàm lượng protein và lipid trong hải sâm tại một số vùng biển trên thế giới .............................................................................................................. 9

Bảng 1.2. Thành phần monosaccharide và nhóm sulfate của FCS từ một số loài hải sâm ................................................................................................... ..14

Bảng 1.3. Các dạng sulfate hóa của các đơn vị phân nhánh của FCS từ các loài hải sâm khác nhau .................................................................................. 20

Bảng 2.1. Các đỉnh phổ, vùng phổ đặc trưng của fucoidan xuất hiện trên phổ hồng ngoại (IR) ....................................................................................... 39

Bảng 3.1. Hiệu suất chiết polysaccharide sulfate ở một số loài hải sâm. ...... 43

Bảng 3.2. Thành phần hóa học của PS dạng thô của hải sâm Stichopus horrens ............................................................................................................ 44

Bảng 3.3. Thành phần hóa học của PS phân đoạn F1, F2 của hải sâm Stichopus horrens ............................................................................................ 49

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hình thái chung bên ngoài của hải sâm .......................................... 8

Hình 1.2. Hải sâm Stichopus horrens,Selenka,1867. .................................... .11

Hình 1.3. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus horrens ...........15

Hình 1.4. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus, Kariya

và cộng sự ......................................................................................................16

Hình 1.5. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus, Long Yu và cộng sự ....................................................................................................... 16

Hình 1.6. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Isostichopus badionotus ... .17

Hình 1.7. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea …...18

Hình 1.8. Cấu trúc của fucosylate chondroitin sulfate...................................19

Hình 1.9. Cấu trúc của một đơn vị trong chuỗi fucosylated chondroitin sulfate…….......................................................................................................19

Hình 1.10. Cấu trúc đặc trưng của fucosylated chondroitin sulfate ở một số loài hải sâm được nghiên cứu của nhiều tác giả. (a) β-D-glucuronic acid, (GlcA). (b) N-acetyl- β-D-galactosamine, (GalNAc). (c) mạch nhánh fucose, α-L-fucose…....................................................................................................21

Hình 2.1. Nguyên liệu hải sâm Stichopus horrens ......................................... 29

Hình 2.2. Quy trình chiết tách thu polysaccharide sulfate dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens. ........................................................................................... 33

Hình 2.3. Quy trình tinh sạch polysaccharide sulfate bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi anion trên nhựa DEAE Macro-prep .................................................. 35

Hình 3.1. Tách phân đoạn PS từ hải sâm Stichopus horrens bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion. ................................................................................. 47

Hình 3.2. Sắc ký đồ IC thu được của dung dịch chuẩn của các đường đơn .. 50

Hình 3.3. Sắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F1 ................ 51

Hình 3.4. Sắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F2 ................ 51

Hình 3.5. Phổ hồng ngoại IR các phân đoạn F1 (A) và F2 (B) của PS ở hải sâm Stichopus horrens .................................................................................... 54

Hình 3.6. Phổ 1H-NMR các phân đoạn F1 (A) và F2 (B) của PS ở hải sâm Stichopus horrens ............................................................................................ 57

Hình 3.7. Cấu trúc của phân đoạn F1 (FCS1) của PS ở hải sâm Stichopus horrens ............................................................................................................ 58

Hình 3.8.Phổ 13C-NMR phân đoạn F2 của PS ở hải sâm Stichopus horrens.59

Hình 3.9. Cấu trúc của phân đoạn F2 (FS2) của PS ở hải sâm Stichopus horrens ............................................................................................................ 59

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI: ......................................................................... 4

2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: ..................................................................... 5

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU: ...................................... 6

3.1. Đối tượng nghiên cứu: ....................................................................... 6

3.2. Phạm vi nghiên cứu: .......................................................................... 6

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: .................................................................. 6

5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ..................... 6

5.1. Ý nghĩa khoa học: .............................................................................. 6

5.2. Ý nghĩa thực tiễn:............................................................................... 6

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................... 7

1.1. GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM ................................................................ 7

1.1.1. Giới thiệu chung về hải sâm ........................................................... 7

1.1.2. Hải sâm Stichopus horrens ........................................................... 10

1.1.2.1. Phân loại ................................................................................... 10

1.1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh sản ................................................ 11

1.1.2.3. Phân bố và môi trường sống .................................................... 12

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM .......................................................................................................... 12

1.2.1. Thành phần hóa học của polysaccharide sulfate từ hải sâm .... 12

1.2.2. Thành phần đa dạng trong cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm ................................................................................................. 15

1.2.2.1. Các nghiên cứu về thành phần Fucan sulfate .......................... 15

1.2.2.2. Các nghiên cứu về thành phần Fucosylate chondroitin sulfate 18

1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của polysaccharide sulfate hải sâm ............................................................................................................ 22

1.2.3.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và hình thành huyết khối của FCS ................................................................................................................ 22

1.2.3.2. Hoạt tính gây ức chế sự tổn thương mô ................................... 23

1.2.3.3. Hoạt tính kháng sự xâm nhập của vi sinh vật ngoại lai ........... 23

1.2.3.4. Hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ............................... 24

1.2.3.5. Hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm ................................... 24

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, HƯỚNG PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI ..................................................................... 25

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 29

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................... 29

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 29

2.1.2. Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất ...................................................... 30

2.1.2.1. Thiết bị ...................................................................................... 30

2.1.2.2. Dụng cụ ..................................................................................... 30

2.1.2.3. Hóa chất .................................................................................... 30

2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 31

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens ...................................................................... 31

2.2.1.1. Phương pháp chiết tách ............................................................ 31

2.2.1.2. Phương pháp tách phân đoạn................................................... 34

2.2.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của polysaccharide sulfate ............................................................................. 36

2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate ............. 36

2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng sulfate ............................... 36

2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic acid ........................ 36

2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein ............................... 37

2.2.2.5. Phương pháp xác định thành phần đường đơn monosaccharide ................................................................................................................ 37

2.2.3. Các phương pháp phân tích phổ về cấu trúc của polysaccharide sulfate ....................................................................................................... 38

2.2.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại IR ............................................. 38

2.2.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR .................... 40

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 42

3.1. TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE DẠNG THÔ ................................................................................ 42

3.1.1. Tách chiết polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens ................................................................................................................... 42

3.1.2. Thành phần hóa học của polysaccharide sulfate dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens ............................................................................ 44

3.2. QUÁ TRÌNH TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS .................................................. 46

3.2.1. Tách phân đoạn polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens ...................................................................................................... 46

3.2.2. Thành phần hóa học các phân đoạn thu được của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens .......................... 48

3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE CÓ NGUỒN GỐC TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS ......................... 53

3.3.1. Phổ hồng ngoại IR......................................................................... 53

3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ............................................. 55

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................ 61

4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 61

4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 63

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 75

MỞ ĐẦU

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI:

Trong cuộc sống hiện nay, sức khỏe là một trong những mối quan tâm hàng đầu; do đó, nhiều người có xu hướng lựa chọn sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc hữu cơ. Bên cạnh đó, các loại thực phẩm chức năng (TPCN) - là những thực phẩm không chỉ chứa các chất dinh dưỡng mà còn chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, kháng viêm,… được chiết tách, phân lập từ các loài thực vật, động vật (như Curcumin được chiết xuất từ củ nghệ tươi, Resveratrol có trong nho và quả mọng, polysaccharide từ các loài sinh vật biển,…) cũng ngày càng được nhiều người quan tâm, sử dụng nhằm hỗ trợ tăng sức đề kháng, giảm bớt các nguy cơ gây bệnh.

Sinh vật biển là một trong những đối tượng tiềm năng để thu nhận các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Nhiều sản phẩm từ các hợp chất thu nhận từ sinh vật biển đã được thương mại hóa như Seavie hải sâm (gồm acid amin, nguyên tố vi lượng, hoạt chất holothurin B từ hải sâm…), fucoidan từ rong nâu,... Các loài động vật, thực vật biển rất giàu carbohydrate và chủ yếu ở dạng polysaccharide sulfate (PS) [1]. Các nghiên cứu về PS từ sinh vật biển đã chứng minh hợp chất này sở hữu một phổ rộng về các hoạt tính sinh học có lợi như: chống tạo mạch, kháng u, chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối,... qua đó cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của hợp chất này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm [2, 3]. Trong số các sinh vật biển, hải sâm là một trong những loài có giá trị kinh tế cao, không chỉ là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng với các vitamin và khoáng chất, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra ở hải sâm còn có nhiều tính sinh học như peptide, acid béo, hợp chất hữu cơ có hoạt nortriterpene/triterpene glycoside và đặc biệt là PS [4, 5, 6]. PS từ hải sâm sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng viêm, kháng u, chống oxy hóa, chống ung thư… đã được chứng minh. Về mặt cấu trúc, các polysaccharide sulfate từ hải sâm có thành phần hóa học và cấu trúc rất đa dạng, phức tạp đặc biệt là cấu tạo của các mạch nhánh [7], từ đó dẫn đến sự khác nhau về hoạt tính sinh học ở các polysaccharide sulfate từ các loài hải sâm.

Các polysaccharide sulfate ở hải sâm thuộc 2 nhóm chính là Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS), là một polymer có mạch nhánh, cấu trúc được tạo nên bởi các đơn vị lặp của disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-Gluc- (1→n), có cấu trúc khác so với các PS được phân lập từ các động vật không xương sống và động vật có xương sống khác, hay từ các loài tảo biển; nhóm thứ hai có thành phần chủ yếu là các gốc đường fucose và các nhóm sulfate, được gọi là Fucan Sulfate (FS) [8], FS từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm sulfate trong gốc đường fucose [9].

Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về những hợp chất có hoạt tính sinh học từ hải sâm cũng đã và đang được tiến hành tại Viện Hóa sinh Biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), tuy nhiên, chủ yếu tập trung vào hợp chất tryterpene glycoside. Đối với hợp chất PS, cho đến nay mới chỉ có công bố chính thức về hợp chất này từ 3 loài Holothuria spinifera, Stichopus variegatus và Holothuria atra trong số gần 70 loài hải sâm đã được xác định trong vùng biển Việt Nam. Trong số các loài hải sâm tại Việt Nam, Stichopus horrens là một trong số các loài có trữ lượng tự nhiên lớn, phân bố tại nhiều vùng biển bao gồm cả Nha Trang và đây là lợi thế về nguồn nguyên liệu để tiến hành nghiên cứu về PS. Do đó, trong phạm vi nghiên cứu này, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens” nhằm thu nhận, nghiên cứu các đặc điểm cơ bản về cấu trúc của PS ở loài Stichopus horrens tại vùng biển Nha Trang, từ đó định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng PS từ loài hải sâm này, cũng như làm cơ sở để tiến hành những nghiên cứu về PS từ những loài hải sâm khác tại Việt Nam.

2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

Thu nhận và đánh giá sơ bộ cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm S. horrens, làm cơ sở để tiến hành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học, đánh giá mối liên hệ giữa hoạt tính và cấu trúc, từ đó định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng PS từ loài hải sâm này tại Việt Nam.

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU:

3.1. Đối tượng nghiên cứu:

Polysaccharide sulfate chiết tách từ hải sâm S. horrens.

3.2. Phạm vi nghiên cứu:

Hải sâm S. horrens thu ở vùng biển Nha trang, Khánh Hòa vào tháng

12/2019.

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

- Chiết tách và thu nhận polysaccharide sulfate (PS) từ hải sâm S.

horrens.

- Tinh chế PS bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion trên nhựa DEAE Macro-

prep.

- Xác định thành phần hóa học cơ bản của các phân đoạn PS ở hải sâm S. horrens (tổng carbohydrate, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid, hàm lượng protein, thành phần đường đơn).

- Xác định một số đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn PS ở loài hải sâm

S. horrens.

5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

5.1. Ý nghĩa khoa học:

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các số liệu khoa học về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate (PS) ở loài hải sâm S. horrens tại Việt Nam.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn:

Kết quả nghiên cứu được dùng làm cơ sở để tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học của PS chiết tách từ loài hải sâm S. horrens, từ đó định hướng ứng dụng hợp chất này vào lĩnh vực y dược hay làm thực phẩm chức năng sử dụng cho con người.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM

1.1.1. Giới thiệu chung về hải sâm

Hải sâm là nhóm sinh vật biển, rất phong phú và đa dạng các loài, sinh sống ở tầng đáy, thuộc ngành da gai (Echinodermata), lớp hải sâm (Holothuroidea). Tên thông dụng của hải sâm là dưa chuột biển, ngoài ra còn có các tên thường gọi như đỉa biển, hải thử, sa tốn. Hải sâm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái [10]. Về hình thái, hải sâm thường có kích thước lớn màu nâu đậm, cơ thể thon dài dạng hình trụ, rỗng hoặc đặc bên trong tùy thuộc vào loài, tạo nên hình dạng đối xứng 2 bên, cấu tạo bên ngoài gồm miệng nằm ở mặt bụng, quanh miệng có 20 xúc tu, hậu môn nằm cuối thân. Mặt lưng có 2- 3 hàng gai thịt lớn, dạng hình nón khá dài, chạy dọc theo hai đường biên lưng của cơ thể. Những chiếc gai thịt dài, cũng xuất hiện ở mặt bên và phần rìa bụng. Một số loài phẳng phần lưng hoặc bụng, một số loài đã phát triển kênh hô hấp. Chân bám được sắp xếp dọc theo các vòng của phần bụng. Chân ống hình trụ, nhỏ và dài, cuối chân có đĩa bám (Hình 1.1) [11]. Một đặc điểm khác của hải sâm là có số lượng lớn khung xương cacbonat (ossicle), có nguồn gốc từ phôi [12]. Hải sâm thường ăn các xác chết của động vật, sinh vật phù du và các chất hữu cơ dưới biển. Phần lớn chúng sử dụng các loại chất nền dưới đáy biển trong suốt quá trình trưởng thành. Hải sâm thường bắt mồi - là những loài trôi lơ lửng trong sóng - bằng cách sử dụng các xúc tu [13]. Hải sâm sinh sản bằng cách phóng tinh trùng và trứng vào nước biển, sau đó trứng được thụ tinh, và phát triển ngoài cơ thể con cái. Tuyến sinh dục nằm ở phần trước của lưng, trong quá trình sinh sản, con đực và con cái nâng nửa thân trước lên, con đực thụ tinh, sau đó con cái sinh sản. Trứng và tinh trùng được tạo ra theo cách này được thụ tinh trong biển và bắt đầu phát triển. Số lượng trứng của một con cái khoảng 500.000 đến 10 triệu quả và nở trong 2 ngày ở nhiệt độ nước 20 °C.

Hình 1.1. Hình thái chung bên ngoài của hải sâm [13]

Hải sâm được tìm thấy ở hầu hết các môi trường đáy biển, nhưng đa dạng nhất là ở các rạn san hô nhiệt đới. Chúng phân bố dọc theo thềm lục địa, từ vùng triều đến vùng biển khơi sâu và được tìm thấy ở hầu hết các loại nền đáy. Hiện nay, trên thế giới ghi nhận khoảng 1400 loài hải sâm thuộc 6 bộ, 25 họ [14]. Ở Việt Nam, khoảng 70 loài đã được xác định, trong đó Khánh Hòa và Côn Đảo là một trong những khu vực có số lượng lớn các loài có giá trị kinh tế cao như các loài trong họ Holothuriidae (Holothuria, Stichopus), Cucumaridae (Colochirus, Cucumaria) và Sinaptidae (Protankyra) [15].

Hải sâm đã được sử dụng từ rất lâu làm một thực phẩm hay một vị thuốc trong đông y, do có giá trị dinh dưỡng cao cùng khả năng chữa một số bệnh như thấp khớp, cao huyết áp, hen suyễn,…[16, 17]. Một số hợp chất dinh dưỡng ở hải sâm như protein (các axit amin), chất béo (lipid), axit béo, hàm lượng khoáng (Ca, Mg, Fe, Zn), Vitamin A, Vitamin B1 (thiamine), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (niacin) và các nguyên tố vi lượng,... [18, 19]. Dạng thể keo (colagen) chiếm 40 ÷ 60 % tổng số protein chứa trong mô của hải sâm. Với phần lớn là dạng keo này nên protein trong hải sâm rất dễ tiêu hóa, thường phù hợp để tăng cường sức khỏe, tránh suy nhược cơ thể, đặc biệt là đối với người cao tuổi. Hàm lượng lipid trong hải sâm thấp nhưng lại chứa các hợp chất đặc biệt như phospholipid, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, acid

béo no và không no (34 loại acid béo), trong đó acid béo không bão hòa chiếm ưu thế và các acid béo có nhiều nối đôi chiếm từ 43,1-75,0% gồm: linoleic, arachidoric, eicosatrrienic, eicosapentaenoic, là các acid béo không thể thay thế có hoạt tính sinh học cao, là tiền chất của prostaglandin một loại dược phẩm quý. Chất hexosamines có nhiều trong hải sâm, trong đó glucosamine trong hải sâm với hàm lượng trong mô cơ là 0,11 ÷ 0,12 % (trọng lượng khô) có tác dụng kháng vi khuẩn, kìm hãm sự phát triển của khối u ác tính sẽ mở ra triển vọng điều trị bệnh ung thư trong tương lai [20]. Chất holothurinosides là các saponin pentasaccharide không có sự sulfate hóa được chiết từ hải sâm có hoạt tính chống oxy hóa tế bào và chống sự phát triển của tế bào, vì vậy cũng được sử dụng để hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư, cũng như quá trình điều trị bệnh ung thư trong tương lai gần [20]. Ngoài ra, còn chứa nhiều loại axit amin thiết yếu có tỉ lệ lớn như glycine, glutamic acid, aspartic acid, alanine, và arginine [18, 19, 21]. Hàm lượng trung bình của protein và lipid ở hải sâm từ các vùng biển trên thế giới được thể hiện trong bảng 1.1.

Bảng 1.1 Hàm lượng protein và lipid trong hải sâm tại

một số vùng biển trên thế giới [21].

Hàm lượng % trọng lượng khô

TT Vùng biển

Protein Lipid

1 Địa Trung Hải 55,0 ÷ 65,0 0,7

2 Trung Quốc - Nhật Bản 64,0 0,8

3 Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương 32,0 ÷ 52,0 0,5 ÷ 0,7

4 Liên Xô (cũ) 60,0 ÷ 65,0 0,1 ÷ 0,8

5 Nha Trang- Khánh Hòa 40,76 ÷ 77,54 0,1 ÷ 0,65

Trong mô cơ của một số loài hải sâm chứa nhiều thành phần khoáng vi lượng như sắt (Fe), magie (Mg), selen (Se), kẽm (Zn)… và một số nguyên tố vi lượng quý hiếm như Se, là một trong những khoáng chất vi lượng thiết yếu, có thể ngăn chặn những rối loạn chuyển hóa, làm chậm quá trình lão hóa và

phòng chống một số bệnh mãn tính; là chất giải độc, vô hiệu hóa các kim loại nặng, đi vào cơ thể qua đường ăn uống như chì và thủy ngân, để thải ra nước tiểu [22, 23].

Trong số các hợp chất có giá trị ở hải sâm phải kể đến các polysaccharide sulfate (PS) hay glycosaminoglycans (GAGs), với nhiều hoạt tính sinh học quý như: chống tạo mạch, kháng u, chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối,…[2, 3, 24].

1.1.2. Hải sâm Stichopus horrens

1.1.2.1. Phân loại

Họ Stichopodidae lần đầu tiên được đề xuất bởi Haeckel, với tên gọi “Stichopodida”, để phù hợp với chi Stichopus và Thelenota. Đặc điểm mà phân chia họ này, với những họ khác là ở sự đặc biệt của 2 tuyến sinh dục. Hiện nay, họ Stichopodidae bao gồm 9 chi và 35 loài phân bố khắp nơi. Chi Stichopus và Thelenota là 2 giống đầu tiên được phân loại vào trong họ này [22].

Lớp Holothuroidea

Phân lớp Holothuriacea.

Bộ Synallactida.

Họ Stichopodidae.

Chi Stichopus.

Loài Stichopus horrens.

Hình 1.2. Hải sâm Stichopus horrens, Selenka, 1867.

1.1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh sản

S. horrens có hình dạng cơ thể gần giống hình tứ giác ở mặt cắt ngang với bề mặt cứng và thô; có nếp nhăn ở phần giữa lưng. Cơ thể nhiều gai lớn như trái sầu riêng. Mặt lưng có 2-3 hàng gai thịt lớn dạng hình nón khá dài chạy dọc theo hai đường biên lưng cơ thể. Chủ yếu có màu nâu sẫm và vàng nhạt, với từng đốm nâu trắng li ti dọc thân. Khoang miệng có một vài gai nhỏ. Chân của hải sâm bị giới hạn trong 3 phần với phần giữa gồm nhiều hàng chân dạng sợi nhưng mật độ lại ít hơn, nền màu trắng kem với những đốm nâu chạy dọc phần bụng với 20 xúc tu hình tấm khiên. Ở phần lưng, có nhiều các trâm hình tròn và trâm que hình chữ C. Những mảng hình tròn ở phần lưng với 4 lỗ ở trung tâm, 9-12 lỗ ngoại biên xung quanh bề mặt trơn, 4 cái gai với chiều cao trung bình tạo thành cột tháp nhọn hình chữ thập. Các mẫu xương nhỏ ở vùng vây lưng bao gồm các hình vòng giống các trâm gai với các lỗ trên bề mặt tạo ra hình như chữ C và dây, có một cái trâm tháp lớn gồm 4 cái gai hợp lại với nhau tạo thành một cái tháp gai nhọn ở trung tâm. Trên bề mặt các phần trâm gai hình que đều thô và gồ ghề, đặc biệt ở hai đầu thu hẹp lại thành gai; ở trung tâm có các nhánh gai phức tạp, có lỗ. Ở các trâm gai viền nhô đục lỗ có 6 tới 12 lỗ không đều; kích thước nhỏ hơn so với chân ống. Chân ống có trâm lớn, tấm đa điểm và trâm tháp. Trâm gai lớn có tấm trung tâm với đục lỗ; bề mặt thanh gồ ghề và được phủ bởi các gai nhỏ. Trong các xúc tu, các tiểu xương

bao gồm các que có kích thước và độ dày khác nhau. Tất cả các trâm gai có bề mặt thô và bảo phủ bởi các gai nhỏ; các trâm gai nhỏ thường hay thẳng, trong khi các trâm gai lớn hơn đều cong thành quai [25]. Loài này thể hiện màu sắc cơ thể đa dạng, trong các mẫu vật từ các nơi khác nhau. Trọng lượng trung bình của loài hải sâm này từ 200 đến 500 g, chiều dài khoảng 20 cm [26, 27]. Các loài của lớp Holothuroidea là gonochoric và chỉ có một tuyến sinh dục. Vòng đời: Phôi phát triển thành ấu trùng planktotrophic (auricularia) sau đó thành ấu trùng doliolaria rồi biến chất thành hải sâm chưa trưởng thành. Ngoài ra, chúng cũng có thể sinh sản vô tính bằng cách phân hạch (các cá thể sống tự phân chia theo cách co thắt dần dần, sau một thời gian có thể tách ra thành hai cá thể riêng biệt).

1.1.2.3. Phân bố và môi trường sống

S. horrens được tìm thấy nhiều ở các rạn san hô, bên dưới những tảng đá bè lớn từ độ sâu từ 2 đến 20 m. Ở những nơi khác, nó xuất hiện phổ biến trên các khu vực đá vụn và cát; ẩn dưới đá hoặc san hô chết, hoạt động nhiều vào ban đêm, ẩn nấp trong các kẽ hở vào ban ngày. Mật độ quần thể của loài này không cao. Chúng hay ngụy trang thêm lớp cát trên lưng, đồng thời để giữ mát cho cơ thể và tránh tia nắng mặt trời.

Hải sâm S. horrens phân bố phổ biến nhiều nơi trên thế giới như ở các nước Nhật Bản, Australia, Ấn Độ, Malaysia, Trung Quốc và các vùng biển ở Đông Phi. Ở Việt Nam, phân bố chủ yếu ở các vùng biển Phú Quốc, Côn Đảo, Kiên Giang, Khánh Hòa , Phú Yên, Quảng Ninh, Hải Phòng, Vũng Tàu,... [21].

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM

1.2.1. Thành phần hóa học của polysaccharide sulfate từ hải sâm

Các nghiên cứu về PS được chiết tách từ các loài hải sâm khác nhau trên thế giới chứng minh thành phần hóa học như hàm lượng carbohydrate, thành phần và tỉ lệ giữa các gốc đường đơn (monosaccharide), hàm lượng sulfate và các thành phần khác rất đa dạng. Các điều kiện môi trường sống khác nhau giữa các loài hải sâm cũng là một yếu tố tạo nên sự đa dạng này. Trong nghiên cứu

của Ustyuzhanina và cộng sự năm 2018, kết quả cho thấy thành phần hóa học của PS với tỉ lệ phần trăm về khối lượng khác nhau của hàm lượng sulfate 25,1%; hàm lượng uronic acid 4,7% và các thành phần đường đơn fucose là 23,2%, galactosamine là 3.1% của loài hải sâm S horrens [28]. Tác giả Phạm Đức Thịnh và cộng sự, năm 2018 nghiên cứu về PS của loài hải sâm Stichopus variegatus [29], cho các kết quả về thành phần hóa học như hàm lượng carbohydrate là 45,8%, hàm lượng sulfate 32%, hàm lượng protein là 7,5%, bên cạnh đó kết quả thành phần đường đơn của PS thu nhận được rất đa dạng gồm fucose, galactose, glucuronic acid và N-acetyl-galactosamine với các tỷ lệ mol khác nhau. Trong nghiên cứu của Li và cộng sự năm 2020 [30] về loài hải sâm Stichopus chloronotus, kết quả phân tích thành phần hóa học thu được hàm lượng tổng carbohydrate rất cao là 63,4%, cùng với hàm lượng sulfate 35,7%, tỷ lệ mol giữa gốc đường đơn fucose và sulfate cao 1,0:1,3. Thành phần đường đơn của PS thu nhận được từ loài hải sâm Cucumaria frondosa trong nghiên cứu của Varsa Kale năm 2013 [31] vô cùng đa dạng gồm nhiều gốc đường đơn N-acetylneuraminic acid, mannose, N-acetylglucosamine , galactose, fucose, glucose với tỷ lệ mol khác nhau. PS được chiết tách từ các loài hải sâm thuộc 2 nhóm chính là Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và Fucan Sulfate (FS). Thành phần đường đơn (monosaccharide) chủ yếu là các gốc đường fucose. Thành phần đường đơn (monosaccharide) của FCS trong các nghiên cứu đã công bố bao gồm nhiều loại monosaccharide khác nhau, phổ biến nhất là D- glucuronic acid và D-glucosamine với tỉ lệ xấp xỉ nhau. Sự khác biệt lớn đến từ tỉ lệ của gốc fucose và nhóm thế sulfate, đây là hai thành phần thường chiếm ưu thế, ngoài ra, sự khác biệt này không chỉ phụ thuộc vào các loài hải sâm khác nhau mà còn bị ảnh hưởng bởi phương pháp, kỹ thuật sử dụng để tiến hành chiết tách [7]. Thành phần hóa học với các tỉ lệ monosaccharide và nhóm sulfate của FCS ở một số loài hải sâm được thể hiện ở bảng 1.2.

Bảng 1.2. Thành phần monosaccharide và nhóm sulfate của FCS

từ một số loài hải sâm [7]

Thành phần hóa học (tỉ lệ mol) Loài hải sâm (U:N:F:-OSO3

-) *

Stichopus variegatus 1:0,83:1,07:3,82

Stichopus tremulus 1:0,8:1,2:3,0

Isostichopus badionotus 1:0,7:0,9:3,1

Stichopus japonicus 1:0,88:0,85:3,68

1:1,14:1,06:4,56

1:0,85:2,36:4,63

Stichopus japonicus 1:1,19:2,83:4,39

1:1:1:4,7

1:1,29:0,18:1,86

1:0,85:1,85:2,04 Ludwigothurea grisea 1:1,10:1,07:2,93

1:0,8:1,5:2,6 Pearsonothuria graeffei 1:0,8:1,3:2,5

Holothuria vagabunda 1:1,1:0,9:2,7

1:1,06:0,89:3,83 Holothuria leucospilota 1:1,04:0,81:2,06

Holothuria atra 1:0,87:0,69:2,35

Holothuria scabra 1:0,78:0,53:1,34

Holothuria nobilis 1:0,96:0,82:2,99

Holothuria edulis 1:1,28:0,82:3,5

* U: Glucuronic acid; N: α-glucosamine; F: Fucose.

1.2.2. Thành phần đa dạng trong cấu trúc của polysaccharide sulfate

từ hải sâm

1.2.2.1. Các nghiên cứu về thành phần Fucan sulfate

Các công bố về Fucan sulfate ở các loài hải sâm khác nhau trên thế giới chỉ ra FS có cấu trúc rất đa dạng. Thành phần Fucan sulfate (FS) ở các loài hải sâm có các cấu trúc đặc trưng riêng, điều này được chứng minh trong kết quả nghiên cứu về hợp chất này ở các loài hải sâm khác nhau trên thế giới. Như trong nghiên cứu của Ustyuzhanina và cộng sự năm 2018, FS ở loài hải sâm S. horrens sau khi chiết tách được tinh chế bằng kỹ thuật sắc kí trao đổi ion [28]. Kết quả nghiên cứu về cấu trúc sau đó cho thấy, mạch của FS thu nhận được tạo nên bởi các đơn vị 3-α-L-fucopyranose 2-sulfate, nhóm sulfate liên kết tại vị trí O-2 và O-4 của vòng fucosyl (hình 1.3).

-) (hình 1.4).

Hình 1.3. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus horrens [28]

Cùng nghiên cứu về chi Stichopus, Kariya và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về FS thu nhận từ loài hải sâm Stichopus japonicus [20]; theo đó, -) và cấu tạo mạch của FS này được tạo nên bởi các gốc đường đơn Fuc(2OSO3 Fuc(2,4OSO3

Hình 1.4. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Stichopus japonicus, Kariya và cộng sự [20]

Vào năm 2015, một cấu trúc mới dạng mạch nhánh của FS, thu nhận từ loài hải sâm Acaudina molpadioides, đã được công bố trong nghiên cứu của Long Yu và cộng sự [32]. Cấu trúc này hoàn toàn khác so với cấu trúc của PS của loài hải sâm Stichopus japonicus đã được công bố trước đó (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Acaudina molpadioides, Long Yu và cộng sự [32]

Cùng năm 2015, Wu và các cộng sự đã tiến hành thu nhận và nghiên cứu cấu trúc của FS từ 4 loài hải sâm khác nhau gồm Pearsonothuria graeffei, Holothuria vagabunda, Stichopus tremulu và Isostichopus badionotus [33].

Theo đó, cấu trúc mạch của FS từ loài Stichopus tremulus gồm chủ yếu là các gốc tại vị trí O không có nhóm sulfate liên kết trên vòng fucose (non-O-sulfate fucose); trong khi đó, cấu trúc đa dạng hơn được công bố ở hai loài hải sâm là Pearsonothuria graeffei với các gốc 2,4-disulfate, non-O-sulfate fucose và ở loài Isostichopus badionotus chứa chủ yếu là các gốc non-O-sulfate fucose, 2- O-sulfate fucose và 2-4-O-disulfate fucose. Một cấu trúc của FS từ hải sâm Isostichopus badionotus - bao gồm các đơn vị lặp lại của tetrasaccharide, cũng được công bố trong nghiên cứu của Chen và cộng sự [16]. (Hình 1.6)

Hình 1.6. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Isostichopus badionotus [16]

Sự đa dạng về mặt cấu trúc còn được thể hiện ở kết quả nghiên cứu về FS ở loài hải sâm Ludwigothurea grisea. Như trong kết quả nghiên cứu của Silva và cộng sự, FS ở loài hải sâm Ludwigothurea grisea thu ở vùng biển -) Brazil có cấu trúc mạch thẳng, được tạo nên bởi gốc đường đơn Fuc(2OSO3 -) [34]. Tuy nhiên, vào năm 2014, trong liên kết 1,3 với gốc Fuc(2,4OSO3 nghiên cứu của Myron và cộng sự, cũng tiến hành trên đối tượng loài hải sâm này, cấu trúc FS thu nhận được có dạng mạch nhánh chứ không phải dạng mạch thẳng (hình 1.7) [7].

Hình 1.7. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea [7]

Từ kết quả các nghiên cứu có thể thấy, cấu trúc của FS rất đa dạng và có sự khác nhau giữa các họ hải sâm, thậm chí giữa các loài trong cùng một họ. Kết quả này có thể do sự khác nhau về các điều kiện môi trường sống, thời gian và địa điểm thu mẫu… gây ra. Sự khác nhau về mặt cấu trúc có thể tạo nên sự đa dạng về mặt hoạt tính của FS ở các loài hải sâm khác nhau.

1.2.2.2. Các nghiên cứu về thành phần Fucosylate chondroitin sulfate

Fucosylate chondroitin sulfate (FCS) là một trong 2 dạng PS ở hải sâm và nhận được nhiều quan tâm, do sở hữu hoạt tính sinh học phong phú và đa dạng [16, 35, 36]; cấu trúc FCS thu nhận từ nhiều loài hải sâm cũng đã được làm rõ.

Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, đặc điểm cấu trúc chung của các polysaccharides dạng này bao gồm lõi chondroitin [→4)-β-D-GlcA- (1→3)-β-D-GalNAc-(1→]n và các nhánh fucosyl được gắn với O-3 của gốc glucuronyl (hình 1.8). Các FCS khác nhau về trọng lượng phân tử, mức độ phân nhánh và kiểu sulfate hóa của cả nhánh từ mạch khung đến nhánh từ gốc fucosyl [7, 16, 37, 38].

Hình 1.8. Cấu trúc của fucosylate chondroitin sulfate

Ngoài ra, nhóm FCS từ hải sâm có cấu trúc giống polysaccharide thu nhận được khá phổ biến ở động vật có vú là chondroitin sulfate, nhưng khác nhau ở vị trí C-3 của gốc uronic axit có tạo mạch nhánh bởi nhóm fucose sulfate (Hình 1.9) [39, 40]; với đặc điểm cấu trúc của nhóm fucose sulfate mạch nhánh này, nên tránh được sự phân hủy dưới tác động bởi enzyme chondroitin được sinh ra bởi sinh vật biển; ngoài ra còn làm tăng mật độ điện tích để thích nghi với điều kiện môi trường biển và đồng thời có hoạt tính sinh học rất cao.

Hình 1.9. Cấu trúc của một đơn vị trong chuỗi

fucosylated chondroitin sulfate.[40]

Các nghiên cứu về cấu trúc cho thấy, cấu tạo FCS gồm 3 thành phần chính là: uronic acid, sulfate và các gốc đường amin. Cấu trúc mạch khung thì tương tự như chondroitin sulfate (CS) ở động vật có vú [39], các nhánh α-L- fucopyranose có thể gắn ở các vị trí khác nhau trên mạch chính (β-D-glucuronic acid hoặc β-D-galactosamine) [7]. Ngoài ra, các nhánh fucose này có mô hình sulfate hóa, có thể phân biệt được so với mạch chondroitin sulfate và mô hình sulfate hóa của fucan nhìn chung thường ở vị trí C-2, 3 và 4; trong một số công bố khác, trong cấu trúc của FCS xuất hiện kiểu liên kết glycosidic giữa các gốc fucose theo dạng liên kết (1→2, 1→3 hoặc 1→4) và liên kết glycosidic của các fucan này với mạch chính CS có thể ở vị trí C-3 của gốc glucuronic acid. Quá trình sulfate hóa, hay vị trí liên kết của các nhóm sulfate, cùng với thành phần cấu tạo khác nhau của các nhánh, tạo nên cấu trúc hóa học đặc trưng của từng loài hải sâm (hình 1.10) [41]. Sự hiện diện của các mạch nhánh khác nhau trên phân tử FCS cung cấp cho loài hải sâm (động vật không xương sống) khả năng điều chỉnh hệ thống sinh lý. Mức độ hoạt động trong các hệ thống này không chỉ phụ thuộc vào quá trình fucosyl hóa, mà còn phụ thuộc vào các dạng sulfate hóa của các mạch nhánh khác nhau trong cấu trúc (Bảng 1.3).

Bảng 1.3. Các dạng sulfate hóa của các mạch nhánh khác nhau của FCS

từ các loài hải sâm [40]

Tỷ lệ (%) các đơn vị phân nhánh

Loài hải sâm

Fuc0S Fuc3S Fuc4S Fuc2S4S Fuc3S4S

Stichopus tremulus [16] - - 24,8 22,4 52,8

Isostichopus badionotus [16] - - 4,1 95,9 -

Stichopus japonicus [43] 18 17 0 16 23

0 - ~ 49 ~ 20 ~ 17 Ludwigothurea grisea [41,42]

Pearsonothuria graeffei [16] - - 81,6 18,4 -

Holothuria edulis [44] - - - 18 -

Việc chọn lựa phương pháp, kỹ thuật, cơ chế tách chiết thích hợp là rất quan trọng, điều này ảnh hưởng đến cấu trúc của PS thu nhận được từ hải sâm. Ngoài ra, các điều kiện môi trường sống và vị trí thu nhận mẫu, mùa vụ khác nhau giữa các loài hải sâm cũng là yếu tố tạo nên sự đa dạng về thành phần cấu trúc của PS.

1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của polysaccharide sulfate

hải sâm

Sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ mới giúp đẩy mạnh các nghiên cứu về những hợp chất có hoạt tính sinh học ở hải sâm như: polysaccharide sulfate (PS), collagen, sialic acid, saponin, ...[18, 19, 21, 45], trong đó PS hay glycosaminoglycans là hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất, vì các hoạt tính sinh học đa dạng của hợp chất này như: chống đông tụ, chống tắc nghẽn mạch máu, kháng viêm [24, 46], điều chỉnh sự hình thành mạch máu [47], ức chế sự di căn của tế bào ung thư [48, 49], kháng virus [50],… trong đó hoạt tính chống đông tụ là hoạt tính được đánh giá nhiều nhất khi nghiên cứu về FCS từ các loài hải sâm.

1.2.3.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và hình thành huyết khối của

FCS

Chondroitin sulfate (CS) không phải là tác nhân chống đông tụ máu, nhưng nhờ quá trình fucosyl hóa làm cho nó hoạt động và mức độ tùy thuộc vào dạng sulfate hóa trên nhánh fucosyl [51]. Trong số các hoạt tính tiềm năng cho lĩnh vực y sinh, thì chống đông tụ máu của FCS được quan tâm nhiều nhất. Cơ chế hoạt động chống đông tụ máu và chống hình thành huyết khối của FCS chủ yếu tập trung vào vai trò làm chất xúc tác cho các chức năng ức chế thrombin của hai tác nhân antithrombin (AT) và heparin cofactor II (HCII), đối với FIIa và Xa [52]. Trọng lượng phân tử và mật độ sulfat hóa trong cấu trúc của FCS đã được chứng minh là đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động chống đông tụ máu và chống hình thành huyết khối [53, 54, 55]. Từ nhiều kết quả nghiên cứu về hoạt tính này cho thấy, nếu FCS không fucosyl hóa thì sẽ không tham gia vào quá trình chống đông tụ máu, do đó việc loại bỏ mạch nhánh fucopyranosyl (Fucp) khỏi FCS được cho là yếu tố làm mất hoạt tính này [41, 56]. Theo nhiều nghiên cứu, một đơn vị Fucp có dạng 2,4-O-disulfate là quyết định hoạt tính chống đông tụ máu và chống hình thành huyết khối của FCS và hoạt tính mạnh hay yếu phụ thuộc vào số lượng các đơn vị này [57]. Như số lượng đơn vị Fucp 2,4-O-disulfate trong cấu trúc FCS của bốn loài hải sâm Isostichopus badionotus, Thelenota ananas, Stichopus japonicus và

Apostichopus japonicus cao hơn so với trong cấu trúc FCS của các loài hải sâm khác và FCS thu nhận ở 4 loài trên cũng thể hiện hoạt tính chống đông tụ máu mạnh hơn [27]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hoạt tính này của FCS có tiềm năng được sử dụng thay thế Heparin làm 1 chất chống đông tụ sử dụng trong lĩnh vực y dược [16, 41, 49, 54, 56, 58, 59]. Tuy nhiên, vẫn có nghiên cứu chỉ ra rằng, các cấu trúc khác nhau (các dạng sulfate hóa khác nhau) của các đơn vị α-L-Fucp phân nhánh không có tác động đến kết quả chống đông tụ máu [60].

1.2.3.2. Hoạt tính gây ức chế sự tổn thương mô

Nghiên cứu của Monteiro-Machado và cộng sự đã cho thấy, FCS từ loài L. grisea có thể thể hiện các đặc tính điều trị có tiềm năng chống lại độc tính gây ra bởi nọc của loài rắn Bothrops jararacussu [61]. Độc tính được gây ra từ nọc của loài rắn này khi thêm vào trong mẫu mô cơ trong ống nghiệm; khi có mặt của FCS thì độc tính trên mẫu mô cơ đã được loại bỏ hoàn toàn. Điều này, chứng minh cho vai trò của FCS, có thể ức chế hoạt động gây phù và ngăn chặn một phần sự giảm tổng số bạch cầu trong máu, khi được ủ trước với nọc độc thô. FCS có vai trò là một chất ức chế độc tính và viêm, do nọc độc gây ra từ loài rắn Bothrops jararacussu và có thể đối với các loại độc tố tương tự khác gây ra.

1.2.3.3. Hoạt tính kháng sự xâm nhập của vi sinh vật ngoại lai

Hoạt tính chống virus HIV của FCS từ loài hải sâm T.ananas đã được nghiên cứu bởi Lian W., Huang N. và cộng sự [62, 63]. Các dữ liệu thể hiện trong nghiên cứu mở ra một hướng ứng dụng của FCS trong việc ngăn chặn một cách hiệu quả và có chọn lọc đối với virus HIV type 1 (HIV-1). Kết quả chỉ ra rằng, FCS này có thể liên kết với glycoprotein 120 (gp120) trên màng của virus HIV. Dựa trên tất cả các nghiên cứu về hoạt tính này của FCS cho đến nay, các nhánh fucosyl sulfate được chỉ ra là các mô hình cấu trúc đóng vai trò chính cho hoạt động chống HIV-1. Ngoài ra, mối liên hệ giữa kích thước phân tử với hoạt tính chống virus HIV-1 cũng được nghiên cứu, theo đó những FCS có trọng lượng phân tử thấp thể hiện hoạt tính chống virus HIV-1 mạnh hơn [62]. Kết quả từ nghiên cứu của Pomin và cộng sự cũng đề xuất cơ chế hoạt động kháng virus của các polysaccharides đã sulfate hóa [64].

1.2.3.4. Hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào

Sự tác động hay ảnh hưởng của FCS được tách chiết từ loài hải sâm L. grisea lên sự phát triển của tế bào như cơ chế phì đại cơn trơn mạch máu (SMC) trong nghiên cứu của Tapon-Bretaudière J. và cộng sự [52] cho thấy khả năng ức chế của FCS lên cơ chế này rất hiệu quả. Ngoài ra, nghiên cứu còn chỉ ra rằng sự hiện diện của các nhóm sulfate liên kết tại nhánh fucose trên FCS, được chỉ ra là yếu tố quyết định thiết yếu tới hoạt động tăng sinh và di chuyển của tế bào. Sự ảnh hưởng của FCS lên tế bào bị loại bỏ khi diễn ra quá trình defucosyl [52].

1.2.3.5. Hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm

Như đã biết, heparin là chất có khả năng ức chế liên kết P- và L-selectin, với phối tử của chúng (sialyl LewisX), dẫn đến kết quả kháng u và chống viêm; FCS được tách chiết từ các loài hải sâm cũng thể hiện hoạt tính này [48]. FCS có tác dụng ức chế mạnh ảnh hưởng của cả liên kết P- và L-selectin, với sialylLewisX cố định, và gắn của tế bào ung thư biểu mô (LS180) với P- và L- selectin cố định. Quá trình thể hiện khả năng ức chế của FCS xảy ra phụ thuộc vào liều lượng và cách thức. Nghiên cứu của Borsig L. và cộng sự [48] cho thấy FCS được tách chiết từ loài hải sâm L. grisea đã được chứng minh có liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn, cũng như hoạt động kháng u và chống viêm; ngoài ra FCS cũng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư biểu mô tuyến MC- 38, xâm nhập vào phổi trong một mô hình nghiên cứu thực nghiệm về di căn ở chuột [48]; bên cạnh đó, các tác giả còn chứng minh hoạt tính kháng viêm qua hai mô hình kháng viêm khác nhau (viêm phúc mạc do thioglycollate và viêm phổi do lipopolysaccharide); FCS chiết tách từ loài hải sâm L. grisea còn cho thấy khả năng ức chế sự tái tạo bạch cầu trung tính, cả hai hoạt tính ức chế đều phụ thuộc vào liều lượng [48]. Nghiên cứu của Panagos và cộng sự cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của FCS, được chiết tách từ loài hải sâm Holothuria forskali, bằng cách sàng lọc các FCS có nguồn gốc từ các oligosaccharide thông qua kỹ thuật microarray [38]. Trong nghiên cứu này, tác giả đã đề xuất cấu trúc của FCS, và sự liên quan của các dạng sulfate hóa của các đơn vị Fucp, trong việc điều chỉnh cấu trúc 3D tổng thể. Hay trong nghiên cứu của Zhao và cộng

sự trong cả điều kiện in vivo và in vitro cho thấy, FCS có thể đồng thời làm giảm mức độ di căn bằng cách sử dụng tế bào B16F10 của khối u ác tính ở chuột và khuynh hướng hình thành huyết khối tắc mạch khi FCS được sử dụng. Sự hình thành fibrin bị ức chế chủ yếu bằng cách làm giảm sự tạo ra yếu tố hoạt hóa Xa. Ngoài các hoạt động này, FCS còn có khả năng ngăn chặn sự kích hoạt của các đường dẫn tín hiệu p38MAPK và ERK1/2 được coi là những con đường trung tâm cho sự biểu hiện của ma trận liên quan đến sự di căn [65]. Trong một công bố khác của He M. và cộng sự, FCS chiết tách từ loài hải sâm I. badionotus có thể ức chế sự phát triển của khối u bằng cách điều chỉnh giảm các biểu hiện của Hif-1α (yếu tố gây giảm oxy 1-alpha), heparanase và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu [66].

Năm 2017, trong nghiên cứu của mình, tác giả Thịnh [67] đã tiến hành khảo sát hoạt tính chống ung thư của các phân đoạn FCS từ 3 mẫu hải sâm S. variegatus, H. spinifera, B. Argus có hàm lượng sulfate cao trên hai dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư phổi (LU-1) và tế bào ung thư gan (Hep-G2), chất đối chứng dương được sử dụng là DMSO (Dimethyl sulfoxide). Kết quả nghiên cứu cho thấy, chỉ có 2 mẫu là phân đoạn F3 - H. spinifera và F3 – B.argus thể hiện hoạt tính, trong đó mẫu F3 – B.argus ức chế được cả 02 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với tỷ lệ tương ứng là 78,22% (LU-1); 71,05% (Hep-G2). Đối với phân đoạn F3 - H. spinifera chỉ thể hiện hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), với tỷ lệ là 53,15%. Hai phân đoạn F3 - H. spinifera và F3 – B.argus đều là phân đoạn của fucan sulfate. Bên cạnh đó, phân đoạn F3 - H. spinifera còn thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng sử dụng nghiên cứu.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, HƯỚNG PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về polysaccharide sulfate (PS) từ nhiều loài hải sâm thu nhận từ các vùng khác nhau. Hoạt tính sinh học của PS được Berteau và Mulloy nghiên cứu đầu tiên ở động vật biển không xương sống [68]. Sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và các công nghệ, cùng

với nhiều thiết bị mới đã hỗ trợ và tạo cơ sở cho các nghiên cứu mới về PS từ các loài hải sâm. Các nghiên cứu về cấu trúc và các hoạt tính sinh học của PS chiết tách từ các loài hải sâm đã công bố trước đây cho thấy, với cùng một loài hải sâm, nhưng sống ở các vùng biển khác nhau, đồng thời khi tiến hành thu mẫu ở các thời điểm mùa vụ, vị trí khác nhau cho các kết quả về đặc điểm cấu trúc và các hoạt tính sinh học khác nhau. Alves và các cộng sự [69] đã công bố cấu trúc và hoạt tính sinh học của các polysaccharide sulfate từ loài nhím biển và hai loài hải sâm Isostichopus badionotus và Ludwigothurea grisea. Tổng kết từ các nghiên cứu PS, từ động vật không xương sống ở biển, ở đây là các loài hải sâm, có cấu trúc đồng nhất, mạch thẳng và lặp lại với chỉ từ 1-, 3- hoặc 4- đơn vị đường đơn. Tuy nhiên, mỗi loài đều có một cấu trúc fucan sulfate hóa riêng biệt với các cấu trúc khác nhau ở vị trí liên kết giữa các gốc fucose và mức độ liên kết, cũng như vị trí sulfate trên các gốc đường này. Thành phần chủ yếu của PS từ hải sâm là L-fucose và các nhóm este sulfate, nhờ có đặc điểm cấu trúc như vậy, nên các PS này thể hiện là một trong những hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh nhất được phân lập từ các loài hải sâm. Kariya và cộng sự đã phân lập được hai loại fucan sulfate từ hải sâm Sichopus japonicus nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính ức chế tế bào tủy xương [20]. Nhóm tác giả Long Yu và cộng sự đã công bố các kết quả hoạt tính kháng ung thư dạ dày của fucan sulfate được phân lập từ loài hải sâm Acaudina molpadioides [30]. Chen và các cộng sự đã công bố nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính kháng đông tụ của fucan sulfate từ các loài hải sâm Isostichopus badionotus và Ludwigothurea grisea [54]. Trong nghiên cứu của Mohamed Ben Mansour cũng công bố về cấu trúc và hoạt tính chống đông tụ của fucan sulfate từ hải sâm Holothuria polii [70]. Gần đây nhất, năm 2020 Li và cộng sự đã nghiên cứu về PS từ loài hải sâm Stichopus chloronotus được thu nhận ở Trung Quốc, nghiên cứu chỉ ra thành phần hóa học cơ bản, đặc điểm cấu trúc và đặc biệt là các hoạt tính sinh học quý như chống oxy hóa và khả năng ảnh hưởng một số đặc tính lên hệ miễn dịch [30].

Các PS phân lập từ các loài hải sâm sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý hiếm và có tiềm năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh và dược. Hoạt tính sinh học của PS thể hiện dựa trên cơ sở cấu trúc của chúng.

Việc phân tích cấu trúc của PS có ý nghĩa vô cùng quan trọng dựa vào đó có thể giải thích các hoạt tính sinh học cũng như cơ chế tác động, từ đó làm cơ sở để ứng dụng hợp chất này vào thực tiễn. PS từ nhiều loài sinh vật biển như mực, cua, bạch tuộc, cá mập,…[27]; hay từ các loài rong biển [71, 72],… đã được thu nhận và tiến hành nghiên cứu; công trình nghiên cứu PS từ hơn 20 loài rong nâu khác nhau về cấu trúc được phát triển thành các thực phẩm chức năng thương mại (fucoidan) [73]; còn với PS từ hải sâm được nghiên cứu cấu trúc với một số loài phân bố ở Việt Nam.

Tại Việt Nam, với đường bờ biển dài 3260 km, giáp biển Đông, cùng với đặc điểm khí hậu nhiệt đới tạo nên sự đa dạng về nguồn lợi tài nguyên biển bao gồm một hệ sinh vật biển vô cùng phong phú và đa dạng [74]. Đây là điều kiện vô cùng thuận lợi về nguồn nguyên liệu để tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm ra các hợp chất thiên nhiên mới có hoạt tính sinh học. Các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên biển đã bắt đầu từ những năm thuộc thập niên 60 của thế kỷ 20, tập trung vào một số nhóm hợp chất như protein, lipid, các nguyên tố đa lượng và vi lượng hay các nhóm chất độc tố, tuy nhiên chỉ thật sự được đẩy mạnh trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây với sự phối hợp của các nhà nghiên cứu ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Với sự phát triển về khoa học kỹ thuật và phương pháp, thiết bị nghiên cứu, các số lượng các công bố về hợp chất có hoạt tính sinh học từ nhiều đối tượng sinh vật biển khác nhau tại vùng biển Việt Nam ngày càng tăng. Có thể kể ra như tuyển tập cụm công trình “Khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên thiên nhiên sinh vật Biển Việt Nam nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị phục vụ cuộc sống”, với sự tham gia của các nhà khoa học từ các Viện khác nhau thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (như Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Tài nguyên Môi trường Biển Hải phòng), kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên từ 5 đối tượng sinh vật biển chọn lọc (gồm: hải sâm Holothuria vagabunda và Holothuria scabra, Cầu gai Diadema setosum, hải miên cành Haliclona sp. và bọt biển xốp đen Icrinia echinata) đã được công bố; các tác giả đã sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chiết tách, tinh sạch và xác định được cấu trúc của khoảng 30 chất, trong đó có 4 chất mới lần đầu tiên

được phân lập từ thiên nhiên, kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cũng cho thấy nhiều chất có hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng sinh rất cao. Tác giả Phạm Đức Thịnh và cộng sự năm 2018 nghiên cứu về PS từ loài hải sâm Stichopus variegatus đã xác định được thành phần hóa học, đặc trưng cấu trúc và đặc biệt là nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư của PS thu nhận được từ loài hải sâm này [75]. Năm 2019, nhóm tác giả Phạm Đức Thịnh và các cộng sự nghiên cứu về PS từ loài hải sâm Holothuria spinifera, kết quả của nghiên cứu cũng xác định được một số thành phần hóa học cơ bản và đặc điểm cấu trúc của PS từ loài hải sâm này [76]. Trong nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài luận văn thạc sĩ của tác giả Mai Ngô Thương Hoài năm 2019 “Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra”, kết quả bước đầu của nghiên cứu cũng xác định được thành phần hóa học và đặc trưng cấu trúc của PS thu nhận từ hải sâm Holothuria atra [77]. Polysaccharide sulfate ở sinh vật biển cũng là nhóm hợp chất sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý hiếm, tuy nhiên hiện nay chỉ mới được nghiên cứu trên một số loài thực vật, chủ yếu là rong và một số loài hải sâm nhất định, vẫn chưa được quan tâm đặc biệt nhiều ở các động vật biển trong đó có hải sâm.

Tóm lại, từ việc phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước, đề tài: “Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens” được đề xuất thực hiện nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về polysaccharide sulfate từ hải sâm theo hướng nghiên cứu các hợp chất mới có hoạt tính sinh học, nhằm ứng dụng làm thực phẩm bổ dưỡng và thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ nguồn tài nguyên biển.

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hợp chất polysaccharide sulfate (PS)

Hình 2.1. Nguyên liệu hải sâm Stichopus horrens

chiết tách từ loài hải sâm S. horrens. Quy trình thu mẫu: Mẫu hải sâm được thu ở vùng biển Nha Trang vào tháng 12 năm 2019. Hải sâm sau khi thu được giữ trong thùng chứa mẫu có đá khô, đậy nắp kín rồi chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu hải sâm được tiến hành phân loại, để định danh xác nhận lại loài hải sâm bởi ThS. Nguyễn Thị Mỹ Ngân, chuyên gia phân loại động vật biển không xương sống thuộc Viện Hải Dương Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất 2.1.2.1. Thiết bị • Máy đo quang Genesys 10S UV-Vis (Thermo Scientific, Mỹ). • Hệ thống sắc kí trao đổi ion Dionex ICS-6000 (Thermo Scientific, Mỹ); cột phân tích trao đổi anion CarboPac MA1 (250mm x 4); cột bảo vệ CarboPac MA1 (50 mm x 4); đầu dò điện hóa (Electrochemical Detector-ED). • Máy phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR: AVANCE III – (Bruker, Thụy Sỹ). • Thiết bị phân tích phổ hồng ngoại: TENSOR 27 – (Bruker, Đức). • Cân phân tích CPA224S (Sartorius, Đức). • Máy ly tâm siêu tốc Centrifuge 5424R (Eppendorf, Đức). • Máy đo pH 7110 (WTW, Đức). • Máy đông khô: LyoQuest Plus ECO 50 (Telstar, Tây Ban Nha). • Máy sấy chân không: FRANCE – ETUVE. • Máy cô quay chân không: Heidolph-Laboratory 4003-digital. • Màng siêu lọc MWCO 10kDa, VIVAFLOW 200. • Máy xay đa năng QE-1000: xuất xứ Trung Quốc. • Hệ thống chiết phân đoạn với cột chiết DEAE-Macro Prep (1,6 x 40 cm).

2.1.2.2. Dụng cụ

• Micropipet 100 µl, 1000 µl, 5000 µl (Sartorius, Đức), đầu tip. • Vial 5mL có nắp (Thermoscientific, Mỹ). • Bơm kim tiêm, màng lọc xylanh 0.22 µm Nylon (Merck, Đức). • Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm như : pipet, cuvet thạch anh, bình định mức, ống đong, cốc thủy tinh có mỏ, ống nghiệm, bình cầu,…

2.1.2.3. Hóa chất

• Các hóa chất phân tích: L-Cystein, N-Acetyl-galactosamine, Glucuronic acid, D-Galactose, L-Fucose, D-Glucose, D-glucuronic acid (Sigma).

(Merck), CH3COOH

• Hóa chất pha đệm và các dung dịch thuốc thử: Phenol (TQ), Carbazole (Merck), NaBH4 (Merck), CH3COONa (Scharlau), NH4OH (Merck), Na2SO4 (Merck), K2SO4 (Merck), NaOH (Merck), TCA (Tricloacetic acid) (Merck), Gelatin (Sigma) , BaCl2 (Merck), TFA (Trifluoroacetic acid) (Merck), EDTA (Merck), màng thẩm tách kích thước 10 KDa, hexadecyltrimethylamonium bromide (Merck). • Các hóa chất sử dụng trong quá trình xử lý mẫu khác gồm: Enzyme Papain có xuất xứ Ấn Độ, hoạt độ 2000 UI/g; Ethanol 96%; Aceton (TQ-Trung Quốc); HCl (TQ); NaCl (TQ).

2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn polysaccharide sulfate

từ hải sâm Stichopus horrens

2.2.1.1. Phương pháp chiết tách Chiết xuất là quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất lỏng khác. Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Chiết là phương pháp được thực hiện nhằm mục đích điều chế hay phân tích. Sản phẩm thu được của quá trình chiết là một dung dịch các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết. Có 3 quá trình xảy ra đồng thời trong chiết xuất là: sự hòa tan của chất tan vào dung môi, sự khuếch tán của chất tan trong dung môi và sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Trong chiết xuất hợp chất thiên nhiên sẽ xảy ra một số quá trình sau: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích,... Một số phương pháp chiết thường được sử dụng như chiết hồi lưu, chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn, phương pháp chiết có hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm, chiết có sự hỗ trợ của enzyme … Trong đó, chiết sử dụng enzyme là phương pháp phổ biến nhất do có nhiều ưu điểm như dễ tiến hành, hiệu quả cao, thân thiện với môi trường và đặc biệt là không gây ảnh hưởng đến cấu trúc của chất cần nghiên cứu.

Phương pháp chiết tách polysaccharide sulfate (PS) từ hải sâm thực hiện dựa theo phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Phạm Đức Thịnh và

cộng sự [29, 76], tham khảo thêm từ các nghiên cứu của (Dong và cộng sự, 2014 [78] và Varsa Kale và cộng sự, 2013 [31]). Phương pháp chiết tách PS được tóm tắt theo sơ đồ hình 2.2. Phương pháp chiết tách PS từ hải sâm được mô tả trong nghiên cứu của Phạm Đức Thịnh và cộng sự là phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ kết hợp với enzyme papain – đây là một enzyme có tính đặc hiệu cao, rất bền khoảng hoạt động khá rộng trong điều kiện pH từ 4 đến 10 và nhiệt độ lên tới 80oC [79]; ở hải sâm, PS phân bố chủ yếu ở thành tế bào cơ thể và ở dạng proteoglycans (protein-polysaccharide), cơ chế hoạt động của enzyme papain trong quá trình chiết là tham gia các phản ứng cắt mạch và phá vỡ liên kết glucoside, liên kết giữa polysaccharide với mạch protein trong hải sâm bị phá vỡ cũng như protein trong hải sâm bị thủy phân theo thời gian dưới tác động enzyme từ đó giải phóng PS, các PS sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi chiết. Trong nghiên cứu của tác giả Phạm Đức Thịnh và cộng sự cũng đã nghiên cứu về các điều kiện chiết tối ưu với việc sử dụng enzyme để có thể đảm bảo được hoạt tính của enzyme, giúp hỗ trợ hiệu quả cho quá trình chiết PS từ hải sâm và đưa ra được quy trình chiết với những điều kiện đã tối ưu. Bên cạnh đó, phương pháp chiết tách bằng dung môi hữu cơ có kết hợp với enzyme papain là một phương pháp phổ biến được các tác giả sử dụng trong nghiên cứu về PS từ hải sâm nói riêng hay các sinh vật biển khác nói chung, bởi vì tính đặc hiệu của enzyme papain đối với quá trình phá vỡ liên kết của protein và polysaccharide, để tránh làm ảnh hưởng đến cấu trúc của polysaccharide, điều này dẫn đến đảm bảo hoạt tính sinh học của PS đang nghiên cứu [31, 37, 69, 78, 80].

Hình 2.2. Quy trình chiết tách thu polysaccharide sulfate dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens.

Quá trình chiết tách được tiến hành như sau: mẫu hải sâm S. horrens được làm sạch, loại bỏ nội tạng và được làm khô; sau đó mẫu hải sâm khô được chiết trong đệm acetate 0,1M (pH 6) với tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:30 (g:ml), bổ sung vào dung dịch đệm chiết enzyme papain (2000 UI/g), với tỉ lệ 10% (so với khối lượng mẫu khô), 5 mM EDTA và 5 mM L-cystein. Quá trình chiết được thực hiện ở 55 ºC. Sau 24 giờ, tiến hành lọc rồi ly tâm 6000 vòng/phút thu dịch chiết, đun sôi dịch chiết trong 10-15 phút để bất hoạt enzyme. Dung dịch Cetavlon 10% được bổ sung vào dịch chiết để kết tủa PS trong 24 giờ ở 4 ºC và sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút, thu kết tủa. Hỗn hợp kết tủa Cetavlon và PS được hòa tan trong hỗn hợp (NaCl 3M + ethanol 20%), tiếp đó, ethanol 96% được thêm vào đến nồng độ ethanol cuối cùng đạt 80% để kết tủa lại PS trong dịch tủa. Sau 24 giờ, ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút thu tủa, tủa được rửa với ethanol 75% từ 3 đến 5 lần để loại muối, sau đó sấy khô, nghiền nhỏ thu được PS dạng thô.

2.2.1.2. Phương pháp tách phân đoạn

PS từ hải sâm, được tiến hành tách phân đoạn bằng kỹ thuật sắc ký trao

đổi anion trên cột DEAE-Macro Prep.

• Chuẩn bị dung dịch mẫu PS: 500 (mg) PS dạng thô, được hòa tan hoàn toàn trong 50 ml dung dịch đệm acetate 0,1 M (pH 5). Sau đó, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 20 phút, để loại bỏ cặn, trước khi nạp lên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-Macro Prep (1,6 x 40 cm).

• Hoạt hóa và cân bằng cột bằng dung dịch đệm acetate 0,1M (pH=5).

Tiến hành tách phân đoạn: đầu tiên, mẫu đã được chuẩn bị được đưa lên cột, sau đó dung dịch đệm acetate 0,1M (pH 5) không chứa muối NaCl, được bơm qua cột đến khi dung dịch đầu ra, có kết quả âm tính với thuốc thử phenol/acid sulfuric. Tiếp sau đó, rửa giải các các hợp chất liên kết trên cột bằng dung dịch đệm acetate 0,1M (pH 5) chứa NaCl, với nồng độ tăng dần từ 0 đến 2M, tốc độ rửa giải 0,8 ml/phút và tiến hành thu các phân đoạn với thể tích mỗi phân đoạn là 10 ml.

Xác định tổng carbohydrate của tất cả các phân đoạn thu nhận. Các phân đoạn thu nhận được tiến hành cô đặc để giảm thể tích, sau đó thẩm tách để loại muối, cuối cùng thực hiện quy trình đông khô thu được bột PS dạng tinh chế. Quy trình tách phân đoạn và tinh sạch PS từ hải sâm S. horrens được tóm tắt theo sơ đồ hình 2.3 [29, 76].

Hình 2.3. Quy trình tinh sạch polysaccharide sulfate bằng kỹ thuật sắc kí trao đổi anion trên nhựa DEAE Macro-prep.

2.2.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của

polysaccharide sulfate

2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate

Tổng carbohydrate được xác định bằng bằng phương pháp phenol – acid sulfuric (Dubois và cộng sự 1956) [81]. Tiến hành xây dựng đường chuẩn với D-glucose làm dung dịch chuẩn.

Tiến hành thực nghiệm: 5 mg mẫu hòa tan với 1 ml nước cất, lấy 200 µl dung dịch mẫu thêm vào 200 µl thuốc thử phenol 5%, lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Thêm tiếp 1 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc, lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo mật độ quang ở bước sóng λ = 490 nm.

2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng sulfate

Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin (KS Dodgson và cộng sự, 1962) [82]. Tiến hành xây dựng đường chuẩn với K2SO4 làm dung dịch chuẩn.

Tiến hành thực nghiệm: 5 mg mẫu được tiến hành thủy phân trong 2 ml HCl 1N ở nhiệt độ 100 ºC trong 6 giờ. Mẫu sau thủy phân cho thực hiện kết tủa với BaCl2 trong sự có mặt của gelatin. Giữ 10 – 15 phút ở nhiệt độ phòng trước khi đem đo độ đục ở bước sóng λ = 360 nm.

2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic acid

Hàm lượng acid uronic được xác định bằng phương pháp Carbazole (Bitter và Muir, 1962) [83]. Tiến hành xây dựng đường chuẩn với D- glucuronic acid làm dung dịch chuẩn.

Tiến hành thực nghiệm: lấy 250 μl dung dịch cần phân tích cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 mL dung dịch A (dung dịch NaBH4 nồng độ 0,9% trong acid sulfuric 98%), phản ứng được tiến hành ở 100 ºC trong 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B (dung dịch carbazole 0,1% trong cồn tuyệt đối), lắc đều và cho phản ứng lại ở 100ºC trong 15 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo quang

ở bước sóng λ = 525 nm.

2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp của Lowry [84]. Dung dịch chuẩn được sử dụng là Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serum albumin).

Tiến hành thực nghiệm: 5 mg mẫu hòa tan với 1 ml nước cất. Lấy 100 µl dung dịch mẫu hòa với 2900 µl nước cất trong ống nghiệm pyrex. Thêm 1,0 ml dung dịch A (Lowry reagent – code : L3540 – Sigma ) vào ống nghiệm lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm 0,5 ml thuốc thử Folin 0,4 N, lắc đều và để yên trong 30 phút. Sau 30 phút, tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng (cid:1) = 750 nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu lặp và lấy giá trị trung bình. Sử dụng chất chuẩn BSA (0,5 mg/ml) để tiến hành xây dựng đường chuẩn.

2.2.2.5. Phương pháp xác định thành phần đường đơn monosaccharide

Thành phần của các đường đơn có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về cấu trúc của PS. Các phân đoạn polysaccharide sẽ được thủy phân thành các monosaccharide, sau đó sử dụng các phương pháp phân tích để xác định, trong đó phương pháp sắc kí được sử dụng nhiều nhất vì cho kết quả có độ tin cậy cao, khả năng chọn lọc và độ phân giải tốt. Thành phần đường đơn được xác định theo phương pháp của Dong và cộng sự: polysaccharide sulfate được thủy phân về các monomer bằng acid TFA 2N (Trifluoroacetic acid), trước khi phân tích bằng HPLC (High-performance liquid chromatography–HPLC) ICS- 6000 trên cột Dionex CarboPac MA1, đầu dò điện hóa (Electrochemical Detector-ED), pha động: NaOH 1 M, tốc độ dòng 0,4 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 500 µl, thời gian phân tích là 30 phút đối với dung dịch chuẩn và 60 phút đối với mẫu thử. Thời gian phân tích đối với mẫu thử được thiết lập lâu hơn là do cần kiểm soát các thành phần đường đơn khác có thể có trong mẫu phân tích, bởi vì cột phân tích sử dụng để ứng dụng cho việc phân tích các carbohydrate. Các đường đơn D-Galactose, L-Fucose, D-Glucose, N-Acetyl- galactosamine được sử dụng để tiến hành xây dựng phương trình đường chuẩn. Thành phần các đường đơn trong mẫu phân đoạn PS được thể hiện theo % tỷ

lệ mol dựa vào các đường đơn chuẩn [85].

Tiến hành thực nghiệm : Cân khoảng 10 mg cho vào ống nghiệm thủy tinh có nút vặn kín, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic axít) 2M lắc vortex cho hòa tan, rồi đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ, sau đó cho bay hơi dung môi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nước loại ion (DI), ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút, phần dịch nổi được dùng để phân tích thành phần đường đơn trên hệ thống sắc kí ion ICS – 6000 (Thermoscientific).

2.2.3. Các phương pháp phân tích phổ về cấu trúc của

polysaccharide sulfate

2.2.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại IR

Phương pháp phân tích theo quang phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả. Quang phổ hồng ngoại có thể được sử dụng trong xác định và nghiên cứu cấu trúc, cho biết sự hiện diện của các nhóm chức trong các hợp chất. Một trong những ưu điểm của phương pháp phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử…), đó là cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi nhiều phương pháp tính toán phức tạp. Việc phân tích cấu trúc của PS, với đặc trưng là các mô hình sulfate hóa trên khung mạch chính, nên dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại thu được mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate, trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 2.1). Khi nhóm sulfate ở vị trí axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, vậy nên muốn biết chính xác cần phải tiến hành phân tích dựa vào phổ NMR, để xác định rõ các vị trí của các nhóm sulfate trong cấu trúc của PS đang nghiên cứu.

Bảng 2.1. Các đỉnh phổ, vùng phổ đặc trưng của fucoidan xuất hiện

trên phổ hồng ngoại (IR) [70, 86]

Đỉnh Dao động

775 Dao động dãn vòng của α- anomer

802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6

822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí

equatorial

845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial

847 Dao động của liên kết C1-H của α - anomer

893 Dao động của liên kết C1-H của β - anomer

917 Dao động vòng của α - anomer

1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal

1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C

1255-1264 Dao động hoá trị của S=O

1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO

1430 Dao động gấp của C-H

1730 Dao động hoá trị của C=O

3300-3440 Dao động hoá trị của O-H

Tiến hành: Mẫu các phân đoạn PS được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của PS được ghi trên máy TENSOR 27 - Bruker (Đức) đo tại Viện công nghệ hóa học, số 01 Mạc Đĩnh Chi, Tp. Hồ Chí Minh, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong

vùng số sóng 4.000 - 400 cm-1. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial [70, 87, 88].

2.2.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Để có thể xác định được cấu trúc của một hợp chất, phải kết hợp tối thiểu là giữa phổ IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), trong đó phổ NMR cung cấp nhiều thông tin về vị trí nhóm thế, vị trí liên kết, để có thể giải đoán được cấu trúc của hợp chất nghiên cứu; trên phổ đồ tại vị trí, mà hạt nhân hấp thu năng lượng để có hiện tượng cộng hưởng gọi là độ chuyển dịch hóa học ( δ ). Độ chuyển dịch hóa học của hạt nhân proton 1H, được ký hiệu là δH, δH, thường nằm trong khoảng từ 0 đến 20 ppm. Độ chuyển dịch hóa học của hạt nhân carbon 13C, được ký hiệu là δC, δC, thường nằm trong khoảng 0 đến 240 ppm. Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacaride-), có độ chuyển dịch hóa học nằm trong khoảng từ 1 - 6 ppm. Các proton 1H anomeric của mỗi monosaccharide, có độ chuyển dịch hóa học phụ thuộc vào cấu hình dạng α- hoặc β- của chúng. Hầu như các proton của α-anomeric có độ chuyển dịch hóa học xuất hiện trong vùng từ 5 - 6 ppm, còn các proton của β-anomeric có độ chuyển dịch hóa học xuất hiện ở vùng 4 - 5 ppm. PS thể hiện đặc trưng trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton thu được là dựa vào sự xuất hiện độ dịch chuyển hóa học của nhóm methyl ở vị trí C6, với tín hiệu trong vùng 1,2 – 1,4 ppm, là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl; còn vị trí H-1 (H-α) của PS, có các tín hiệu độ dịch chuyển hóa học trong vùng 5,0 – 5,5 ppm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR thể hiện nhiều đặc trưng của PS, tuy nhiên, với cấu trúc rất phức tạp của PS thì chúng ta phải sử dụng phổ 13C-NMR, để có thể giải đoán và xác định cấu trúc của PS đang nghiên cứu. Với bản chất là cường độ tín hiệu yếu hơn nhiều so với phổ 1H-NMR, tuy nhiên với ưu điểm là cho các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của các carbon trong cấu trúc một vùng rộng hơn 0 - 240 ppm so với phổ 1H-NMR; với vùng tín hiệu δ lớn như vậy, nên các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của 13C-NMR, ít chồng chập lên nhau như trong phổ 1H-NMR. Các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện

trong vùng 90 - 100 ppm, còn với các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của C- nonanomeric xuất hiện trong vùng 60 - 85 ppm. Đối với PS, thì vùng tín hiệu đặc trưng chúng ta thường quan sát trong phổ 13C-NMR, là vùng trường cao 15-20 ppm để nhận biết tín hiệu độ chuyển dịch hóa học là của nhóm methyl – CH3 vị trí C-6 của vòng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của carbon α-anomeric thường xuất hiện trong vùng 95 - 103 ppm, trong khi carbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng 101 - 105 ppm. Còn với nguyên tử carbon của nhóm carboxyl của uronic acid, các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học thường sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp hơn 170 - 180 ppm. Với các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon có gắn với nhóm - OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose, xuất hiện trong vùng trường cao hơn 60 - 64 ppm, trong khi các tín hiệu của các nguyên tử carbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose), thường xuất hiện trong vùng 65 - 87 ppm. Bên cạnh, việc sử dụng phổ IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) để có thể giải đoán, phân tích xác định cấu trúc thường rất phức tạp với các mạch nhánh, chuỗi liên kết khác nhau của PS, các tác giả của các đề tài nghiên cứu thường phải sử dụng kết hợp để làm đơn giản hóa đi cấu trúc của các PS đang nghiên cứu, như bằng các phản ứng hóa học đề metyl hóa, sulfate hóa hay acetyl hóa và sử dụng kết hợp với các kỹ thuật phân tích phổ DEPT-NMR, TOCSY- NMR,… còn sử dụng cả phương pháp phân tích phổ khối lượng (MS) để phân tích cấu trúc, cùng với việc phải sử dụng các phương pháp hóa học để có thể làm tăng độ tinh khiết của các PS như các phương pháp xử lý mẫu, phương pháp chiết tách, thu nhận các phân đoạn bằng các kỹ thuật sắc kí với các cơ chế như trao đổi ion, thẩm thấu gel (loại trừ theo kích thước phân tử).

Tiến hành thực nghiệm: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C- NMR được ghi trên máy Bruker AVANCE III - 500 NMR Spectrometer (Thụy Sỹ) đo tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu các phân đoạn PS được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/ml, đo phổ 1H- NMR ở tần số 500,23 MHz và phổ 13C-NMR được đo ở 125,78 MHz với chất nội chuẩn Tetramethylsilane (TMS).

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE DẠNG THÔ

3.1.1. Tách chiết polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens

Mẫu polysaccharide sulfate (PS) ở loài hải sâm S. horrens sau khi được tách chiết theo phương pháp được mô tả ở mục 2.2.1, kết quả thu được như sau: PS ở dạng thô thu nhận được chiếm tỉ lệ 4,2% so với khối lượng mẫu khô, so sánh với các kết quả nghiên cứu khác về PS cũng thu nhận từ loài S. horrens, ở các khu vực khác trên thế giới có thể thấy, tỉ lệ PS thô trong nghiên cứu này thấp hơn so kết quả nghiên cứu của Ling và cộng sự, 2018 [89] là hơn 6%; tác giả Ustyuzhanina và cộng sự, 2018 [28, 90] cũng nghiên cứu về loài S. horrens nhưng ở Nga cho kết quả hiệu suất chiết cao hơn 11,9 %. So sánh với hàm lượng PS ở các loài hải sâm khác cùng chi Stichopus ta thấy, hàm lượng thu được trong nghiên cứu này cao hơn cao hơn so với loài Stichopus japonicus ở Nhật Bản 0,03% [20], nhưng lại thấp hơn so với một số như Stichopus japonicus ở Trung Quốc là 4,8% [88]; Stichopus tremulus là 7,0% [91] và Stichopus variegatus là 6,8% [75]; và cũng thấp hơn so với một số loài thuộc chi khác như ở chi Holothuria: loài Holothuria nobilis có hàm lượng PS được xác định chiếm 8,3% [16]; loài Holothuria vagabunda thu nhận ở Ấn Độ Dương là 6,3% [91], hay loài Isostichopus badionnotus là 9,9%.

Dựa vào các số liệu về hiệu suất của quá trình chiết tách có thể thấy sự khác nhau và không mang tính quy luật, tỉ lệ rõ ràng về hàm lượng PS trong cùng một loài hải sâm nhưng được thu ở các vị trí địa lý khác nhau, kết quả này cho thấy sự khác nhau về hàm lượng PS từ mỗi loài hải sâm thường chỉ mang tính chất tương đối, được sử dụng để tham khảo so sánh. Do đó, rất khó để đánh giá sự khác nhau về hàm lượng PS giữa các loài trong cùng một chi hay giữa các chi khác nhau. Sự khác nhau trên có thể do là sự khác nhau về cấu trúc thành tế bào cơ thể của các loài hải sâm; bên cạnh đó, hàm lượng PS từ hải sâm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: vị trí thu mẫu, điều kiện địa lý, môi trường sống tại khu vực đó và các phương pháp, kỹ thuật sử dụng để chiết tách

PS cũng là nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng PS [37]. Ví dụ như cùng loài Stichopus japonicus nhưng được thu ở những vị trí khác nhau, đồng thời quy trình chiết tách khác nhau, từ đó dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng PS thu nhận được, theo đó ở loài Stichopus japonicus tại Nhật Bản là 0,03% [20], còn trên loài Stichopus japonicus ở Trung Quốc là 4,8% [88].

Tóm lại, kết quả hàm lượng PS thu nhận được thường sẽ được sử dụng để đánh giá giá trị của các loài hải sâm và làm cơ sở để so sánh, lựa chọn phương pháp chiết tách thích hợp cho từng đối tượng cụ thể.

Bảng 3.1. Hiệu suất chiết polysaccharide sulfate ở một số loài hải sâm.

Hải sâm Hiệu suất chiết PS (%)*

4,2 % Stichopus horrens

Stichopus horrens [89] 6,0 %

Stichopus horrens [28, 90] 11,9 %

Stichopus japonicus [20] 0,03 %

Stichopus japonicus [88] 4,8 %

Stichopus tremulus [91] 7,0 %

Stichopus variegatus [75] 6,8 %

Holothuria nobilis [16] 8,3 %

Holothuria vagabunda [91] 6,3 %

* tính theo trọng lượng nguyên liệu mẫu hải sâm khô.

3.1.2. Thành phần hóa học của polysaccharide sulfate dạng thô từ

hải sâm Stichopus horrens

Thành phần của các đường đơn và hàm lượng sulfate tạo nên các đặc trưng cấu trúc của polysaccharide sulfate, do đó, tiến hành phân tích thành phần này là bước thực hiện quan trọng để có thể giải đoán, phân tích đặc trưng cấu trúc PS cần nghiên cứu.

PS ở hải sâm S. horrens sau khi tách chiết sẽ được tiến hành xác định hàm lượng một số thành phần hóa học cơ bản như carbohydrate, sulfate, acid uronic, protein và thành phần đường đơn, kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.2.

PS thô

Sulfate

Protein

% khối lượng giữa các gốc đường

Uronic acid

**%

Tổng carbohydrate **%

**%

Fuc GalNAc GlcA

Bảng 3.2.Thành phần hóa học của PS dạng thô của hải sâm Stichopus horrens

S.horrens

11,1

10,8

1,3

0,82

36,4

4,9

14,1

S.horrens

13,2

23,2

3,1

25,1

4,7

[90]

S. chloronotus

12,5

40,3

4,2

30,2

5,3

[90]

**% tính theo khối lượng của mẫu PS dạng thô.

Kết quả thể hiện trong bảng 3.2 cho thấy, protein vẫn hiện diện trong mẫu PS thô với tỉ lệ khá cao là 14,1 %, ngoài ra còn có uronic acid với tỉ lệ 4,9 %. Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định là 11,1 %, thấp hơn so với hàm lượng thành phần này ở PS cũng trên loài hải sâm S. horrens nhưng được thu nhận tại Nga trong công bố của Ustyuzhanina và cộng sự [90] là 13,2 %. Kết quả này cũng chênh lệch không quá lớn so với hàm lượng carbohydrate của PS

ở một số loài khác trong cùng chi Stichopus như loài Stichopus chlorontus là 12,5 %. Tuy nhiên, hàm lượng carbohydrate của PS ở loài hải sâm Stichopus horrens lại có sự khác biệt lớn so với PS ở các loài hải sâm thuộc một số chi khác, ví dụ như ở loài Apostichopus japonicus (64,2 %) [1]; Holothuria mexicana (58,54 %) [92], Actinopyga mauritiana (44,62 %), Holothuria leucospilota (44,96 %), Holothuria Scarba (48,65 %) [93].

Hàm lượng sulfate trong PS thu nhận từ loài hải sâm S. horrens trong nghiên cứu này là 36,4 %; cao hơn so với hàm lượng sulfate trong PS cùng trên loài S. horrens được thu nhận tại Nga [28, 90] là 25,1 %. Kết quả này cũng cao hơn so với hàm lượng sulfate của PS thu nhận từ một số loài hải sâm khác như ở loài hải sâm Apostichopus japonicus là 15,74% [1]; loài Ludwigothurea grisea là 13,9 % [5].

Polysaccharide là những carbohydrate cao phân tử chuỗi dài, bao gồm các đơn vị đường đơn (monosaccharide) liên kết với nhau bằng các liên kết glycosidic, có thể phản ứng bị thủy phân bằng các tác nhân như enzyme cho ra các đường đơn cấu thành nên cấu trúc (monosaccharide hoặc oligosaccharide). Kết quả phân tích thành phần đường đơn của mẫu PS từ hải sâm S. horrens cho thấy, cấu tạo PS thu nhận được gồm 03 thành phần đường chính là Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA) với tỉ lệ phần trăm khối lượng khác nhau, trong đó tỉ lệ Fucose (Fuc) chiếm ưu thế. Kết quả này hoàn toàn tương đồng với công bố của Ustyuzhanina và cộng sự, 2018 [28, 90] tại Nga, hay của Song và cộng sự tại Trung Quốc, khi nghiên cứu về PS cũng trên loài S. horrens. Kết quả công bố về thành phần đường đơn của PS ở một số loài hải sâm khác chi trên thế giới như Ludwigothurea grisea, Isosticopus badionotus và Brandthorurea arenicola [8], Apostichopus japonicus, Actinoyaga mauritiana [37], Acaudina molpadioidea, Holothuria nobilis [76], Thelenata ananas [94] cũng cho các kết quả tương tự. Có sự khác biệt nhỏ trong thành phần đường PS từ loài Holothuria atra với 04 gốc đường đơn, bên cạnh 03 gốc đường chính là Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic acid (GlcA) còn có một tỉ lệ nhỏ đường Galactose [77]. Như vậy, từ kết quả nghiên cứu thành phần đường của PS ở các loài hải sâm

khác nhau có thể thấy thành phần đường đơn của polysaccharide sulfate có nguồn gốc từ hải sâm chủ yếu gồm các đường chính là Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA), ngoài ra còn có một hàm lượng nhỏ các gốc đường khác như Galactose (Gal) hay Glucose (Glu) [23, 27].

Dựa vào các kết quả phân tích thành phần hóa học của PS dạng thô từ hải sâm S. horrens nhìn chung thấy được sự tương đồng về thành phần hóa học, nhưng tỉ lệ giữa các thành phần có sự chênh lệch với các loài hải sâm đã được nghiên cứu và công bố trước đó; điều này dẫn đến đặc điểm cấu trúc của PS từ các loài hải sâm khác nhau và sẽ thể hiện các hoạt tính sinh học khác nhau. Kết luận lại là thành phần hóa học của PS dạng thô thu được chưa thể đánh giá được tiềm năng ứng dụng; do đó, phải tiến hành thực hiện các bước tách phân đoạn bằng kỹ thuật sắc kí trao đổi anion, để có thể làm đơn giản hóa việc nghiên cứu cấu trúc của chúng, qua đó có thể dựa vào để đánh giá được tiềm năng của PS từ loài hải sâm S. horrens đang nghiên cứu.

3.2. QUÁ TRÌNH TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

3.2.1. Tách phân đoạn polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus

horrens

Kết quả tách phân đoạn PS từ hải sâm S. horrens bằng kỹ thuật sắc ký

trao đổi anion trên nhựa DEAE-Macro prep được thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1. Tách phân đoạn PS từ hải sâm Stichopus horrens bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion.

Từ sắc ký đồ cho thấy, PS ở hải sâm S. horrens đã được tách thành 2 phân đoạn ở các nồng độ muối NaCl rửa giải khác nhau, gồm phân đoạn F1 (nồng độ muối NaCl từ 0,5 - 0,7 N) và phân đoạn F2 (nồng nồng độ muối NaCl từ 0,7 - 1,2 N). PS từ hải sâm S. horrens có thể có hai nhóm hợp chất tương ứng với mỗi phân đoạn, sự khác nhau về các gốc tích điện âm trong cấu trúc của hai nhóm hợp chất dẫn đến thời điểm được rửa giải khác nhau.

Trong hai phân đoạn thu nhận được, hàm lượng F2 cao hơn so với F1

(16,7% ở F2 so với 12,3% ở F1); hàm lượng PS dạng tinh chế chiếm 1,2 % so với mẫu hải sâm dạng khô. Kết quả này có sự khác biệt không chỉ về số phân đoạn mà còn ở hàm lượng mỗi phân đoạn so với kết quả tách phân đoạn PS ở một số loài khác; như ở loài Holothuria atra (hàm lượng 2 phân đoạn F1, F2 lần lượt là 29,50% và 53,50%) hay Stichopus variegatus (hàm lượng 3 phân đoạn SvF1, SvF2 và SvF3 lần lượt là 18,30%, 20,2% và 46%) [78]. Các loài hải sâm đều có thành phần hóa học khác nhau; vì vậy, quá trình tách phân đoạn có thể thu nhận 2, 3 hoặc nhiều phân đoạn hơn. PS thu nhận từ hải sâm có thể thuộc nhóm Fucosylated chondroitin sulfate (FCS), hay nhóm Fucan sulfate

(FS) và cũng có thể cả hai nhóm. Để có thể xác định rõ điều này phải tiến hành nghiên cứu, phân tích thành phần hóa học và giải đoán cấu trúc của mỗi phân đoạn thu nhận.

3.2.2. Thành phần hóa học các phân đoạn thu được của

polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens

Hai phân đoạn F1 và F2 thu được sau quá trình sắc ký được tiến hành xác định hàm lượng một số thành phần hóa học cơ bản, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Hàm lượng carbohydrate thu được từ hai phân đoạn có sự chênh lệch so với mẫu PS dạng thô, có thể được giải thích là do hàm lượng protein trong mẫu dạng thô chiếm tỉ lệ khá cao 14,1 % khối lượng mẫu khô, trong khi ta có thể thấy hàm lượng protein của phân đoạn F1 chỉ còn chiếm 5,01 %, còn với phân đoạn F2 đều không phát hiện thấy hàm lượng protein. Hàm lượng uronic acid của phân đoạn F1 là 4,7 % khá tương đồng với mẫu PS dạng thô; còn với phân đoạn F2 không phát hiện thấy Uronic acid. Hàm lượng sulfate thu được của hai phân đoạn F1 và F2 lần lượt là 47,4% và 48,1 %; kết quả này cũng có sự chênh lệch giữa dạng thô và các phân đoạn, có thể giải thích cho sự chênh lệch này theo giả thuyết đã đặt ra với hàm lượng carbohydrate. Liên hệ với quá trình tách phân đoạn với kỹ thuật sắc ký trao đổi anion, bản chất pha tĩnh Macro- Prep DEAE là cơ chế trao đổi anion yếu, với các amin bậc 4 liên kết với ion Cl- , các phân đoạn của PS được rửa giải theo chế độ gradient tăng dần nồng độ của NaCl trong dung dịch rửa giải, với hai peak thu được thể hiện trong sắc kí đồ của quá trình tách phân đoạn hình 3.1 khá gần nhau cho thấy sự chênh lệch về mật độ điện tích âm không lớn, hoàn toàn phù hợp với kết quả hàm lượng sulfate khi phân tích hai phân đoạn F1 và F2, cũng cho kết quả chênh lệch không lớn, bởi vì cơ chế rửa giải là phân đoạn nào có mật độ nhóm mang điện tích âm nhỏ hơn thì liên kết với pha tĩnh yếu hơn, sẽ được rửa giải ra trước, còn với phân đoạn nào có mật độ nhóm mang điện tích âm lớn hơn sẽ được rửa giải ra sau.

Bảng 3.3. Thành phần hóa học của PS phân đoạn F1, F2 của hải sâm Stichopus horrens

Tỷ lệ mol giữa các gốc đường Uronic acid PS Sulfate **% Protein **% Tổng carbohydrate **% **% Fuc GalNAc GlcA

F1 12,1 1 0,63 0,41 47,4 4,7 5,01

F2 15,1 1 - - 48,1 - -

**% tính theo khối lượng của mẫu PS của hai phân đoạn F1, F2

Như đã phân tích, để có thể giải đoán và xác định rõ cấu trúc của hai phân đoạn thu được, đầu tiên cần tiến hành phân tích xác định thành phần của các gốc đường đơn (monosaccharide). Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.3, là tỷ lệ mol giữa các gốc đường của các phân đoạn thu được của PS từ hải sâm S. horrens. Hình 3.2 thể hiện sắc kí đồ của các dung dịch chuẩn đường đơn, với 4 peak trên sắc kí đồ tương ứng với 4 đường đơn chuẩn D-Galactose (Gal), L- Fucose (Fuc), D-Glucose (Glu), N-Acetyl-galactosamine (GalNAc), các peak tách nhau rõ ràng với độ phân giải và độ chọn lọc thích hợp cho việc định lượng các thành phần của các gốc đường đơn. Thành phần Glucuronic acid (GlcA) được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Carbazole [83].

Hình 3.2. Sắc ký đồ IC thu được của dung dịch chuẩn của các đường đơn.

Bảng 3.3 thể hiện kết quả phân tích thành phần các gốc đường đơn, và sắc kí đồ trong hình 3.3 và 3.4 của hai phân đoạn F1 và F2 từ hải sâm S. horrens cho thấy, trong phân đoạn F1 có chứa đồng thời cả 3 gốc đường là Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA) với các tỉ lệ mol giữa các gốc đường này là Fuc : GalNAc : GlcA = 1 : 0,63 : 0,41; còn với phân đoạn F2 thì chỉ chứa duy nhất một gốc đường Fucose (Fuc). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả khi phân tích thành phần các gốc đường đơn của mẫu PS dạng thô, tỷ lệ hay phần trăm khối lượng giữa các gốc đường khá tương đồng, có thể đưa ra kết luận sơ bộ là PS có nguồn gốc từ hải sâm S. horrens, chứa hai nhóm hợp chất và cấu trúc chỉ chứa 3 gốc đường đơn Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA).

Hình 3.3. Sắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F1

Hình 3.4. Sắc ký đồ IC của thành phần đường đơn phân đoạn F2

Dựa trên các nghiên cứu về PS từ hải sâm trên thế giới, các phân đoạn có thành phần đường đơn (monosaccharide) bao gồm Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA) và sulfate được xếp vào nhóm Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS), còn những phân đoạn có thành

phần đường đơn chỉ chứa duy nhất Fucose (Fuc) và có chứa nhóm sulfate sẽ được xếp vào nhóm Fucan Sulfate (FS) [7, 12, 28, 90]. Tuy nhiên, vẫn có nghiên cứu thì khi tách phân đoạn thu được 3 peak tương ứng với 3 phân đoạn, ví dụ như nghiên cứu của tác giả Phạm Đức Thịnh và các cộng sự về loài hải sâm Stichopus variegatus [76], sau khi chiết tách phân đoạn thì thu nhận được ba phân đoạn F1, F2, F3 với phân đoạn F1 có chứa năm gốc đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic acid (GlcA), Galactose (Gla), Glucose (Glu), trong đó Galactose (Gla), Glucose (Glu) chỉ chiếm lượng rất thấp và sulfate; phân đoạn F2 có chứa ba gốc đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic acid (GlcA) và sulfate; còn với phân đoạn F3 chỉ chứa duy nhất một gốc đường Fucose (Fuc), và sulfate; tác giả đã xếp các phân đoạn F1 và F2 vào nhóm Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và phân đoạn F3 sẽ thuộc nhóm Fucan Sulfate (FS). Do vậy, để có thể phân biệt và chứng minh, các đặc điểm từ kết quả phân tích thành phần các phân đoạn thu nhận sẽ thuộc nhóm nào ta có thể phân tích như sau: hàm lượng uronic acid được chứng minh có mặt trong tất cả các phân đoạn của nhóm FCS [7], với phân đoạn thuộc nhóm FCS thì ngoài 3 gốc đường chính là Fucose (Fuc), N- Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic acid (GlcA) thì các gốc đường Galactose (Gla) và Glucose (Glu) cũng được phát hiện với hàm lượng rất thấp. Dựa vào cơ chế trao đổi anion yếu của quá trình tách phân đoạn PS từ hải sâm, thì hàm lượng sulfate của các phân đoạn có sự thay đổi tuyến tính tăng dần theo nồng độ của NaCl trong dung dịch rửa giải, điều này đã được giải thích ở lập luận trên, phân đoạn được rửa giải ở nồng độ NaCl càng cao thì sẽ cho ra phân đoạn chứa hàm lượng sulfate cao hơn so với các phân đoạn trước đó.

Tóm tắt lại, PS ở loài hải sâm S. horrens sau khi tách phân đoạn bằng kỹ thuật sắc kí trao đổi anion thu được hai phân đoạn. Từ kết quả về các thành phần hóa học như hàm lượng carbohydrate, tỷ lệ các gốc đường đơn, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid và protein, đồng thời dựa vào các nghiên cứu khác về PS ở các loài hải sâm trên thế giới, thì phân đoạn F1 được xếp vào nhóm Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và phân đoạn F2 được xếp vào nhóm Fucan Sulfate (FS) [8, 23, 27, 29, 37, 77, 94].

3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE CÓ NGUỒN GỐC TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

3.3.1. Phổ hồng ngoại IR

Với đặc trưng là các mô hình sulfate hóa trên khung mạch chính, nên dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate, ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường, sự hiện diện của nhóm sulfate được thể hiện qua sự xuất hiện của các đỉnh tín hiệu đặc trưng cho các liên kết C–O–S tại vùng từ 820 đến 850 cm-1, liên kết S=O tại vùng từ 1255 đến 1264 cm-1; bên cạnh đó, là vùng tín hiệu đặc trưng của nhóm uronic acid trong phổ hồng ngoại thu được từ các phân đoạn; giá trị các vùng tín hiệu đặc trưng tham khảo thể hiện chi tiết trong bảng 2.1 [70, 86].

Kết quả phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ hồng ngoại IR của hai phân đoạn F1 (FCS1) và F2 (FS2) thể hiện trong hình 3.5. Với ba vùng có tín hiệu trong phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F1 (FCS1) (hình 3.5-A), tín hiệu tại vùng có số sóng của những nhóm xuất hiện ở 1250,32 cm-1, tương ứng với dao động kéo giãn không đối xứng của nhóm S=O là đặc trưng cho các sulfate este; những nhóm tín hiệu tại vùng có số sóng ở 825,37 và 848,38 cm-1, thể hiện dao động kéo giãn đối xứng của nhóm C–O–S [30] là vị trí trục (axial) C4 của vòng fucopyranose (4–O–sulfated–Fuc hoặc 4–O–sulfated–GalNAc), vị trí tín hiệu có cường độ nhỏ tại vùng hấp thụ có số sóng ở 586,03 cm-1, gây ra bởi dao động kéo giãn của nhóm S–O, điều này cho thấy rằng, nhóm sulfate cũng có một lượng nhỏ ở vị trí C2 hoặc C3 [30]. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F2 (FS2) (hình 3.5-B), cho thấy xuất hiện tín hiệu có cường độ hấp thụ mạnh ở số sóng 1233,04 cm-1 của nhóm S=O và ở 842,55 cm-1 xác nhận sự hiện diện của 4–O–sulfated–Fuc, theo các nghiên cứu đã được công bố trước đây về nhóm hợp chất Fucan Sulfate (FS) [29, 30]. Các tín hiệu tại các vùng có số sóng ở 1643,97 cm-1 và 1033,9 cm-1 (hình 3.5-A), phản ánh cho dao động kéo giãn không đối xứng, tương ứng với nhóm C=O (carboxyl) và C–O–C, thuộc nhóm uronic acid [30]. Dải hấp thụ tại vùng có số sóng ở 2927,69 và 2937,36 cm-1 phản ánh dao động giãn của nhóm C–H, đại diện cho nhóm methyl của gốc đường fucose, điều này chứng minh rằng, sự hiện diện của gốc

đường fucose trong cả hai phân đoạn F1 (FCS1) và F2 (FS2) [95]. Các tín hiệu tại các vùng có số sóng ở 3448,95 và 3446,46 cm-1, tương ứng với đỉnh có cường độ rộng lớn, do sự dao động hóa trị giãn của O-H [96], phổ đổ thể hiện các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm OH. Xuất hiện tín hiệu ở 1641,69 cm-1 (hình 3.5-B), có thể là tín hiệu cho các dao động của tinh thể nước [30]. Tóm lại, với những kết quả thu được từ phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ hồng ngoại IR của hai phân đoạn F1 (FCS1) và F2 (FS2) từ hải sâm S. horrens, bước đầu cho thấy, các đặc điểm đặc trưng cấu trúc của hai nhóm hợp chất từ hải sâm đang nghiên cứu, có các đặc điểm tương đồng với cùng loài hải sâm và các loài hải sâm khác của các tác giả trên thế giới đã được công bố trước đó [28, 29, 30, 90, 91, 95]. Là cơ sở để có thể khẳng định hai phân đoạn, F1 là nhóm hợp chất thuộc nhóm Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và phân đoạn F2 là nhóm hợp chất thuộc nhóm Fucan Sulfate (FS).

A

C-O-S

C = O

S = O

OH

B

C4-O-S

S = O

OH

Hình 3.5. Phổ hồng ngoại IR các phân đoạn F1 (A) và F2 (B) của PS

ở hải sâm Stichopus horrens

3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Với phổ hồng ngoại IR, chỉ đo các thay đổi của mômen lưỡng cực trong một phân tử; do đó, chỉ giúp ta xác định được các loại dao đặc trưng của các liên kết hay nhóm chức có trong phân tử. Vậy nên phải sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR là 1H-NMR và 13C-NMR, để có thể giải đoán, phân tích được cấu trúc của hợp chất đang nghiên cứu. Hình 3.6 thể hiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của hai phân đoạn F1 (FCS1) và F2 (FS2) từ hải sâm S. horrens; trên phổ đồ xuất hiện nhiều vùng đặc trưng của hai nhóm hợp chất Fucosylated Chondroitin Sulfate (FCS) và Fucan Sulfate (FS). Liên hệ tham khảo dữ liệu phổ thu được, với các nghiên cứu về cấu trúc của hai nhóm hợp chất FCS và FS, có nguồn gốc từ các loài hải sâm khác nhau trên thế giới đã được công bố [16, 37, 90, 95, 97, 98], với phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của hai phân đoạn F1(FCS1) và F2 (FS2), khá phức tạp với nhiều vùng tín hiệu khác nhau cùng với đó là sự chồng chập, trùng lặp nhau của các tín hiệu, độ phân giải khá kém, với phân đoạn F1 (FCS1) do trong thành phần cấu trúc, có chứa đồng thời các gốc đơn vị đường đơn khác nhau, và mật độ sulfate hóa lẫn kiểu liên kết O-glycoside khác nhau, trong cả hai phân đoạn thu được là nguyên nhân gây ra sự phức tạp này. Chúng ta chỉ có thể giải đoán phổ, dựa vào các vùng tín hiệu đặc trưng của hai nhóm hợp chất, mà không thể giải thích được một cách chi tiết tất cả các tín hiệu trên phổ thu được. Hình 3.6 – A là phổ 1H-NMR của phân đoạn F1 (FCS1), cho ta thấy những vùng tín hiệu đặc trưng của nhóm fucosylated chondroitin sulfate (FCS), đó là các tín hiệu có cường độ mạnh của proton H-6 thuộc nhóm methyl (–CH3) vòng fucose, tại độ chuyển dịch hóa học trong vùng từ 1,0 đến 1,4 ppm [16, 93]; phổ 1H-NMR của phân đoạn F2 (FS2) hình 3.6 – B, cũng xuất hiện tín hiệu có cường độ mạnh của proton H-6 thuộc nhóm methyl (–CH3) vòng fucose tại độ chuyển dịch hóa học này. Vùng tín hiệu từ 2,0 đến 3,0 là sự hiện diện nhóm acethyl của vòng GalNAc (CH3CO-), có thể khẳng định lại một lần nữa, là phân đoạn F1 thuộc nhóm fucosylated chondroitin sulfate (FCS), vì có sự hiện diện của các gốc đường đơn fucose và N-Acetyl-galactosamine trong phân đoạn này; bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR của phân đoạn F2 (FS2) hình 3.6 – B, không phát hiện thấy tín hiệu trong vùng này nên không có sự hiện diện nhóm acethyl của vòng

GalNAc (CH3CO-), với kết quả này cho thấy rằng, phân đoạn F2 chỉ chứa duy nhất vòng fucose, khẳng định lại là phân đoạn F2 thuộc nhóm fucan sulfate (FS). Trong vùng độ chuyển dịch hóa học từ 5,0 đến 5,8 là vùng quan sát sự hiện diện của nhóm sulfate hóa của vòng fucose. Hai tín hiệu độ chuyển dịch hóa học ở 5,67 ppm và 5,4 ppm, thể hiện tương ứng cho proton anomeric H1 của vòng pyranose với 2,4-O-disulfated fucose (Fuc2S4S) và 3,4-O-disulfated fucose (Fuc3,4S) [29]. Do đó, phân đoạn F1 (FCS1) chứa hai gốc fucose với kiểu sulfate hóa khác nhau. Tuy nhiên, nghiên cứu về nhóm hợp chất fucosylated chondroitin sulfate (FCS), có nguồn gốc từ loài hải sâm S. horrens được thu thập ở Nga, được công bố chỉ có một kiểu sulfate hóa là 2,4-O- disulfated fucose [28, 90], điều này có thể được giải thích, do sự khác biệt của phương pháp tách chiết, tách phân đoạn và do điều kiện môi trường sống khác nhau, dẫn đến sự khác nhau về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của PS [16, 29, 90]. Vùng tín hiệu proton có độ chuyển dịch hóa học từ 3,3 đến 4,4 ppm (hình 3.6 – A), có thể là sự hiện diện các proton C2 - C5 của vòng glycosidic. Tuy nhiên, rất khó để đưa ra kết luận thông tin chính xác do sự chồng chéo của các tín hiệu [16, 29]. Các kết quả phân tích phổ NMR thu nhận được của phân đoạn F1 từ hải sâm S. horrens, tương đồng với các nghiên cứu đã công bố trước đây, về sự fucosyl hóa chondroitin sulfate từ hai loài hải sâm Holothuria vaganbuda, Holothuria polii [16, 98], chỉ có sự khác biệt là ở mật độ nhóm sulfate và vị trí của nhóm sulfate của vòng pyranose; do đó, cấu trúc của mạch khung của phân đoạn F1 từ hải sâm S. horrens được thể hiện trong hình 3.7.

Trong phổ 1H-NMR (hình 3.6 – B) của phân đoạn F2 (FS2), xuất hiện tín hiệu với độ chuyển dịch hóa học proton anomeric (H1) ở 5,1 – 5,3 ppm, điều này phù hợp với sự tồn tại của các loại đơn vị α-L-fucose khác nhau [99]. Các tín hiệu có cường độ cao tại độ chuyển dịch hóa học 5,19 ppm, tương ứng với gốc 4-O-sulfated-Fucose (Fuc4S) và các tín hiệu khác yếu hơn ở vùng tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học từ 5,3 đến 5,4 ppm được xác định là gốc 2-O- sulfated-Fucose (Fuc2S) [91, 99], kết quả này cũng được xác nhận bởi kết quả của phổ hồng ngoại IR cho phân đoạn F2 (FS2). So sánh đối chiếu với các nghiên cứu về nhóm hợp chất fucan sulfate (FS), từ nguồn gốc các loài hải sâm,

của các tác giả trên thế giới đã được công bố trước đây [16, 88, 89, 99], chỉ ra rằng cấu trúc nhóm hợp chất fucan sulfate (FS), của hải sâm được hình thành từ các kiểu sulfate hóa lên gốc fucose khác nhau. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của tác giả Ustyuzhanina và cộng sự, 2018 [28, 90], đã công bố nhóm hợp chất fucan sulfate được tách chiết phân đoạn từ loài hải sâm S. horrens ở Nga, chỉ chứa một kiểu sulfate hóa lên gốc fucose (Fuc2S); điều này một lần nữa khẳng định, điều kiện môi trường sống khác nhau dẫn đến sự khác nhau về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của PS, tạo nên đặc điểm cấu trúc của các nhóm hợp chất PS vô cùng phong phú và đa dạng.

Hình 3.6. Phổ 1H-NMR các phân đoạn F1 (A) và F2 (B) của PS

ở hải sâm Stichopus horrens

Hình 3.7. Cấu trúc của phân đoạn F1 (FCS1) của PS ở hải sâm Stichopus horrens

Hình 3.8 thể hiện kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C- NMR của phân đoạn F2 (FS2), cũng xuất hiện các vùng tín hiệu đặc trưng của nhóm hợp chất fucan sulfate; phổ đồ cho thấy rằng, các tín hiệu xuất hiện trong vùng có độ chuyển dịch hóa học từ 90 đến 100 ppm, là các tín hiệu đặc trưng cho nhóm methyl của carbon anomeric (C1) và tín hiệu tại độ chuyển dịch hóa học ở 16,00 ppm là tín hiệu đặc trưng cho carbon C6 của nhóm methyl (Fuc- CH3) của vòng fucose [88, 96]. Đồng thời, trong phổ 13C-NMR hình 3.8 và trong phổ 1H-NMR hình 3.6 – B, cũng xuất hiện tương ứng một số các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học ở 92,81 ppm (C1), 5,4 ppm (H1); các tín hiệu này thể hiện sự hiện diện của đơn vị (1→3)-linked α-Fuc2S và tại các tín hiệu độ chuyển dịch hóa học ở 96,84 ppm (C1), 5,19 (H1); các tín hiệu này thể hiện sự hiện diện của đơn vị (1→3)-linked α-Fuc4S [33]. Các tín hiệu xuất hiện trong vùng từ 65 đến 75 ppm, cho thấy sự xuất hiện các carbon C2-C5 của vòng fucose, kết quả này tương tự được đưa ra trong nghiên cứu của tác giả Ustyuzhanina và cộng sự, 2018 [28, 90], đã công bố về nhóm hợp chất fucan sulfate được tách chiết phân đoạn từ loài hải sâm S. horrens ở Nga [28, 90]. Dựa vào các kết quả phân tích phổ NMR của phân đoạn F2 (FS2), cấu trúc của mạch khung của phân đoạn F2 từ hải sâm S. horrens được thể hiện trong hình 3.9.

Hình 3.8. Phổ 13C-NMR phân đoạn F2 của PS ở hải sâm Stichopus horrens

Hình 3.9. Cấu trúc của phân đoạn F2 (FS2) của PS ở hải sâm Stichopus horrens

Tổng kết lại: Từ mẫu hải sâm S. horrens tươi được xử lý sơ bộ và sử dụng các phương pháp tách chiết thu được mẫu polysaccharide sulfate (PS) dạng thô; sử dụng kỹ thuật sắc kí trao đổi anion với cột tách DEAE – Macro Prep (1,6 x 40 cm), để tách phân đoạn đã phân lập được hai phân đoạn thuộc hai nhóm hợp chất từ hải sâm S. horrens F1- fucosylated chondroitin sulfate (FCS1) và F2-fucan sulfate (FS2), tiến hành phân tích thành phần hóa học của hai phân đoạn, kết quả cho thấy cả hai phân đoạn đều chứa hàm lượng sulfate rất cao tương ứng là 47,4 % và 48,1 %, mặc dù hàm lượng carbohydrate khá thấp. Sử dụng các phương pháp phân tích phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, kết hợp kết quả thu được từ hai phương pháp tiến hành phân tích cấu trúc cho thấy, mang đặc điểm đặc trưng cho từng nhóm hợp chất, kiểu sulfate hóa đa dạng ở các vị trí khác nhau của vòng pyranose đối với FCS và vòng fucose đối với FS. Theo các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và ứng dụng của PS cho thấy, với thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của hai phân đoạn thuộc hai nhóm hợp chất F1-fucosylated chondroitin sulfate (FCS1) và F2-fucan sulfate (FS2) có nguồn gốc từ hải sâm S. horrens có thể dự đoán tiềm năng khả quan về hoạt tính sinh học quý và có thể ứng dụng trong các lĩnh vực. Thực hiện nghiên cứu và kết quả thu được của đề tài này sẽ là cơ sở khoa học rất có giá trị cho các bước nghiên cứu tiếp theo sâu hơn, rộng hơn về sự liên kết, mối quan hệ giữa các thành phần hóa học, cũng như đặc điểm cấu trúc với các hoạt tính sinh học và khả năng của các hợp chất PS từ nguồn gốc của hải sâm S. horrens.

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

1. Polysaccharide sulfate (PS) đã được phân lập và chiết tách từ loài hải sâm S. horrens thu thập ở vùng biển Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Kết quả phân đoạn tinh chế bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi anion trên nhựa DEAE-Macro prep cho ra 02 phân đoạn ở các nồng độ dung dịch rửa giải khác nhau gồm: F1 (0,6N NaCl) và F2 (1,0N NaCl), hàm lượng mỗi phân đoạn thu nhận được lần lượt là 12,3 % và 16,7 % được tính so với mẫu PS thô; hàm lượng PS dạng tinh chế chiếm 1,2 % so với mẫu hải sâm ở dạng khô.

2. Kết quả đánh giá một số thành phần hóa học chính của mẫu PS và các

phân đoạn F1, F2 đạt được như sau:

• Thành phần hóa học cơ bản của mẫu PS thô gồm: hàm lượng tổng carbohydrate là 11,1 %; acid uronic là 4,9% và hàm lượng sulfate là 36,4 %. Các gốc đường đơn được xác định gồm 3 gốc đường chính là Fucose, N-Acetyl-Galactosamine và acid Glucuronic với % khối lượng giữa các gốc đường lần lượt là 10,8; 1,3; 0,82.

• Một số thành phần hóa học cơ bản của hai phân đoạn F1 và F2 đã được xác định như hàm lượng sulfate (F1 là 47,4 %; F2 là 48,1 %), uronic acid (F1 là 4,7 %; còn phân đoạn F2 không phát hiện). Kết quả phân tích thành phần đường đơn cho thấy phân đoạn F2 chỉ chứa duy nhất 1 gốc đường fucose, trong khi đó phân đoạn F1 có chứa đồng thời cả 03 gốc đường Fucose, Glucuronic acid, N-Acetyl- galactosamine với các tỉ lệ mol khác nhau. Như vậy, kết quả xác định thành phần hóa học chỉ ra, phân đoạn F2 thuộc nhóm fucan sulfate, và phân đoạn F1 thuộc nhóm fucosylated chondroitin sulfate.

3. Đặc điểm cấu trúc của hai phân đoạn fucosylated chondroitin sulfate (FCS1) và fucan sulfate (FS2) của hải sâm S. horrens bước đầu đã được xác định dựa trên các kết quả phân tích phổ IR và NMR được mô tả như sau:

• Phân đoạn fucosylated chondroitin sulfate (FCS1) được cấu tạo bởi các gốc đường đơn Fucose, N-acetyl-galactosamine và Glucuronic acid theo các tỉ lệ mol lần lượt là 1: 0,63 : 0,41; kiểu sulfate hóa ở vị trí 2,4-O-disulfated fucose (Fuc2S4S) và 3,4-O-disulfated fucose (Fuc3,4S) của vòng pyranose. • Phân đoạn fucan sulfate (FS2) được tạo nên bởi một loại đường đơn là Fucose với kiểu sulfate hóa, các mức độ sulfate hóa Fuc2S và Fuc4S ở vị trí carbon anomeric (C1), kiểu liên kết chủ yếu giữa các gốc đường là liên kết (1→3)-α-Fucopyranose.

4.2. KIẾN NGHỊ

Với các kết quả bước đầu thu được, sẽ tiến hành thêm các nghiên cứu sâu hơn để làm rõ cấu trúc của polysacccharide sulfate ở loài hải sâm S. horrens như phân tích thêm phổ NMR của hai phân đoạn; đánh giá hoạt tính sinh học của polysaccharide sulfate ở loài S. horrens, làm rõ mối quan hệ giữa cấu trúc và các hoạt tính này. Đồng thời, đẩy mạnh các nghiên cứu về polysaccharide sulfate từ các loài hải sâm khác trong vùng biển Việt Nam, để có thể nâng tầm giá trị của các loài hải sâm ở nước ta, tạo cơ sở cho việc quản lý, duy trì, khai thác và sử dụng hiệu quả hơn, nguồn lợi đến từ các nguồn tài nguyên biển vô cùng phong phú và đa dạng của nước ta.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Xua C., Zhanga R., Wenb Z., 2018, Bioactive compounds and biological functions of sea cucumbers as potential functional foods, Journal of Functional Foods, 49, pp. 73 – 84.

[2] Liu X., Sun Z., Zhang M., Meng X., Xia X., Yuan W., Xue F., Liu C., 2012, Antioxidant and antihyperlipidemic activities of polysaccharides from sea cucumber Apostichopus japonicus, Carbohydrate Polymer, 90, pp. 1664 – 1670.

[3] Nadia Ruocco, Susan Costantini, Stefano Guariniello, Maria Costantini, 2016, Polysaccharides from the marine environment with pharmacological, cosmeceutical and nutraceutical potential, Molecules MDPI, 21(5), pp. 551.

[4] Yuri Khotimchenko, 2018, Pharmacological Potential of Sea Cucumbers, International Journal of Molecular Sciences, 19(5):1342.

[5] Ratih Pangestuti, Zainal Arifin, 2017, Medicinal and health benefit effects of functional sea cucumbers, Journal of Traditional and Complementary Medicine, 8(3), pp. 1-11.

[6] Shujuan Shi, Wenjing Feng, Song Hu, Shixiu Liang, Nina An, Yongjun Mao, 2015, Bioactive compounds of sea cucumbers and their therapeutic effects, Chinese Journal of Oceanology and Limnology.

[7] Pang Myron, Shafiquzzaman Siddiquee, Sujjat Al Azad, 2014, Fucosylated chondroitin sulfate diversity in sea cucumbers: A review, Carbohydrate Polymer, 112, pp. 173 – 178.

fractionation of isolation and fucose

[8] Paulo A. S. Mourão, Izaias G. Bastos, 1987, Highly acidic glycans from rich sulfated sea cucumbers polysaccharides from the body wall of Ludwigothurea grisea, European Journal of Biochemistry, 166, pp. 639 – 645.

[9] Yutaka Kariya, Shugo Watabe, Mamoru Kyogashima, Masayuki Ishihara, Tadashi Ishii, 1997, Structure of fucose branches in the glycosaminoglycan

from the body wall of the sea cucumber Stichopus japonicus, Carbohydrate Research, 297(3), pp. 273 – 279.

[10] Peston G.L., 1993, Nearshore marine resources of the Southern Pacific: Information for fisheries development and management, Institute of Pacific Studies, Fiji, Forum Fisheries Agency, Solomon Islands, International Centre for Ocean Development, Canada, pp. 371 – 407.

[11] Đào Tấn Hổ, 2006, Đặc điểm hình thái các loài hải sâm có giá trị thương mại ở biển Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ biển. T6, 2, tr. 72 – 89.

[12] Panning A.,1944, The Trepang fishery Communications from the Zoological State Institute and Zoological Museum, Hamburg, 49, pp. 1 – 76.

[13] Steven W.Purcell, Yves Samyn, Chantal Conand, 2012, Commercially important sea cucumbers of the world. FAO Species Catalogue for Fishery Purposes. No. 6. Rome, FAO.

[14] LV Y., Zheng R., Zuo T., Wang Y., Li Z., Xue Y., Xue C., Tang Q., 2014, Identification of five sea cucumber species through PCR-RFLP analysis, Journal of Ocean University of China, 13, pp.825 – 829.

[15] Thái Trần Bái , 2004, Động vật học không xương sống, tr. 335 – 337.

[16] Chen S., Xue C., Yin L., Tang Q., Yu G., Chai W., 2011, Comparison of structures and anticoagulant activities of fucosylated chondroitin sulfates from different sea cucumbers, Carbohydrate Polymer, 83(2), pp. 688 – 696.

[17] Đào Tấn Hổ, 1991, Nguồn lợi Hải sâm (Holothuroidea) ở vùng biển phía nam Việt Nam. Tuyển tập báo cáo khoa học toàn quốc về biển lần thứ III.

[18] Sara Bordbar, Farooq Anwar, Nazamid Saari, 2011, High-Value Components and Bioactives from Sea Cucumbers for Functional Foods – A Review, Marine Drugs, 9(10), pp. 1761 – 1805.

[19] Bộ thủy sản, Nguồn lợi thủy sản của các nước ở các đảo của Thái Bình Dương- phần 2: Hải sâm, Trung tâm thông tin KH-KT và kinh tế thủy sản.

[20] Kariya Y., Mulloy B., Imai K., Tominaga A., Kaneko T., Asari A., Suzuki K., Masuda H., Kyogashima M., Ishii T., 2004, Isolation and partial

characterization of fucan sulfates from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus and their ability to inhibit osteoclastogenesis, Carbohydrate Research, 339(7), pp. 1339 – 1346.

[21] Fangguo Wang, 1997, Nutrient analysis of frozen sea cucumber Acaudina molpadioidea, Marine Science, 15(4), pp. 65 – 67.

[22] Jinadasa B.K.K.K., Samanthi R.I., Wicramsinghe I., 2014, Trace Metal Accumulation in Tissue of Sea Cucumber Species; North-Western Sea of Sri Lanka, American Journal of Public Health Research, 2(5A), pp. 1 – 5.

[23] Vitor H. Pomin, William P. Vignovich, Alysia V. Gonzales, Ariana A. Vasconcelos, Barbara Mulloy, 2019, Galactosaminoglycans: Medical Applications and Drawbacks, Molecules MDPI, 24(15), pp. 2803.

[24] Woo Sau Pinn, 2018, Systematic Studies on Sea Cucumbers of the Family Stichopodidae (Echinodermata:Holothuroidea), A PhD dissertation, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers:HUSCAP.

[25] http://www.wildsingapore.com/wildfacts/echinodermata/holothuroidea/

/horrens.html.

[26] https://www.sealifebase.se/summary/Stichopus-horrens.html.

[27] Jing Wen, Chaoqun Hu, Sigang Fan, 2010, Chemical composition and nutritional quality of sea cucumbers, Journal of the Science of Food and Agriculture, 90(14), pp. 2469 – 2474.

[28] Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S., Borodina E.Y., Nifantiev N.E., Usov A.I., 2018, A highly regular fucan sulfate from the sea cucumber Stichopus horrens, Carbohydrate Research, 456, pp. 5 – 9.

[29] Pham Duc Thinh, Thanh Thi Thu Thuy, Tran Thi Huyen, Nguyen Van Minh, Tran Thi Thanh Van, Bui Minh Ly, 2016, Isolation, chemical composition and structural characteristic of sulfated polysaccharides from the body wall of sea cucumber Stichopus variegatus collected in Nha trang Bay, Journal of Science and Technology, 54, No 2B.

[30] Li Q., Jiang S., Shi W., Qi X., Song W., Mou J., Yang J., 2020, Structure characterization, antioxidant and immunoregulatory properties of a novel fucoidan from the sea cucumber Stichopus chloronotus, Carbohydrate Polymers, 231, 115767.

[31] Varsha Kale, Jona Freysdottir, Berit S. Paulsen, O´lafur H. Friðjo´nsson, Guðmundur O´li Hreggviðsson, Sesselja Omarsdottir, 2013, Sulphated polysaccharide from the sea cucumber Cucumaria frondosa affect maturation of human dendritic cells and their activation of allogeneic CD4(+) T cells in vitro, Bioactive Carbohydrates and dietary fibre 2, I08 – I17.

[32] Yu L., Ge L., Xue C., Chang Y., Zhang C., Xu X., Wang Y., 2014, Structural study of fucoidan from sea cucumber Acaudina molpadioides: A fucoidan containing novel tetrafucose repeating unit, Food Chemistry, 142, pp. 197 – 200.

[33] Wu M., Xu L., Zhao L., Xiao C., Gao N., Luo L., Yang L., Li Z., Chen L., Zhao J., 2015, Structural analysis and anticoagulant activities of the novel sulfated fucan possessing a regular well-defined repeating unit from sea cucumber, Marine Drugs ,13(4), pp. 2063 – 2084.

[34] Ana Cristina E.S. Vilela Silva, Ana Paula Alves, Ana Paul Valente, Victor D.Vacquier, Paulo A.S.Mourão, 1999, Structure of the sulfated α-L-fucan from the egg jelly coat of the sea urchin Strongylocentrotus franciscanus: patterns of preferential 2-O- and 4-O-sulfation determine sperm cell recognition, Oxford University Press Glycobiology, 9(9), pp. 927 – 933.

[35] Paulo A.S.Mourão, 2015, Perspective on the use of sulfated polysaccharides from marine organisms as a source of new antithrombotic drugs, Marine Drugs, 13, pp. 2770 – 2784.

[36] Vitor H. Pomin, Paulo A.S.Mourão, 2014, Specific sulfation and glycosylation – A structural combination for the anticoagulation of marine carbohydrates, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 4(33).

[37] Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S., Tsvetkova E.A., Shashkov A.S., Stonik V. A., Nifantiev N.E., Usov A.I., 2016, Structural

characterization of fucosylated chondroitin sulfates from sea cucumbers Apostichopus japonicus and Actinopyga mauritiana, Carbohydrate Polymers, 153, pp. 399 – 405.

[38] Panagos C.G., Thomson D.S., Moss C., Hughes A.D., Kelly M.S., Liu Y., Chai W., Venkatasamy R., Spina D., Page C.P., Hogwood J., Woods R.J., Mulloy B., Bavington C.D.,Uhrín D., 2014, Fucosylated chondroitin sulfates from the body wall of the sea cucumber Holothuria forskali: Conformation, selectin binding, and biological activity, Journal of Biological Chemistry, 289(41), pp. 28284 – 28298.

[39] Vieira R.P., Mulloy B., Paulo A.S.Mourão, 1991, Structure of a fucose- branched chondroitin sulfate from sea cucumber: evidence for the presence of 3-O-sulfo-β-D-glucuronosyl residues, Journal of Biological Chemistry, 266, pp.13530 – 13536.

[40] Vitor H. Pomin, 2014, Holothurian fucosylated chondroitin sulfates. Marine Drugs, 12, pp. 232 – 254.

[41] Paulo A.S.Mourão, Pereira M.S., Pavão M.S.G., Mulloy B., Tollefsen D.M., Mowinckel M.C., Abildgaard U., 1996, Structure and anticoagulant activity of a fucosylated chondroitin sulfate from echinoderm. Sulfated fucose branches on the polysaccharide account for its high anticoagulant action, Journal of Biological Chemistry, 271(39), pp. 23973 – 23984.

[42] Ken-ichiro Yoshida, Yoshinori Minami, 1992, Structure of DHG, a depolymerized holothurian glycosaminoglycan from sea cucumber Stichopus japonicus. Tetrahedron lett, 33, pp. 4959 – 4962.

[43] Luo L., Wu M., Xu L., Lian W., Xiang J., Lu F., Gao N., Xiao C., Wang S., Zhao J., 2013, Comparison of physicochemical characteristics and anticoagulant activities of polysaccharides from three sea cucumbers, Mar. Drugs, 11, pp. 399 – 417.

[44] Roberto J C Fonseca, Gustavo R C Santos, Paulo A.S.Mourão, 2009, Effects of polysaccharides enriched in 2,4-disulfated fucose units on

coagulation, thrombosis and bleeding. Practical and conceptual implications, Thromb. Haemost., 102, pp. 829 – 836.

[45] Morya V. K., Kim J., Kim E.K., 2012, Algal fucoidan: Structural and size dependent bioactivities and their perspectives, Applied Microbiology and Biotechnology, 93(1), pp.71 – 82.

[46] Vitor H. Pomin, Paulo A.S.Mourão, 2008, Structure, biology, evolution, and medical importance of sulfated fucans and galactans. Glycobiology, 18(12), pp. 1016 – 1027.

[47] Hu S., Xia G., Wang J., Wang Y., Li Z., Xue C., 2014, Fucoidan from sea cucumber protects against high-fat high-sucrose diet-induced hyperglycaemia and insulin resistance in mice, Journal of functional foods, 10, pp. 128 – 138.

[48] Borsig L., Wang L., Cavalcante M.C., Cardilo-Reis L., Ferreira P.L., Paulo A.S.Mourão, Esko. J.D., Pavao M.S., 2007, Selectin blocking activity of a fucosylated chondroitin sulfates glycosaminoglycan from sea cucumber. Effect on tumor metastasis and neutrophil recruitment, Journal of Biological Chemistry, 282, pp. 14984 – 1499.

[49] Liu X., Liu Y., Hao J., Zhao X., Lang Y., Fan F., Cai C., Li G., Zhang L., Yu G., 2016, In Vivo Anti-Cancer Mechanism of Low-Molecular-Weight Fucosylated Chondroitin Sulfate (LFCS) from Sea Cucumber Cucumaria frondosa, Molecules MDPI, 21(5), pp. 625.

[50] Kato D., Era S., Watanabe I., Arihara M., Sugiura N., Kimata K., Suzuki Y., Morita K., Hidari K.I.P.J., Suzuki T., 2010, Antiviral activity of chondroitin sulphate E targeting dengue virus envelope protein, Antiviral Research, 88(2), pp. 236 – 243.

[51] Vitor H. Pomin, 2015, Medical Gains of Chondroitin Sulfate Upon Fucosylation, Current Medicinal Chemistry, 22(999), pp. 4166 – 4176.

[52] Tapon-Bretaudière J., Drouet B., Matou S., Mourão A.S., Bros A., Letourneur D., Fischer A.M., 2000, Modulation of Vascular Human Endothelial and Rat Smooth Muscle Cell Growth by a Fucosylated Chondroitin Sulfate from Echinoderm, Thromb Haemost, 84(2),pp.332 – 337.

[53] Boisson-vidal C., Tapon-Bretaudière J., Mourão P.A.S., 2001, Inactivation of Thrombin by a Fucosylated Chondroitin Sulfate from Echinoderm, Thrombosis Research, 102(2), pp. 167–176.

[54] Chen S., Li G., Wu N., Guo X., Liao N., Ye X., Liu D., Xue C., Chai W., 2013, Sulfation pattern of the fucose branch is important for the anticoagulant and antithrombotic activities of fucosylated chondroitin sulfates, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1830 (4), pp. 3054 – 3066.

