ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------
Nguyễn Thị Khuyến
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN
GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn
Hà Nội - 2016
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 4
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 6
1.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae ......................................................... 6
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae ................................................ 6
1.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae ................................................................. 7
1.1.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae .......................................................................................... 8
1.1.4. Ph}n biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin .... 9
1.2. C|c phương ph|p chuyển gen v{o nấm sợi ............................................................... 12
1.2.1. Phương ph|p chuyển gen sử dụng tế b{o trần (protoplast) .......................... 12
1.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation) ................................. 13
1.2.3. Phương ph|p chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT) .... 13
1.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc c|c chủng chuyển gen .................................... 17
1.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm .......................................... 19
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 23
2.1. Nguyên liệu .............................................................................................................................. 23
2.1.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................................................ 23
2.1.2. Thiết bị v{ hóa chất ........................................................................................................... 25
2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu..................................................................... 28
2.2. Phương ph|p nghiên cứu .................................................................................................. 28
2.2.1. Thu nhận b{o tử nấm ....................................................................................................... 29
2.2.2. T|ch chiết DNA, RNA v{ tổng hợp cDNA ................................................................. 29
2.2.3. Quan s|t hình th|i v{ kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa ................ 30
2.2.4. Ph}n biệt A. oryzae v{ A. Flavus bằng c|c kỹ thuật sinh học ph}n tử ........ 31
2.2.5. Tạo c|c vector nhị thể dùng cho chuyển gen ........................................................ 32
2.2.6. Chuyển gen v{o nấm sợi A. oryzae ............... Error! Bookmark not defined.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................... Error! Bookmark not defined.
3.1. X|c nhận chủng A. oryzae an to{n để sử dụng cho chuyển gen ............... Error!
Bookmark not defined.
3.1.1. Ph}n biệt c|c chủng A. oryzae an to{n v{ chủng Aspergillus flavus sinh độc
tố aflatoxin .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen . Error! Bookmark not
defined.
3.2. Lựa chọn marker chuyển gen v{o A. oryzae Error! Bookmark not defined.
3.3. X}y dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ...... Error!
Bookmark not defined.
3.3.1. Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil ........... Error!
Bookmark not defined.
3.3.2. Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen v{o A. oryzae trợ dưỡng
uridine/uracil .................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.4. Đ|nh gi| hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP v{
DsRed Error! Bookmark not defined.
3.4.1. Chuyển gen GFP v{ DsRed v{o nấm sợi A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
.................................................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.4.2. X|c nhận c|c thể chuyển gen .......................... Error! Bookmark not defined.
3.5. Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA m~ hóa
enzyme phytase của A. fumigatus ở A. oryzae ..... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 34
MỞ ĐẦU
Aspergillus oryzaelà loài nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực
phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nước châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung
Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines. Loài nấm này đã
được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn
(GRAS). Ở Việt Nam, A. oryzae được sử dụng để sản xuấttương truyền thống tại một
số địa phương ở các tỉnh phía Bắc.A. oryzae có khả năng tiết một lượng lớn các
enzyme khác nhau vào môi trường. Do đó, loài nấm này được sử dụng như nhà máy
tế bào để sản xuất thương mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên và tái
tổ hợp. Gần đây chủng A. oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại Nhật
Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen. Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của A.
oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm sợi
an toàn này.
Hiện nay, hai phương pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là
chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Tuy nhiên việcchuyển gen vào nấm sợiA. oryzaecho đến nay chỉ sử
dụng phương pháp chuyển gen qua tế bào trần.Phương pháp này tương đối phức tạp
và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn với chi phí
hợp lý. Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành
công ở nấm sợi A. oryzae. Bên cạnh đó, A. oryzaecókhả năng kháng lại hầu hết các
hợp chất kháng sinh thường được sử dụng cho chuyển gen.Do đó phát triển các
chủng A. oryzae trợ dưỡngđể sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải
biến di truyền cũng như biểu hiện gen ởA. oryzae.
Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển genhiệu quả cho nấm sợi A. oryzae
thông quavi khuẩn A. tumefaciensnhằm phục vụ hướng nghiên cứu bền vững về biểu
hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài“Nghiên
cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
cho nấm sợi Aspergillus oryzae” với những nội dung chính như sau:
- Xác nhận các chủng A. oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tượng
chuyển gen.
- Tạo chủng A. oryzae đột biến trợ dưỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen
pyrG.
- Tạomột số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu
hiện gen ở nấm sợi A. oryzae.
- Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh
quangGFP vàDsRed.
- Bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạođược để biểu hiện gen
phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus.