Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chuyển gen codA mã hóa enzyme sinh tổng hợp glycine betain dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng khô hạn RD29A vào cây đậu tương

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TẠ THỊ ĐÔNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA MÃ HÓA ENZYME SINH TỔNG

HỢP GLYCINE BETAIN DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER

CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

Mã số: 60 42 01 14

Người hướng dẫn: PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ

Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội, 10/2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới

sự hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà. Các nội dung nghiên cứu, kết quả

trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình

thức nào.

Luận văn sử dụng thông tin, số liệu và hình ảnh từ các bài báo và nguồn tài

liệu của các tác giả khác đều được chú thích và trích dẫn đầy đủ.

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội

dung luận văn.

Hà Nội, tháng 10 năm 2017

Học viên

Tạ Thị Đông

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà đã tận tình

hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học

tập, làm việc và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Nguyễn Văn Đoài, cùng

tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên Phòng Công nghệ tế bào thực vật,

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian

thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và Ban đào tạo Viện Sinh

thái và Tài nguyên sinh vật đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong

suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ và chia sẻ,

động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn.

Hà Nội, tháng 10 năm 2017

Học viên

Tạ Thị Đông

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii

MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ..............................................................vi

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vii

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

NỘI DUNG...................................................................................................................... 2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 2

1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ

DỤNG .............................................................................................................................. 2

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ........................................................................................ 2

1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................................ 3

1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương ............................................. 4

1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 5

1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG .......................... 7

1.2.1. Tác động của hạn đến hệ rễ .................................................................................. 8

1.2.2. Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm ....................................................... 8

1.2.3. Tác động của hạn đến hình thái lá ...................................................................... 10

1.3. GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB ......... 10

1.3.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường ở thực vật .................. 10

1.3.2. Các con đường sinh tổng hợp GB ...................................................................... 12

1.3.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp GB tăng cường khả năng chống chịu điều

kiện môi trường bất lợi .................................................................................................. 14

1.4. PROMOTER VÀ PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A ................... 20

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter .................................................................. 20

1.4.2. Promoter cảm ứng khô hạn RD29A ................................................................... 20

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN ...... 21

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 28

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 28

2.1.1. Vật liệu thực vật.................................................................................................. 28

2.1.2. Chủng vi khuẩn và vector ................................................................................... 28

2.1.3. Hóa chất thiết bị .................................................................................................. 29

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 29

2.2.1. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen pIBTII- rd29A-codA .................. 29

2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium .............. 34

2.2.3. Phương pháp đánh giá cây thuốc lá chuyển gen codA ....................................... 34

2.2.4. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen ...................................................... 34

2.2.5. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng phản ứng PCR ........... 36

2.2.6. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng Phosphinothricin ....... 36

2.2.7. Xây dựng đường chuẩn xử lý hạn ở giống đậu tương ĐT22. ............................. 37

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 38

3.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA DƯỚI

SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A ..................... 38

3.1.1. PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis với mồi RD29A-HindIII-F và

RD29A-Xbal-R. .............................................................................................................. 38

3.1.2. Tách dòng rd29A bằng vector pBT, cắt pBT-rd29A và pIBTII-35S-codA với

HindIII và Xbal .............................................................................................................. 38

3.1.3. Nối rd29A với pIBTII-codA, biến nạp vào E.coli, chọn dòng băng phản ứng

cloni PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-XbaL-R ........................................... 39

3.1.4. Biến nạp pIBTII-rd29A-codA vào Agrobacterium chọn dòng băng phản ứng

colony PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R .......................................... 40

3.2. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO THUỐC LÁ THÔNG QUA VI

KHUẨN AGROBACTERIUM. ...................................................................................... 41

3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào giống thuốc lá K326. ........... 41

3.2.2. Kết quả đánh giá và phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen ............................ 42

3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá chuyển gen ........ 43

3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 ......... 44

3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. Tumefacien sử dụng cho biến nạp đến khả

năng cảm ứng tạo chồi ................................................................................................... 44

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ ppt (Phosphinothricin) đến hiệu quả chuyển gen ...... 45

3.3.3. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương ............................ 46

3.4. PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN .. 49

3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA

bằng phản ứng PCR ....................................................................................................... 49

3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-codA

bằng ppt ......................................................................................................................... 50

3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22 ........................... 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 68

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

AS

Acetosyrigone

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

6-benzyladenine purin

BAP

Glycine Betain

GB

Base pair

bp

Cocultivation medium

CCM

Deoxyribonucleic acid

DNA

Escherichia coli

E. coli

Gibberellic acid

GA3

Germination medium - Môi trường nảy mầm

GM

Indoleacetic acid

IAA

Indole-3-butyric acid

IBA

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

MS

α-Naphthaleneacetic acid

NAA

Optical density

OD

Polymerase Chain Reaction

PCR

Phosphinothricin

PPT

Rooting medium - Môi trường ra rễ

RM

Shoot induction medium - Môi trường tạo chồi

SIM

Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi

SEM

Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

T-DNA

Các thế hệ cây đậu tương chuyển gen

T0, T1

Yeast extract peptone

YEP

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) ................................................. 6

Bảng 1.2. Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp

GB, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi. ................................. 18

Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương trên thế giới .. 23

Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương ở Việt Nam .. 26

Bảng 2.1 Các cặp mồi dung cho phản ứng PCR đậu tương .......................................... 28

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR ............................................................................ 29

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A ....................................... 30

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối promoter rd29A với vector tách dòng pBT . 30

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme HindIII và XbaI .............................. 31

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối với nhờ enzyme T4 ligase ................................... 31

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng phản ứng colony PCR ................................................ 32

Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết ........................................................... 33

Bảng 2.9 Chu trình nhiệt của PCR ................................................................................ 33

Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọn lọc 41

Bảng 3.2 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen .............................. 43

Báng 3.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi ................... 45

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ppt đến khả năng tạo chồi ...................................... 46

Bảng 3.5. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương .............. 47

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng T1 bằng Phosphinothricin 250mg/l .................... 52

Bảng 3.7 Sự phát triển của thân và rễ các cây đậu tương ĐT22 thí nghiệm ............... 54

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) ......... 6

Hình 1.2 Sinh tổng hợp GB ở thực vật bậc cao ........................................................... 13

Hình 1.3 Sinh tổng hợp GB ở A. globiformis ............................................................. 13

Hình 2.1 Sơ đồ khái quát thí nghiệm tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá

mầm hạt chín ................................................................................................................. 35

Hình 3.1 Kết quả PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis ............................... 38

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR được xử lý bởi HindIII / XbaI ................... 39

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR ...................................................... 40

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR với cặp mồi đặc hiệu .................... 41

Hình 3.5 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở thuốc lá. ...................................... 42

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá ......................................... 42

Hình 3.7 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen .............................. 44

Hình 3.8 Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc với nồng độ ppt khác nhau ...... 46

Hình 3.9 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở đậu tương. ................................... 48

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR ............................................................. 49

Hình 3.11 Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR ............................................................. 50

Hình 3.12 Kết quả kiểm tra các dòng Đậu Tương T0 bằng Phosphinothricin ............. 50

Hình 3.13 Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng Phosphinothricin ............... 51

Hình 3.14 Sinh trưởng của giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm ................................. 53

Hình 3.15 Sự phát triển thân và rễ ở giống DT22 ........................................................ 54

Hình 3.16 Các cây được phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo ............... 55

MỞ ĐẦU

Đậu tương là cây trồng quan trọng cho nền nông nghiệp thế giới, là một loại cây

trồng được sử dụng làm nguồn thức ăn cho con người và vật nuôi, cũng như trong

công nghiệp… Hạt đậu tương có chứa hàm lượng protein và dầu cao, ngoài ra, còn có

các chất khác như carbohydrate, vitamin và các khoáng chất. Do vậy, đậu tương trở

thành đối tượng cho các nghiên cứu về nâng cao các tính trạng số lượng, chất lượng và

khả năng chống chịu. Hiện nay, chuyển gen đang là một trong những phương pháp

ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng.

Cây đậu tương là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất ở nhiều

quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì, có khả năng thích nghi rộng với các

điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả

năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ tiếp đến là Châu Á. Bình quân hàng

năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình

quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản lượng đậu

tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc. Trong năm 2014

sản lượng đậu tương của brazil đạt 90.700.000 ha. Ngày 11/4/17, IBGE- Viện Địa lý

và Thống kê Brazil dự báo sản lượng đậu tương nước này trong năm nay sẽ đạt mức

kỷ lục 110,9 triệu tấn tăng 15,9% so với năm 2016

Bước vào thời kỳ hiện tại, biến đổi khí hậu đang ảnh hưởng tới năng suất và

chất lượng của cây trồng, các yếu tố bất lợi của môi trường đang là những thách thức

lớn cho mục tiêu duy trì phát triển bền vững cho sản xuất lương thực cho con người,

trong đó hạn mặn là hai trong số những yếu tố quan trọng kìm hãm sự phát triển sản

xuất nông nghiệp. Những năm gần đây, thế giới cũng như Việt Nam thường xuyên

phải gánh chịu những biến động lớn. Sự gia tăng của hạn hán, lũ lụt, xói mòn, thoái

hóa đất gây ảnh hưởng đến cây trồng.

Đậu tương là cây trồng chịu hạn kém khi thiếu nước ở các thời kỳ khác nhau

đều có ảnh hưởng xấu đến năng suất. Như vậy, việc chọn tạo được các giống đậu

tương có khả năng chống chịu hạn là một nhu cầu cần thiết trong sản xuất và được

xem như định hướng nghiên cứu phát triển cây đậu tương ở Việt Nam.

NỘI DUNG

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ

SỬ DỤNG

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Dựa vào sự đa dạng về hình thái của hạt, Fukuda và nhiều nhà khoa học đã

thống nhất rằng cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc, xuất

phát từ một loại đậu tương dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên khoa học là Glycile

Soja Sieb và Zucc[26]. Từ Trung Quốc đậu tương được lan truyền dần ra khắp thế giới.

Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu

tương được đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật đến giữa thế kỷ 17 đậu

tương được nhà thựcvật học người Đức Engellbert Caempler đưa về Châu Âu và đến

năm 1954 đậu tương mới được du nhập vào Hoa Kỳ. Sau chiến tranh thế giới thứ hai,

đậu tương phát triển mạnh ở Mỹ, Brazin và Canada. Ở nước ta đậu tương có lịch sử

phát triển lâu đời nhưng trải qua thời gian dài cây đậu tương vẫn chiếm một vị trí rất

khiêm tốn trong nền sản xuất của nông nghiệp Việt Nam. Đậu tương được trồng lấy

hạt, là loại cây thực phẩm quan trọng sau lúa mì, lúa nước và ngô. Đậu tương được

trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á. Ở nước ta hiện nay có 6

vùng sản xuất đậu tương: vùng Đông Nam Bộ 26,2%, miền núi Bắc Bộ 24,7%, đồng

bằng Sông Hồng 17,5%, đồng bằng Sông Cửu Long 12,4%, hai vùng còn lại trồng

đậu tương với tỷ lệ thấp hơn là đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên.

Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm

Papilionoideae chi Glycine với tên khoa học là Glycine max. Căn cứ vào đặc điểm

hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì Hymowit và Newell

(1984) cho rằng ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja[35]. Chi Glycine được chia

thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu tương

trồng Glycine max [1].

1.1.2. Đặc điểm sinh học

Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn

non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây

cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân

có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo

giống.

Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3

thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hình dạng của lá thay

đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp,

những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn.

Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa mọc

thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự

thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%.

Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3

hạt. Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục… những giống có hạt màu vàng có giá trị

thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g. Hình dạng

và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống.

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết

quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài

1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt

nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 - 20cm, có

vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp

cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha.

Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất

sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung

bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120

ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 -

150 ngày [1].

1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương

Đậu tương là cây thực phẩm ngắn ngày, giàu dinh dưỡng, có giá trị kinh tế cao,

sản phẩm của nó được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc,

nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất

tốt.

Giá trị dinh dưỡng: Trong hạt đậu tương có các thành phần hoá học sau protein

(40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S;

các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose. Trong đậu tương có

đủ các acid amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan,

valin. Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa

một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể. Các thực phẩm

làm từ đậu tương được xem là một loại "thịt không xương" vì chứa tỷ lệ đạm thực vật

dồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật. Thậm chí, lượng đạm

(protein) trong 100 g đậu tương có thể tương đương với lượng đạm trong 800 g thịt bò.

Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lượng đạm tiêu thụ hằng ngày là do

đậu tương cung cấp. Hàm lượng chất đạm chứa trong đậu tương cao hơn nhiều so với

lượng chất đạm chứa trong các loại đậu khác.

Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá,

thịt và cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35 -

50% (phụ thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có

thành phần tạo cholesterol. Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu thực vật

quan trọng, lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất

béo chiếm khoảng 18%. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, đáng kể là

các vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi,

photpho và các thành phần giúp ích cho sức khỏe con người như phytosterol, lecithin,

isoflavon, phytoestogen và những sản phẩm ức chế phân hủy protein[1].

Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu

về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu

tương khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -18°C và từ dầu

người ta có thể làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều

ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo,

chất đốt lỏng[1].

Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có

thể dùng làm thức ăn cho gia súc. Đậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo đất

trồng, một ha đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60 kg

nitơ, thân và lá với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu

cơ. Việc luân canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất

trồng hữu hiệu.

1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam

Thế giới: Nhận thấy với những giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao của cây đậu

tương, nên đây được xem là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất ở

nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích nghi

rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng

rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là Châu Á. Bình

quân hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng

suất bình quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản

lượng đậu tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc. Trong

năm 2014, 82% (90.700.000 ha) trong số 111 triệu ha đậu tương trồng trên toàn cầu là

đậu tương chuyển gen.

Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ rất sớm, nó được trồng trước cây đậu

xanh và đậu đen. Tuy nhiên với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống năng

suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tương trong nước

không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là nguyên nhân khiến cho

nông dân không mặn mà với cây đậu tương. Vì vậy, diện tích và sản lượng đậu tương

của nước ta phát triển chậm. Năm 2012, sản lượng đậu tương nước ta giảm 34,3% so

với cùng kỳ năm trước, xuống còn 175,2 nghìn tấn do thời tiết lạnh khác nghiệt vào

cuối năm 2011 và đầu năm 2012 khiến cho năng suất và diện tích gieo trồng giảm

mạnh. Quy mô sản xuất vẫn còn tương đối nhỏ và tiếp tục không đáp ứng được nhu

cầu tiêu thụ trong nước. USDA dự báo diện tích trồng đậu tương năm 2013 nước ta

tăng khoảng 180 nghìn ha so với năm 2011 và sản lượng đạt ở mức 270.000 tấn. Theo

số liệu thống kê chính thức, đậu tương đang được trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả

nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam.

Thủ tướng Chính phủ cũng đã phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất ngành

nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030. Theo đó, diện tích đất quy

hoạch khoảng 100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo

trồng khoảng 350.000 ha, sản lượng 700.000 tấn; vùng sản xuất chính là đồng bằng

sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên. Theo Hiệp hội chăn nuôi Việt

Nam (VNFA), đậu tương sản xuất trong nước có mức giá bán kém cạnh tranh so với

đậu tương nhập khẩu. Ví dụ, đậu tương sản xuất trong nước hiện có giá từ 16.000

VND – 17.000 VND/kg (tương đương 0,77 – 0.82 USD/kg), trong khi giá đậu tương

nhập khẩu chỉ khoảng từ 14.600 – 15.000 VND/kg (tương đương 0,70 – 0,71

USD/kg).

Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015)

2011 2012 2013 2014* 2015*

Diện tích gieo trồng (nghìn ha) 181,1 119,6 117,8 120 130

Năng suất (tấn/ha) 1,47 1,45 1,43 1,47 1,48

Tổng sản lượng (nghìn tấn) 266,9 173,7 168,4 176,4 192,4

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, *số liệu dự báo của USDA

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo

Nguồn: Tổng Cục thống kê Việt Nam, *số liệu 2011: ước tính của FAS

Hình 1.1 Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015)

1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây

nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Những cây có khả năng duy

trì và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của

thực vật có thể làm giảm mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chống

chịu hạn.

Có 2 loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện) và

hạn sinh lý hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ cây không thể lấy nước

từ đất vào tế bào, đã đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài. Hạn không khí thường đặc

trưng ở nhiệt độ cao (39oC - 42 oC) và độ ẩm thấp hơn 62%. Hạn không khí thường

gây ra hiện tượng héo tạm thời, vì rễ không hút đủ nước mà quá trình thoát hơi nước

xảy ra quá nhanh do nhiệt độ cao. Hạn sinh lý khác với 2 loại hạn trên ở chỗ môi

trường vẫn đầy đủ nước nhưng do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường tế

bào và môi trường bên ngoài rễ nên rễ cây không có khả năng hút nước [10].

Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng để có thể

thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia

thành ba cơ chế chủ đạo bao gồm: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape),

cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance).

Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình

trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra. Các giống đậu tương

ngắn ngày được trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này để

thích ứng với các điều kiện bất lợi về nước. Các giống này có tính chín sớm và bắt đầu

nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này

có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước

xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8. Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có

các cơ chế để duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc

tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận

khác nhau của cây. Ở các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có

thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao đổi chất có

thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất

thấp. Sức căng của các mô và tế bào của cây được duy trì thông qua việc tổng hợp

mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi [79].

1.2.1. Tác động của hạn đến hệ rễ

Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy

nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu

tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ

để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu [80]. Bên cạnh đó hệ thống rễ

sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ ẩm cao và tìm kiếm

các chất dinh dưỡng. Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng đến độ sâu của rễ đậu

tương là tỉ số kéo dài rễ trụ (taproot elongation rate). Do rễ trụ được hình thành đầu

tiên ở đậu tương, chính vì thế việc xác định các giống đậu tương có đặc tính kéo dài rễ

trụ nhanh sẽ cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ. Sự khác nhau về tính trạng

kéo dài bộ rễ ở các giống đậu tương đã được nghiên cứu khá chi tiết ở trong điều kiện

nhà lưới [81]. Đánh giá 105 giống đậu tương khác nhau cho thấy tỉ số kéo dài rễ trụ

khác nhau giữa các giống vào khoảng 1,3cm/ngày. Những nghiên cứu tiếp theo trên

các giống có tỉ số kéo dài rễ trụ cao cho thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều

sâu trên 120cm so với các giống còn lại. Một vài nghiên cứu cũng đã được thực hiện

đối với hệ thống rễ nhánh của cây đậu tương cho thấy trong điều kiện hạn số lượng rễ

nhánh trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ

không thay đổi. Hạn chế về nước ở cây đậu tương thường làm tăng sinh khối của rễ, từ

đó làm tăng tỉ lễ rễ : thân. Ở cây đậu tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều

dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới nước [82].

Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan rất chặt chẽ đối với

nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ

nhánh ở các giống chịu hạn. Những tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu

quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn.

1.2.2. Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm

Các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với tình trạng nước ở trong đất.

Trong điều kiện hạn, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng cố định CO2, giảm sự

phát triển lá mà khả năng cố định nitơ cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Kết quả này

làm giảm sinh tổng hợp protein [83]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định nitơ

trong điều kiện hạn đã được xác định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O2

giảm, nguồn carbon tới các nốt sần giảm, hoạt tính của enzyme sucrose synthase giảm,

hàm lượng ure và axit amin tự do tăng [84]. Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước

của lá và nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn. Hoạt tính của

enzym nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá

trình quang hợp giảm khoảng 5%. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực

tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng

khuyếch tán oxy. Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá

của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt

sần.

Sự thay đổi về di truyền cũng được xác định ở các cá thể nhạy cảm với khả

năng cố định nitơ trong điều kiện hạn. Khi so sánh các giống đậu tương có hoặc không

có khả năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dưới điều kiện hạn ở giai đoạn sinh

trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mô tốt hơn có năng suất

hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong

những chỉ tiêu để sàng lọc các dòng cây đậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn

trong điều kiện khô hạn. Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng đậu tương dựa

vào chỉ tiêu này, 8 dòng đậu tương có khả năng cố định nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt

hơn. Nghiên cứu sâu hơn các dòng đậu tương này [85] tìm ra rằng quá trình dị hóa ure

không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên cứu. Giống đậu tương

Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố định nitơ cao, đã được dùng làm thể bố

mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có năng suất cao ở các điều kiện hạn.

Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt được dùng để cải thiện khả năng

cố định nitơ và năng suất trong các điều kiện ngập úng.

Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích được liệu khả năng cố

định nitơ trong điều kiện hạn có được điều hòa ở mức độ cơ thể của cây đậu tương hay

không hay quá trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần. Chúng ta đã biết rằng, tín

hiệu điều hòa quá trình cố định nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen feedback

mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá.[84].

1.2.3. Tác động của hạn đến hình thái lá

Lông tơ lá thường là một đặc điểm phổ biến của thực vật chịu hạn, cũng như

một vài loại cây trồng, trong đó có đậu tương. Thông thường, độ dày lông tơ lá gia

tăng hệ số phản xạ từ lá, dẫn đến giảm nhiệt độ của lá trong điều kiện chiếu sáng cao.

Độ dày lông tơ lá là đặc điểm thích ứng quan trọng cho cây đậu tương dưới điều kiện

khô hạn. Lông tơ dày đặc được tăng cường sức sinh trưởng, rễ dày đặc hơn và mở rộng

xuống sâu hơn. Sự gia tăng độ dày lông tơ lá có thể làm tăng lớp ranh giới chống lại

stress lên tới 50%, giảm nhiệt độ của lá, hạn chế thoát hơi nước và tăng cường quang

hợp. Hơn nữa, sự gia tăng độ dày lông tơ có thể làm giảm đi đáng kể phạm vi ảnh

hưởng bệnh khảm virus của đậu tương [86].

1.3. GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB

1.3.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường ở thực vật

Điều kiện bất lợi từ môi trường sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học như

mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về hình

thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng và

phát triển của thực vật. Để đảm bảo tính toàn vẹn và sống còn, nhiều loài thực vật có

các chiến lược đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau. Sự phản ứng của cơ

thể sống với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào từng loài, kiểu gen, thời gian tác động

và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn phát triển, dạng đặc thù của

các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng. Khi bị tác động bởi các yếu tố bất

lợi của môi trường, thực vật sẽ tạo ra một số chất kích thích, protein giải độc hoặc

hormone giúp chúng có khả năng thích ứng. Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống

chịu các điều kiện bất lợi từ môi trường ở thực vật đang được tập trung vào hướng

nghiên cứu làm tăng cường các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự

mất cân bằng về nước. Sự tăng cường các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu được phát

hiện trong nhiều trường hợp môi trường bất lợi như hạn hán, muối mặn và lạnh giá

[42], [67]. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế

bào khi bị mất nước do lạnh, muối hoặc hạn. Những thực vật sống trong môi trường

thiếu nước bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng

chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó.

Một trong những phương thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng về áp

suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự xuất

hiện và tích lũy các chất hòa tan tương thích, protein hoặc các axit amin đặc hiệu [16].

Hiện tượng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước. Sự tích lũy các chất này

không làm ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của các enzyme nội bào. Ngược lại,

sự tích lũy lượng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ điều chỉnh áp suất thẩm thấu

bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nước vào tế bào. Ngoài ra,

chúng có thể thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipit

hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào và các phức hệ protein.

Về mặt hóa học, chúng thường là những phân tử trung hòa về điện, có kích thước rất

nhỏ, đóng vai trò quan trọng giúp các phân tử protein và màng tế bào chống lại sự biến

tính dưới tác động của các điều kiện bất lợi phi sinh học [10]. Chất bảo vệ áp suất

thẩm thấu hay các chất hòa tan tương thích được chia làm 4 nhóm chất sau đây: (1) GB

là dẫn xuất methyl hóa nhóm nitơ của axit amin, (2) proline và ectoine (axit amin), (3)

polyols và trehalose (là một hợp chất polyme không phải đường) và (4) các loại đường

tan: glucose, sucrose, fructan, manitol và pinitol. GB, proline và các nhóm đường thực

hiện chức năng như các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu và bảo vệ tế bào khỏi bị mất

nước. Quá trình này liên quan đến một số enzyme chức năng đã được phân lập và phân

tích về mặt sinh hóa như các enzyme chủ chốt tham gia sinh tổng hợp và chuyển hóa

các chất điều hòa áp suất thẩm thấu, các enzyme giải độc và các loại protease khác.

Protein vận chuyển nước qua màng, chất vận chuyển các đường đơn, proline và GB

được xem như có chức năng chuyển nước, proline, GB, các chất đường đơn qua màng

nguyên sinh chất và màng không bào để điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện

môi trường cực đoan.

GB một hợp chất amoni bậc bốn, là một trong những chất hòa tan tương thích

hiệu quả nhất và được tìm thấy trong một phạm vi rộng của các loài động vật, vi khuẩn

và một số loài thực vật hạt kín chịu hạn hán và chịu mặn [36]. Trước đây GB đã được

đề xuất, tăng tích lũy các betaine trong các loài thực vật đóng một vai trò sinh lý quan

trọng làm giảm bớt căng thẳng thẩm thấu [70]. Trong tự nhiên, rau bina, ngô, củ cải

đường và lúa mạch, nhanh chóng tích lũy GB xảy ra trong quá trình cây bị stress với

muối, hạn hán và nhiệt độ thấp [19]. GB bảo vệ cây bằng cách hoạt động như một chất

hữu cơ có ảnh hưởng đến thẩm thấu (osmolyte), duy trì cân bằng nước giữa các tế bào

thực vật và môi trường, ổn định các đại phân tử dưới điều kiện khô hạn và nồng độ

muối cao[51].

GB tích lũy ở nồng độ cao không gây cản trở chức năng của tế bào chất và có

tác dụng đảm bảo tính ổn định cấu trúc và chức năng của các đại phân tử. GB xuất

hiện như một yếu tố quyết định tới khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở cây trồng.

Chất này có hiệu quả lớn và liên quan mật thiết đến khả năng sinh trưởng của cây

trồng trong điều kiện môi trường hạn hán và nhiễm mặn. Mức độ tích lũy GB tương

quan với khả năng chống chịu điều kiện bất lợi. GB được tích lũy chủ yếu trong lục

lạp, nó đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh và duy trì màng thylacoid, do đó duy

trì hiệu quả quang hợp[74].

Trong nhiều loài cây trồng, sự tích lũy tự nhiên của GB đủ để cải thiện tác động

tiêu cực của tình trạng mất nước gây ra bởi những vấn đề môi trường khác nhau. Bên

cạnh đó, một số loài cây trồng như lúa, khoai tây, cà chua, thuốc lá, v.v. tự nhiên

không sản xuất GB trong điều kiện stress hoặc không stress. Các ứng dụng của GB

ngoại sinh có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực của môi trường bên ngoài. GB

ngoại sinh có thể thâm nhập qua lá và được vận chuyển đến các cơ quan nơi nó sẽ góp

phần tăng cường khả năng chịu đựng stress. Ngoài ra, những loài cây này là mục tiêu

tiềm năng cho việc ứng dụng kỹ thuật di truyền của quá trình sinh tổng hợp GB [47].

Với kiến thức ngày càng hiểu biết sâu rộng về genomics và proteomics cùng với các

công nghệ kỹ thuật gen, một số loài thực vật đã được chuyển các gen mục tiêu liên

quan đến con đường sinh tổng hợp GB, các cây chuyển gen đã được chứng minh

tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện stress phi sinh học [60].

1.3.2. Các con đường sinh tổng hợp GB

Sinh tổng hợp GB ở thực vật: Ở thực vật bậc cao, GB được tổng hợp từ serine

qua ethanolamine, choline và betaine aldehyde. Quá trình sinh tổng hợp GB ở thực vật

trải qua hai bước như sau: (1) Đầu tiên, tiền chất choline được chuyển thành betaine

aldehyde (một hợp chất trung gian độc với thực vật) nhờ sự xúc tác của choline

monooxygenase (CMO); (2) tiếp theo, betaine aldehyde được chuyển thành glycine

betaine dưới hoạt động của betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) [58]. Mặc dù,

con đường tổng hợp GB trực tiếp từ sự N-methyl hóa glycine cũng được biết đến,

nhưng sự tích lũy GB ở tất cả các loài thực vật được xác định là con đường tổng hợp

từ choline.

Hình 1.2 Sinh tổng hợp GB ở thực vật bậc cao [58]

Sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter

panescens: Ngược lại, con đường sinh tổng hợp GB ở Arthrobacter globiformis và A.

panescens rất đơn giản, choline được chuyển hóa thành GB chỉ cần xúc tác bởi một

enzyme choline oxidase (COD) (Hình 1.). Kết quả là từ tiền chất choline chuyển hóa

thành sản phẩm trực tiếp là GB không thông qua hợp chất trung gian [38].

Hình 1.3 Sinh tổng hợp GB ở A. globiformis [38]

Từ các con đường sinh tổng hợp GB ở các đối tượng sinh vật khác nhau như

nêu ở trên, nhận thấy con đường sinh tổng hợp GB ở A. globiformis và A. panescens là

đơn giản nhất. Từ tiền chất choline được chuyển hóa thành GB chỉ cần xúc tác bởi

enzyme choline oxidase (COD) được mã hóa bởi gen codA nên chúng tôi chọn gen

codA làm gen mục tiêu để nghiên cứu.

Gen codA có kích thước phân tử là 1641 bp, mã hóa cho choline oxidase có

kích thước phân tử 547 amino acid, trọng lượng 60 kDa. Choline oxidase là một

enzyme chìa khóa giữ vai trò quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp GB ở

Arthrobacter. Choline oxidase có khả năng xúc tác phản ứng oxi hóa 4 electron của

choline để tạo ra sản phẩm trực tiếp là GB mà không qua các hợp chất trung gian.

Enzyme này có ý nghĩa quan trọng bởi vì khi tích lũy hàm lượng cao GB trong tế bào

giúp cho tế bào chống lại sự khử nước và hiện tượng co nguyên sinh trong điều kiện

môi trường bất lợi.

1.3.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp GB tăng cường khả năng chống

chịu điều kiện môi trường bất lợi

Theo số liệu báo cáo của ISAAA năm 2016, tổng diện tích gieo trồng cây trồng

biến đổi gen trên toàn thế giới ước tính khoảng 86,5 triệu hecta, trong đó diện tích

trồng đậu tương biến đổi gen chiếm 50% (tương đương 33,87 triệu hecta) tổng diện

tích gieo trồng. Theo báo cáo, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ được gieo trồng với diện

tích lớn ở tốp 5 nước trồng cây biến đổi gen nhiều nhất thế giới là Brazil, Mỹ, Ac-hen-

ti-na, Paraguay và Canada, chiếm 94% (tương đương 31, 84 triệu hecta) tổng diện tích

gieo trồng đậu tương. Cùng với đó, việc phát triển cây trồng biến đổi gen mang đa tính

trạng, đặc biệt là mang thêm các tính trạng chống chịu đang có xu hướng tăng lên. Cụ

thể theo báo cáo của ISAAA, diện tích gieo trồng cây trồng biến đổi gen mang nhiều

tính trạng tăng từ 58,5 triệu hecta vào năm 2015 lên 75,4 triệu ha vào năm 2016, tăng

16,9 triệu hecta, tương đương 29%. Một số nước như Băng-la-đét đưa việc phát triển

cây trồng biến đổi gen chống chịu các điều kiện bất lợi vào kế hoạch năm năm lần thứ

bảy (2016-2020), Mỹ, Kenya, Uganda, Tanzania, Mô-zăm-bích, Công hòa Nam Phi

với dự án WEMA phát triển giống ngô chịu hạn [87].

Với những hiểu biết sâu sắc về con đường sinh tổng hợp GB ở sinh vật, cùng

với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây

trồng biến đổi gen, các nhà khoa học đã phân lập được các gen: codA (COD), COX,

BADH, betA (CDH), CMO, GSMT và SDMT từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho

các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB. Các gen này đã được thiết kế

với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây

trồng, các loài cây trồng biến đổi gen đã được phân tích có sự tích lũy GB dẫn đến

tăng cường được khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường như mặn muối,

khô hạn, lạnh, băng giá, nhiệt độ cao và tác nhân oxy hóa.

Cây lúa chuyển gen CDH và codA phân lập từ vi khuẩn có khả năng tích lũy

một lượng lớn chất GB trong tế bào đã được báo cáo [68]; [61]). Cây lúa chuyển gen

cho thấy có sự tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện bị stress muối, lạnh và

hạn. Sự cải thiện khả năng chịu mặn đã được quan sát thấy ở các cây lúa chuyển gen

COX, hàm lượng GB tích lũy thậm chí thấp hơn so với hàm lượng GB tích lũy ở cây

lúa chuyển gen CDH và codA [66]. Kết quả tương tự cũng được công bố ở cây lúa

chuyển gen CMO biểu hiện tích lũy GB ở lục lạp [65]. Những kết quả này cho thấy

rằng, mặc dù hàm lượng GB tổng hợp và tích lũy ở cây chuyển gen là khá thấp, nhưng

cây lúa chuyển gen tăng cường khả năng chịu mặn. Có thể, ở cây lúa sự vận chuyển

choline từ tế bào chất tới lục lạp hiệu quả hơn, nơi GB tích lũy được sử dụng hiệu quả

để giảm thiểu các tác hại của muối lên bộ máy quang hợp.

Thiếu nước hoặc hạn hán là một trong những hạn chế nghiêm trọng nhất của

môi trường đến sản xuất nông nghiệp. Những nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng, ứng

dụng GB ngoại sinh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tham gia sinh tổng hợp GB đều

tăng cường khả năng chịu hạn của cây trồng[56] báo cáo, cây ngô chuyển gen CDH

biểu hiện và lích lũy GB ở trong lục lạp có khả năng chịu hạn. Ngô chuyển gen cho

thấy cải thiện khả năng chịu hạn ở các giai đoạn phát triển khác nhau, năng suất hạt

của cây chuyển gen cao hơn đáng kể so với các cây đối chứng không chuyển gen. Cây

bông chuyển gen CDH cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn[45]. Các cây bông biến

đổi gen tích lũy hàm lượng GB lên đến 2,3 - 2,9 lần cao hơn so với các cây đối chứng

không chuyển và cho thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen cao hơn hẳn so với

cây không chuyển gen từ giai đoạn cây con đến giai đoạn cây ra hoa. Tương tự như

vậy, cây lúa chuyển gen codA cũng tăng cường tích lũy GB và cải thiện khả năng chịu

hạn [64]. Hơn nữa, một vài thí nghiệm cho thấy những tác động tích cực của việc ứng

dụng GB ngoại sinh trên các loài thực vật bị stress về nước. Hiệu quả tương tự cũng

được tìm thấy ở cây hướng dương và cây thuốc lá dưới điều kiện hạn hán (Iqbal et al.,

2005[39];[46]. Ứng dụng GB ngoại sinh cải thiện tình trạng stress nước, kết quả sản

xuất sinh khối tăng lên trong các loài thực vật này.

Nhiệt độ thấp là một yếu tố môi trường giới hạn phân bố địa lý và mùa sinh

trưởng của nhiều loài thực vật và thường ảnh hưởng xấu đến chất lượng cây trồng và

năng suất [69]. Các tác hại của stress nhiệt độ thấp đối với nhiều loài cây trồng là làm

giảm tốc độ tăng trưởng, giảm năng suất và thậm chí làm chết cây [48]. Các kết quả

nghiên cứu đã chứng minh rằng ứng dụng GB ngoại sinh giúp bảo vệ thực vật bậc cao

chống chịu tốt với điều kiện môi trường bị stress nhiệt độ thấp [37]. Ứng dụng kỹ thuật

di truyển về sinh tổng hợp GB trong một số loài cây trồng đã cho thấy tăng cường tính

chống chịu với điều kiện môi trường bị stress nhiệt độ thấp ở tất cả các giai đoạn khác

nhau của sự phát triển của cây chuyển gen. Cây Arabidopsis chuyển gen codA, tăng

cường chịu stress lạnh đã đạt được trong quá trình nảy mầm [14]. Cây chuyển gen cho

thấy tỷ lệ nảy mầm tăng cao so với cây đối chứng không chuyển gen. Kết quả tương tự

cũng được báo cáo ở cây lúa chuyển gen codA và cây thuốc lá chuyển gen BADH [19];

[33].

Trong cây cà chua chuyển gen codA, mặc dù hàm lượng GB tích lũy rất thấp

nhưng cây cà chua biến đổi gen biểu hiện tăng cường khả năng chịu lạnh ở tất cả các

giai đoạn phát triển, từ hạt giống nảy mầm đến giai đoạn sinh sản. Tăng cường khả

năng chịu lạnh trong sự hiện diện của mức độ rất thấp GB có thể là do mức ngưỡng rất

thấp GB nội sinh (0,1 mmol/g trọng lượng tươi) là đủ để cung cấp bảo vệ đầy đủ

chống lại stress lạnh trong cà chua biến đổi gen [52]. Thêm vào đó, cây cà chua

chuyển gen codA nhắm mục tiêu tích lũy GB ở trong tế bào chất và trong lục lạp, cho

thấy một mối tương quan giữa tích lũy GB trong các khoang này với khả năng chịu

nhiệt độ thấp, muối và oxy hóa [53]. Cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu

tích lũy GB ở trong tế bào chất (cytosolic) cho thấy sự tích lũy GB tăng gấp 5 - 6 lần

so với cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy GB ở trong lục lạp. Mặc

dù, sự tích lũy GB thấp ở cây chuyển gen codA hướng mục tiêu lục lạp nhưng vẫn cho

thấy cây chuyển gen tăng cường khả năng chịu lạnh, muối và các căng thẳng về oxy

hóa.

Stress nhiệt độ thấp gây ra rối loạn chức năng màng tế bào hoặc biến tính

protein, gây ra một sự xáo trộn trong hệ thống vận chuyển điện tử vào trong màng ty

lạp thể hoặc chloroplastic và dẫn đến việc sản xuất chất oxy phản ứng (ROS) [49].

Nồng độ ROS cao trong tế bào sẽ gây tổn hại, ảnh hưởng đến các thành phần tế bào và

cũng cản trở việc sửa chữa phức hợp PSII bằng cách ức chế sinh tổng hợp de novo

protein [30]. Park và đtg (2007a) cho rằng một trong những lý do có thể bảo vệ tốt hơn

chống lại stress nhiệt độ thấp ở cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy

GB trong lục lạp có thể là cải thiện khả năng vận chuyển oxy của phức hợp PSII do

các sửa chữa được cảm ứng bởi GB[53]. Một lý do khác, có thể là GB ổn định toàn

vẹn cấu trúc của màng tế bào chống lại nhiệt độ khắc nghiệt, làm giảm peroxy lipid

màng và bảo vệ PSII electron vận chuyển [37], [30]. Tác dụng tương tự về chức năng

bảo vệ của GB đã được quan sát thấy ở cây ngô chuyển gen [57].

Một khía cạnh khác có hại của stress nhiệt độ thấp là nó gây ra việc sản xuất

hydrogen peroxide (H2O2), mà lần lượt kích hoạt sự tổng hợp của catalases [55]. Việc

ứng dụng GB ngoại sinh và nội sinh làm tăng cường hoạt động catalase và do đó tăng

cường khả năng chịu stress nhiệt độ thấp. Sự gia tăng hoạt động catalase đã được quan

sát thấy trong các cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy ở lục lạp, các

cây cà chua chuyển gen đã được chứng minh tăng khả năng chịu lạnh và oxy hóa [53].

GB tích lũy trong lục lạp và kết quả tăng cường khả năng chịu nhiệt độ thấp là

một dấu hiệu cho thấy tăng GB cấp trong các lục lạp liên quan chặt chẽ với phức hệ

PSII hoạt động trong quá trình stress lạnh [52]. Trong lá cà chua chuyển gen codA cho

thấy hầu hết GB được tích lũy trong lục lạp. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy ở

cây lúa và Arabidopsis chuyển gen codA [61], [59]. Những phát hiện này cho thấy

rằng sự tích lũy GB trong lục lạp có hiệu quả bảo vệ bộ máy quang hợp khỏi các tác

hại gây ra bởi stress nhiệt độ thấp.

Các nghiên cứu trước đó cho thấy quang hợp là mục tiêu chính trong nghiên

cứu về ức chế bằng nhiệt độ cao và PSII là thành phần nhạy cảm nhất với nhiệt độ

trong hệ thống này [18]. Các kết quả cho thấy, khi nhiệt độ cao hơn 45oC, PSII bị ảnh

hưởng rõ rệt nhất bởi nhiệt độ [32]. Nhiệt độ cao vừa phải thường ức chế sự cố định

CO2 và không có khả năng phá hủy PSII [28]. Nhiệt độ cao thường có ảnh hưởng đến

quá trình quang hợp, trong khi tiếp xúc với nhiệt độ cao vừa phải làm suy yếu hoạt

tính của ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisco) qua đó làm giảm

khả năng quang hợp [29]. Cơ chế của các quá trình này thường có liên quan tới sự loại

bỏ hoạt tính của một số vị trí hoạt động của Rubisco dẫn đến tỷ lệ quang hợp giảm và

việc loại bỏ hoạt tính tăng dần theo sự tăng của nhiệt độ [63]. Hiện tượng này đã được

chứng minh qua các nghiên cứu trên cây bông, cây thuốc lá, Arabidopsis, và cây lúa

mạch [29].

Một vài nghiên cứu in vitro cho thấy GB bảo vệ các enzyme và phức hợp

protein chống lại sự bất hoạt do tác dụng của hơi nóng [27]. GB có hai chức năng là

sửa chữa phức hợp PSII trong quá trình ức chế quang năng và bảo vệ phức hợp protein

khỏi tác dụng của hơi nóng [15]. GB ổn định phức hợp PSII bằng cách kích thích sự

sửa chữa của phức hợp khi cây tiếp xúc với nhân tố gây ức chế là hơi lạnh và độ mặn

[52]. Một cơ chế tương tự có thể xảy ra trong quá trình gây ức chế bằng nhiệt độ. Cây

Arabidopsis chuyển gen codA (làm tích lũy GB) cho thấy sự kích thích khả năng

chống chịu với nhiệt độ cao trong quá trình sinh trưởng của các cây con. Có thể sự

chống chịu với nhiệt độ cao được cảm ứng trong cây Arabidopsis chuyển gen do sự

bảo vệ enzyme hoạt hóa Rubisco được hoạt hóa bởi GB. Sự phát hiện này được củng

cố bằng sự tăng hoạt động quang hợp ở cây thuốc lá chuyển gen BADH [76]. Cơ sở

sinh lý cho sự tăng khả năng chống chịu với nhiệt độ cao (25 – 45oC) của cây thuốc lá

chuyển gen có liên quan tới sự tăng khả năng chống chịu của sự quang hợp với nhiệt

độ cao. Nhiệt độ cao vừa phải không ảnh hưởng đến hoạt động hoặc hiệu quả của PSII

và tỷ lệ đồng hóa CO2 tăng do cảm ứng với GB có liên quan tới sự hoạt hóa của

Rubisco nhờ các enzyme trung gian [76]. Sự tích tụ GB làm tăng sự chống chịu của

các enzyme hoạt hóa Rubisco với nhiệt độ cao, dẫn đến sự tăng khả năng chống chịu

của việc đồng hóa CO2 trong cây chuyển gen so với cây không chuyển gen. Trong

nghiên cứu gần đây, sự tích tụ GB trong cây thuốc lá chuyển gen BADH làm tăng sự

chống chịu của PSII với nhiệt độ rất cao (lên tới 50oC) và cải thiện tính bền ở nhiệt độ

cao của phức hợp vận chuyển oxy và của trung tâm phản ứng của PSII [75].

Bảng 1.2. Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp

GB, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi

Khả năng

Sự tích lũy GB

Cơ quan

Tài liệu tham khảo

Loài cây

Gen

chống chịu

(cơ quan)

đích

bất lợi

codA

Arabidopsis

1.0 µmol g-1 trọng lượng

Nhiệt độ thấp,

Hayashi et al. 1997,

(COD)

Lục lạp

thaliana

tươi (lá/hạt)

mặn

1998

Arabidopsis

codA

12.0-18.0 µmol g-1 trọng

Lục lạp

Nhiệt độ cao

Alia et al. 1998b

thaliana

lượng khô (hạt)

Arabidopsis

codA

Nồng độ chưa xác định

Lục lạp

Ánh sáng

Alia et al. 1999

(chồi)

mạnh

thaliana

0.7-0.9 µmol g-1 trọng lượng

Lục lạp

Sakamoto et al.

Arabidopsis

Băng giá

codA

khô (chồi)

2000

thaliana

Khả năng

Sự tích lũy GB

Cơ quan

Tài liệu tham khảo

Loài cây

Gen

chống chịu

(cơ quan)

đích

bất lợi

0.82 µmol g-1 trọng lượng

Waditee et al.

Cải bẹ

codA

Lục lạp

Mặn

2005

tươi (lá)

0.1-0.3 µmol g-1 trọng lượng

Hồng

codA

Tế bào chất

Hạn, mặn

Huang et al. 2000

tươi (lá)

0.17-0.29 mmol g-1 trọng

Chưa xác

Bạch đàn

codA

Mặn

Yu et al. 2009

lượng tươi (lá)

định (N.A)

5.3 µmol g-1 trọng lượng

Lục lạp/tế

Nhiệt độ thấp,

Sakamoto et al.

Lúa

codA

tươi (lá)

bào chất

mặn

1998

1.0-2.12 µmol g-1 trọng

Mohanty et al.

Lúa

codA

Lục lạp

Mặn

lượng khô (lá)

2002

0.1-0.3 µmol g-1 trọng

Cà chua

codA

Lục lạp

Nhiệt độ thấp

Park et al. 2004

lượng tươi (lá)

2.0 µmol g-1 trọng lượng

Lục lạp/tế

Nhiệt độ thấp,

Cà chua

codA

Park et al. 2007a

tươi (cơ quan sinh sản)

bào chất

mặn, oxy hóa

0.9-1.43 µmol g-1 trọng

oxy hóa, mặn,

Cà chua

codA

Lục lạp

Ahmad et al. 2008

lượng tươi (lá)

hạn

Arabidopsis

GSMT/SD

0.8–1.7 mmol g-1 trọng

N.A.

Waditee et al.

Mặn

thaliana

lượng tươi (hạt)

2005

Cải dầu

13 mmol g-1 trọng lượng khô

COX

Tế bào chất

Hạn, mặn

Huang et al. 2000

(lá)

Cà rốt

93–101 mmol g-1 trọng

BADH

Lục lạp

Mặn

Kumar et al. 2004

lượng khô (rễ, lá)

Bông

betA

130.2–142.0 mmol g-1 trọng

N.A.

Hạn

Lv et al. 2007

(CDH)

lượng khô (lá)

13 mmol g-1 trọng lượng khô

Thuốc lá

COX

Tế bào chất

Mặn

Huang et al. 2000

(lá)

≤ 66 nmol g-1 trọng lượng

Thuốc lá

betA

Tế bào chất

Mặn

Lilius et al. 1996

tươi (N.A.)

0.02–0.05 mmol g-1 trọng

Thuốc lá

CMO

Lục lạp

Mặn

Nuccio et al. 1998

lượng tươi (lá)

0.44–4.92 mmol g-1 trọng

Thuốc lá

BADH

Lục lạp

Mặn

Yang et al. 2008

lượng tươi (lá)

0.46–4.6 mmol g-1 trọng

Thuốc lá

BADH

Lục lạp

Nhiệt độ cao

Yang et al. 2005

lượng tươi (lá)

BADH/

4.7–7.0mmol g-1 trọng lượng

Thuốc lá

N.A.

Mặn

Yang et al. 2008

SeNHXI

khô (lá)

Khả năng

Sự tích lũy GB

Cơ quan

Tài liệu tham khảo

Loài cây

Gen

chống chịu

(cơ quan)

đích

bất lợi

5.0 mmol g-1 trọng lượng

Lúa

betA

Ty thể

Hạn, mặn

Takabe et al. 1998

tươi (N.A.)

2.6–3.12 mmol g-1 trọng

Lúa

COX

Lục lạp

Mặn

Su et al. 2006

lượng tươi (lá)

0.29–0.43 mmol g-1 trọng

Shirasawa et al.

Lúa

CMO

Lục lạp

Mặn

lượng khô (lá)

2006

1.7–4.2mmol g-1 trọng lượng

Ngô

betA

Lục lạp

Lạnh

Quan et al. 2004a

tươi (lá, hạt)

2.6–4.0 mmol g-1 trọng

Ngô

betA

Lục lạp

Hạn

Quan et al. 2004b

lượng tươi (lá)

1.4. PROMOTER VÀ PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter

Promoter của sinh vật nhân thật thường rất đa hình và khó xác định. Chúng có

thể nằm cách điểm khởi đầu phiên mã vài kilobase. Người ta thường tìm thấy hộp

TATA trong nhiều promoter của sinh vật nhân thật. Các liên kết giữa protein với hộp

TATA có tác dụng hỗ trợ việc hình thành phức hệ phiên mã của RNA polymerase.

Hộp TATA thường nằm khá gần vị trí khởi đầu phiên mã (trong khoảng 50

base).Trình tự điều hòa promoter của sinh vật nhân thật thường liên kết với các protein

gọi là nhân tố phiên mã.

Những nghiên cứu về promoter đã giúp các nhà khoa học tìm ra các hướng

mới nhằm điều khiển sự hoạt động của gen. Việc đi sâu vào nghiên cứu cấu trúc, chức

năng và các yếu tố liên quan của promoter đã cho thấy khả năng thay đổi sự biểu hiện

gen trong sinh vật cũng như các gen quan tâm bằng việc sử dụng cấu trúc (Promoter +

Gen). Do đó promoter được coi như là một nhân tố rất quan trọng trong việc kiểm soát

quá trình biểu hiện của gen.

1.4.2. Promoter cảm ứng khô hạn RD29A

Khả năng hình thành sự cộng sinh với Bradyrhizobium cố định đạm làm cho

cây đậu nành Glycine max không phụ thuộc vào phân bón N, đặc biệt là ở Brazil. Tuy

nhiên, hạn hán làm ảnh hưởng đến hiệu suất nhà máy nói chung và quy trình cố định

đạm sinh học (BNF), Hạn hán làm giảm nồng độ chlorophyll trong tất cả các kiểu

gen. Các gen NFDT thường cho thấy nồng độ N, K và Mn cao hơn ở các chồi, không

phân biệt tình trạng nước. Tiếp xúc với hạn hán đã làm tăng tổng lượng đường hòa tan

trong nốt ở tất cả các kiểu gen, cũng như nồng độ ureides ở lá và nốt, trong khi ureides

trong các quả phồng lên chỉ ở những kiểu gen dễ bị tổn thương. Hạn hán ảnh hưởng

xấu đến quang hợp và các thuộc tính BNF. Cho thấy tiềm năng sử dụng các gen NFDT

gây giống nhằm tao các giống chịu hạn [21].

Năm 1994,Yamaguchi-Shinozaki và Shinozaki mô tả và phân tích một

promoter điều chỉnh gen rd29A ở Arabidopsis được gây ra để đáp ứng mất nước, nhiệt

độ thấp, muối cao hoặc điều trị bằng axit abscisic ngoại sinh. Việc sao chép các gen

liên kết với cDNA rd29 được gây ra rất nhanh và ở tốc độ cao sau 20 phút sau khi bắt

đầu mất nước, sau đó là phiên mã lần thứ hai bắt đầu sau 3 đến 4 giờ mất nước [71].

Các mức của mRNA rd29 thay đổi khác nhau để phản ứng mất nước, nhiệt độ thấp, áp

suất muối, hoặc tiếp xúc với ABA [72]. Sự khử nước tạo ra rd29A mRNA với động

lực học hai bước. Trong điều kiện mất nước, ABA nội sinh bắt đầu tích lũy 2 giờ sau

khi mất nước bắt đầu và đạt đến tốc độ tối đa là 10 giờ [43], cho thấy rằng sự khởi đầu

nhanh chóng đầu tiên của rd29A không phải là trung gian bởi ABA nội sinh. Đột biến

ABA-insensitive làm giảm mức độ cảm ứng của mRNA rd29A bằng cách mất nước ở

10 giờ. Do đó, rd29A có ít nhất hai bộ phận hoạt động cis (ABA-đáp ứng (ABRE) và

các phần tử phản ứng mất nước (DRE).

Hiện nay, promoter rd29A thường được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen

liên quan đến tính chịu hạn, nhằm tăng cường tính chống chịu của cây chuyển gen với

các stress môi trường. Promoter rd29A có vai trò điều hòa hoạt động gen chuyển,

nhằm mục đích tăng cường hoạt động gen từ đó tăng cường hoạt động chống lại stress

của cây trồng [9].

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN

Thế giới: Ngày nay, trong nhiều phương pháp chuyển gen, có nhiều phương

pháp không thành công ở đậu tương đã được ghi nhận như chuyển gen thông qua sóng

điện trường [62], chuyển gen thông qua PEG/liposome [24], chuyển gen thông qua

silicon carbide [41], chuyển gen vi tiêm [22] hay chuyển gen lục lạp [20]; thì chỉ có

hai phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium và sung bắn gen là thành công

đối với đậu tương. Trong đó, chuyển gen thông qua Agrobacterium trở nên phổ biến

hơn ở các phòng thí nghiệm trên thế giới vì phương pháp đơn giản, quen thuộc với các

nhà nghiên cứu, chi phí thiết bị tối thiểu, và việc chèn một gen đơn lẻ có độ tin cậy hay

số bản copy thấp[31]. Cho tới nay, một lượng báo cáo đã công bố liên quan tới điều

kiện tối ưu để thu nhận cao các thể chuyển gen đậu tương; chẳng hạn như điều kiện

nồng độ khuẩn Agrobacterium, nồng độ môi trường tái sinh. Sau khi Hinchee và cộng

sự phát triển phương pháp chuyển gen vào đậu tương thông qua Agrobacterium, nhiều

chủng Agrobacterium đã được nghiên cứu và ứng dụng như EHA101, EHA105,

LBA4404 và AGL1 [54], [23]. Gần đây, chủng A. tumefaciens KAT23 (AT96-6)

được phân lập từ rễ cây đào cũng có khả năng tăng hiệu quả chuyển T-DNA vào đậu

tương [77]. Tuy nhiên, những nghiên cứu này lại có những phần thêm vào không

mong muốn như các promoter, chất kháng sinh chọn lọc được chèn vào trong thể

chuyển gen. Điều này đã nêu lên vấn đề an toàn sinh học tiềm năng liên quan đến môi

trường và nguy cơ sức khỏe của con người. Để khắc phục những rủi ro tiềm tàng,

phương pháp tạo cây chuyển gen không marker đã được phát triển, chẳng hạn như

đồng chuyển gen (co-transformation) [44], chuyển gen thông qua transposon [73]và tái

tổ hợp các vị trí đặc hiệu [17]. Trong số các phương pháp khác nhau, hệ thống đồng

chuyển gen là một trong những phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để sản xuất

cây chuyển gen không marker.

Trong hệ thống đồng chuyển gen, một gen marker và gen quan tâm được đặt

trên những phân tử DNA riêng biệt và được đưa vào bộ gen thực vật. Sau đó, các gen

không có khả năng chọn lọc phân ly khỏi các gen marker đánh dấu ở các thế hệ con

cháu. Hầu hết các chủng A. tumefaciens có khả năng chứa nhiều hơn một T-DNA, và

các khối u thường được đồng chuyển nạp với nhiều T-DNA [34]. Kết quả là, có hai

khả năng; nhiều T-DNA được đưa vào tế bào thực vật hoặc từ một hỗn hợp của các

chủng ('phương pháp hỗn hợp') hoặc từ một chủng đơn (phương pháp đơn chủng').

Depicker et al [25] mô tả một phương pháp chủng đơn có hiệu quả hơn so với một

phương pháp hỗn hợp. Đối với một phương pháp chủng đơn trong đồng chuyển gen,

[44] đã thử nghiệm phương pháp đồng chuyển gen để phát triển một hệ thống vector

siêu nhị thể (superbinary) phù hợp. Việc sử dụng các plasmid mang hai đoạn T-DNA

chuyển vào lúa và thuốc lá được tạo ra và đánh giá.

Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương trên thế giới

Chỉ thị chọn lọc

Tham khảo

Chủng A.tumefaciens

Giống đậu tương

Gen chọn lọc

Chất chọn lọc

nptII

kanamycin

A208

Peking.Maple Prest

bar

Phosphinothricin

AGL1

Ber

bar

Phosphinothricin

EHA101

Williams 82

Hinchee et al., 1988 Olhoft et al., 2001 Zeng etal., 2004

bar

EHA101

Paz et al., 2004

Phosphinothricin hoặc bialaphos

bar

glufosinate

EHA101

Paz et al., 2006

Williams,William s 79, Peking, Thorne Thorne, Williams, Williams 79, Williams 82

EHA105

AC Colobri

nptII

kanamycin

Donaldson et al., 2000

hpt

EHA105

hygromycin

Liu et al., 2006

Hefeng 25, Dongnong 42, Heinong 37,Jilin 39,Jiyu 58

bar

EHA105

A3237

glufosinate

bar

LBA4404

Jungery

phosphinothricin

hpt

Bert

hygromycin

Zhang et al., 1999 Xue et al.,2008 Olhoft et al., 2003

LBA4404, EHA 105

Những nghiên cứu về đậu tương chuyển gen trên thế giới chủ yếu tâp trung vào

các nhóm tính trạng đó là: tính kháng thuốc diệt cỏ, tính kháng sâu bệnh, tính chịu hạn,

hay việc tạo ra các giống đậu tương có hàm lượng các axit amin chứa lưu huỳnh cao,

cải thiện chất lượng protein của đậu tương [78]. Với rất nhiều nghiên cứu này cùng

những kết quả đã đạt được, đậu tương trở thành 1 trong những cây trồng biến đổi gen

được thương mại hóa mạnh nhất. Vào năm 1997, cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ

Phosphinothricin và gen tăng hàm lượng axit oleic lần đầu tiên được thương mại hóa

[40]. Trong số diện tích đậu tương chuyển gen thì 75% được trồng ở Bắc Mỹ. Riêng ở

Mỹ, diện tích đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 85% diện tích trồng cây đậu tương.

Còn ở châu Á, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 6% tổng sản phẩm cây trồng biến

đổi gen. Năm 2004, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ đạt đến diện tích 48,4 triệu ha

chiếm 60% diện tích cây trồng biến đổi gen. Trong năm 2012, đậu tương chiếm 47%

của tất cả các số diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới, trong đó, số diện tích

toàn cầu của đậu tương kháng thuốc diệt cỏ là 80.700.000 ha, tăng 5,3 triệu ha so với

năm 2011. Ngoài những nghiên cứu về đậu tương kháng sâu bệnh, trên thế giới đã có

những thành công trong việc tạo ra giống kháng virus gây bệnh lùn, khảm đậu tương.

Hay những nghiên cứu liên quan đến việc chuyển nạp gen Cry tạo protein kháng sâu

phân lập từ vi khuẩn Bacillus thurigiensis.

Việt Nam: đậu tương là cây thực phẩm quan trọng, tuy nhiên năng suất đậu

tương hiện còn rất thấp, bình quân chỉ 1,3 tấn/ha. Sử dụng giống đậu tương biến đổi

gen có các đặc tính như kháng sâu hoặc chịu hạn, chịu ngập úng… là giải pháp nâng

cao năng suất đậu tương ở nước ta. Tuy nhiên, cho đến nay nhiều nghiên cứu về đậu

tương chủ yếu tập trung vào đánh giá đa dạng di truyền giống hay phân tích hệ gen

đậu tương [11], [3], chỉ có một số ít nghiên cứu về chuyển gen vào đậu tương (Bảng

1.4). Cụ thể, năm 2007, Trần Thị Cúc Hòa đã nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển

gen của 42 giống đậu tương khác nhau thông qua A. tumefaciens EHA105 mang cấu

trúc vector pCAMBIA3301 chứa gen GUS bằng phương pháp nốt lá mầm, và thu

được kết quả khá cao ở tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen GUS (trung bình 60,4%). Khi

nghiên cứu hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen của các giống MTĐ 176, HL

202, Maverick và Williams 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua trung gian A.

tumefaciens và chọn lọc bằng glufosinate, Trần Thị Cúc Hòa và cộng sự đã thu được

hiệu quả chuyển nạp gen ở 2 giống đậu tương đang trồng ở Việt Nam (MTĐ 176 và

HL 202) và 2 giống nhập nội (Maverick và Williams 82) đạt mức cao, 1-5%. Giống

Maverick có hiệu quả chuyển nạp gen cao nhất với 2-5%, giống MTĐ 176 và HL 202

có hiệu quả chuyển nạp gen từ 1-2%, đây là mức hiệu quả có thể tạo ra giống đậu

tương biến đổi gen. Có thể sử dụng giống đậu tương MTĐ 176 và HL 202 để chuyển

nạp các gen hữu dụng tạo ra giống đậu tương biến đổi gen hoặc sử dụng giống

Maverick để tạo dòng biến đổi gen và thực hiện hồi giao với giống đậu tương Việt

Nam)[6]. Cùng hệ thống biểu hiện này, năm 2010 Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự cũng

đã nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của 20 giống đậu tương Việt Nam thông qua vi

khuẩn A. tumefaciens, và kết quả cho thấy tỷ lệ biểu hiện gen GUS dao động từ 16-

90% (trung bình đạt 70,10%). Trong đó, các giống DT84, ĐVN6, ĐVN9, DT90 có tỷ

lệ biểu hiện cao (76-90%) [4]. Đây chính là những giống có khả năng sử dụng làm vật

liệu để chuyển các gen quan tâm, tạo giống đậu tương biến đổi gen của Việt Nam.

Năm 2013, Trần Thị Cúc Hòa và cộng sự đã công bố kết quả “Nghiên cứu chọn

tạo giống đậu tương kháng ruồi đục thân và sâu đục quả” bằng phương pháp đồng

chuyển gen thông qua A. tumefaciens sử dụng hệ thống vector chuyển gen chứa 2 T-

DNA, một T-DNA mang gen bar và một T-DNA mang gen đích soycry1Ac hoặc

vip3A. Kết quả cho thấy đã tạo được các dòng biến đổi gen từ giống Williams đến thế

hệ T2 và được xác định qua phân tích Southern blot mang gen soycry1Ac hoặc vip3A.

Phân tích ELISA các dòng T2 mang gen soycry1Ac ghi nhận sự biểu hiện đáng kể của

protein Cry1Ac. Thí nghiệm tính kháng sâu đục quả của các dòng T2, T3 mang gen

vip3A trong điều kiện tự nhiên trồng trong nhà lưới cho thấy một số dòng biến đổi gen

có tỷ lệ sâu hại rất thấp so với giống đối chứng không biến đổi gen [7]. Phân tích

ELISA của các dòng T5 mang gen soycry1Ac cho thấy sự hiện diện của Cry1Ac

protein dao động từ 284 đến 650 ng/g lá tươi. Thử nghiệm tính kháng sâu đục quả

trong nhà lưới của các dòng biến đổi gen mang gen soycry1Ac hoặc vip3A cho thấy

một số dòng biến đổi gen có tỷ lệ quả bị sâu đục quả gây hại rất thấp so với giống

đối chứng không chuyển nạp gien. Thử nghiệm tính kháng sâu xanh da láng của các

dòng T4 mang gen vip3A ghi nhận tỷ lệ sâu chết cao và khối lượng sâu giảm nhanh ở

dòng biến đổi gen so với giống đối chứng. Các dòng đậu tương biến đổi gen đã được

phát triển đến thế hệ T6 và T7 [8]. Đối với tạo chọn dòng đậu tương chịu hạn, kết quả

chuyển nạp gen dreb1A (pPTNrd29A-DREB1A) nhóm tác giả đã tạo được 5 dòng T0

từ giống Maverick mang gen chịu hạn dreb1A. Các dòng đậu tương mang gen chịu hạn

dreb1A đã được chọn lọc đến thế hệ T3.

Cũng năm 2013, Nguyễn Văn Đồng và cộng sự cũng đã công bố kết quả bước

đầu về nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và kháng thuốc trừ

cỏ vào giống đậu tương ĐT22. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã tiến hành biến

nạp gen mã hóa yếu tố phiên mã GmMYB vào nốt lá mầm của cây đậu tương ĐT22

thông qua vi khuẩn A.tumefaciens EHA101 với gen chỉ thị chọn lọc thực vật – bar.

Phân tích khả năng kháng thuốc trừ cỏ kết hợp PCR của các dòng đậu tương T0 nhận

được tần số biến nạp gen GmMYB đạt 0,6 đến 1,6%. Tất cả 10 dòng T0 kháng thuốc

trừ cỏ Basta và dương tính với phép thử PCR đều ra hoa kết quả bình thường [2].

Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương ở Việt Nam

Chỉ thị chọn lọc

Tham khảo

Giống đậu tương

Gen đích (mục đích)

Chủng A.tumefaciens /vector

Chất chọn lọc

Gen chọn lọc

bar

glufosinate

EHA105/pCAM BIA 3301

gusA (chỉ thị chuyển gen)

Trần Thị Cúc 2008c

MTĐ 176, HL 202, Maverick và Williams 82

Williams 82

bar

glufosinate

Trần Thị Cúc Hòa et al., 2013

pHOA40 pHOA60 pHOA100 pHOA130

Cry4A (kháng sâu) Cry2Aa (kháng sâu) soycry1ac + 2A- cry4Aa (kháng sâu) soycry1ac + 2A- cry2Aa (kháng sâu)

Maverick

dreb1A (kháng hạn)

pPTN-rd29A- DREB1

ĐT22

bar

glufosinate

GmMYB (kháng hạn)

EHA101/pZY1 01Asc

Trần Thị Cúc Hòa et al., 2015 Nguyễn Văn Đồng et al., 2013

Gus

bar

glufosinate

EHA105/ pCAM3301

Nguyễn Tiến Dũng et al., 2010

VCB, Cọc Chùm, ĐVN6, KW, DT2003, DT90, DT2008, ĐVN11, ĐVN5, ĐVN9, DT84, VMK, VCB, A28, ĐT22

ĐT12, DT84

Gus HA từ virus H5N1

Bar npt

Glufosinat e kanamycin

Bùi Phương Thảo et al., 2009; Lê Văn Sơn, 2010

CV58 pGV2260/ pTN289 (mang Gus) và pPhaso- SHELP (mang HA/ H5N1)

DT84

npt

kanamycin

Gus, RD29A/P5CSm

CV58 pGV2260/ pBI101

ĐT12, DT84

Gus HA từ virus H5N1

Bar npt

Glufosinat e

Nguyễn Thị Thúy Hường, 2011 Nguyễn Thu Hiền et al., 2011.

CV58 pGV2260/pTN2 89 (mang Gus)

Chỉ thị chọn lọc

Tham khảo

Giống đậu tương

Gen đích (mục đích)

Chủng A.tumefaciens /vector

Chất chọn lọc

Gen chọn lọc

kanamycin

và pPhaso- SHELP (mang HA/H5N1)

npt

kanamycin

GP5 từ virus PRRSV

CV58 pGV2260 /pPLAN- psGP5/M-acr

Nguyễn Tường Vân, 2014

MTD 176, Williams 82, Maverick, Thorne

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Vật liệu thực vật

Hạt giống đậu tương ĐT22 được cung cấp từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát

triển Đậu đỗ- Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm - Viện Khoa học nông nghiệp

Việt Nam. Các giống này có nhiều ưu điểm như: thời gian sinh trưởng ngắn, độ thuần

khá, có năng suất cao, có thể trồng đại trà.

Giống thuốc lá K326 do phòng Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh

học cung cấp.

2.1.2. Chủng vi khuẩn và vector

Vector chuyển gen codA được điều khiển bởi promoter 35S và gen Bar kháng

Phosphinothricin (ppt) để chọn lọc tế bào chuyển gen. Do phòng Công nghệ tế bào

thực vật cung cấp. Chủng vi khuẩn E. coli DH5α và Agrobacterim tumefacien C58.

Mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R, mồi codA F/R, mồi Bar F/R

Các loại enzyme cắt giới hạn, Taq polymerase, dNTPs, thang DNA 1 kb của

hãng Fermentas (Mỹ).

Bảng 2.1 Các cặp mồi dung cho phản ứng PCR đậu tương

Nhiệt độ Kích

bắt cặp thước STT Trình tự 2 cặp mồi

(bp)

oC

53 ~750 codA-F: GTGTTGCAGTTGGATCGTTG 1

(codA) codA-R: CCCTACACCTGGAGAGTCAA

53 ~400 Bar-F: AAACCCACGTCATGCCAGTT 2

(Bar) Bar-R: GACAAGCACGGTCAACTTCC

53 ~1300 RD29A-HindIII-F: 3

(rd29A) CCCAAGCTTATCATGTTAGCGTCAGATA

RD29A-Xbal-R:

GCTCTAGATCCAATAGAAGTAATCAAAC

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

Thể tích (µl) Thành phần STT

Mastermix 2X 10 1

10pM mồi xuôi đặc hiệu 1 1 2

10pM mồi ngược đặc hiệu 1 1 3

10pM mồi xuôi đặc hiệu 2 1 4

10pM mồi ngược đặc hiệu 2 1 5

DNA khuôn 1 6

5 H2O 7

Tổng thể tích 20

2.1.3. Hóa chất thiết bị

Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)/ Môi trường B5.

Quá trình tái sinh và chuyển gen cây đậu tương cần sử dụng các môi trường

sau: GM, MS, SIM, SEM, RM. Môi trường nuôi khuẩn và tạo huyền phù khuẩn: YEB,

CCM.

Các chất điều hòa sinh trưởng: Benzyl amino purine (BAP), Indol - 3 - butiric

acid (IBA)...; các chất kháng sinh: Spectinomcine, rifamicine, cefotaxim...

Các hóa chất được cung cấp bởi các hãng: New England Biolabs (Anh),

Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa

(Hà Lan).

Các hóa chất: Yeast extract, bacto pepton, trypton, NaCl, agarose, sucrose, Tris

HCL, EDTA, MgSO4, glycerol, glycine betaine, Spectinomycine, rifamycin,

cefotaxime và các loại hóa chất thông dụng khác được cung cấp bởi các hãng Sigma

(Mỹ), Merck (Đức) và Wako (Nhật Bản).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen pIBTII- rd29A-codA

PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis thaliana (A.thaliana) với mồi

RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R.

Promoter rd29A được khuếch đại từ mẫu DNA tổng số của cây A.thaliana nhờ

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn rd29A. Thành phần phản ứng PCR

được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A

Thể tích (µl) Tên thành phần STT

Master Mix 2X 25 1

Mồi RD29A-HindIII-F 1 2

Mồi RD29-Xbal-R 1 3

Nước deion khử trùng 21 4

Mẫu DNA 2 5

50 Tổng

- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như sau: 94ºC:3 phút; [94ºC:20s; 41ºC: 20s;

72ºC: 80s]x 3 chu kỳ; [94ºC:20s; 50ºC: 20s; 72ºC: 80s]x 27 chu kỳ; 72ºC: 5

phút.

- Tách dòng rd29A bằng vector pBT.

- Promoter rd29A sau khi được khuếch đại được nối với vector tách dòng pBT,

thành phần phản ứng ghép nối như sau:

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối promoter rd29A với vector tách dòng pBT

STT Tên thành phần Thể tích (µl)

Rd29A 2 1

pBT 1 2

T4 Buffer 1 3

T4 ligase 0,5 4

Nước deion khử trùng 5,5 5

10 Tổng

Cắt pBT-rd29A và pIBTII-35S-codA với HindIII và XbaI. Thu hồi phân đoạn

11 kb của và pIBTII-35S-codA và 1,3kb của pBT:rd29A, nối rd29A với pIBTII -codA

Cắt đồng thời 2 vector pBT-rd29A và pIBTII-35S-codA bằng 2 enzyme cắt giới

hạn HindIII và XbaI.

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme HindIII và XbaI

STT Thể tích (µl) Tên thành phần

Buffer tango 10X 2 1

HindIII 1 2

XbaI 1 3

Mẫu 6 4

Nước 1 5

20 Tổng

Sản phẩm của phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 % sau đó

thôi gel thu hồi phân đoạn DNA có kích thước 11 kb của pIBTII -35S-codA và 1,3kb

của pBT-rd29A. Sản phẩm thôi gel được ghép nối với nhờ enzyme T4 ligase, thành

phần phản ứng như sau:

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối với nhờ enzyme T4 ligase

STT Tên thành phần Thể tích (µl)

Buffer T4 1 1

enzyme 0.5 2

pIBTII -CodA 2 3

rd29A 3 4

Nước 3.5 5

10 Tổng

- Biến nạp vào E.coli, chọn dòng bằng phản ứng colony PCR với mồi RD29A-

HindIII-F và RD29A-Xbal-R:

- Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 90 phút. Sau đó đặt hỗn hợp phản ứng

lên đá lạnh và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Bổ sung 5

µl sản phẩm ghép nối vào ống đựng tế bào khả biến E.coli đã làm tan đá, trộn nhẹ sau

đó ủ trong đá lạnh 30 phút. Sốc nhiệt tế bào ở 42oC trong 1 phút và chuyển ngay vào

đá lạnh, để ổn định 5 phút. Bổ sung 200 µl môi trường YEP lỏng, nuôi lắc 200 v/p,

37oC trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dung dịch biến nạp lên đĩa môi trường YEP đặc bổ

sung 100 mg/l spectomycin, nuôi ở 37oC trong khoảng 14 -16 giờ để hình thành khuẩn

lạc. Các khuẩn lạc riêng rẽ được sử dụng để tiến hành phản ứng cloni PCR với cặp mồi

đặc hiệu RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R. Plasmid pIBTII-rd29A-CodA tái tổ hợp

được. Thành phần phản ứng như sau:

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng phản ứng colony PCR

Thể tích (µl) STT Tên thành phần

Master Mix 2X 5 1

Mồi Rd29A-HindIII-F 0.5 2

Mồi Rd29-Xbal-R 0.5 3

Nước deion khử trùng 4.5 4

Mẫu 5

9 Tổng

- Biến nạp pIBTII-rd29A-codA vào Agrobacterium chọn dòng bằng phản ứng

cloni PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R: Tế bào khả biến đặt trong đá

10-15 phút. Bổ sung 1 µl vector chuyển gen vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Rửa

Cuvette bằng cồn 100o, rửa lại bằng nước khử ion, khử trùng rồi thấm khô. Chuyển tất

cả hỗn hợp dịch A. tumefacien + vector chuyển gen vào cuvette. Xung điện: 2,5 kv,

25µF và điện trở 400. Đặt ngay vào đá. Sau 5-10 phút bổ sung 300 µl LB và trộn

nhẹ. Chuyển sang ống eppendorf 2 ml. Ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. Cấy trải

dịch vào đĩa chọn lọc chứa kháng sinh spectinomycine 100 mg/l và rifamicine 50 mg/l.

Ủ ở 28oC trong 48 giờ. Khuẩn lạc được sàng lọc bằng phương pháp Colony PCR.

- Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA:

- Quy trình tách chiết DNA tổng số: thu 20 mg mẫu lá đậu tương và nghiền cẩn

thận trong nitơ lỏng cho đến khi thành bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml.

- Thành phần dung dịch đệm tách chiết.

Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng

Tris – HCl 1M, pH =0,8 0,1M 1

NaCl 5M 1,4M 2

EDTA 0,5M 0,02M 3

CTAB 4% 4

5,2ml H2O 5

- Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo

nhẹ. Ủ nhiệt độ 65OC khoảng 1 giờ ( cứ 5 phút đảo nhẹ một lần), thêm 600 µl dung

dịch Cholorofom: Isoamyl (24:1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 12000 vòng/phút, ở 4oC, trong 5 phút. Dùng pipette

hút lấy 500 µl dịch sang ống eppendorf 1,5ml, ủ đá.

- Thêm 500 µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với

tốc độ 13000 v/p ở 4OC, trong 10 phút.

- Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1

lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendof.

- Thêm 50 µl nước khử ion và 2 µl RNAse, ủ ở 37oC trong 30 phút. Bảo quản

DNA tổng số ở -20oC.

- Phản ứng PCR:

- Gen codA và gen Bar được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc

hiệu tương ứng:

Bảng 2.9 Chu trình nhiệt của PCR

Thời gian (phút) Số vòng lặp Nhiệt độ

94˚C 5 minutes 1 Biến tính mẫu

94˚C 20 seconds Biến tính mẫu

53˚C 20 seconds 30 Bắt cặp mồi

72˚C 60 seconds Kéo dài

72˚C 5 minutes 1 Kéo dài

25˚C 1 Kết thúc

2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium

Quy trình biến nạp thuốc lá tiến hành theo Topping và cs. Bước chuẩn bị khuẩn

biến nạp giống với chuẩn bị khuẩn biến nạp ở đậu tương, cặn khuẩn được hòa tan với

dung dịch ½ MS thu dịch huyền phù khuẩn.

Cây con phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành biến nạp. Các

mảnh lá sẽ được cắt với kích thước 1cm2 và đặt trên môi trường tiền nuôi cấy MS1

(phụ lục 2), sau 2 ngày tiền nuôi cấy các mảnh lá sẽ được ngâm với dịch huyền phù

khuẩn có chứa vector chuyển gen mang gen codA. Sau ngâm 10 phút lá sẽ được thấm

khô và đặt trên môi trường đồng nuôi cấy MS2 (phụ lục 2) 2 ngày. Sau đó, các mảnh lá

tiếp tục được chuyển lên môi trường cảm ứng tạo chồi MS3 (phụ lục 2) có bổ sung chất

chọn lọc 2 mg/l ppt và cefotaxim 500 mg/l. Sau 3-5 tuần các chồi phát triển cao

khoảng 1,5-2 cm thì được cắt và chuyển sang môi trường tạo rễ MS4 (phụ lục 2) có bổ

sung hất chọn lọc ppt 1 mg/l và cefotaxim 500 mg/l.

Sau 2-3 tuần các cây con sống trên môi trường chọn lọc và tạo rễ phát triển

hoàn chỉnh với 3-4 lá thật sẵn sàng cho ra bầu chứa giá thể TN1 đặt trong phòng 7 -10

ngày sau đó đưa ra nhà lưới.

2.2.3. Phương pháp đánh giá cây thuốc lá chuyển gen codA

Cây thuốc lá chuyển gen được xử lý gây hạn nhân tạo trên môi trường có bổ

sung PEG (Polyethylene glycol) (phụ lục 3). Mẫu lá cây chuyển gen được cắt thành

các mảnh nhỏ 1cm2 và đặt trên môi trường chứa 2,5% PEG 8000 và 1 mg/l BAP để

kiểm tra tỷ lệ cảm ứng tạo chồi của cây chuyển gen so với cây đối chứng trên môi

trường gây hạn nhân tạo. Các mẫu chồi cây chuyển gen được tách và cấy trên môi

trường chứa 2,5% PEG 8000 và 1mg/l IBA để kiểm tra khả năng sống, tạo rễ của các

chồi so với cây đối chúng trên môi trường gây hạn nhân tạo.

2.2.4. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm

của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện trong phòng nuôi cây với điều

kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25oC ± 2,

cường độ chiếu sáng 2000lux. Phương pháp tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm

hạt chín được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001) có cải

tiến.

Kí hiệu và thành phần các loại môi trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi

từ nách lá mầm hạt chín được chỉ ra trong (phụ lục 4).

Hình 2.1 Sơ đồ khái quát thí nghiệm tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá

mầm hạt chín

Chủng vi khuẩn Agrobacterium có chứa gen quan tâm được bảo quản trong

glycerol trong tủ -80o được nuôi trong YEP lỏng (phụ lục 1) có bổ sung kháng sinh

chọn lọc, nuôi lắc 200 v/ph trong điều kiện 28oC qua đêm, sau đó cấy trên môi trường

YEP đặc chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi tối 2 ngày ở điều kiện 28oC. Chọn khuẩn lạc

tròn đều đứng độc lập phục vụ cho biến nạp, mức OD650 đặt từ 0,6 – 0,8 là phù hợp

cho biến nạp. Sau đó đem li tâm lạnh thu lấy cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với

dung dịch CCM1 (phụ lục 4) tạo thành dịch huyền phù khuẩn.

Hạt chín được chọn lọc, loại bỏ những hạt kém chất lượng và tiến hành khử

trùng bằng khí clo. Khí clo được tạo ra bằng cách bổ sung vào 100 ml javen 4 ml HCl

37%. Việc khử trùng được thực hiện trong một bình kín và đặt trong tủ hút. Sau khi

khử trùng, cho hạt nảy mầm trên môi trường GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm,

tách đôi hai lá mầm, loại đỉnh sinh trưởng, phần lá mầm còn lại tạo 5-7 vết thương tại

vị trí chồi chính bị loại bỏ và sử dụng làm nguyên liệu biến nạp.

Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy: Môi trường đồng nuôi cấy là CCM đặc có bổ

sung AS. CCM được đổ trên đĩa petri, khi khô đặt giấy thấm đã khử trùng lên trên bề

mặt môi trường. Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30

phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy

CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.

Diệt khuẩn và tạo đa chồi: Mẫu biến nạp sau thời gian đồng nuôi cấy được lắc

trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxim với thời gian là 10 phút,

sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Dùng panh và dao cắt bỏ chồi chính xuất

hiện trên các mảnh lá mầm, cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l

cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ

sung 500 mg/l cefotaxim, 3 mg/l ppt và nuôi trong 2 tuần.

Tái sinh cây hoàn chỉnh: Các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ

được chuyển sang môi trường phát triển chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và

3 mg/l ppt. Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 5 cm sẽ được chuyển sang môi

trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh.

2.2.5. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng phản ứng PCR

Các cây chuyển gen được trồng ra đất sau một thời gian thu mẫu lá tách DNA.

Tiến hành phản ứng PCR từ DNA tổng số của cây chuyển gen, nhằm xác định nhanh

ban đầu các cây được chuyển gen thành công.

2.2.6. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng Phosphinothricin

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại tại 3 vị trí lá khác

nhau của các dòng đậu tương T0 và T1với Phosphinothricin 200mg/l + 1ml/l Tween

20. Dùng tăm bông thấm trực tiếp lên lớp lá đã được đánh dấu ngang bề mặt lá sao cho

dung dịch còn đọng lại trên bề mặt lá. Sau thời gian từ 3-5 ngày kiểm tra kết quả.

2.2.7. Xây dựng đường chuẩn xử lý hạn ở giống đậu tương ĐT22.

Thí nghiệm được bố trí lặp lại ngẫu nhiên 3 lần liên tiếp trong điều kiện gây hạn

nhân tạo (nhiệt độ 33oC, độ ẩm 55%, ánh sáng: 14h/10h sáng tối, đất 400g/ chậu,

không bổ sung nước trong suốt thời kỳ thí nghiệm) và điều kiện thường (nhiệt độ

28oC, độ ẩm 80%, ánh sáng: 14h/10h sáng tối, đất 400g/chậu, bổ sung nước: 10ml/cây/

ngày trong suốt thời kỳ thí nghiệm) tại 2 buồng sinh trưởng khác nhau. Hạt giống đậu

tương ĐT22 gieo sau 12 - 16 ngày cây đạt lá V3, cây cao từ 28 cm - 30 cm thì sử dụng

cho thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm nhằm mục đích xác định được đường chuẩn chịu

hạn của giống đậu tương ĐT22.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA

DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A

3.1.1. PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis với mồi RD29A-HindIII-F

và RD29A-Xbal-R.

Promoter rd29A là một promoter cảm ứng hạn, cùng với promoter 35S thường

được sử dụng trong thiết kế vector chuyển các gen liên quan đến tính chống chịu stress

môi trường. Vì vậy, trong điều kiện khô hạn, dưới sự điều khiển của promoter rd29A

sẽ tăng cường biểu hiện của gen codA, từ đó sẽ có tác động tăng cường hoạt động

phiên mã các gen liên quan đến phản ứng trả lời lại các yếu tố bất lợi cho đời sống cây

trồng.

Kết quả PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis với mồi RD29A-

HindIII-F và RD29A-Xbal-R.

Hình 3.1 Kết quả PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis

M: thang DNA chuẩn 1kb;(1 -3):Mẫu lá cây Arabidpsis

3.1.2. Tách dòng rd29A bằng vector pBT, cắt pBT-rd29A và pIBTII-35S-codA

với HindIII và Xbal

Sản phẩm PCR được gắn vào vector tách dòng pBT. Kết quả chon dòng cho ta

thấy sản phẩm tương đương với kích thước đã tính toán theo lý thuyết thu đươc các

băng có kích thước 1,3kb của promoter rd29A và 2,7 kp của pBT-rd29A (Hình 3.2 A).

Như vậy sản phẩm PCR đã ghép nối thành công vào vector tách dòng pBT.

Cắt pIBTII-35S-codA với HindIII và Xbal (Hình 3.2 B). Kết quả thu được phân

đoạn 11kb của pIBTII- codA.

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR được xử lý bởi HindIII / XbaI

Hình A: 1, 2, 3 là các dòng của pBT: rd29A vector.

Hình B: Là sản phẩm thu hồi phân đoạn 11 kb của pIBTII-codA

3.1.3. Nối rd29A với pIBTII-codA, biến nạp vào E.coli, chọn dòng băng phản ứng

cloni PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-XbaL-R

Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. Coli DH5α

bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau đó,sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường

YEP đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc spectinomycine, rifamycine. Kháng sinh giúp

cho việc chọn lọc các dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng. Trên môi

trường có chứa kháng sinh xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng, những khuẩn lạc này đã

được biến nạp chứa gen kháng kháng sinh. Vì vậy các khuẩn lạc được lựa chọn để sử

dụng để biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium.

Để kiểm tra chính xác khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen quan

tâm, chúng tối tiến hành sang lọc bằng kỹ thuật colony- PCR. Vì số lượng khuẩn lạc

là khá nhiều nên chúng tôi chọn ngẫu nhiên 6 khuẩn lạc trắng để thục hiện phản ứng

colony-PCR (Hình 3.3). PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose

1%. Nếu khuẩn có plasmid mang gen thì sản phẩm PCR sẽ xuất hiện một bằng có kích

thước mong muốn khoảng 1,3kp. Hình ảnh điện di cho thấy trong 6 dòng khuẩn lạc

trắng kiểm tra cả 6 dòng đều cho kết quả dương tính với PCR.

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR

M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-6 các dòng khuẩn lạc đem chọn lọc

3.1.4. Biến nạp pIBTII-rd29A-codA vào Agrobacterium chọn dòng băng phản

ứng colony PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R

Các dòng khuẩn sau khi được lựa chọn thì tiến hành nuôi lỏng tăng sinh khối để

tách plasmid thu được sau đó biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng phương

pháp xung điện. Sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường chứa spectinomycin

100mg/l, rifamycin 50 mg/l. Các dòng khuẩn lạc thu được tiến hành chọn lọc ngẫu

nhiên bằng phương pháp colony-PCR kết quả thu được thể hiện trong (Hình 3.4).

Kết quả colony-PCR cho thấy ở cả 6 dòng khuẩn kiểm tra khi nhân với cặp mồi

đặc hiệu RD29A F/R cho thấy xuất hiện một băng có kích thước khoảng 1,3kp phù

hợp với kích thước của promoter rd29A. Như vậy 6 dòng khuẩn đều được biến nạp

thành công. Chúng tôi đã thu được chủng Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển

gen pIBTII-rd29-codA.

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR với cặp mồi đặc hiệu

M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-6 các dòng khuẩn Agrobacterium đem chọn lọc

3.2. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO THUỐC LÁ THÔNG QUA VI

KHUẨN AGROBACTERIUM.

3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào giống thuốc lá

K326.

Nhằm mục đích kiểm tra hoạt động của vector chuyển gen pIBTII-rd29A-codA,

chúng tôi tiến hành chuyển vào cây mô hình thuốc lá giống K326 và thử nghiệm kiểm

tra hoạt động.

Kết quả thu được sau các đợt biến nạp cho thấy sau 15 ngày đa số các mảnh lá

đều mọc lên các cụm chồi ở các mép lá. Trong khi đó, mẫu đối chứng âm không

chuyển gen đưa vào môi trường chọn lọc bị vàng và chết dần đi không thấy hiện tượng

phát sinh chồi, một vài mảnh lá có hiện tượng phát sinh chồi nhưng sau đó đều vàng

và rụng đi (Hình 3.5). Kết quả tạo chồi cho thấy các đợt biến nạp đều có tỷ lệ tạo chồi

cao đạt 80%, tuy nhiên cũng có những mảnh lá không tạo chồi chiếm 20%. Từ các

cụm chồi thu được 68 chồi vào môi trường MS4 (phụ lục 3) và thu được 27 cây sống

sót và tạo rễ. Kết quả thu được 19 cây sống và ra cây bằng giá thể TN1 trong nhà lưới.

Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọn lọc.

Số lần biến Số mẫu Số mẫu tạo Số chồi cắt Số chồi Số cây cho

nạp biến nạp chồi cho ra rễ sống tạo rễ ra chấu cát

1 25 21 36 15 10

2 25 19 32 12 9

Tổng 50 40 68 27 19

Hình 3.5 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở thuốc lá

3.2.2. Kết quả đánh giá và phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen

Chọn ngẫu nhiên 12 dòng thuốc lá chuyển sống sau chọn lọc bằng ppt phân tích

PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R thu được cả 12 dòng xuất hiện băng vạch có

kích thước của đoạn gen codA và gen bar trong phản ứng PCR. Kết quả được trình bày

trong (Hình 3.6) nhận được băng có kích thước khoảng 750 bp và 400 bp phù hợp với

kích thước của đoạn gen codA và gen Bar.

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá

M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-12 các

dòng thuốc lá chuyển gen; -: lá cây thuốc lá k326

3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá chuyển gen

Tiến hành gây hạn nhân tạo in vitro với 6 dòng thuốc lá chuyển gen trong 12

dòng cho kết quả kiểm tra có băng vạch gen codA trong phản ứng PCR nhằm bước

đầu đánh giá sự hoạt động của gen chuyển dưới sự điều khiển của promoter rd29A, có

làm tăng cường hoạt động của gen codA trong cây thuốc lá chuyển gen từ đó tăng

cường khả năng chịu hạn hay không.

Tiến hành gây hạn nhân tạo 30 ngày, theo (bảng 3.2) ở giai đoạn gây hạn 7

ngày và 14 ngày các mảnh lá chuyển gen đều xanh và tạo chồi đạt 68%, các mảnh lá

cây đối chứng chuyển màu vàng và tạo đa chồi ít đạt 31%. Các chồi chuyển gen được

cắt và chuyển sang môi trường chịu hạn nhân tạo đều tạo rễ sau 10 ngày cấy chuyển và

các chồi cây đối chứng thì không tạo rễ cây phát triển không bình thường. Kết quả cho

thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen được tăng cường so với cây đối chứng ở

môi trường gây hạn nhân tạo in vitro.

Bảng 3.2 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen

7 ngày 14 ngày

Số mảnh Số mảnh lá Số chồi Số mảnh lá Số chồi STT Số chồi tạo chồi tạo rễ tạo chồi tạo rễ lá

12 9 6 14 10 16 1

12 11 8 13 10 16 2

12 9 7 15 12 16 3

12 12 5 12 11 16 4

12 11 8 12 12 16 5

12 14 6 15 10 16 6

72 66 40 81 65 96 Tổng

12 8 1 12 5 16 ĐC

Hình 3.7 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen

A: Chồi ĐC ở môi trường hạn nhân tạo; B: Chồi chuyển gen ở môi trường hạn

nhân tạo

Từ Bảng 3.2, sức chống chịu các dòng chuyển gen rd29A-codA đều cao hơn

dòng đối chứng. Tuy nhiên, ở các dòng thuốc lá chuyển gen thì mức độ chịu hạn cũng

khác nhau. Điều này là do có thể vị trí gen được chuyển vào các vị trí khác nhau trong

tế bào nên có dòng được tăng cường hoạt động, có một số dòng bị ức chế hoạt động.

Ngoài ra 1 nguyên nhân nữa cũng có thể dẫn tới hiện tượng các dòng có khả năng chịu

hạn khác nhau là những dòng cây chỉ có duy nhất một bản copy, vì số lượng bản copy

càng nhiều thì càng bị ức chế hoạt động.

3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22

3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. tumefacien sử dụng cho biến nạp đến

khả năng cảm ứng tạo chồi

Khuẩn Agrobacterium đã được biến nạp mang cấu trúc rd29A-codA được nuôi

trên môi trường YEP đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc. Để xác định nồng độ

Agrobacterium tối ưu sử dụng cho biến nạp đậu tương, 4 nồng độ khuẩn ở OD650 ( 0,4;

0,6; 0,8; 1) đã được sử dụng. Lây nhiễm 30 phút mảnh lá mầm với dịch khuẩn ở các

nồng độ khác nhau tiến hành đồng nuôi cấy 5 ngày, rửa khuẩn cấy chuyển sang môi

trường cảm ứng tạo chồi. Theo (Bảng 3.3) sau 14 ngày cảm ứng tạo chồi tại SIM1

không có ppt ta không thấy sự sai khác nhiều về khả năng tạo chồi ở 2 nồng độ OD650

0,4; 0,6 là không có sự sai khác đạt 75%, tại OD650 0,8; 1,0 tái nhiễm khuẩn rất cao và

các mảnh lá mầm chết, không tạo đa chồi. Tại SIM2 có bổ sung ppt sau 14 ngày tiếp

tục chọn lọc thí nghiệm ở OD650 (0,6) cho các cụm chồi sống sót và phát sinh chồi cụm

là cao nhất, ở các nồng độ còn lại cụm chồi gây chết hoàn toàn, tạo cụm chồi sống sót

kém. Do đó, chúng tôi kết luận rằng nồng độ tối ưu của Agrobacterium là: OD650 (0,6)

Bảng 3.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi

Nồng độ Số mảnh lá mầm thí Số mảnh lá mầm Số mảnh lá mầm

Agrobacterium nghiệm cảm ứng tạo chồi cảm ứng tạo chồi

trên mt (SIM1) trên mt (SIM 2) đo ở OD650

0.4 60 48 12

0.6 60 45 18

0.8 60 29 11

1.0 60 20 10

Tổng 240 98 55

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Phosphinothricin (ppt) đến hiệu quả chuyển gen

Để xác định hàm lượng ppt sử dụng chọn lọc các chồi chuyển gen thí nghiệm

với 5 nồng độ ppt (0; 1; 3; 5; 7) mg/l bổ sung vào môi trường SIM 2.

Sau 15 ngày các cụm chồi đặt trên môi trường SIM 2 + ppt, theo (Bảng 3.4) tỉ lệ

tạo chồi đã đạt tương đối ổn định và không tăng khi nuôi cấy thời gian lâu hơn. Nồng

độ ppt thấp: 0 mg/l và 1mg/l cụm chồi xanh và phát triển bình thường, trong khoảng

nồng độ ppt từ 3 - 5 mg/l 100% mẫu chịu ảnh hưởng của ppt lá úa vàng vàng rụng ở

ngày thứ 7 trên SIM2, ở nồng độ 7 mg/l các cụm chồi chết khô hoàn toàn tại ngày thứ

8. Tuy nhiên, tỉ lệ tạo chồi xanh và chồi kéo dài giảm theo sự tăng nồng độ của ppt. Ở

nồng độ (3; 5) mg/l ppt hai chỉ tiêu này giảm đi rõ rệt. Sau khoảng 30 ngày nuôi cấy

trên môi trường có bổ sung ppt, đã có sự khác biệt về sinh trưởng của chồi trên các

môi trường bổ sung các nồng độ ppt khác nhau. Các môi trường bổ sung nồng độ ppt 3

mg/l, chồi vẫn sinh trưởng phát triển nhưng chậm, có tạo cụm chồi mới xanh. Nồng độ

ppt 5 mg/l tỉ lệ cụm đa chồi chết hoàn toàn, kết quả theo (Hình 3.8). Như vậy, từ các

kết quả này chúng tôi lựa chọn môi trường bổ sung ppt 3mg/l để chọn lọc cây chuyển

gen.

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ppt đến khả năng tạo chồi

Môi trường chọn lọc

Số mảnh lá Nồng độ ppt Số mảnh lá trên Số cụm chồi Số cụm chồi trên mầm thí mg/l mt SIM1 trên mt SIM2 mt SEM nghiệm

100 82 82 78 0

100 83 45 38 1

100 86 23 16 3

100 79 16 0 5

100 81 0 0 7

Hình 3.8 Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc với nồng độ ppt khác nhau

A: 3mg/l ppt; B: 5mg/l ppt; C: 7mg/l ppt

3.3.3. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương

Giống đậu tương tiến hành nghiên cứu là giống ĐT22 được chuyển gen thông

qua vi khuẩn A.tumefaciens có chứa vector pIBTII-rd29A-codA. Kết quả thu được

trình bày theo (Bảng 3.5).

Bảng 3.5. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương

Lô thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo đa chồi Số mẫu kéo dài Số chồi tạo rễ Số cây sống trên giá thể

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tổng 298 318 282 326 314 278 304 316 301 288 3025 182 219 261 197 279 262 211 206 192 216 2225 11 14 11 13 22 12 16 12 14 15 140 5 6 7 6 11 4 5 8 5 12 69 1 2 1 2 3 3 4 2 2 3 23

Số lượng mẫu biến nạp là 3025 trong đó 2225 mẫu tạo đa chồi, chiếm tỉ lệ

73,55%. Từ các cụm chồi này thu được 140 chồi kéo dài ở các giai đoạn khác nhau; có

thể ở giai đoạn kéo dài chồi SEM lần 1, lần 2 hoặc lần 3; chiếm tỷ 4,63%. Các chồi

mọc cao đến một kích thước nhất định 2,5 – 3,5 cm và đã có các lá chính, cắt sang môi

trường tạo rễ chứa kháng sinh cefotaxim 250mg/l. Trong môi trường tạo rễ RM, các

chồi ra rễ là 69 chồi. Chất lượng rễ ở các chồi là khác nhau, có những chồi không ra rễ.

Chọn lọc các chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, tiến hành trồng cây này trong giá thể TN1

bổ sung 25% chibat có 23 cây sống sót và phát triển bình thường khi đặt trong buồng

sinh trưởng nhiệt độ 28oC, Độ ẩm 80%, ánh sáng: 16h/8h (sáng/tối). Các giai đoạn

phát triển cụ thể được trình bày trong (Hình 3.9).

Hình 3.9 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở đậu tương

3.4. PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN

3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA

bằng phản ứng PCR

Khi cây được trồng ra giá thể TN1 trong buồng sinh trưởng sau 30 ngày tiến

hành thu mẫu lá tách DNA tổng số để kiểm tra bước đầu cây chuyển gen.

C

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR

M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-16 các

dòng đậu tương T0 chuyển gen; WT: lá cây đậu tương ĐT22

Từ 23 dòng thu được đem đi tách DNA tổng số để kiểm tra ban đầu kết quả

chuyển gen. Kết quả tách chiết DNA tổng số thu được một năng lớn không hề đứt gãy

phù hợp dùng để tiếp tục phân tích. Từ lượng DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR

với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R. Thu được 9 dòng cho kết quả dương tính với PCR

(Hình 3.10) nhận được 2 băng có kích thước là 750bp và 400bp phù hợp với kích

thước của đoạn gen Bar và gen codA.

Thu được 20 cây T1 từ hạt 10 dòng đậu tương T0, sau 20 ngày gieo thu mẫu lá

tách DNA để kiểm tra kết quả chuyển gen. Tiến hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi

codA F/R và Bar F/R. Thu được 4 dòng cho kết quả dương tính với PCR (Hình 3.11)

nhận được 2 băng có kích thước khoảng 750bp và 400bp phù hợp với kích thước của

đoạn gen bar và gen codA.

Hình 3.11 Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR

M: thang DNA chuẩn 1kb; +: khuẩn Agrobacterium mang gen cần chuyển; 1-4 các

dòng đậu tương T1 chuyển gen.

3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-

codA bằng ppt

Phosphinothricin 250mg/l bổ sung tween 20, dùng tăm bông thấm thuốc thử

phết trực tiếp lên bề mặt của lá của cây đậu tương đã biến nạp. Thu kết quả sau 3 -5

ngày.

Hình 3.12 Kết quả kiểm tra các dòng Đậu Tương T0 bằng Phosphinothricin

A: Cây T0 dương tính Phosphinothricin 250mg/l

B: Cây T0 âm tính Phosphinothricin 250mg/l

C: Cây đối chứng

Hình 3.13 Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng Phosphinothricin

A: Cây T1gieo sau 20 ngày

B1: Lá cây T1 dương tính Phosphinothricin 250mg/l

B2: Lá cây T1 có khả năng tự phục hồi với Phosphinothricin 250mg/l

B3: Lá cây T1 âm tính Phosphinothricin 250mg/l.

Từ 23 dòng đậu tương T0 thử trực tiếp với Phosphinothricin 250mg/l tại bề mặt

lá. Sau 3 ngày phết thuốc diệt cỏ tại vị trí dùng thuốc thử ở 13 cây lá co lại và mất dần

sắc tố xanh lục cả lá mà chuyển sang màu xanh vàng đến 5 ngày thì tại vị trí thử

chuyển sang màu vàng, cháy khô. 10 cây còn lại tại vị trí thử lá vẫn nguyên hiện trạng

ban đầu hoặc lá hơi co lại nhưng không bị mất màu xanh lục của lá. Như vậy kết quả

kiểm tra các dòng T0, thu được 10 dòng dương tính với Phosphinothricin 250mg/l.

Sau khi thu hoạch hạt của các dòng T0 tiến hành gieo để đánh giá các dòng T1.

Các cây T1 sau khi nảy mầm 22-25 ngày ta dùng Phosphinothricin 250mg/l bổ sung

Tween 20 để kiểm tra khả năng kháng thuốc của các cây T1.

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng T1 bằng Phosphinothricin 250mg/l

-: Kết quả âm tính; +: Kết quả dương tính; ?: Kết quả có khả năng phục hồi với ppt

Số dòng cây Đậu tương T1 (Giống đậu tương DT22)

STT T0 Tên dòng PCR ppt

1 rd29A codA 1 + + -

2 3 rd29A codA 2 rd29A codA 3 + + + - + + + +

4 rd29A codA 4 + + +

5 rd29A codA 5 + + +

6 rd29A codA 6 + + + +

rd29A codA 7 7 + + + +

rd29A codA 8 8 + + + +

rd29A codA 9 9 + + + +

10 rd29A codA 10 + + + Tên dòng rd29A codA 1.1 rd29A codA 1.2 rd29A codA 2.1 rd29A codA 3 rd29A codA 4.1 rd29A codA 4.2 rd29A codA 5.1 rd29A codA 5.2 rd29A codA 5.3 rd29A codA 6.1 rd29A codA 6.2 rd29A codA 6.3 rd29A codA 7.1 rd29A codA 7.2 rd29A codA 8.1 rd29A codA 8.2 rd29A codA 9 rd29A codA 10.1 rd29A codA 10.2 ppt - - - - - - - - - + + + - - - + + + - + - + - ? - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - + - - - PCR - - - + - + - - - - - - - - - - + + -

Kết quả sau 5 ngày kiểm tra thu được 3 dòng dương tính hoàn toàn với thuốc

thử và 3 dòng có hiện tượng bị ảnh hưởng nhẹ và hồi phục lại trạng thái ban đầu tại vị

trí thử, còn lại 13 dòng thì âm tính hoàn toàn với thuốc thử theo Hình 3.13.

3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22

Mục đích phục vụ cho kiểm tra hoạt động của vector pIBTII-rd29A-codA ở cây

đậu tương chuyển gen. Tiến hành xác định ngưỡng chịu hạn của giống đậu tương

ĐT22 này trong điều kiện gây hạn nhân tạo.

Hạt giống đậu tương ĐT22 gieo sau 10 - 12 ngày cây đạt lá V3, cây cao từ 28

cm- 30 cm thì sử dụng cho thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện trong 15 ngày gây

hạn nhân tạo. Đến ngày thứ 12 gây hạn nhân tạo gây chết khô hoàn toàn ở giống đậu

tương ĐT22 tại điều kiện xử lý khô hạn nhiệt độ: 33oC, độ ẩm: 55%, ánh sáng:

14h/10h sáng/tối, không bổ sung nước. Các cây tại buồng không xử lý khô hạn nhiệt

độ: 28oC, độ ẩm: 80%, ánh sáng: 14h/10h sáng tối, bổ sung 10ml nước/cây /ngày vẫn

sống và phát triển bình thường.

Hình 3.14 Sinh trưởng của giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm

Sự phát triển thân rễ tại buồng xử lý khô hạn và buồng không xử lý có sự khác

biệt, kích thước thân của cây không xử lý khô hạn tăng theo đường tuyến tính đi lên,

cây xử lý hạn bắt đầu từ ngày thứ 6 thì dừng sinh trưởng về chiều cao thân. Tại ngày

thứ 7 thì sự hình thành lá mới không còn ở cây đặt trong buồng xử lý hạn, kích thước

lá co ngắn lại, lá chuyển sang màu xanh lục, lớp lông trên bề mặt lá không còn.

Bộ rễ của cây xử lý khô hạn giảm phát triển từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 nhưng

tăng trở lại sau ngày thứ 9 -12 khi thân cây ngừng phát triển. Sau 6 ngày đặt trong

buồng sinh trưởng bộ rễ tại buồng không xử lý hạn cho bộ rễ to rộng nhiều rễ phụ rễ

chính phát triển bình thường, tại buồng xử lý hạn thì chỉ thấy rễ chính phát triển theo

chiều kéo dài, kích thước giảm ở các ngày tiếp theo.

Bảng 3.7 Sự phát triển của thân và rễ các cây đậu tương ĐT22 thí nghiệm

Chiều cao thân (cm) chiều dài rễ (cm)

Đk Bình thường Đk hạn nhân tạo Đk Bình thường Đk hạn nhân tạo

3 Ngày 33.83 33.63 25.50 20.33

6 Ngày 43.00 41.83 22.92 19.38

9 Ngày 50.83 37.83 29.00 17.50

12 Ngày 59.33 37.83 24.83 19.25

Hình 3.15 Sự phát triển thân và rễ ở giống DT22

Hình 3.16 Các cây được phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo

Các cây được xử lý hạn sau 3, 6, 9, 10, 11, 12 ngày sẽ được chuyển sang buồng

sinh trưởng không xử lý hạn để tiến hành phục hồi. Theo Hình 3.16, ta quan sát thấy

các cây sau 3 và 6 ngày gây hạn phục hồi phát triển tốt, hình thái cây và thời gian ra

hoa đậu quả hoàn toàn kịp với các cây không xử lý hạn. Các cây sau 9 ngày và 10

ngày gây hạn sinh trưởng và phát triển chậm hơn, thân cây bé và ra hoa đậu quả muộn

hơn số lượng quả kém. Cây sau 11 ngày xử lý hạn cây vẫn sống và phát triển lá mới

nhưng không tạo hoa và đậu quả cùng thời điểm với các dòng xử lý chịu hạn và khả

năng thu được nhiều hạt giảm. Vậy các yếu tố hạn hán ảnh hưởng trực tiếp đến quá

trình sinh trưởng phát triển của giống đậu tương DT22, giới hạn sống của giống đậu

tương DT22 trong điều kiện xử lý khô hạn nhiệt độ: 33oC, độ ẩm: 55%, ánh sáng:

14h/10h sáng/tối, không bổ sung nước là 12 ngày, sau 9 ngày gây hạn thì cây sinh

trưởng và phát triển chậm. Không tạo quả kịp sau 11 ngày gây hạn, ngừng phát triển

không phục hồi được sau 12 ngày gây hạn.

Từ kết quả xử lý hạn với giống đậu tương ĐT22, đề xuất đánh giá sự biểu hiện

gen đích ở mức độ mRNA, protein và sự gia tăng tích luỹ hàm lượng glycine betain ở

các dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn trong các điều kiện thí nghiệm gây hạn nhân

tạo sau 9-12 ngày gây hạn.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã thiết kế thành công vector chuyển gen pIBTII-rd29A-codA. Trong đó

promoter cảm ứng khô hạn điều khiển hoạt động của gen codA.

2. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống thuốc lá

K326 thu được 19 dòng, trong đó có 12 dòng xuất hiện băng vạch có kích thước của

đoạn gen codA và gen bar trong phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R.

Kết quả xử lý hạn và định lượng GB đã chứng minh được các dòng thuốc lá chuyển

gen có khả năng chịu hạn nhân tạo cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen.

3. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen codA vào giống đậu tương

ĐT22 thu được 23 dòng T0, trong đó có 10 dòng dương tính với thuốc diệt cỏ 250mg/l

và 9 dòng xuất hiện băng vạch có kích thước của đoạn gen codA và gen bar trong phản

ứng PCR với 2 cặp mồi CodA F/R và Bar F/R. Bước đầu đánh giá và kiểm tra các

dòng T1 chuyển gen codA bằng phản ứng PCR và thuốc diệt cỏ 250mg/l, thu được 4

các dòng dương tính với PCR và thuốc diệt cỏ.

4. Xác định được chỉ tiêu liên quan đến tính chống chịu của cây với strees môi

trường: độ dài rễ, trọng lương tươi, trọng lượng khô từ đó xây dựng được phương pháp

đánh giá các dòng chuyển gen chịu hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục đánh giá và kiểm tra các dòng đậu tương T1, T2 và các thế hệ sau bằng

thuốc diệt cỏ và phản ứng PCR với 2 cặp mồi codA F/R và Bar F/R.

2. Xác định sự có mặt và gắn kết ổn định của gen chuyển trong các dòng đậu

tương chuyển gen bằng Southern blot và đánh giá biểu hiện gen ở mức độ phiên mã

và biểu hiện protein đích dưới điều kiện xử lý hạn.

3. Định lượng hàm lượng GB ở các dòng đậu tương chuyển gen, xác định khả

năng hoạt động của gen codA điều khiển bởi promoter cảm ứng khô hạn rd29A.

4. Đánh giá kiểm tra các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 trong điều kiện xử

lý stress môi trường.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần Văn Điền. Giáo Trình Cây Đậu Tương. nhà xuất bản nông nghiệp, 2007.

2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo,

(2013) “Nghiên cứu biến nạp gene liên quan dến khả năng kháng hạn và kháng

thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22.” Tạp Chí KHCN. Bộ NNPTNT, vol. 1.

3. Lê Tiến Dũng, Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Trần Phan

Lam Sơn, (2013) “Những kết quả gần đây về nghiên cứu chức năng gen đậu

tương trong điều kiện khô hạn.” Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Sinh Học Toàn

Quốc, pp. 747–751.

4. Nguyễn Tiến Dũng, Ngô Xuân Bình, Hà Văn Chiến, Nguyễn Xuân Đồng,

(2010) “Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương

[Glycine Max (L.) Merr.] Của việt nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Tumefaciens.” Tạp Chí Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, vol. 11, pp. 69–

74.

5. Nguyễn Thị Thu Hiền. "Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của

Virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật“. Luận án

tiến sĩ 2014.

6. Trần Thị Cúc Hòa, (2008) “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gene từ

giống MTĐ 176, HL 202 Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá

mầm qua trung gian Agrobacterium Tumefaciens.” Tạp Chí Nông Nghiệp &

Phát Triển Nông Thôn, vol. 1, pp. 14–19.

7. Trần Thị Cúc Hòa, (2013) “Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng ruồi

đục thân và sâu đục quả.” Hội Thảo Quốc Gia về Khoa Học Cây Trồng Lần

Thứ Nhất, pp. 441–446.

8. Trần Thị Cúc Hòa, Phạm Trung Nghĩa, Trần Ngọc Thạch, Hồ Thị Huỳnh Như,

Lã Cao Thắng, Trần Thanh Hải, Nguyễn Trần Hải Bằng, Võ Thị Kiều Trang

(2015) “Tạo dòng đậu tương chuyển gene kháng sâu và chịu hạn.” Chuyên Đề

Nghiên Cứu Phát Triển và Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Nông Nghiệp

Tháng 6/2015, pp. 19–26.

9. Nguyễn Thị Thúy Hường. “phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan

đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam”. Luận án

tiến sĩ 2011.

10. Trần Thị Phương Liên, (2010) “Protein và tính chống chịu ở thực vật.” NXB

Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Hà Nội.

11. Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Tường Vân, Nông Văn Hải, Chu

Hoàng Hà, (2010) “Tách dòng và xác định trình tự cDNA của gen GS1 ở cây

đậu tương (Glycine Max L.).” Công Nghệ Sinh Học, vol. 8, No. 3A, pp. 499–

504.

12. Bùi Phương Thảo, Lê Thị Thủy, Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Chu

Hoàng Hà, Trần Thanh Thu, G.Angeneon, Lê Văn Sơn , (2009) “Nghiên cứu

tạo cây đậu tương chuyển gene mang cấu trúc biểu hiện gene mã hóa kháng

nguyên HA của Virus A/H5N1.” Hội Nghị KHCN Toàn Quốc Thái Nguyên, pp.

868–872.

13. Lê Thị Thủy, Lê Văn Sơn, Bùi Phương Thảo, Chu Hoàng Hà, (2010) “Nghiên

cứu tái sinh cây đậu tương (Glycine Max L.) thông qua nách lá mầm hạt Chín.”

Tạp Chí KHCN ĐH Quốc Gia HN, vol. 26, No. 2S, pp. 247–254.

Tiếng Anh

14. Alia, Hayashi H, Chen THH, Muratat N, “Transformation with a gene for

choline oxidase enhances the cold tolerance of arabidopsis during germination

and early growth.” Plant Cell Environ, vol. 21, pp. 232–239.

15. Allakhverdiev, Suleyman I., Dmitry A. Los, Prasanna Mohanty, Yoshitaka

Nishiyama, Murata, Norio., (2007) “Glycinebetaine alleviates the inhibitory

effect of moderate heat stress on the repair of photosystem II during

photoinhibition.” Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, vol. 1767, No.

12, pp. 1363–1371.

16. Ashraf, M., (2009) “Biotechnological approach of improving plant salt

tolerance using antioxidants as markers.” Biotechnology Adv, vol. 27, pp. 84–

93.

17. Bai Xianquan, Qiuyun Wang, Chengcai Chu, (2008) “Excision of a selective

marker in transgenic rice using a novel creloxp system controlled by a floral

specific promoter.” Transgenic Research, vol. 17, No. 6, pp. 1035–1043.

18. Berry JA, and Björkman O., (1980) “Photosynthetic response and adaptation to

temperature in higher plants.” Annu Rev Plant Physiol, vol. 31, pp. 491–543.

19. Bohnert, H. J., (1995) “Adaptations to environmental stresses.” The Plant Cell

Online, vol. 7, no. 7, pp. 1099–1111.

20. Boynton John E.Nicholas W.Gillham, Elizabeth H. Harris, Jonathan P. Holesr,

Anita, M.Johnson, Allan R.jones, Barbara L.randoph-Anderson, Dminiqe

Robertson, Ted M. klien, Katherine B. Shark, John C Sanfor, (1988)

“Chloroplast transformation in chlamydomonas with high velocity

microprojectiles.” Science, vol. 1482.

21. Cerezini Paula, Lima Santos, Antonio Eduardo Pípolo, Mariangela Hungria,

Marco Antonio Nogueira, (2017) “Water restriction and physiological traits in

soybean genotypes contrasting for nitrogen fixation drought tolerance.” Scientia

Agricola, vol. 74, No. 2, pp. 110–117.

22. Crossway Anne, Oakes Janette V., Irvine Jonathan M., Ward Barney, Knauf

Vic C., Shewmaker C. K. (1986) “Integration of foreign DNA following

microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.” MGG Molecular & General

Genetics, vol. 202, No. 2, pp. 179–185.

23. Dang, Wei, and Zhi ming Wei, (2007) “An optimized agrobacterium-mediated

transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes.”

Plant Science, vol. 173, Elsevier B.V., pp. 381–389.

24. Davey Michael R., Anthony Paul, Power J. Brian, Lowe Kenneth C. (2005)

“Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.” Biotechnology

Advances, vol. 23, No. 2 , pp. 131–171.

25. Depicker, A., Herman, L; Jacobs, A; Schell, J; (1985) “Frequencies of

simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the

Agrobacterium plant cell interaction.” Mol. Gen. Genet, vol. 201, p. 477484.

26. Fukuda, Y., (1933) “Cytogenetical studies on the wild and cultivated

manchurian soybeans (GlycineL.).” Japanese Journal of Botany, vol. 6, pp.

489–506.

27. Gorhan, John., (1995) “Betaines in higher plants ”– Biosynthesis and Role in

Stress Metabolism.

28. Haldimann, P., and U. Feller, (2004) “Inhibition of photosynthesis by high

temperature in oak (Quercus Pubescens L.) leaves grown under natural

conditions closely correlates with a reversible heat-dependent reduction of the

activation state of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase.” Plant,

Cell and Environment, vol. 27, No. 9, pp. 1169–1183.

29. Haldimann, Pierre, and Urs Feller, (2005) “Growth at moderately elevated

temperature alters the physiological response of the photosynthetic apparatus to

heat stress in pea (Pisum Sativum L.) leaves.” Plant, Cell and Environment,

vol. 28, No. 3, pp. 302–317.

30. Hamilton, E. W., and S. a Heckathorn, (2001) “Mitochondrial adaptations to

naCl. Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins,

whereas complex II is protected by proline and betaine.” Plant Physiology, vol.

126, No. 3, pp. 1266–1274.

31. Hansen, Geneviève, and Martha S. Wright, (1999) “Recent advances in the

transformation of plants.” Trends in Plant Science, vol. 4, No. 6, pp. 226–231.

32. Havaux, M., et al., (1996) “Thylakoid membrane stability to heat stress studied

by flash spectroscopic measurements of the electrochromic shift in intact potato

leaves: influence of the xanthophyll content.” Plant, Cell and Environment, vol.

19, No. 12, pp. 1359–1368.

33. Holmström KO, Somersalo S, Mandal A, Palva ET, Welin B, (2000) “Improved

tolerance to salinity and low temperature in transgeneic tobacco producing

glycine betaine.” J Exp Bot, vol. 51, pp. 177–185.

34. Hooykaas, P. J. J., and R. A. Schilperoort, (1992) “Agrobacterium and plant

genetic engineering.” Plant Mol. Biol., vol. 19, pp. 15–38.

35. Hymowitz, T., and C. A. Newell, (1981) “Taxonomy of the genus glycine,

domestication and uses of soybeans.” Econ. Bot, vol. 3 , pp. 272–288.

36. Chen THH, and Murata N., (2002) “Enhancement of tolerance of abiotic stress

by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes.” Current

Opinion in Plant Biology, vol. 5, pp. 250–257.

37. Chen WP, Li PH, Chen THH, (2000) “glycinebetaine increases chilling

tolerance and reduces chilling-induced lipid peroxidation in zea mays l.” Plant

Cell Environ, vol. 23, pp. 609–618.

38. Ikuta S, Mamura S, Misaki H, Horiuti Y, (1977) “Purification and

characterization of choline oxidase from arthrobacter globiformis.” J Biochem,

vol. 82, pp. 1741–1749.

39. Iqbal Z., Lateef M., Jabbar A., Muhammad G., Khan, M. N. (2005)

“Anthelmintic activity of calotropis procera (Ait.) ait. f. flowers in sheep.”

Journal of Ethnopharmacology, vol. 102(2).

40. James, J. A., and B. H. Lee, (1997) “Glucoamylases: microbial sources,

industrial applications and molecular biology - a review.” Journal of Food

Biochemistry, vol. 21, No. 1, pp. 1–52.

41. Kaeppler, H. F., Somers, D. A., Rines, H. W., Cockburn, A. F. (1992) “Silicon

carbide fiber-mediated stable transformation of plant cells.” Theoretical and

Applied Genetics, vol. 84, No. 5–6, pp. 560–566.

42. Khan MS, Zaidi A, Wani PA, Ahemad M, Oves M., (2009) “Functional

diversity among plant growth-promoting rhizobacteria. In: khan ms, zaidi a,

musarrat j (Eds) microbial strategies for crop improvement.” Springer, pp. 105–

132.

43. Kiyosue Tomohiro, Yamaguchi-Shinozaki Kazuko; Shinozaki Kazuo, (1993)

“Characterization of two cDNAs (ERD11 and ERD13) for dehydration-

inducible genes that encode putative glutathione s-transferases in arabidopsis

thaliana l.” FEBS Letters, vol. 335, No. 2, pp. 189–192.

44. Komari Toshihiko, Hiei Yukoh, Saito Yasuhito, Murai Nobuhiko, Kumashiro

Takashi, (1996) “Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation

of higher plants mediated by agrobacterium tumefaciens and segregation of

transformants free from selection markers.” The Plant Journal, vol. 10, No. 1,

pp. 165–174.

45. Lv S, Young A, Zhang K, Wang L, Zhang J, (2007) “ Increase of

glycinebetaine synthesis improves drought tolerance in cotton.” Mol Breed, vol.

20, pp. 233–248.

46. Ma XL, Wang YJ, Xie SI, Wang C, Wang W, (2007) “Glycinebetaine

application ameliorates negative effects of drought stress in tobacco.” Russ J

Plant Physiol, vol. 54, pp. 472–479.

47. McCue KF, and Hanson AD., (1990) “Drought and salt tolerance: towards

understanding and application.” Trends Biotechnol, vol. 8, pp. 358–362.

48. McKersie, Bryan D., and Ya’acov Y. Leshem, (1994) “Stress and stress coping

in cultivated plants.” Igarss 2014, No. 1.

49. Nishiyama Y, Yamamoto H, Allakhverdiev SI, Inaba M, Yokota A, Murata N,

(2001) “Oxidative stress inhibits the repair of photodamage to the

photosynthetic machinery.” EMBO J, vol. 20, pp. 5587–5594.

50. Nyyssölä Antti, Kerovuo Janne, Kaukinen Pasi, Von Weymarn Niklas,

Reinikainen Tapani (2000) “Extreme halophiles synthesize betaine from

glycine by methylation.” Journal of Biological Chemistry, vol. 275, No. 29, pp.

22196–22201.

51. Papageorgiou GC, and Murata N., (1995) “The unusually strong stabilizing

effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygene-evolving

photosystem II complex.” Photosynth Res, vol. 44, pp. 243–252.

52. Park, Eung-Jun, Zoran Jeknic, Atsushi Sakamoto, Jeanine DeNoma, Raweewan

Yuwansiri, Norio Murata, Tony H. H. Chen, (2004) “Genetic engineering of

glycinebetaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from

chilling damage.” The Plant Journal, vol. 40, pp. 474–487.

53. Park, Eung-Jun, Zoran Jeknic, Pino, Norio Murata, Tony H. H.

Chen,“Glycinebetaine accumulation is more effective in chloroplasts than in the

cytosol for protecting transgenic tomato plants against pbiotic stress.” Plant

Cell Environ, vol. 30, pp. 994–1005.

54. Parrott, W. A., Williams E. G. Hildebrand D. F., Collins G. B., (1989) “Effect

of genotype on somatic embryogenesis from immature cotyledons of soybean.”

Plant Cell, Tissue and Organ Culture, vol. 16, No. 1, pp. 15–21.

55. Prasad TK, Anderson MD, Martin BA, Stewart CR, (1994) “Evidence for

chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for

hydrogene peroxide.” Plant Cell, vol. 6, pp. 65–74.

56. Quan R, Shang M, Zhang H, Zhao Y, Zhang J, “Engineering of enhanced

glycinebetaine synthesis improves drought tolerance in maize.” Plant

Biotechnol J, vol. 2, pp. 477–486.

57. Quan R, Shang M, Zhang H, Zhao Y, Zhang J, “Improved chilling tolerance

by transformation with betA gene for the enhancement of glycinebetaine

synthesis in maize.” Plant Sci, vol. 166, pp. 141–149.

58. Rathinasabapathi, B, Burnet M, Russell B L, Gage D A, Liao P C, Nye G J,

Scott P, Golbeck J H, Hanson, A D., (1997) “Choline monooxygenase, an

unusual iron-sulfur enzyme catalyzing the first step of glycine betaine synthesis

in plants: prosthetic group characterization and cDNA cloning.” Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 94, No.

7, pp. 3454–8.

59. Sakamoto, Atsushi, and Norio Murata, (2000) “Genetic engineering of

glycinebetaine synthesis in plants: current status and implications for

enhancement of stress tolerance.” J Exp Bot, vol. 51, pp. 81–88.

60. Sakamoto, Atsushi, and Norio Murata, (2002) “The role of glycine betaine in

the protection of plants from stress: clues from transgeneic plants.” Plant Cell

Environ, Vol. 25, pp. 163–171.

61. Sakamoto Atsushi, Alia, Murata Norio (1998) “Metabolic engineering of rice

leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold.” Plant

Mol Bio, vol. 138, pp. 1011–1019.

62. Salmenkallio-Marttil M., Aspegren K S, Kurtn U, Mannonen L, Ritala A, Teeri

T H, (1995) “Transgenic barley ( hordeum vulgate l .) by eleetroporation of

protoplasts.” Plant Cell Reports, Vol. 15, pp. 301–304.

63. Salvucci, M. E., (2004) “Relationship between the heat tolerance of

photosynthesis and the thermal stability of rubisco activase in plants from

contrasting thermal environments.” Plant Physiology, vol. 134, No. 4, pp.

1460–1470.

64. Sawahel W., (2003) “Improved performance of transgeneic glycienebetaine

accumulating rice plants under drought stress.” Biologia Plantarum, vol. 47, pp.

39–44.

65. Shirasawa K, Takabe T, Kishitani S, (2006) “Accumulation of glycinebetaine in

rice plants that overexpress choline monooxygenease from spinach and

evaluation of their tolerance to abiotic stress.” Ann Bot, vol. 98, pp. 565–571.

66. Su J, Hirji R, Zhang L, He C, Selvaraj G, Wu R, (2006) “Evaluation of the

stress-inducible production of choline oxidase in transgeneic rice as a strategy

for producing the stress protectant glycine betaine.” J Exp Bot, vol. 57, pp.

1129–1135.

67. Szabados L, and Savoure A., (2009) “Proline: a multifunctional amino acid.”

Trends Plant Sci, vol. 15, pp. 89–97.

68. Takabe Teruhiro, Hayashi Y, Tanaka A, Takabe T, Kishitani S, (1998)

“Evaluation of glycinebetaine accumulation for stress tolerance in transgeneic

rice plants. in: proceedings of international workshop on breeding and

biotechnology for environmental stress in rice.” Hokkaido Agricultural

Experiment Station, Sapporo, pp. 63–68.

69. Thomashow MF., (1999) “Plant cold acclimation: freezing tolerance genees and

regulatory mechanisms.” Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, Vol. 50, pp.

571–599.

70. Wyn Jones RG, (1984) “Phytochemical aspects of osmotic adaptation.” Recent

Adv Phytochem, vol. 18, pp. 55–78.

71. Yamaguchi-Shinozaki K, Koizumi M, Urao S, Shinozaki K, (1992) “Molecular

cloning and characterization of 9 cDNAs for genes that are responsive to

desiccation in arabidopsis thaliana: sequence analysis of one cDNA clone that

encodes a putative transmembrane channel protein.” Plant Cell Physio, vol. 33,

pp. 217–224.

72. Yamaguchi-Shinozaki, K., and K. Shinozaki, (1993) “Characterization of the

expression of a desiccation-responsive rd29 gene of arabidopsis thaliana and

analysis of its promoter in transgenic plants.” Molecular & General Genetics :

MGG, vol. 236, No. 2–3,, pp. 331–340.

73. Yan, H., and C. M. Rommens, (2006) “Transposition-based plant

transformation.” Plant Physiology, vol. 143, No. 2, pp. 570–578.

74. Yang W.J., Rich P.J., Axtell J.D., Wood K.V., Bonham C.C., Ejeta G.,

Mickelbart M.V., Rhodes D, (2003) “Genotypic variation for glycinebetaine in

sorghum.” Crop Sci, vol. 43, pp. 162–169.

75. Yang, Xinghong, Xiaogang Wen, Hongmei Gong, Qingtao Lu, Zhipan Yang,

Yunlai Tang, Zheng Liang, Congming Lu, (2007) “Genetic engineering of the

biosynthesis of glycinebetaine enhances thermotolerance of photosystem II in

tobacco plants.” Planta, vol. 225, No. 3, pp. 719–733.

76. Yang, Xinghong, Zheng Liang, Congming Lu, (2005) “Genetic engineering of

the biosynthesis of glycinebetaine enhances photosynthesis against high

temperature stress in transgenic tobacco plants.” Plant Physiology, vol. 138,

No. 4, pp. 2299–2309.

77. Yukawa Kiyoshi, Kaku Hisatoshi, Tanaka Hiroshi, Koga-Ban Yasunori,

Fukuda Masao (2007) “characterization and host range determination of

soybean super virulent Agrobacterium Tumefaciens KAT23.” Bioscience,

Biotechnology, and Biochemistry, vol. 71, No. 7, pp. 1676–1682.

78. Zeng P., Vadnais D. A., Zhang Z., Polacco J. C., (2004) “Refined glufosinate

selection in Agrobacterium-Mediated transformation of soybean [Glycine Max

(L.) Merrill].” Plant Cell Reports, vol. 22, No. 7, pp. 478–482.

79. Nguyen HT, Babu RCBlum, A. (1997) “Breeding for drought resistance in

rice: physiology and molecular genetics considerations”. Crop Sci. 37:

1426-14

80. Taylor HM Burnett E, Booth GD (1978) “Taproot elongation rates of

soybeans”. Z. Acker-und Pflanzenbau Bd. 146

81. Kaspar TC, Taylor HM, Shibles RC. (1984) “Taproot elongation rates of

soybean cultivars in the glasshouse and their relation to filed rooting

depth”. Crop Sci. 24: 916-920

82. Huck MG, Ishihara K, Peterson C.M. and Ushijima T (1983) “Soybean

adaptation to water stress at selected stages of growth”. Plant Physiol. 73:

422-427.

83. Purcell LC, King CA (1996) “Drought and nitrogen source effects on

nitrogen nutrition, seed growth, and yield in soybean”. J. Plant Nutr. 19:

969-99

84. King CA, Purcell LC (2005) “Inhibition of N2 fixation in soybean is

associated with elevated ureides and aminoacids”. Plant Physiol. 137: 1389-

1396.

85. Sinclair TR., Purcell L.C, King CA., Sneller CH., Chen P, Vadez V (2007)

“Drought tolerance and yield increase of soybean resulting from improved

symbiotic N fixation”. Field Crops Res. 101: 68-7.

86. Tran LS, Mochida K (2010) “Functional genomics of soybean for improvement

of productivity in adverse conditions” Funct Integr Genomics. ;10(4):447-62.

87. ISAAA, Brief 52: Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016,

ISAAA briefs; 2016.

PHỤ LỤC

1. Môi trường nuôi khuẩn

Yeast extract peptone yeast extract (10 g/l) + NaCl (5 g/l) + tryptone ( 10 g/l) +

(YEB) đặc 15g/l Bacto agar, pH = 7

Yeast extract peptone yeast extract (10 g/l ) + NaCl (5 g/l) + tryptone(10 g/l),

(YEP) lỏng pH = 7

2. Môi trường chuyển gen thuốc lá

Môi trường Thành phần

Nhiễm khuẩn(½ MS) ½ MS pH 5,8

Bổ sung: 0,02g/l Acetosyringone

Tiền nuôi cấy (MS1) MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar, pH 5,8

Đồng nuôi cấy (MS2) MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar, pH 5,8

Bổ sung: 0,02g/l Acetosyringone

Chọn lọc tạo chồi MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar, pH 5,8

(MS3) Bổ sung: 500mg/l Cefotaxime + 2mg/l ppt

Chọn lọc cây (MS4) MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 0,1mg/l IBA + 8g/l

Agar, pH 5,8

Bổ sung: 500mg/l Cefotaxime + 1 mg/l ppt

3. Môi trường gây hạn nhân tạo ở thuốc lá.

Môi trường Thành phần

Cảm ứng tạo chồi MS + 1mg/l BAP + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar + 2,5% PEG

8000 +1mg/l ppt, pH 5,8

Tạo rễ MS + 0,1mg/l IBA + 20g/l Sucrose + 8g/l Agar + 2,5% PEG

8000 +1mg/l ppt, pH 5,8

4. Môi trường chuyển gen Đậu tương

Môi trường Thành phần

Gieo hạt (GM) 3,052g/l Muối B5 + 20 g/l Sucrose + 2,5 g/l gellan, pH =

5,8 có bổ sung 1ml/l vitaminB5 1000X

Nhiễm khuẩn (CCM lỏng) 0,316g/l Muối B5 + 1,7 mg/l BAP + 3,9g/l MES +

0,25mg/l GA3 +30 g/l Sucrose, pH = 5,4 có bổ sung:

0,04g/l Acetosyringone + 154mg/l dithiothreitol + 400

mg/l L-cysteine +158 mg/l Sodium thiosulfate + 1ml/l

vitaminB5 1000X +1,67 mg/l BAP +0,25mg/l GA3

Đồng nuôi cấy (CCM 0,316g/l Muối B5 + 1,7 mg/l BAP + 3,9g/l MES +

đặc) 0,25mg/l GA3 +30 g/l Sucrose + 6 g/l Agar, pH = 5,4

có bổ sung: 0,04g/l Acetosyringone + 1ml/l vitaminB5

1000X +1,67 mg/l BAP +0,25mg/l GA3

Diệt khuẩn và tạo đa chồi 3,052g/l Muối B5 + 0,59g/l MES +30 g/l Sucrose + 8 g/l

(SIM) Agar, pH = 5,8 có bổ sung: 1,67 mg/l BAP + 500mg/l

Cefotaxim + 1ml/l vitaminB5 1000X

Tái sinh cây hoàn chỉnh 4,3g/l MS + 0,59g/l MES + 30 g/l Sucrose + 200ml/l

(SEM) nước dừa + 2,5 g/l gellan, pH = 5,8 có bổ sung: 500mg/l

Cefotaxim + 1ml/l vitaminB5 1000X + 500mg/l GA3 +

100mg/l IAA + 200ml/l Nước dừa + 50mg/l L-

Asparagine monohydrate

Ra rễ (RM) 4,3g/l MS + 20 g/l Sucrose + 0,59g/l MES + 2,5 g/l

gellan, pH = 5,8 có bổ sung: 250mg/l Cefotaxim +

0,1mg/l IBA + 1ml/l vitaminB5 1000X + 50mg/l L-

Asparagine monohydrate