[55] Glauser B.F., Paulo A.S.Mourão, Pomin V.H., 2013, Marine Sulfated Glycans with Serpin-Unrelated Anticoagulant Properties, Advances in clinical chemistry, 62, pp. 269 – 303.

[56] Paulo A.S.Mourão, Guimarães M.A.M., Mulloy B., Thomas S., Gray E., 1998, Antithrombotic activity of a fucosylated chondroitin sulphate from echinoderm: Sulphated fucose branches on the polysaccharide account for its antithrombotic action, British journal of haematology, 101(4), pp. 647 – 652.

[57] Vitor H. Pomin, 2014, Anticoagulant motifs of marine sulfated glycans, Glycoconjugate Journal, 31(5), pp. 341 – 344.

[58] Li Q., Cai C., Chang Y., Zhang F., Linhardt R.J., Xue C., Li G., Yu G., 2018, A novel structural fucosylated chondroitin sulfate from Holothuria Mexicana and its effects on growth factors binding and anticoagulation, Carbohydrate Polymers, 181, pp. 1160 – 1168.

[59] Liu X., Hao J., Shan X., Zhang X., Zhao X., Li Q., Wang X., Cai C., Li G., Yu G., 2016, Antithrombotic activities of fucosylated chondroitin sulfates and their depolymerized fragments from two sea cucumbers, Carbohydrate Polymers, 152, pp. 343 – 350.

[60] Santos G.R.C., Glauser B.F., Parreiras L.A., Vilanova E., 2015, Distinct structures of the α -fucose branches in fucosylated chondroitin sulfates do not affect their anticoagulant activity, Glycobiology, 25, pp. 1 – 32.

[61] Monteiro-Machado M., Tomaz M.A., Fonseca R.J.C., Strauch M.A., Cons B.L., Borges P.A., Patr F.C., Tavares-Henriques M.S., Teixeira-Cruz J.M., Calil-Elias S., et al., 2015, Occurrence of sulfated fucose branches in

fucosylated chondroitin sulfate are essential for the polysaccharide effect preventing muscle damage induced by toxins and crude venom from Bothrops jararacussu snake, Toxicon, 98, pp. 20 – 33.

[62] Lian W., Wu M., Huang N., Gao N., Xiao C., Li Z., Zhang Z., Zheng Y., Peng W., Zhao J., 2013, Anti-HIV-1 activity and structure-activity-relationship study of a fucosylated glycosaminoglycan from an echinoderm by targeting the conserved CD4 induced epitope, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1830(10), pp. 4681 – 4691.

[63] Huang N., Wu M., Zheng C., Zhu L., Zhao J., Zheng Y., 2013, The depolymerized fucosylated chondroitin sulfate from sea cucumber potently inhibits HIV replication via interfering with virus entry, Carbohydrate Research, 380, pp. 64 – 69.

[64] Vitor H. Pomin, 2017, Antimicrobial Sulfated Glycans: Structure and Function, Current topics in medicinal chemistry, 17, pp. 319 – 330.

[65] Zhao Y., Zhang D., Wang S., Tao L., Wang A., Chen W., Zhu Z., Zheng S., Gao X., Lu Y., 2013, Holothurian Glycosaminoglycan Inhibits Metastasis and Thrombosis via Targeting of Nuclear Factor- kB/Tissue Factor/Factor Xa Pathway in Melanoma B16F10 Cells, PLoS ONE, 8(2), e56557.

[66] He M., Wang J., Hu S., Wang Y., Xue C., Li H., 2014, The Effects of Fucosylated Chondroitin Sulfate Isolated from Isostichopus badionotus on Antimetastatic Activity via Down- regulation of Hif-1α and Hpa, Food Science Biotechnology, 23, pp. 1643 – 1651.

[67] Phạm Đức Thịnh, 2017, Báo cáo: Nghiên cứu các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ một số sinh vật biển của vịnh Nha Trang sử dụng phương pháp chiết tách bằng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn, Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha trang.

[68] Olivier Berteau, Barbara Mulloy, 2003, Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide, Glycobiology, 13(6), pp. 29R – 40R.

[69] Alves A.P., Mulloy B., Diniz J.A., Mourão P.A.S., 1997, Sulfated polysaccharides from the Egg Jelly Layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins, The Journal of Biological Chemistry, 272 (11), pp. 6965 – 6971.

[70] Mohamed Ben Mansour, Rafik Balti, Lamia Yacoubi, Véronique Ollivier, Frédéric Chaubet, Raoui Mounir Maaroufi, 2019, Primary structure and anticoagulant activity of fucoidan from the sea cucumber Holothuria polii, International Journal of Biological Macromolecules, 121, pp. 1145 – 1153.

[71] Joanne Katherine Talens Manlusoc, Chieh-Lun Hsieh, Cheng-Yang Hsieh, Ellen San Nicolas Salac, Ya-Ting Lee, Po-Wei Tsai, 2019, Pharmacologic Application Potentials of Sulfated Polysaccharide from Marine Algae, Polymers MDPI, 11(7), pp. 1163.

[72] Dai-Hung Ngo, Se-Kwon Kim, 2013, Sulfated polysaccharides as bioactive agents from marine algae, International Journal of Biological Macromolecules, 62, pp. 70 – 75.

[73] http://www.nitra.ac.vn/tabid/63/id/329/language/vi-VN/Default.aspx.

[74] http://baochinhphu.vn/Bien-Viet-Nam/Da-xac-dinh-danh-muc-gan- 12000-loai-sinh-vat-bien-Viet-Nam/330856.vgp.

[75] Pham Duc Thinh, Bui Minh Ly, Roza V. Usoltseva, Natalia M.Shevchenko, Anton B. Rasin, Stanislav D. Anastyuk, Olesya S.Malyarenko, Tatiana N. Zvyagintseva, Pham Trung San, Svetlana P. Ermakova, 2018, A novel sulfated fucan from Vietnamese sea cucumber Stichopus variegatus: Isolation, structure and anticancer activity in vitro, International Journal of Biological Macromolecules, 117, pp. 1101 – 1109.

[76] Pham Duc Thinh, Tran Thanh Huyen, Tran Thi Thanh Van, Cao Thi Thuy Hang, Dinh Thanh Trung, Pham Trung San, 2019, Extraction and structural characteristic of polysaccharide sulfate from sea cucumber Holothuria spinifera, Vietnam Journal of Chemistry, 57(4E1,2):108-13.

[77] Mai Ngô Thương Hoài, 2019, Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra, Luận văn

thạc sĩ, Học viện khoa học và công nghệ, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

[78] Dong X., Pan R., Deng X., Chen Y., Zhao G., Wang C., 2014, Separation purification, anticoagulant activity and preliminary structural characterization of two sufated polysaccharides from sea cucumber Acaudina molpadioidea and Holothuria nobilis, Process Biochemistry, 49, pp. 1352 – 1361.

[79] Storer A.C., Ménard R., 2013, Papain, Handbook of Proteolytic Enzymes, Chapter 419, pp. 1858 – 1861.

[80] Qin Y., Yuan Q., Zhang Y., Li J., Zhu X., Zhao L., Wen J., Liu J., Zhao L., Zhao J., 2018, Enzyme-Assisted Extraction Optimization, Characterization and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Sea Cucumber Phyllophorus proteus, Molecules MDPI, 23(3), 590, pp. 1 – 19.

[81] Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F., 1956, Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry, 28(3), pp. 350 – 356.

[82] Dodgson K.S., Price R.G., 1962, A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides, Biochemical Journal, 84(1), pp. 106 – 110.

[83] Bitter T., Muir H.M., 1962, A modified uronic acid carbazole reaction. Analytical Biochemistry, 4(4), pp. 330 – 334.

[84] Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.l., Randall R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagent, Journal of Biological Chemistry, 193(1), pp. 265 – 275.

[85] Thermo Scientific, 2013, Column Product Manual, Dionex CarboPac MA1, 18 pages.

[86] Phạm Đức Thịnh, 2015, Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở Vịnh Nha Trang, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội.

[87] Yang D., Lin F., Huang Y., Ye J., Xiao M., 2020, Separation, purification, structural analysis and immune-enhancing activity of sulfated polysaccharide isolated from sea cucumber viscera, International Journal of Biological Macromolecules, 115, pp. 1003 – 1018.

[88] Song S., Wu S., Ai C., Xu X., Zhu Z., Cao C., Yang J., Wen C., 2018, Compositional analysis of sulfated polysaccharides from sea cucumber (Stichopus japonicus) released by autolysis reaction, International Journal of Biological Macromolecules, 114, pp. 420 – 425.

[89] Zhao L., Liu Q., Yang X., Cao R., 2018, Comparative Study on Antineoplastic Activity of Polysaccharide from Four Kinds of Sea Cucumber, Journal of Ocean University of China, 17, pp. 1473 – 1478.

[90] Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I., 2018, Two structurally similar fucosylated chondroitin sulfates from the holothurian species Stichopus chloronotus and Stichopus horrens, Carbohydrate Polymers, 189, pp. 10 – 14.

[91] Wu N., Chen S., Ye X., Li G., Yin L., Xue C., 2014, Identification of fucans from four species of sea cucumber by high temperature 1H-NMR, Journal of Ocean University of China, 13(5), pp. 871 – 876.

[92] Jiaojiao Mou, Cong Wang, Wenjing Li, Jie Yang, 2017, Purification, structural characterization and anticoagulant properties of fucosylated chondroitin sulfate isolated from Holothuria mexicana, International Journal of Biological Macromolecules, 98, pp. 208 – 215.

[93] Nahla El-Sayed El-Shazly Omran, 2013, Nutritional value of some Egyptian sea cucumbers, African Journal of Biotechnology, 12(35), pp. 5466 – 5472.

free

[94] Wu M., Xu S., Zhao J., Kang H., Ding H., 2010, Preparation and characterization of molecular weight fractions of glycosaminoglycan from sea cucumber Thelenata ananas using radical depolymerization, Carbohydrate Research, 345, pp. 649 – 655.

[95] Tapon-Bretaudiere J., Chabut D., Zierer M., Matou S., Helley D., Bros A., Mourão P.A., Fischer A.M., 2002, A fucosylated chondroitin sulfate from echinoderm modulates in vitro fibroblast growth factor 2-dependent angiogenesis, Molecular Cancer Research, 1(2), pp. 96 – 102.

[96] Pang Myron, Shafiquzzaman Siddiquee, Sujjat Al Azad, 2017, Partial structural studies of fucosylated chondroitin sulfate (FuCS) using attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and chemometrics, Vibrational Spectroscopy, 89, pp. 26 – 36.

[97] Mohamed Ben Mansour, Rafik Balti, Véronique Ollivier, Hichem Ben Jannet, Frédéric Chaubet, Raoui Mounir Maaroufi, 2017, Characterization and anticoagulant activity of a fucosylated chondroitin sulfate with unusually procoagulant effect from sea cucumber, Carbohydrate Polymers, 174, pp. 760 – 771.

[98] Yu L., Xue C., Chang Y., Xu X., Ge L., Liu G., Wang Y., 2014, Structure elucidation of fucoidan composed of a novel tetrafucose repeating unit from sea cucumber Thelenota ananas, Food Chemistry, 146, pp. 113 – 119.

[99] Pereira M.S., Oehninger S., Barnett T., Williams R.L., Clark G.F., 1999, Structure and anticoagulant activity of sulfated fucans. Comparison between the regular, repetitive, and linear fucans from echinoderms with the more heterogeneous and branched polymers from brown algae, Journal of Biological Chemistry, 247(12), pp. 7656 – 7667.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn D-Glucose trong phân tích hàm lượng carbohydrate mẫu PS dạng thô.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Carbohydrate

y = 0.0084x - 0.0364 R² = 0.9989

m n 0 9 4 D O

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

100

150

250

200 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucose (ug/ml)

Phụ lục 2: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn K2SO4 trong phân tích hàm lượng sulfate mẫu PS dạng thô.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate

0,35

0,3

y = 0.0005x - 0.0779 R² = 0.9957

0,25

0,2

0,15

m n 0 6 3 D O

0,1

0,05

200

300

400

600

700

800

500 Nồng độ dung dịch chuẩn K2SO4 (ug/ml)

Phụ lục 3: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid trong phân tích hàm lượng uronic acid mẫu PS dạng thô.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Uronic acid

0,6

0,5

y = 0.0041x + 0.0011 R² = 0.996

0,4

0,3

0,2

m n 5 2 5 D O

0,1

100

120

60 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid (ug/ml)

Phụ lục 4: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn BSA trong phân tích hàm lượng protein mẫu PS dạng thô.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Protein

1,000

0,800

y = 0.0065x + 0.0702 R² = 0.9991

0,600

0,400

m n 0 5 7 D O

0,200

0,000

0,00

20,00

40,00

80,00

100,00

120,00

60,00 Nồng độ dung dịch chuẩn BSA (ug/ml)

Phụ lục 5: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn D-Glucose trong phân tích hàm lượng carbohydrate các phân đoạn PS.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Carbohydrate

1,8

1,6

y = 0.0083x + 0.0333 R² = 0.999

1,4

1,2

0,8

m n 0 9 4 D O

0,6

0,4

0,2

100

150

250

200 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucose (ug/ml)

Phụ lục 6: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn K2SO4 trong phân tích hàm lượng sulfate các phân đoạn PS.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate

0,35

0,3

y = 0.0005x - 0.0526 R² = 0.9955

0,25

0,2

0,15

m n 0 6 3 D O

0,1

0,05

200

300

400

600

700

800

500 Nồng độ dung dịch chuẩn K2SO4 (ug/ml)

Phụ lục 7: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid trong phân tích hàm lượng uronic acid các phân đoạn PS.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Uronic acid

0,6

0,5

y = 0.0042x + 0.0009 R² = 0.9974

0,4

0,3

0,2

m n 5 2 5 D O

0,1

100

120

60 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid (ug/ml)

Phụ lục 8: Đồ thị xây dựng đường chuẩn của dung dịch chuẩn BSA trong phân tích hàm lượng protein các phân đoạn PS.

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Protein

1,000

0,800

y = 0.0065x + 0.0681 R² = 0.9983

0,600

0,400

m n 0 5 7 D O

0,200

0,000

0,00

20,00

40,00

80,00

100,00

120,00

60,00 Nồng độ dung dịch chuẩn BSA (ug/ml)

Phụ lục 9: Sắc ký đồ IC của PS dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 10: Sắc ký đồ IC của phân đoạn PS F1 từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 11: Sắc ký đồ IC của phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 12: Phổ IR của mẫu PS dạng thô từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 13: Phổ IR của phân đoạn PS F1 từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 14: Phổ IR của phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR của phân đoạn PS F1 từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR của phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens.

Phụ lục 17: Phổ 13C-NMR của phân đoạn PS F2 từ hải sâm Stichopus horrens.

Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Xác định thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate từ hải sâm Stichopus horrens

Dương Khánh Minh

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE

TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

Nha Trang - 2020

Dương Khánh Minh

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE

TỪ HẢI SÂM STICHOPUS HORRENS

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Mã số: 8440118

Nha Trang – 2020

-) *

S.horrens

11,1

10,8

1,3

0,82

36,4

4,9

14,1

A

C-O-S

C = O

S = O

OH

B

C4-O-S

S = O

OH

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Carbohydrate

m n 0 9 4 D O

200 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucose (ug/ml)

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate

m n 0 6 3 D O

500 Nồng độ dung dịch chuẩn K2SO4 (ug/ml)

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Uronic acid

m n 5 2 5 D O

60 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid (ug/ml)

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Protein

m n 0 5 7 D O

60,00 Nồng độ dung dịch chuẩn BSA (ug/ml)

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Carbohydrate

m n 0 9 4 D O

200 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucose (ug/ml)

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate

m n 0 6 3 D O

500 Nồng độ dung dịch chuẩn K2SO4 (ug/ml)

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Uronic acid

m n 5 2 5 D O

60 Nồng độ dung dịch chuẩn D-Glucuronic acid (ug/ml)

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Protein

m n 0 5 7 D O

60,00 Nồng độ dung dịch chuẩn BSA (ug/ml)

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Huỳnh quang và hóa phát quang: Chương 3 - Hóa phát quang

Luận văn Thạc sĩ: Chế tạo và nghiên cứu tính chất điện, từ của vật liệu multiferroic Ba₀.₇Ca₀.₃TiO₃/ NiFe₂O₄

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu vật liệu biến hóa dạng chuỗi một chiều chế tạo từ kim loại đồng trên đế FR-4 hoạt động tại tần số MHz ứng dụng trong truyền năng lượng không dây

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá khả năng tác động tới môi trường biển của việc xả nước thải từ sự cố nhà máy điện hạt nhân Fukushima sử dụng công cụ ERICA

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mô hình đầu dò nơtron và gamma sử dụng nhấp nháy EJ-276 ghép nối với mảng nhân quang silicon

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá khả năng ảnh hưởng của bức xạ ion hóa đến sức khỏe cư dân khu vực mỏ đất hiếm Đông Pao, xã Bản Hon, huyện Tam Đường, tỉnh Lai Châu

Luận văn Thạc sĩ: Sử dụng phương pháp nhiễu xạ neutron khảo sát cấu trúc tinh thể và pha trật tự từ trong vật liệu Pr2FeCrO6

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính ức chế NO của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm biển Aspergillus sp. CL251

Luận văn Thạc sĩ: Phân tích một số hợp chất bisphenol thôi nhiễm từ bao bì nhựa lên một số mẫu thực phẩm nền tinh bột

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của loài hoa mộc (Osmanthus fragrans (Thunb.) Lour.) ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng viêm của loài côi Turpinia montana (Blume) Kurz

Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đặc trưng tính chất vật liệu composite có cấu trúc nano chitosan–cyclodextrin/TiO₂–Ag

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu chế tạo và khảo sát một số tính chất của màng phủ trên cơ sở nhựa epoxy gốc nước và khung cơ kim - ZIF

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất napthoquinone chứa nguyên tố flo bằng phản ứng đa thành phần

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu điều chế vật liệu Bioglass và tổ hợp lai với polymer ALG-F127 định hướng ứng dụng trong điều trị nội nha

Luận văn Thạc sĩ: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase trên một số hợp chất phân lập từ thịt quả bình bát nước (Annona glabra L.).

Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất của benzazole

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu chiết tách lignin từ vỏ sầu riêng Ri6 (Durio zibethinus Murr.) và tổng hợp vật liệu biocomposite định hướng ứng dụng trong bảo quản sau thu hoạch

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hạt nano bạc phủ acid hyaluronic mang doxorubicin định hướng ứng dụng trong điều trị ung thư

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê