Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------

Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Huỳnh Thị Thu Huệ

TS. Lê Hồng Điệp

Hà Nội, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn

khoa học của TS. Huỳnh Thị Thu Huệ và TS. Lê Hồng Điệp. Các nội dung nghiên

cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ

hình thức nào.

Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của

các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung

luận văn.

Học viên

Nguyễn Thùy Linh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học,

trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến

thức cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Thị Thu Huệ –

Viện Nghiên cứu hệ gen và TS. Lê Hồng Điệp –Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận

tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản

Luận văn Thạc sĩ này. Xin được cảm ơn đề tài cấp nhà nước: ―Phân lập thiết kế gen

chịu hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen‖ do Viện Nghiên cứu hệ gen

chủ trì, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản đã hỗ trợ tôi về mọi

phương diện để thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen - Viện Nghiên

cứu hệ gen đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã

luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình

học tập và nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên

Nguyễn Thùy Linh

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................. ii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. iv

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vi

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. vii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Cây ngô và hạn hán ....................................................................................... 3

1.1.1. Tình hình về cây ngô ở nước ta .............................................................. 3

1.1.2. Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô ............................................ 4

1.1.3. Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán .................................. 5

1.2. Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn ............................................. 6

1.2.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới ............. 6

1.2.2. Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới ................................................................................................................ 7

1.2.3. Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam ....................... 9

1.3. Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB ....................... 10

1.3.1. Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật ............................... 10

1.3.2. Họ nhân tố phiên mã DREB................................................................. 12

1.3.3. Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7 .......................................................... 13

Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 15

2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 15

2.1.1. Mẫu thực vật ......................................................................................... 15

2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector và mồi ............................................................ 15

2.1.3. Hóa chất và môi trường ........................................................................ 17

2.1.4. Thiết bị nghiên cứu .............................................................................. 18

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19

2.2.1. Tách chiết DNA ................................................................................... 19

2.2.2. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA .................................................... 20

2.2.3. Phương pháp PCR ................................................................................ 21

2.2.4. Tinh sạch DNA .................................................................................... 21

2.2.5. Tạo tế bào khả biến E. coli và biến nạp bằng sốc nhiệt ....................... 21

2.2.6. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens và biến nạp bằng xung điện ........ 22

2.2.7. Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv ............................................................. 22

2.2.8. Tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv: :polyA .............................................................................................................. 23

2.2.9. Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .............. 24

2.2.10. Real-time PCR định lượng để ước lượng số bản sao của gen trong cây chuyển gen................................................................................................... 26

2.2.11. Real-time PCR định lượng để đánh giá sự biểu hiện của gen trong cây chuyển gen................................................................................................... 27

2.2.12. Phân tích cây chuyển gen ................................................................. 28

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 29

3.1. Kết quả phân lập gen ZmDREB2.7tv từ cây ngô Tẻ vàng 1 ....................... 29

3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 ................................ 29

3.1.2. Phân lập và tạo dòng gen ZmDREB2.7tv ............................................. 30

3.1.3. Phân tích trình tự gen ZmDREB2.7tv ................................................... 32

3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2.7tv ......... 35

3.2.1. Thiết kế vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv................... 35

3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv ...... 39

3.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens EHA105 mang vector biểu hiện ................ 42

3.3. Kết quả tạo cây ngô biến đổi gen mang gen ZmDREB2.7tv ....................... 42

3.3.1. Chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô thế hệ T0 .............................. 42

3.3.2. Đánh giá cây chuyển gen thế hệ T0 ..................................................... 47

3.3.3. Tạo và đánh giá cây chuyển gen thế hệ T1 .......................................... 50

3.3.4. Ước lượng số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế .............................................................................................................. 51 hệ T1

3.3.5. Đánh giá sự biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T2 ......................................................................................... 53

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 56

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 57

iii

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta. .................................................................................................................... 4

Hình 1.2. Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm [32]. ......................................................................................................................... 7

Hình 1.3. Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn [32]. ......................................................................................................................... 8

Hình 1.4. Các nhóm protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp hạn [28]. ....................................................................................................................... 11

Hình 2.1. Phương pháp tạo vector biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv ................ 24

Hình 3.1. Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số từ ba mẫu lá ngô Tẻ vàng 1 ............ 29

Hình 3.2. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pJET1.2/ZmDREB2.7tv ......................................................................................... 31

Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv bằng enzyme giới hạn BglII. .......................................................................................... 32

Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự ZmDREB2tv phân lập từ giống ngô Tẻ vàng 1 và trình tự tham chiếu ngô B73 bằng công cụ BioEdit. ........................................ 34

Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv ............................................................................................................................... 36

Hình 3.6. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pRTL2/rd29A: :ZmDREB2.7tv ...................................................................................................... 37

Hình 3.7. Kết quả kiểm tra plasmid pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv..................... 38

Hình 3.8. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pCAMBIA1300/ rd29A::ZmDREB2.7tv ........................................................................................... 40

Hình 3.9. Kết quả tạo plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv .............. 41

Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA .... ............................................................................................................................... 42

Hình 3.11. Quá trình chuyển gen vào ngô trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium. ...................................................................................................... 43

Hình 3.12. Điện di đồ DNA tổng số tách từ các cây chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T0 ................................................................................................................ 47

Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T0 ....................................... 48

Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HygR trong cây chuyển gen thế hệ T0 ............................................................................................ 49

Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm trong cây chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T2 .................................................................... 54

Hình 3.17. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 của cây chuyển gen khi gặp hạn. ........................................................................... 54

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................... 16

Bảng 2.2. Thành phần các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu ............... 17

Bảng 3.1. Kết quả chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô .................................. 46

Bảng 3.2: Kết quả phân ly của gen ZmDREB2tv trong cây chuyển gen thế hệ T1 ............................................................................................................................... 50

Bảng 3.3. Đường chuẩn khuếch đại của hai gen ZmDREB2.7tv và Glb-1 ........... 52

Bảng 3.4. Giá trị Ct và số lượng bản sao gen ZmDREB2.7tv của trong các cây chuyển gen thế hệ T1 ............................................................................................ 53

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Actin-1 Gen actin-1

AP2/ERF2 AP2/ethylene-responsive element-binding

AS Acetone syringone

CBF C-repeat Binding Factors

DNA Deoxyribonucleic acid

DREB Dehydration-responsive element-binding

Glb-1 Gen globulin-1

HygR Gen hygromycin

International Service for the Acquisition of Agribiotech ISAAA Applications

KL Khuẩn Lạc

MS Murashige and Skoog Medium

PCR Polymerization Chain Reaction

rd29A Gen/promoter của gen rd29A

RNA Ribonucleic acid

USDA The United States Department of Agriculture

vii

ZmDREB2.7tv Gen ZmDREB2.7 phân lập từ ngô Tẻ vàng 1

MỞ ĐẦU

Cây ngô là một trong các loài cây trồng quan trọng đối với con người. Ở Việt

Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Mặc dù sản lượng tăng lên

đáng kể trong vài năm trở lại đây, năng suất trồng ngô vẫn chưa đạt được giá trị

tiềm năng của nó do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó, nguyên nhân chính

ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất ngô là khô hạn, nhất là khi hiện tượng biến đổi

khí hậu khiến các đợt hạn hán xảy ra thường xuyên hơn và nghiêm trọng hơn. Do

đó, bên cạnh các biện pháp thủy lợi, việc nghiên cứu tạo giống ngô có khả năng

thích ứng cao với điều kiện hạn hán là một trong những mục tiêu chính trong các

chương trình lai tạo giống. Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật và sự chấp thuận

cây trồng biến đổi gen ở nước ta đã mở ra một cơ hội, đồng thời là thách thức lớn

trong việc tạo ra giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn. Nguyên nhân gồm cả

khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu

nhiều, công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là

đối tượng khó để chuyển gen.

Giống ngô Tẻ vàng 1 sống ở vùng núi đá thuộc tỉnh Điện Biên, nơi có nhiệt

độ và lượng mưa hằng năm thấp. Giống ngô này đang được sử dụng làm nguồn

nguyên liệu cho các chương trình cải tạo giống bởi khả năng chịu hạn và chịu lạnh

tốt. Đặc điểm có lợi này có thể liên quan đến các gen tham gia vào con đường

chống chịu với bất lợi của cây. Thực vật đáp ứng với các yếu tố bất lợi thông qua

các thay đổi về hình thái và sinh lý, mà cơ sở là thay đổi sự biểu hiện của các gen

tham gia quá trình đáp ứng và bảo vệ. Sự biểu hiện của gen có liên quan chặt chẽ

với hoạt động của các nhân tố khởi đầu phiên mã. DREB (Dehydration Responsive

Element Binding) là một họ nhân tố phiên mã lớn, tham gia vào con đường đáp ứng

với bất lợi của cây. Các gen mã hóa cho các protein trong họ này lần lượt được phân

lập và nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Ở ngô, họ gen DREB gồm nhiều

thành viên và trong đó ZmDREB2.7 đã được nhận định là một gen tiềm năng và

tham gia đáng kể vào phản ứng chịu hạn ở cây.

Do đó, với mục đích cung cấp nguyên liệu cho việc tạo giống ngô biến đổi

gen có khả năng chịu hạn, luận văn thạc sĩ được tiến hành với nội dung: ―Nghiên

cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn‖. Mục tiêu

của nghiên cứu là phân lập gen DREB2.7 từ dòng ngô Tẻ vàng 1 chịu hạn. Từ đó,

phân tích đặc điểm trình tự của gen và protein được dự đoán. Tiếp theo, gen

ZmDREB2.7tv dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng mạnh với hạn - rd29A

được chuyển vào dòng ngô thuần để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây ngô

chuyển gen.

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

1.1. Cây ngô và hạn hán

1.1.1. Tình hình về cây ngô ở nước ta

Ngô là cây lương thực quan trọng ở nước ta, đứng vị trí thứ hai sau lúa. Ngô

là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và là bữa ăn chính của người dân tại nhiều khu

vực đồi núi Việt Nam. Ngô cũng được sử dụng để sản xuất một vài sản phẩm công

nghiệp như cồn, siro ngô, bột ngô... Đồng thời, thân và hạt ngô được sử dụng làm

thức ăn chăn nuôi. Trong đó, 80% tổng sản lượng ngô tiêu thụ hằng năm phục vụ

cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi.

Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, diện tích trồng

ngô ở nước ta vào năm 2017 là 1,1 triệu héc ta [1]. Con số này được dự báo sẽ tăng

trưởng nhẹ vào các năm tới, sau đó giữ ổn định trong khoảng 0,95 – 1,1 triệu héc ta

sau năm 2025 [1]. Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp

Quốc, Việt Nam đứng thứ 24 về sản lượng ngô và thứ 28 về diện tích trồng ngô

nhưng chỉ đứng thứ 56 về năng suất ngô vào năm 2016 [31]. Năng suất ngô trung

bình năm 2016/2017 chỉ đạt 4,60 tấn/ha và với chi phí sản xuất lớn, sản lượng ngô

quốc nội không thể cạnh tranh với ngô từ các nước khác. Ngô sản xuất trong nước

chỉ đủ để đáp ứng từ 40 - 50% nhu cầu của thị trường. Do đó, hàng năm, Việt Nam

phải nhập khẩu hàng triệu tấn hạt để phục vụ công nghiệp sản xuất thức ăn chăn

nuôi (Hình 1.1). Vài năm trở lại đây, lượng ngô nhập nhẩu tăng đáng kể khiến nhà

nước phải có các chính sách khuyến khích người dân chuyển đổi các vùng trồng lúa

sang trồng ngô. Tuy nhiên, lợi nhuận từ việc trồng ngô thấp, chi phí trồng ngô cao

khiến người nông dân từ bỏ nhiều diện tích trồng ngô. Theo dự đoán, để đáp ứng

được nhu cầu về ngô, năng suất ngô nước ta phải đạt ít nhất 5 tấn/ha, giảm giá thành

sản xuất và tăng thu nhập trong người nông dân [19]. Do đó, vấn đề nâng cao sản

xuất ngô nội địa không chỉ đóng vai trò trong nông nghiệp mà còn quan trọng đối

với kinh tế nước nhà.

Hình 1.1. Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta.

Đơn vị: triệu tấn [33]

1.1.2. Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô

Năng suất trồng ngô nước ta tăng đáng kể trong những năm gần đây. Tuy

nhiên, con số 4,60 tấn/ha vẫn tương đối thấp và chưa đạt được đúng tiềm năng có

thể có ở cây ngô (so với Mỹ 11,08 tấn/ha) [31]. Năng suất của cây ngô có thể cao

hơn nhiều, nhưng trên thực tế, nhiều nhân tố chủ quan và khách quan có tác động

tiêu cực đến sản lượng ngô. Trong đó, hạn hán là một trong những nguyên nhân

chính gây mất mùa ở ngô. Nhất là khi, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu, các đợt

nắng nóng và hạn hán kéo dài xảy ra với tần suất ngày càng cao. Năm 2018 chứng

kiến nhiều đợt hạn hán nghiêm trọng kéo dài ở khu vực châu Âu; Mỹ phải chịu

đựng nhiều làn sóng nhiệt trong suốt mùa hè; châu Úc cũng báo cáo năm 2018 là

năm nắng nóng kỉ lục. Ở nước ta, thời điểm cuối tháng 6, đầu tháng 7 năm nay,

nắng nóng gay gắt xảy ra trên diện rộng các tỉnh Bắc Bộ và Trung Bộ đã ảnh hưởng

nghiêm trọng đến hoạt động canh tác của nông dân. Trong khi đó, vụ đông xuân

năm 2018-2019 cũng dược dự báo sẽ xảy ra nắng hạn đối với các tỉnh nam Trung

bộ và Tây Nguyên. Do đó, hạn hán là vấn đề cấp bách không chỉ đối với cây ngô

mà cả sản xuất nông nghiệp nói chung.

Hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống của cây ngô, đặc biệt

nghiêm trọng nếu hạn xảy ra vào giai đoạn phát triển, trước và sau khi ra hoa [12].

Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các triệu chứng như toàn bộ thân và lá

sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại từ dưới

lên trên ngọn, khí khổng lá đóng lại, quang hợp giảm mạnh, giảm cố định carbon và

do đó sinh trưởng bị chậm lại. Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7-10 ngày, sự phát

triển của bắp sẽ chậm hơn cờ, do đó quá trình phun râu chậm hơn sự tung phấn,

điều này dẫn đến khả năng thụ phấn thấp. Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể

dẫn đến việc mất hoàn toàn bắp và do đó mất năng suất [8]. Nếu hạn hán xảy ra

trong thời gian tạo hạt, bắp ngô sẽ có ít hàng hạt và các hàng không có nhiều hạt

[13]. Như vậy, hạn hán dù ngắn hay dài, nhẹ hay nghiêm trọng cũng ảnh hưởng

không nhỏ đến năng suất của cây ngô.

1.1.3. Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán

Hai hướng tiếp cận chính để giảm thiểu thiệt hại do thiên tai nói chung và

hạn hán nói riêng đối với cây trồng là (1) giảm khả năng cây gặp điều kiện bất lợi

và (2) làm tăng khả năng cây chống chịu với các bất lợi đó.

Để giảm khả năng cây gặp hạn, thông thường cần cải tạo hệ thống thủy lợi

tưới tiêu, xây dựng các hồ dự trữ nước để đối phó với điều kiện hạn. Đôi khi, việc

thay đổi phương thức canh tác, thời gian canh tác cũng có thể giúp cây hạn chế gặp

hạn ở các giai đoạn quan trọng trong chu trình sống. Tuy nhiên, thực tế là, ước tính

khoảng 80% diện tích trồng ngô của nước ta không có hệ thống thủy lợi, hoạt động

tưới tiêu phụ thuộc vào nguồn nước mưa tự nhiên. Hơn nữa, phần lớn ngô được

trồng trên khu vực đồi núi trọc, núi đá, các khu vực này thường có khí hậu khắc

nghiệt, điều kiện thời tiết thất thường, khả năng giữ nước của đất kém. Vì vậy, biện

pháp giảm khả năng cây ngô gặp hạn trở nên bất khả thi trong thời gian cấp bách

khi các đợt hạn xảy ra nhiều và khó dự báo hơn.

Biện pháp làm tăng khả năng chống chịu với hạn của cây ngô được cho là có

tiềm năng và lợi thế hơn. Hiện nay, người ta có thể dùng phương pháp lai tạo giống

hoặc tạo cây chuyển gen để tạo ra các cây có tính trạng mới tốt hơn. Phương pháp

lai tạo được coi là phương pháp truyền thống để tạo giống mới. Tuy nhiên, lai tạo

ngô cần nhiều thời gian, công sức và diện tích trồng. Hơn nữa, trong quá trình lai

tạo, bên cạnh tính trạng mong muốn thường đi kèm với các tính trạng không mong

muốn. Ngoài ra, sự cách ly sinh sản giữa các loài cũng là một trong những hạn chế

của phương pháp lai tạo giống này [6]. Trong khi đó, phương pháp tạo cây biến đổi

gen mang lại nhiều lợi thế cho người tạo giống. Thời gian để tạo cây mang tính

trạng mong muốn cần ít thời gian hơn, phương pháp sàng lọc đơn giản hơn. Đồng

thời, sự cách biệt về khoảng cách di truyền được xóa bỏ giúp các nhà khoa học có

thể đưa vào cây trồng các đặc tính tốt của những loài nằm rất xa trong cây phát sinh

chủng loại [6]. Do đó, ngày càng nhiều các giống cây trồng mới được tạo ra là kết

quả của công nghệ tạo cây biến đổi gen.

1.2. Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn

1.2.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới

Các nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen trên thế giới bắt đầu từ những cuối

những năm 1980, sau đó tăng dần vào đầu những năm 1990 và tăng mạnh trong giai

đoạn 2000 - 2010 cùng với sự phát triển của cây trồng biến đổi gen nói chung (Hình

1.2) [32]. Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm trên đồng ruộng của cây ngô biến đổi

gen luôn chiếm tỉ lệ cao trong tổng số các thử nghiệm được USDA cấp phép trong

những năm qua, khoảng 30-50% (Hình 1.2). Đồng thời, diện tích trồng ngô biến đổi

gen cũng tăng mạnh trong những năm gần đây. Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm

trên đồng ruộng của cây ngô chuyển gen đang có xu hướng giảm trong vài năm gần

đây, cùng với xu hướng của cây chuyển gen nói chung. Nguyên nhân là do cây số

lượng lớn các nghiên cứu tìm kiếm các gen và con đường tiềm năng liên quan đến

các tính trạng tốt đã được thực hiện từ những năm 2000. Do đó, các nghiên cứu hiện

tại phần lớn tập trung vào việc khai thác các gen giá trị, tích hợp các gen này vào

cùng một cây và tối ưu các yếu tố liên quan đến điều hòa gen trong cây chuyển gen.

Hình 1.2. Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm [32].

Đến nay, ngô là loài cây trồng có số lượng sự kiện chuyển gen được USDA

thông qua nhiều nhất với 148 sự kiện [18]. Từ đó đến nay, không thể phủ nhận lợi

ích của ngô chuyển gen mang lại cho kinh tế, xã hội và môi trường. Năm 2017, diện

tích trồng ngô biến đổi gen đạt 59,7 triệu ha toàn cầu, chiếm 32% tổng diện tích

trồng ngô nói chung (188 triệu ha) [19]. Trong đó, 5,3 triệu ha trồng ngô có khả

năng kháng sâu, 6,3 triệu ha ngô kháng thuốc diệt cỏ và 48,1 triệu ha trồng ngô có

cả hai đặc tính trên. Việc trồng ngô biến đổi gen đã mang lại lợi nhuận cho người

nông dân trong giai đoạn 21 năm (1996-2016) ước tính đạt 63,7 tỷ đô la Mỹ và chỉ

riêng trong năm 2016 là 6,9 tỷ đô la Mỹ [19].

1.2.2. Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới

Những thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các giống cây biến đổi gen chịu

hạn nói chung và cây ngô nói riêng bắt đầu từ năm 1998 với số lượng ít và tăng

chậm trong 6 năm sau đó [32]. Tuy nhiên, con số này tăng dần từ năm 2005, đạt ổn

định tương đối vào giai đoạn 2008-2015 (khoảng 100-150 thử nghiệm mỗi năm).

Sau đó, số lượng các thử nghiệm giảm từ từ, đến năm 2017, chỉ 55 thử nghiệm về

cây chuyển gen chịu hạn được cấp phép (Hình 1.3). Trong đó, cây ngô có số lượng

thử nghiệm trên đồng ruộng cao nhất, trung bình chiếm 87% trong tổng số các loài

cây trồng. Tuy vậy, so với các tính trạng trên cây ngô như kháng thuốc diệt cỏ hoặc

thuốc trừ sâu, các thử nghiệm về tính trạng chịu hạn vẫn còn hạn chế (chiếm 9%).

Hình 1.3. Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn [32].

Giống ngô chịu hạn đầu tiên là Genuity® DroughtGard™, do Công ty

Mosanto sản xuất, được phê duyệt bởi USDA vào tháng 12 năm 2011, chứa gen

CspB (cold shock protein B) có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Theo thống

kê của ISAAA [19], diện tích trồng ngô Genuity® DroughtGard™ tăng từ 50.000

ha vào năm 2013 lên 810.000 ha vào năm 2015. Năm 2016, diện tích trồng ngô biến

đổi gen chịu hạn đạt 1,2 triệu ha đã tạo ra lợi ích về kinh tế đạt 20 triệu đô la Mỹ, so

với giai đoạn 2014-2016 là 33,3 triệu đô la Mỹ [19]. Giống ngô này sử dụng nước

hiệu quả trong điều kiện bất lợi, do đó đã làm giảm các chi phí liên quan đến động

tưới tiêu. Người nông dân ở các nước đang phát triển, có cánh đồng nhỏ và ít tập

trung hơn sẽ thu được nhiều lợi ích hơn từ công nghệ này. Hơn nữa, các sự kiện ngô

với tính trạng kết hợp như chịu hạn, chịu thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu đã được thử

nghiệm từ năm 2014. Năm 2017, khoảng 1,4 triệu ha ngô chuyển gen chịu hạn với

các tính trạng kết hợp khác [19]. Giống ngô biến đổi gen chịu hạn này cũng sẽ

mang lại lợi ích cho người nông dân ở các nước thường xuyên phải đối mặt với các

đợt hạn nghiêm trọng như châu Phi, châu Âu và một vài khu vực châu Mỹ Latin và

châu Á.

1.2.3. Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam

Công nghệ sinh học được coi là công cụ quan trọng để đạt các mục tiêu quốc

gia, do đó đang được tập trung nghiên cứu và phát triển để hiện đại hóa nền nông

nghiệp và góp phần phát triển nông thôn Việt Nam. Tầm nhìn của nước ta đến năm

2020 là 70% các sản phẩm công nghiệp có nguồn gốc từ công nghệ sinh học. Trong

đó, 30-50% là cây trồng biến đổi gen, 70% các cây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy

in vitro, 80% diện tích trồng rau và hoa quả sử dụng phân bón và chế phẩm trừ sâu

có nguồn gốc sinh học. Cuối cùng, công nghệ sinh học với vai trò là một cấu thành

của khoa học và công nghệ đóng góp 50% vào giá trị nông nghiệp ở nước ta [19].

Ở Việt Nam, ngô là cây trồng biến đổi gen đầu tiên được chấp thuận trồng

thương mại [19]. Với con số 45.000 ha vào năm 2017, diện tích trồng ngô đạt mức

tăng trưởng 13 lần so với năm 2015 là 3.500 ha. Đồng thời, ước tính 37.500 người

nông dân đã chấp thuận và trồng ngô biến đổi gen vào năm 2017, tăng 29% so với

năm 2016 [19]. Đến nay, Việt Nam đã cấp phép cho 22 sự kiện cây biến đổi gen,

trong đó có 14 sự kiện là cây ngô được sử dụng làm thức ăn và thức ăn chăn nuôi.

Trong đó, năm sự kiện (một sự kiện kháng thuốc diệt cỏ và bốn sự kiện đồng thời

kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ) được cho phép trồng thương mại ở nước ta [19].

Các giống ngô chuyển gen được trồng từ năm 2015 chủ yếu mang tính trạng kết

hợp kháng côn trùng và kháng thuốc diệt cỏ. Nghiên cứu của Brookes và Barfoot đã

ước tính rằng, việc chấp thuận ngô biến đổi gen vào năm 2015 đã dần dần mang lại

lợi nhuận cho người nông dân và đồng thời được cho là làm giảm lượng ngô nhập

khẩu [7]. Cụ thể, lợi ích của việc trồng ngô biến đổi gen từ năm 2015 đến 2016 ở

Việt Nam đạt 5,45 triệu đô la Mỹ, trong đó 5 triệu đô la Mỹ chỉ tính trong năm

2016. Do đó, người nông dân Việt Nam sẽ có lợi nhiều hơn khi xu hướng chấp nhận

cây biến đổi gen tăng nhanh [7].

Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây ngô chuyển gen ở Việt Nam mới

đang ở giai đoạn đầu tuy nhiên đã đạt được những thành tựu nhất định. Nhóm

nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đồng [2-4] đã phân lập và chuyển thành công

các gen chịu hạn ZmNF-YB2 và IPT vào các dòng ngô VH1 và C8H9 cho kết quả

ổn định và đồng đều. Một nghiên cứu khác thực hiện chuyển gen CspB đã tối ưu

hóa codon vào ba dòng ngô Việt Nam V152N, C436 và C7N với hiệu suất chuyển

gen của ba dòng lần lượt là 0,90%, 0,28% và 0,50% [5]. Các nghiên cứu khác hiện

nay tập trung vào việc phân lập các gen có giá trị và tiềm năng liên quan đến các

tính trạng mong muốn; tối ưu hóa các quy trình chuyển gen và nuôi cấy mô để phù

hợp với các dòng ngô nền của Việt Nam.

1.3. Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB

1.3.1. Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật

Khi cây đối mặt với hạn, một loạt các thay đổi về mặt sinh lý và hóa sinh

được diễn ra ở cấp độ tế bào, bao gồm mất lực trương, thay đổi tính thấm và thành

phần của màng, thay đổi nồng độ các chất hòa tan và sự tương tác của protein-

protein hay protein-lipid [9]. Cây có thể chống chịu với hạn bằng các cơ chế như

tránh sự mất nước, thích ứng với sự mất nước, hoặc cả hai. Các hình thức chống

chịu trên được điều khiển bởi các tính trạng hình thái và sinh trưởng như độ dày của

rễ, khả năng rễ xâm nhập vào các lớp đất đặc, độ sâu và sinh khối rễ. Các tính trạng

mang tính cơ định trên được thể hiện kể cả khi cây không gặp điều kiện hạn. Trong

khi đó, các tính trạng mang tính thích ứng, ví dụ như khả năng điều hòa thẩm thấu

và thích nghi với hạn, xuất hiện khi hiện tượng thiếu nước xảy ra [17]. Sự giảm hoạt

động quang hợp, tích lũy các chất hữu cơ và hòa tan và sự thay đổi trong quá trình

chuyển hóa carbohydrate là các đáp ứng sinh lý và hóa sinh điển hình khi cây gặp

bất lợi. Sự giảm các hoạt động quang hợp là do các sự kiện khác nhau, ví dụ việc

đóng khí khổng và giảm hoạt động của enzyme trong chu trình. Việc tổng hợp các

chất có hoạt tính điều hòa thẩm thấu là một trong các cơ chế giúp cây thích nghi với

điều kiện thiếu nước. Các phân tử này, hoạt động như là các nhân tố giúp cân bằng

thẩm thấu, sẽ tích lũy trong các tế bào thực vật khi hạn xảy ra và sau đó bị phân giải

khi điều kiện môi trường trở về bình thường. Đồng thời, các protein tham gia vào

trung hòa các gốc oxi hóa tự do sinh ra khi cây gặp bất lợi cũng đóng vai trò bảo vệ

Hình 1.4. Các nhóm protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp hạn [28].

các thành phần của tế bào (Hình 1.4).

Các thay đổi kể trên là kết quả của sự kết hợp hài hòa giữa sự đóng hoặc mở

các nhóm gen liên quan trong cây. Việc nắm rõ cơ sở phân tử của quá trình đáp ứng

hạn là vô cùng quan trọng trong cải tiến khả năng chịu hạn của giống thông qua

công nghệ gen. Nhiều nghiên cứu đã phân lập và đánh giá hàng trăm gen được cảm

ứng khi cây gặp hạn. Sản phẩm của các gen này hoặc tham gia tiếp nhận và dẫn

truyền tín hiệu bất lợi cho tế bào, hoặc điều hòa sự biểu hiện của các gen đáp ứng,

hoặc tham gia bảo vệ và duy trì hoạt động tế bào (Hình 1.4). Trong khi các gen mã

hóa cho protein tham gia bảo vệ có tác dụng trực tiếp, các gen mã hóa cho các

protein tiếp nhận và dẫn truyền và nhân tố phiên mã lại gián tiếp giúp cây tồn tại

bằng cách ảnh hưởng đến các gen khác [17].

Việc sử dụng một hoặc một vài gen mã hóa protein bảo vệ giúp các nhà khoa

học kiểm soát đầu ra rõ ràng hơn bởi hoạt động của các sản phẩm gen có tác động

trực tiếp lên kiểu hình chịu hạn. Tuy nhiên, tính trạng chịu hạn là một tính trạng

phức tạp, việc tác động lên một vài gen bảo vệ thường không đủ hiệu quả. Hơn nữa,

việc chuyển đồng thời nhiều gen vào cây không những yêu cầu kĩ thuật cao và thời

gian dài mà còn có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự cân bằng hệ gen của cây. Do

đó mà hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu đến nhóm gen mã hóa

cho nhân tố phiên mã hoặc nhân tố tham gia tiếp nhận và truyền tín hiệu. Nguyên

nhân là do chỉ cần thao tác trên một gen thuộc nhóm này cũng có thể tạo nên ảnh

hưởng đến nhiều gen khác nhau và do đó tác động lên kiểu hình theo nhiều hướng

khác nhau để cùng tạo nên tính trạng mong muốn. Tuy nhiên, điều này cũng cần

được nghiên cứu một cách kỹ càng và cẩn thận bởi các tác động có thể gây ra bất

thường trong sinh trưởng của cây.

1.3.2. Họ nhân tố phiên mã DREB

Nhân tố phiên mã là các protein tham gia khởi động quá trình phiên mã của

gen bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu nằm trên vùng promoter của gen

đó. Các nhân tố phiên mã làm thay đổi mức độ biểu hiện của các gen đáp ứng với

hạn kể trên, từ đó các đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây được điểu chỉnh phù hợp

để cây sống sót và duy trì sinh trưởng trong điều kiện thiếu nước. Trong nhiều năm

qua, các nhà khoa học đã phát hiện và nghiên cứu nhiều họ nhân tố phiên mã khác

nhau tham gia vào con đường đáp ứng của cây với điều kiện bất lợi, trong đó có

điều kiện hạn. Các nhân tố phiên mã đáp ứng với hạn gồm WRKY, zinc finger,

AP2/ERF2 (AP2/ethylene-responsive element-binding), MYB và NAC [30].

Ở thực vật, nhóm nhân tố phiên mã đáp ứng tốt nhất với các điều kiện bất lợi

là protein C-repeat-binding factor (CBF)/dehydrationresponsive element-binding

(DREB) thuộc họ protein AP2/ERF2 [22]. Promoter của các gen được điều hòa bởi

các nhân tố phiên mã DREB có chứa yếu tố DRE (Dehydration Responsive

Element), với trình tự lõi là A/GCCGAC. Nhân tố phiên mã DREB bám vào các

trình tự DRE bằng domain bám DNA đặc hiệu - AP2 và được phân thành hai nhóm:

DREB1 và DREB2 [21]. Mặc dù chúng chủ yếu tham gia con đường điều hòa của

các gen liên quan đến bất lợi về nước, những chức năng khác cũng được tìm thấy ở

từng gen DREB nhất định. Ví dụ, gen DREB1D/CBF4 có vai trò trong khả năng

thích ứng với hạn của cây, trong khi gen tương đồng với nó là DREB1A/CBF3 lại

có chức năng trong đáp ứng với lạnh [16]. Trong khi đó, protein DREB1C/CBF2

được xác định là nhân tố điều hòa dương tính trong con đường đáp ứng với lạnh ở

cây bằng việc điều hòa chặt chẽ sự biểu hiện của hai gen DREB1A/CBF3 và

DREB1B/CBF1 [23]. Hai nhân tố phiên mã thuộc nhóm DREB2 là DREB2A và

DREB2B ở cây Arabidopsis thaliana lại cho thấy vai trò ở hai điều kiện bất lợi

khác nhau, lần lượt là bất lợi về thẩm thấu và nhiệt độ cao [26]. Trong khi đó, gen

DREB2B phân lập từ lúa tăng cường khả năng chịu hạn và lạnh ở cây chuyển gen

[10]. Đồng thời, một gen thuộc nhóm DREB2 phân lập từ cây dương (Populus

euphratica) lại có hiệu quả trong cả điều kiện lạnh, mất nước và nồng độ muối cao

[11]. Có thể thấy, các gen DREB khác nhau có sự phân hóa chức năng rõ ràng và

hiện đang là một vấn đề được quan tâm. Dù vậy, các nghiên cứu trên nhiều loài

khác nhau, ví dụ như lúa, cà chua, đậu tương, lúa mì, lúa mạch và ngô gợi ý rằng

gen DREB nằm ở trung tâm trong con đường đáp ứng bất lợi ở thực vật.

1.3.3. Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7

Protein DREB2.7 thuộc họ nhân tố phiên mã DREBs/CBFs (Dehydration

Responsive Element Binding proteins/C-repeat Binding Factors - DREBs). Liu và

cộng sự đã phân tích protein ZmDREB2.7 và phát hiện rằng protein có khả năng

bám với hai trình tự DRE điển hình, ACCGAC và GCCGAC với ái lực như nhau

[22]. Khi so sánh với protein ZmDREB2A, protein ZmDREB2.7 cũng có ái lực bám

thấp với trình tự GCC - trình tự đặc trưng trong promoter của các gen đáp ứng với

ethylene hay các bất lợi sinh học [24]. Điều này thể hiện rằng tình tự GCC không

phải là vị trí nhận biết đặc hiệu của protein ZmDREB2.7. Khi chuyển gen

ZmDREB2.7 vào Arabidopsis, người ta nhận thấy, cây chuyển gen tăng khả năng

chịu hạn lên đáng kể. Phần lớn các dòng chuyển gen biểu hiện protein ZmDREB2.7

có kiểu hình bình thường trừ một dòng có mức độ biểu hiện cao nhất của protein

này có sự giảm nhẹ về kích thước lá. Như vậy, sự biểu hiện của yếu tố phiên mã này

không ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình và sự sinh trưởng của cây [22].

Liu và cộng sự đã phân tích dữ liệu hệ gen của ngô tham chiếu B73 và xác

định được 20 gen ZmDREB khác nhau [22]. Trong đó, gen ZmDREB2.7 trong ngô

B73 dài 1080bp, không chứa intron và nằm trên NST số 1. Nghiên cứu của Liu và

cộng sự đồng thời chỉ ra rằng gen ZmDREB2.7 có mức độ biểu hiện rất thấp ở các

mô khác nhau và chỉ được cảm ứng biểu hiện nhẹ ở mô rễ và lá dưới điều kiện khô

hạn. Tuy nhiên, protein ZmDREB2.7 lại có khả năng hoạt hóa phiên mã cao so với

các protein ZmDREB khác. Như vậy, gen ZmDREB2.7 đóng vai trò quan trọng

trong cơ chế đáp ứng với bất lợi phi sinh học của ngô [22]. Do đó, gen ZmDREB2.7

từ các giống chống chịu hạn tốt có thể cung cấp nguồn vật liệu di truyền giá trị cho

chuyển gen và lai tạo giống.

Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

2.1.1. Mẫu thực vật

- Nguồn vật liệu phân lập gen là giống ngô Tẻ vàng 1 do Viện Nghiên cứu

Ngô cung cấp. Hạt ngô được gieo trong phòng thí nghiệm đến giai đoạn ba lá thì thu

mẫu để phân lập gen.

- Nguồn vật liệu để chuyển gen là phôi non dòng ngô K7 do Viện Nghiên cứu

Ngô cung cấp. Cây ngô được trồng và chăm sóc ngoài đồng ruộng. Sau 55 - 60

ngày, các cây cho phôi được thụ phấn bằng các hạt phấn màu trắng hoặc vàng sáng

từ cây cho phấn. Sau 9 - 13 ngày, bắp ngô non được thu để cung cấp phôi cho thí

nghiệm chuyển gen.

2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector và mồi

- Chủng vi khuẩn cho thí nghiệm nhân dòng là Escherichia coli DH10β.

Chủng vi khuẩn sử dụng để chuyển gen vào cây ngô là A. tumefaciens EHA105.

Các chủng vi khuẩn do Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen

cung cấp.

- Các vector được sử dụng trong nghiên cứu gồm: vector nhân dòng pJET 1.2

(Thermo Scientific, Mỹ), vector nhân dòng trung gian pRTL2/rd29A và vector biểu

hiện thực vật pCAMBIA1300 do Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu

hệ gen cung cấp.

- Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu được thiết kế và tổng hợp bởi

Công ty Integrated DNATechnologies (Mỹ). Danh sách các cặp mồi được liệt kê

trong Bảng 2.1

Bảng 2.1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5’ – 3’)

Thí nghiệm phân lập gen ZmDREB2.7tv

ZmDREB2.7_F TCCGCCCGCCTTCATTCC

ZmDREB2.7_R CTGGGAACGAAGCAGTAGC

Thí nghiệm thiết kế vector và kiểm tra cây chuyển gen

ZmDREB2.7_SacI_F ATAGAGCTCATGGATCGGGTGCCGCCGCCGG

ZmDREB2.7_SacI_R ATAGAGCTCTCAAAGAGGGACGACGAGCTGC

rd29A_F TGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTC

polyA_R ACCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT

HygR_F TACACAGCCATCGGTCCAGAC

HygR_R ATCGGCACTTTGCATCGG

Thí nghiệm ước lượng số lượng bản sao gen ZmDREB2.7tv

grd29A_F CTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT

gZm2.7_R CTCGTGCTGCGTACCTT

qGlb1_F CGGATAAGCACGGTAAGGAG

qGlb1_R GTGTGTTGGGTTGGCTGTATG

Thí nghiệm đánh giá sự biểu hiện của gen ZmDREB2.7

rZmDREB2.7_F AGTTCGTCCACCACCTGC

rZmDREB2.7_R TGCCCTTCATGCACCCCTTG

qActin_F AGGATACACACTTCCTCATGC

qActin_R CTGTTCATAATCAAGGGCAACG

2.1.3. Hóa chất và môi trường

- Các bộ kit, enzyme, hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm nhân dòng, nuôi

cấy mô tế bào thực vật, chuyển gen, kiểm tra cây chuyển gen được cung cấp bởi các

hãng uy tín như: Thermo Scientific (Mỹ), Merck (Đức), New England Biolabs

(Mỹ),…

- Môi trường sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nuôi cấy mô thực vật được

liệt kê trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Thành phần các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu

Môi trƣờng Thành phần

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

5 g/L cao nấm men, 10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl LB

YEP 5 g/L cao nấm men, 10 g/L peptone, 5 g/L NaCl, 25 mg/L rifampicin, 50 mg/L kanamycin

Môi trường nuôi cấy mô thực vật

MS + 2,4D 1,5mg/L + L-proline 0,7g/L + sucrose 68,4 g/L + glucose 36 g/L + AS (100uM). Lây nhiễm lỏng

pH 5,5

Nuôi ủ - đồng nuôi cấy MS + 2,4D 2mg/L + L-proline 0,7 g/L + sucrose 30 g/L + phytagel 2,4 g/L + AgNO3 0,85 mg/L + AS (100uM). pH 5,8

Nuôi phục hồi

MS + 2,4D 2mg/L + L-proline 0,7 g/L + sucrose 30 g/L + MES 0,5 g/L + phytagel 2,4g/L + cefotaxim 100mg/L + vancomycin 100mg/L + AgNO3 0,85 mg/L pH 5,8

Chọn lọc 1

MS + 2,4D 1,5mg/L + L-proline 0,7 g/L + MES 0,5 g/L + sucrose 30 g/L + phytagel 2,4 g/L + cefotaxim 100mg/L + vancomycin 100mg/L + AgNO3 0,85 mg/L + hygromycin 1,5 mg/L. pH 5,8

Chọn lọc 2 MS + 2,4D 1,5mg/L + L-proline 0,7 g/L + MES 0,5 g/L + sucrose

30 g/L + phytagel 2,4 g/L + cefotaxim 100mg/L + vancomycin 100mg/L + AgNO3 0,85 mg/L + hygromycin 3 mg/L. pH 5,8

Tái Sinh 1 MS + myo-inositol 100mg/L + sucrose 60 g/L + phytagel 2,4 g/L + cefotaxim 100mg/L + vancomycin 100mg/L + hygromycin 3 mg/L.

pH 5,8

Tái Sinh 2 MS + myo-inositol 100mg/L + sucrose 30 g/L + casein 400mg/L + kinetin 1mg/L + nước dừa 150 mL/L + phytagel 2,4 g/L.

pH 5,8

MS + myo-inositol 100mg/L + sucrose 30 g/L + casein 100mg/l NAA 1mg/L + IBA 0.1 mg/L + phytagel 2,4 g/L. Môi trƣờng ra rễ

pH 5,8

2.1.4. Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị được sử dụng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Bao gồm: Tủ lạnh 20C (Sanyo, Nhật Bản),

Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt (Memmert, Đức), máy làm

khô chân không (Concentrator Plus) (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh Eppendorf

5424R (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh đa năng 5810R (Eppendorf, Đức), máy

chạy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy PCR Master Cycler Pro S

(Eppendorf, Đức), máy soi gel M-26 UVP (Mỹ), máy chụp ảnh gel (GelDoc) UVP

(Mỹ), máy ủ nhiệt Thermomixer C (Eppendorf, Đức), máy giải trình tự ABI 3500

Genetic Analyzer (Life Technologies, Nhật), máy biến nạp xung điện Gene Pulser

(Bio-Rad, Mỹ), box cấy vi sinh vật The Esco Airstream® Class II Biological Safety

Cabinet (Esco, Singapore). Phòng nuôi cấy mô vô trùng, box cấy thực vật Esco

laminar flow cabinets (Esco, Singapore).

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết DNA

DNA tổng số của lá ngô được tách chiết theo quy trình của Rogers và

Bendich [25]. 0,5 g lá tươi được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày

sứ. Sau đó, bột lá được chuyển vào ống ly tâm 1,5 mL chứa 0,5 mL đệm chiết (100

mM Tris-HCl pH8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA pH8,0, 2% CTAB, 0,2% β-

mercaptoethanol) và đảo đều. Hỗn hợp dịch chiết được ủ ở 65°C trong 60 phút.

Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và dịch ở

pha trên chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Dung dịch phenol : choloroform :

isoamyl alcohol (tỉ lệ thể tích 25 : 24 : 1) được bổ sung vào ống mẫu với tỷ lệ thể

tích là 1:1, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C. Dịch ở pha trên

được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở

37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL. DNA được tủa bằng cách

bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ

trong 3 giờ ở -20°C. Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút

ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH

70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch.

Bước rửa được thực hiện hai lần. Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5

phút và được hòa trong nước không chứa Dnase. DNA được bảo quản ở -20°C.

Plasmid được tách chiết từ 3 mL dịch nuôi khuẩn lạc đơn trong ống nghiệm

chứa môi trường lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp, ở nhiệt độ phù hợp (28°C

đối với A. tumefaciens và 37°C đối với E. coli ), nuôi qua đêm với tốc độ lắc 200

vòng/phút. Đầu tiên, dịch nuôi khuẩn được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong

5 phút ở 4°C để thu cặn tế bào. Sau đó, cặn tế bào được hòa tan trong 150 µL dung

dịch I (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTA pH 8,0). Sau khi bổ sung

150 µL dung dịch II (0,2 M NaOH, 1% SDS) và đảo nhẹ 3 – 5 lần, cho 150 µL

dung dịch III ( 3M CH3COOK, 11,5% CH3COOH) vào ống mẫu và đặt trên đá

trong 5 phút. Ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch

trên và chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở

37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL. DNA được tủa bằng cách

bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ

trong 3 giờ ở -20°C. Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút

ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH

70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch.

Bước rửa được thực hiện hai lần. Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5

phút và được hòa trong nước không chứa Dnase. DNA được bảo quản ở -20°C.

2.2.2. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA

Trong nghiên cứu này, RNA được tách chiết theo phương pháp sử dụng TRI

Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu lá ngô. Đầu tiên, 2 - 3 g lá được nghiền thành

bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Sau đó, bổ sung ngay 700 µL Trizol và

bột lá và trộn đều. Hỗn hợp mẫu được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL và giữ ở

nhiệt độ phòng trong 5 phút. Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở điều kiện 12.000

vòng/phút, trong 10 phút ở 4°C, sau đó thu dịch ở pha trên và chuyển sang ống ly

tâm 1,5 mL mới. 300 µL Chloroform được bổ sung vào ống và vortex trong 15 – 20

giây. Ống mẫu được ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và

dịch trên được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. RNA được tủa bằng cách bổ

sung 300 µL 2-propanol lạnh và ủ mẫu ở -20°C trong 1giờ. Sau đó, ống mẫu được

ly tâm với điều kiện 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa

RNA được rửa bằng cách bổ sung 300 µL EtOH 70%, lắc nhẹ ống và ly tâm 12.000

vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Bước rửa tủa được thực hiện hai lần.

Tủa RNA được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút sau đó hòa tan

RNA tổng số trong 50 µL nước đã được xử lý với DEPC (Diethyl pyrocarbonate).

RNA tổng số được bảo quản ở -80°C.

RNA được kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ và đưa về nồng độ 1

µg/µL để làm khuôn cho phản ứng tổng hợp sợi thứ nhất. Phản ứng tổng hợp cDNA

sử dụng bộ kit USB® First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real-Time PCR

(Affymetrix, Mỹ). Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản

xuất.

2.2.3. Phương pháp PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích là 25 µL. Bao gồm các thành

phần: 2,5 µL 10X DreamTaq Buffer, 1 µL dNTPs 10mM, 1 µL 10 µM mồi xuôi, 1

µL 10 µM mồi ngược, 1 µL DNA khuôn (20 ng – 100 ng), 0,2 µL 5U/µL

DreamTaq DNA polymerase và nước. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt

PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau:

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR phân lập trình tự ZmDREB2.7: 95°C - 3

phút; 30 chu kỳ: 95°C - 45 giây, 58°C - 45 giây, 72°C - 1 phút 30 giây; 72°C - 5

phút; 4°C.

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv:

95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 1 phút; 72°C - 5

phút; 4°C.

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng rd29A::ZmDREB2.7tv: 95°C

- 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 56°C - 30 giây, 72°C - 1 phút 15 giây; 72°C - 5

phút; 4°C.

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen HygR: 95°C - 3 phút; 30 chu

kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 50 giây; 72°C - 5 phút; 4°C.

2.2.4. Tinh sạch DNA

- Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt với enzyme giới hạn được tinh sạch bằng

bộ kit GeneJET Gel Purification Kit (Thermo Scientific,Mỹ).

2.2.5. Tạo tế bào khả biến E. coli và biến nạp bằng sốc nhiệt

Tế bào khả biến E. coli được chuẩn bị bằng CaCl2 0,1 M và sau đó được

dùng cho biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt theo quy trình của của Sambrook và

cộng sự [27].

2.2.6. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens và biến nạp bằng xung điện

Tế bào khả biến A. tumefaciens được chuẩn bị bằng HEPES (N-2-

hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) 1 mM pH 7,0 để dùng cho biến

nạp theo phương pháp xung điện. Đầu tiên, một khuẩn lạc đơn A. tumefaciens được

nuôi cấy trong 2 mL môi trường YEP ở 28°C, 6 giờ. Sau đó, 50 µL dịch vi khuẩn

trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 50 mL môi trường YEP lỏng đến khi

OD660nm đạt 1-1,5. Tiếp theo, dịch vi khuẩn được làm lạnh mẫu trên đá 15 phút rồi

ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Tế bào được hòa tan trong

10 mL 1 mM HEPES lạnh và ủ trên đá 15 phút; sau đó ly tâm ly tâm 5000

vòng/phút trong 20 phút và bỏ dịch. Bước này được thực hiện hai lần. Sau đó, bổ

sung 10 mL 10% glycerol vào ống tế bào, hòa tan tủa và ủ trên đá 15 phút; sau đó ly

tâm ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút và bỏ dịch. Tủa tế bào được hòa trong

500-700 µL 10% glycerol và chia 45 µL dịch tế bào vào mỗi ống ly tâm 1,5 mL.

Các ống tế bào khả biến được làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng và giữ tế bào ở -80°C.

Để biến nạp plasmid vào tế bào khả biến A. tumefaciens bằng phương pháp

xung điện, trước tiên tế bào khả biến A. tumefaciens được làm tan bằng cách đặt

ống tế bào trên đá 15 phút. 2 µL plasmid tái tổ hợp được bổ sung vào ống chứa tế

bào khả biến, sau đó trộn đều và đặt ống trên đá trong 5 phút. Hỗn hợp được chuyển

sang cuvette đã được làm lạnh từ trước; lau sạch bên ngoài cuvette. Tế bào khả biến

được xung điện ở 5ms; hiệu điện thế 2,5 kV; điện trở 400Ω. Sau đó, bổ sung ngay 1

mL môi trường SOC lạnh vào cuvette, đảo đều và chuyển dịch khuẩn sang ống vô

trùng, lắc ở 28°C trong 1,5 giờ. Dịch nuôi được cấy trải trên môi trường YEP đặc có

bổ sung kháng sinh chọn lọc. Khuẩn lạc mọc sau hai ngày nuôi đĩa vi khuẩn ở 28°C.

2.2.7. Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv

DNA tổng số được tách chiết từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 theo phương pháp đã

mô tả ở mục 2.2.1. Sau đó, phản ứng PCR phân lập gen ZmDREB2.7tv được thực

hiện với thành phần và chu trình nhiệt như đã mô tả ở mục 2.2.3; trong đó, khuôn là

DNA tổng số của cây ngô Tẻ vàng 1 với cặp mồi ZmDREB2.7_F/R. Tiếp theo, sử

dụng bộ kit CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Mỹ) để xử lý đầu bằng

sản phẩm PCR trên và ghép nối đoạn gen ZmDREB2.7tv vào vector pJET1.2 theo

quy trình của nhà sản xuất. Các plasmid nhân dòng được kiểm tra bằng cách xử lý

plasmid với enzyme giới hạn BglII và đọc trình tự hai chiều.

2.2.8. Tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv:

:polyA

Vector chuyển gen pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA được xây

dựng bằng các phản ứng cắt và nối với enzyme phù hợp theo sơ đồ trên hình 2.1.

Trước tiên, vùng mã hóa của gen ZmDREB2.7tv được gắn với trình tự nhận biết của

enzyme giới hạn SacI ở hai đầu bằng phản ứng PCR với cặp mồi

ZmDREB2.7_SacI_F/R và khuôn là vector nhân dòng pJET1.2/ZmDREB2.7tv theo

thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như ở mục 2.2.3. Sản phẩm PCR

ZmDREB2.7_SacI và vector pRTL2/rd29A cùng được cắt bởi enzyme SacI, sau đó

nối với nhau để tạo vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA. Vector

tái tổ hợp được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme giới hạn SacI và phản ứng

PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F và polyA_R. Tiếp theo, vector pRTL2/

rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA và pCAMBIA1300 cùng được cắt bởi enzyme

HindIII, sau đó nối với nhau để tạo vector pCAMBIA1300/rd29A:

:ZmDREB2.7tv::polyA. Các vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng cách xử lý với

enzyme giới hạn thích hợp.

Hình 2.1. Phương pháp tạo vector biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv

2.2.9. Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

Cây ngô chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng quy trình chuyển gen

vào phôi ngô non trung gian qua vi khuẩn A. tumefaciens theo Frame và cộng sự

[14].

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn: Chuyển một khuẩn lạc A. tumefaciens chứa

plasmid quan tâm trên đĩa nuôi cấy vào 3 mL môi trường YEP lỏng có bổ sung

kháng sinh thích hợp và lắc 200 vòng/phút ở 28°C qua đêm. Dịch nuôi được làm

mới trong 50 mL môi trường YEP lỏng có kháng sinh thích hợp. Khi dịch nuôi đạt

OD600 = 1, thu tế bào bằng cách ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong 15

phút. Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong môi trường lây nhiễm có bổ sung AS

(acetyl syringone). Dịch huyền phù vi khuẩn có chỉ số OD600 = 0,5 được sử dụng để

lây nhiễm với phôi non của ngô.

- Chuẩn bị phôi non: Bắp ngô non được thu từ các cây ngô mẹ sau khi thụ

phấn từ 9 - 13 ngày. Bắp ngô được khử trùng bề mặt bằng dung dịch NaOCl 5%.

Ngay sau khi thu hái, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng và được lây

nhiễm với dịch vi khuẩn có bổ sung AS nồng độ 100 µM trong 20 phút.

- Đồng nuôi cấy: Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi

trường đồng nuôi cấy, đặt trong tối ở nhiệt độ 21°C trong 3 ngày.

- Nuôi phục hồi: Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường đồng nuôi cấy sang

môi trường phục hồi, đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 7 ngày.

- Chọn lọc mô sẹo: Mô sẹo tạo thành từ phôi non được cấy chuyển từ môi

trường phục hồi sang môi trường chọn lọc 1 có bổ sung kháng sinh hygromycin (1,5

mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 14 ngày. Sau đó, các mô sẹo tiếp tục được

chuyển sang môi trường chọn lọc 2 có nồng độ kháng sinh hygromycin (3mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28oC trong 14 ngày.

- Tạo chồi: Các mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc được

cấy chuyển sang môi trường tái sinh 1, không có chất kích thích sinh trưởng, đặt

trong tối ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngày. Các mô sẹo phôi hoá này tiếp đó được cấy

chuyển sang môi trường tái sinh 2 không bổ sung kháng sinh, đặt ngoài sáng ở nhiệt

độ 25°C, liên tục chuyển môi trường tái sinh 2 cho đến khi các mô sẹo phôi hoá này

tạo thành các chồi.

- Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh: Chồi tái sinh trong môi trường tái sinh

được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh ở điều kiện sáng 25°C, trong

khoảng 10 - 20 ngày.

- Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường tái sinh khi có khoảng 2 - 3

lá được chuyển ra trồng trên giá thể trấu hun trong hai tuần, sau đó được chuyển ra

trồng trên đất.

2.2.10. Real-time PCR định lượng để ước lượng số bản sao của gen trong cây

chuyển gen

Phương pháp định lượng tương đối [29] gồm hai phân tích định lượng tuyệt

đối được sử dụng để ước lượng số bản sao của gen quan tâm trong cây chuyển gen.

Hai phân tích định lượng tuyệt đối được thực hiện trên đoạn rd29A:ZmDREB2.7tv

và gen đối chứng nội sinh globulin-1 (Glb-1 - là gen đơn bản trong cây ngô).

Phản ứng real-time PCR định lượng sử dụng Luna® Universal qPCR Master

Mix (New England Biolabs, Mỹ) trên hệ thống máy LightCycler® 96 System

(Roche, Thụy Sĩ). Mỗi phản ứng có thể tích 20 µL gồm các thành phần: 10 µL Luna

Universal qPCR Master Mix, 0,5 µL 10 µM mồi xuôi, 0,5 µL 10 µM mồi ngược, 1

µL 10 ng DNA tổng số và nước. Cặp mồi nhân vùng rd29A: :ZmDREB2.7tv là

grd29A_F và gZm2.7_R. Cặp mồi nhân gen nội sinh Glb-1 là qGlb1_F và qGlb_R.

Chu trình nhiệt cho phản ứng như sau: 95°C - 60 giây; 45 chu kỳ: 95°C - 15 giây,

60°C - 30 giây. Điều kiện để phân tích đường cong nóng chảy được sử dụng chương

trình mặc định của hệ thống máy.

Đường chuẩn được xây dựng bằng cách pha loãng DNA tổng số của cây

chuyển gen D5.1 về nồng độ 1 ng/µL, 10 ng/µL và 100 ng/µL và sử dụng để làm

khuôn cho phản ứng real-time PCR. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại ba lần. Dữ

liệu được phân tích bằng phần mềm LightCycler® 96 version 1.1 và xây dựng

đường chuẩn cho mỗi trình tự rd29A::ZmDREB2.7tv và Glb-1.

Khi đó, số lượng bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen được

suy ra tương đối từ tỷ lệ giữa số lượng phân tử ban đầu của trình tự

{1}

rd29A::ZmDREB2.7tv với Glb-1 trong hệ gen cây ngô (Z0/G0) theo công thức:

Trong đó, Z và G lần lượt là ký hiệu gen ZmDREB2.7tv và Glb-1; I và S lần

lượt là chu kì bão hòa (Y-intercept) và hệ số góc (slope) của đường chuẩn, Ct là giá

trị chu kì ngưỡng của phản ứng khuếch đại gen tương ứng trong mẫu phản ứng.

2.2.11. Real-time PCR định lượng để đánh giá sự biểu hiện của gen trong cây

chuyển gen

Để đánh giá sự biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 trong cây, phương

pháp real-time PCR định lượng tương đối được sử dụng với gen actin là gen đối

chứng nội sinh.

Phản ứng real-time PCR định lượng tương đối được thực hiện với tổng thể

tích phản ứng là 20 µL gồm: 10 µL 2X Luna Universal qPCR Master Mix, 0,4 µL

10 µM mồi xuôi, 0,4 µL 10 µM mồi ngược, 0,5 µL cDNA và nước. Chu trình

nhiệt cho phản ứng như sau: 95°C - 60 giây; 45 chu kỳ: 95°C - 15 giây, 62°C - 30

giây. Điều kiện để phân tích đường cong nóng chảy được sử dụng chương trình mặc

định của hệ thống máy. Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại. Cặp mồi nhân

cDNA gen ZmDREB2.7 là rZmDREB2.7_F và rZmDREB2.7_R. Cặp mồi nhân

cDNA gen Actin-1 là qActin_F và qActin_R.

Để so sánh tương đối mức độ biểu hiện của gen giữa cây chuyển gen và cây

không chuyển gen ở hai điều kiện bình thường và điều kiện hạn, nghiên cứu sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt, các mẫu thí nghiệm chuẩn hóa theo cây không chuyển

gen (calibrator) trong điều kiện thí nghiệm bình thường theo công thức sau:

{2} ΔCt = CtD – CtA

R = 2-(ΔCt(X) – ΔCt(WT0)) {3}

Trong đó, D và A lần lượt là gen ZmDREB2.7tv và actin, Ct là giá trị chu kì

ngưỡng của phản ứng khuếch đại gen trong mẫu phản ứng, X và WT0 lần lượt là

cây thí nghiệm ở điều kiện nhất định và cây không chuyển gen ở điều kiện bình

thường.

2.2.12. Phân tích cây chuyển gen

- Cây ngô chuyển gen thế hệ T0 được tạo ra theo phương pháp chuyển gen

như mô tả ở mục 2.2.9. Các cây ngô chuyển gen thế hệ T1, T2 được thu bằng cách

tự thụ phấn cây T0, T1 tương ứng.

- Các cây chuyển gen ở các thế hệ được thu lá để tách DNA tổng số theo quy

trình ở mục 2.2.1. Sau đó, sự có mặt của các đoạn gen quan tâm: gen ZmDREB2.7tv

và HygR được kiểm tra bằng phản ứng PCR như mô tả ở mục 2.2.3.

- Sự phân ly của gen ZmDREB2.7tv được đánh giá bằng phương pháp chi bình phương (χ2) để tìm ra tỷ lệ phù hợp nhất. Nếu giá trị χ2 < 3,841 thì tỷ lệ phân ly

được cho là đúng với mức ý nghĩa α=0,05, ngược lại là giả thuyết sai.

- Số lượng bản sao của gen chuyển trong cây chuyển gen thế hệ T1 được ước

lượng bằng phương pháp real-time PCR định lượng tuyệt đối như mô tả ở mục

2.2.10.

- Để đánh giá sự biểu hiện của gen quan tâm trong cây ngô biến đổi gen thế

hệ T2 và cây không chuyển gen, các cây ở giai đoạn 3 lá được gây hạn nhân tạo

bằng dung dịch PEG 6000 (polyethylene glycol) 20% trong 6 giờ. Lá của các cây

được thu trước và sau khi xử lý hạn để tách RNA và tiến hành phản ứng real-time

PCR định lượng tương đối như mô tả ở mục 2.2.11.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập gen ZmDREB2.7tv từ cây ngô Tẻ vàng 1

3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá cây ngô Tẻ vàng 1

Giống ngô Tẻ vàng 1 là giống ngô địa phương thuộc tỉnh Điện Biên do Viện

Nghiên cứu ngô thu thập và đánh giá. Giống ngô này có thời gian sinh trưởng ngắn

(98 ngày), thuộc nhóm chín sớm, có chiều cao cây cao và chiều cao đóng bắp trung

bình (196,3 và 90,1 cm); khả năng bị sâu đục thân và rệp thấp, không bị nhiễm khô

vằn. Giống ngô có thân cứng cáp, không bị đổ, có khả năng chịu hạn tốt. Theo

thang đo khả năng chịu hạn dựa trên mức độ xoăn của lá khi cây gặp hạn, trong đó

1 là chịu hạn tốt nhất và 5 là nhạy cảm với hạn, giống ngô địa phương này được cho

điểm 1. Do đó, Tẻ vàng 1 là nguồn vật liệu tốt để phân lập các gen liên quan đến

tính trạng chịu hạn ở ngô, phục vụ công tác tạo cây ngô biến đổi gen.

Qua tham khảo nghiên cứu về họ gen DREB ở cây ngô của Liu và cộng sự

[22], đoạn gen ZmDREB2.7 của ngô tham chiếu B73 không chứa intron. Do đó, gen

quan tâm được phân lập gen trực tiếp từ DNA tổng số cây ngô Tẻ vàng 1. DNA

được tách từ các mẫu lá ở giai đoạn cây ngô ba lá theo quy trình đã trình bày ở phần

phương pháp (Mục 2.2.1). Kết quả cho thấy DNA được tách chiết từ các mẫu lá

khác nhau đều có chất lượng tốt, ít bị đứt gãy, đồng thời đã loại bỏ được hầu hết

Hình 3.1. Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số từ ba mẫu lá ngô Tẻ vàng 1

RNA (Hình 3.1). Như vậy DNA đạt chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Phân lập và tạo dòng gen ZmDREB2.7tv

Thí nghiệm phân lập gen ZmDREB2.7tv được thực hiện thông qua phản ứng

PCR với khuôn là DNA tổng số của cây ngô Tẻ vàng 1. Dựa vào nghiên cứu của

Liu và cộng sự [22] và tham khảo thêm trên trang maizegdb.org, vị trí của vùng gen

ZmDREB2.7tv được xác định. Từ đó, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế nằm ngoài

vùng mã hóa của gen ZmDREB2.7 nhằm khuếch đại trình tự có độ dài theo tính toán

là 1338 bp chứa trình tự mã hóa gen ZmDREB2.7tv, vùng 5’UTR và 3’ UTR của

gen này trên cây ngô Tẻ vàng 1.

Phản ứng PCR phân lập trình tự ZmDREB2.7tv được thực hiện như đã mô tả

ở phần phương pháp (Mục 2.2.7). Sản phầm PCR có kích thước gần 1,5 kb được

tinh sạch bằng kit PCR GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Mỹ) để

làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân dòng sau đó. Đoạn gen ZmDREB2.7tv đã phân

lập được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 theo hướng dẫn của CloneJET PCR

Cloning Kit (Thermo Scientific, Mỹ). Vector pJET1.2 có nhiều đặc điểm phù hợp

của một vector nhân dòng như: số lượng bản sao trong tế bào lớn, có khả năng sao

chép độc lập với tế bào E. coli chủ nhờ trình tự ori, có gen kháng kháng sinh

ampicillin (AmpR) hỗ trợ cho thí nghiệm chọn lọc, chứa vùng nhân dòng đa điểm

(multiple cloning site - MCS) giúp dễ dàng kiểm tra đoạn DNA chèn. Vector

pJET1.2 cung cấp trong bộ kit ở dạng mở vòng và đầu bằng. Trong khi đó, sản

phẩm PCR với enzyme DreamTaq DNA polymerase có đoạn dA ở đầu 3’. Do đó,

sản phẩm PCR được xử lý với enzyme DNA Blunting trước khi tiến hành ghép nối

với vector. Enzyme DNA Blunting là một DNA polymerase bền nhiệt với hoạt tính

đọc sửa, nó sẽ loại bỏ đầu dư thừa 3’ và lấp đầy đầu dính 5’ để tạo đầu bằng.

Sản phẩm ghép nối giữa đoạn trình tự ZmDREB2.7tv và vector pJET1.2 được

biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β. Các tế bào sau đó được nuôi cấy trên

đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 50 mg/mL ở

37°C qua đêm. Nhiều khuẩn lạc đơn mọc trên đĩa biết nạp là các dòng vi khuẩn có

mang plasmid pJET1.2. Để xác định xem các plasmid này có mang đoạn trình tự đã

phân lập hay không, plasmid từ một vài khuẩn lạc được tách chiết để kiểm tra.

Kết quả plasmid tách từ 6 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp được

thể hiện trên hình 3.2. Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai có kích

thước lớn hơn, do đó phân ly chậm hơn trong quá trình điện di. Vì vậy, khi so sánh

độ cao của các băng DNA trên gel agarose, có thể nhận thấy plasmid từ 4 dòng

khuẩn lạc (KL1, KL4-6) cao hơn plasmid đối chứng (pJET1.2 trống) và plasmid từ

hai dòng khuẩn lạc khác (KL2, KL3). Vì vậy, sự có mặt của trình tự chèn trong các

Hình 3.2. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pJET1.2/ZmDREB2.7tv

1 - 6 : Plasmid tách từ sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pJET1.2/ZmDREB2tv lần lượt là KL1 - KL6; 7: Plasmid pJET1.2 trống (đối chứng).

plasmid tái tổ hợp tiếp tục được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme giới hạn.

Khi phân tích vùng nhân dòng đa điểm của vector pJET1.2, nhận thấy hai

phía của vị trí ghép nối đều có trình tự nhận biết của enzyme BglII. Do đó, enzyme

BglII được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự ZmDREB2.7tv trong

vector nhân dòng từ các KL1, KL4-6. Sau khi xử lý với enzyme giới hạn trong 3

giờ, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.3).

Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv bằng enzyme giới

hạn BglII. M: GeneRulerTM 1kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific); 1 - 4: Sản phẩm xử lý plasmid từ các khuẩn lạc lần lượt gồm KL1, KL4 - 6 với enzyme giới hạn. 5: Đoạn gen ZmDREB2tv được phân lập.

Kết quả kiểm tra plasmid bằng enzyme BglII cho thấy, ở cả 4 dòng khuẩn lạc

đều cho 2 băng DNA rõ rệt. Một băng có kích thước tương đương với sản phẩm

PCR nhân trình tự ZmDREB2.7tv (đường chạy 5, Hình 3.4). Một băng có kích thước

lớn hơn (khoảng 3,0 kb) là kích thước của vector pJET1.2 khi xử lý với BglII. Như

vậy, qua kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn, có thể dự đoán rằng, plasmid từ 4

dòng khuẩn lạc KL1, KL4-6 chứa đoạn chèn là trình tự ZmDREB2.7tv được phân

lập từ cây ngô Tẻ vàng 1. Để kiểm chứng giả thuyết, các plasmid được tinh sạch và

đọc trình tự.

3.1.3. Phân tích trình tự gen ZmDREB2.7tv

Các plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc được dự đoán mang trình tự ZmDREB2.7tv

được đọc trình tự hai chiều với mồi của vector là pJET1.2 forward sequencing

primer và pJET1.2 reverse sequencing primer theo phương pháp Sanger. Kết quả

đọc trình tự được xử lý trên phần mềm BioEdit và thu được trình tự consensus của

cả 4 plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc. Các trình tự đều giống nhau gồm 1,327

nucleotides, trong đó vùng khung đọc mở có kích thước 1,077 bp.

Trình tự ZmDREB2.7tv được BLAST trên NCBI thu được kết quả có độ

tương đồng cao nhất với kết quả PREDICTED: Zea mays dehydration-responsive

element-binding protein 2C (LOC103643169), mRNA (độ tương đồng 98%, độ bao

phủ 97%). Tuy nhiên, đến ngày 18/12/2017, trình tự này được chú thích lại thành

PREDICTED: Zea mays ethylene-responsive transcription factor ABI4

(LOC103643169), mRNA. Việc đặt tên cho locus dựa theo các phân tích tính toán

tự động bằng phương pháp dự đoán gen: Gnomon., được bổ sung dữ liệu bởi sự

tương đồng với 2 mRNA, 6 EST và 100% bao phủ với annotated genomic feature

by RNAseq alignments. Ngoài ra, các kết quả khác có độ dài thấp hơn, tập trung

vào vùng từ nucleotide 300-600, với độ tương đồng đều lớn hơn 80%. Trong đó các

trình tự chủ yếu mã hóa cho dehydration-responsive element-binding protein 2C-

like hoặc ethylene-responsive transcription factor thuộc các loài như Triticum

aestivum, Oryza sativa, Eucalyptus qunnii, Sorghum bicolor. Các protein này đều

có vùng bám DNA đặc trưng cho họ AP2/ERF2.

Trình tự ZmDREB2.7tv phân lập từ cây Tẻ vàng 1 được so sánh với trình tự

tham chiếu cây ngô B73 trên cơ sở dữ liệu maizegdb.org. Kết quả cho thấy trình tự

ZmDREB2.7tv tương đồng 1310/1334 bp (98,02%), gap = 13 (0,97%) với trình tự từ

204458353 đến 204459686 trên NST số 1 của hệ gen tham chiếu (Hình 3.4).

Từ kết quả xác định trình tự, đoạn trình tự bp phân lập được có chứa vùng

5’UTR và 3’UTR của gen với kích thước lần lượt là 207 bp và 53 bp (Hình 3.4). Ở

vùng phía trước của gen, nhiều yếu tố hoạt động cis đặc trưng của vùng promoter

được xác định như TATA box, E-box, hay LTRE 1 (low-temperature responsive-

element 1). Vị trí khởi đầu tái bản được dự đoán cách codon mở đầu khoảng 100

nucleotide (vị trí có mũi tên trỏ xuống). Đồng thời, nhiều điểm khác nhau giữa trình

tự gen của giống địa phương Tẻ vàng 1 và cây ngô tham chiếu B73 được phát hiện

gồm: 11 vị trí thay thế nucleotide và 4 vị trí thêm/mất nucleotide. Các biến đổi này

xảy ra ở vùng promoter của gen và nằm rải rác trong vùng mã hóa.

Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự ZmDREB2tv phân lập từ giống ngô Tẻ vàng 1 và trình

tự tham chiếu ngô B73 bằng công cụ BioEdit.

Vùng khung đọc mở được thể hiện bằng chữ in hoa, vùng 5’ và 3’UTR được thể hiện bằng chữ in thường. Vùng trình tự mã hóa domain bám DNA được thể hiện bằng chữ có gạch chân. Mũi tên chỉ vào vị trí khởi đầu tái bản dự đoán. Các trình tự cis-element trên promoter được đóng khung trong hình chữ nhật với tên ở dưới. Các biến đổi dạng thay thế nucleotide được thể hiện bằng hình tròn (●), các biến đổi dạng mất hoặc thêm nucleotide được thể hiện bằng hình tam giác (▲). Các biến đổi trên nucleotide không thay đổi amino acid được tô màu đen và thay đổi amino acid được tô màu đỏ.

Sử dụng công cụ online (https://web.expasy.org/translate) để dịch mã đoạn

gen ZmDREB2.7tv thu được trình tự protein với 358 amino acid và có khối lượng

phân tử là 38,1 kDa với điểm đẳng điện lý thuyết là 6,42. Khi so sánh trình tự

protein suy diễn của cây ngô địa phương Tẻ vàng 1 và cây ngô tham chiếu B53, có

thể nhận thấy một vài điểm khác biệt xảy ra ở vùng nucleotide mã hóa cho domain

bám DNA của protein ZmDREB2.7 không làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide.

Trong khi đó, 5 vị trí thay thế nucletotide làm thay đổi thành phần amino acid ở đầu

C của protein (chấm tròn màu đỏ). Cụ thể, trên hình 3.4, vị trí 806: A  G dẫn đến

Met > Val, vị trí 872: T  A dẫn đến Cys > Ser, vị trí 927: T  C dẫn đến Met >

Thr, vị trí 945: T  dẫn đến Leu > Pro, vị trí 948: A  C dẫn đến Gln > Pro. Các

thay đổi này có thể ảnh hưởng đến sự tương tác và cuộn gấp của protein. Tuy nhiên,

vùng domain bám DNA của protein (vùng gạch chân trên hình 3.4) không thay đổi

so với cây ngô B73. Như vậy, protein ZmDREB2.7tv có khả năng bám vào các

trình tự đặc trưng như các protein khác trong họ DREB.

3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2.7tv

3.2.1. Thiết kế vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv

Trong nghiên cứu này, phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn A. tumefaciens

và vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300 được sử dụng để đưa gen

ZmDREB2.7tv vào cây ngô. Việc lựa chọn promoter để điều hòa gen chuyển đóng

vai trò quan trọng trong việc thành công của cây chuyển gen. Tùy vào mục đích

chuyển gen và vai trò của gen trong cây mà có thể lựa chọn một trong ba loại

promoter: promoter cơ định, promoter đặc hiệu mô và promoter cảm ứng. Như đã

đề cập ở trên, gen ZmDREB2.7tv mã hóa cho protein là một nhân tố phiên mã, có

khả năng đóng và mở các gen trong con đường chống chịu với hạn. Do đó, việc

biểu hiện protein này khi cần thiết và không biểu hiện trong điều kiện bình thường

sẽ mang lại nhiều lợi thế cho cây. Thứ nhất, cây không lãng phí dinh dưỡng và năng

lượng để tổng hợp protein ZmDREB2.7 trong điều kiện bình thường. Thứ hai, việc

biểu hiện các protein này có thể sẽ gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường

của cây. Do đó, trong nghiên cứu này, promoter của gen cảm ứng mạnh với hạn

rd29A, phân lập từ cây A. thaliana được lựa chọn để điều hòa gen ZmDREB2.7tv.

Promoter rd29A đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu biểu hiện gen thực vật

khác nhau [20].

Cấu trúc biểu hiện của gen chuyển bao gồm promoter rd29A, gen

ZmDREB2.7tv và trình tự tín hiệu polyA được xây dựng qua trung gian vector

pRTL2. Vector pRTL2 đã có sẵn promoter rd29A và tín hiệu polyA trong bộ khung

vector. Do đó, bằng việc sử dụng phương pháp cắt và nối với enzyme, đoạn gen

ZmDREB2.7tv được chèn vào vị trí SacI của vector như mô tả trong hình 2.1.

Để chèn gen ZmDREB2.7tv vào vị trí SacI trên vector pRTL2, phản ứng PCR

với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F/R được sử dụng để bổ sung vị trí nhận biết của

enzyme này ở hai đầu của gen. Với khuôn là vector nhân dòng

pJET1.2/ZmDREB2.7tv, phản ứng khuếch đại toàn bộ vùng mã hóa của gen

Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv. M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). 1: Sản phẩm PCR với khuôn là nước; 2: Sản phẩm PCR với khuôn là vector pJET1.2/ZmDREB2.7tv.

ZmDREB2.7tv (1077 bp) với kích thước lý thuyết của sản phẩm PCR là 1089 bp.

Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, đoạn mã hóa của gen ZmDREB2.7tv đã được

khuếch đại thành công với kích thước xấp xỉ 1,1 kb như tính toán. Đồng thời, hai

đầu của đoạn mã hóa được gắn thêm vị trí nhân biết của enzyme SacI, phục vụ cho

thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen.

Đoạn mã hóa gen ZmDREB2.7tv được tạo đầu dính bằng enzyme giới hạn

SacI. Đồng thời, vector pRTL2 cũng được mở vòng bằng enzyme tương ứng. Hai

sản phẩm cắt được ghép nối nhờ enzyme T4 ligase và sản phẩm ghép nối được biến

nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β. Đĩa biến nạp sau khi nuôi qua đêm ở 37°C

xuất hiện nhiều khuẩn lạc đơn. Do đó, các khuẩn lạc được sàng lọc để chọn ra các

Hình 3.6. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp

pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv

1 - 10 : Plasmid tách từ 10 khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pRTL2/rd29A: :ZmDREB2.7tv lần lượt là KL1 - KL10; 11: Plasmid pRTL2 trống (đối chứng).

dòng có mang đoạn chèn như phương pháp đã thực hiện ở trên.

Kết quả điện di các plasmid tách từ 10 khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên được thể

hiện trên hình 3.6. Do 3 khuẩn lạc KL3, KL4 và KL6 cho băng plasmid cao hơn

plasmid pRTL2 trống, plasmid từ 3 khuẩn lạc này được cho là có chứa đoạn gen

ZmDREB2.7tv. Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen quan tâm trong vector, các

plasmid này được xử lý với enzyme giới hạn SacI. Theo lý thuyết, khi có mặt của

đoạn gen ZmDREB2.7tv, sản phẩm của phản ứng cắt gồm 2 băng DNA có kích

thước lần lượt xấp xỉ 3,7 kb (khung vector pRTL2) và 1,1 kb (đoạn gen chèn). Kết

quả kiểm tra với enzyme giới hạn trên hình 3.7A cho thấy, cả ba plasmid từ ba

khuẩn lạc trên đều mang gen ZmDREB2.7tv.

A

B

Hình 3.7. Kết quả kiểm tra plasmid pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv A. Điện di đồ sản phẩm xử lý các plasmid bằng enzyme giới hạn SacI. M: HyperLadderTM 1kb (Bioline); 1 - 3: Sản phẩm xử lý plasmid từ các khuẩn lạc lần lượt gồm KL3, KL4 và KL 6 với enzyme SacI. B. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra plasmid. M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1- 3: Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid từ các khuẩn lạc lần lượt gồm KL3, KL4 và KL 6; 4: Sản phẩm PCR với khuôn là nước.

Tuy nhiên, khi đoạn gen được chèn vào vector bằng một enzyme giới hạn,

gen có thể được chèn vào giữa vùng promoter và terminator theo hai chiều. Do đó,

trong nghiên cứu này, phản ứng PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F - polyA_R

được sử dụng để kiểm tra chiều của gen. Nếu gen chèn đúng chiều, sản phẩm PCR

thu được có kích thước xấp xỉ 1,3 kb còn nếu gen chèn ngược chiều sẽ không thu

được sản phẩm PCR nào. Kết quả trên hình 3.7B cho thấy, trong 3 khuẩn lạc, khuẩn

lạc KL4 (đường chạy số 2) không cho sản phẩm PCR, điều này chứng tỏ KL4 chứa

đoạn gen chèn nằm ngược chiều so với cấu trúc biểu hiện. Trong khi đó, hai khuẩn

lạc còn lại KL3 và KL6 cho sản phẩm PCR là một băng kích thước xấp xỉ 1,3 kb

đậm và sáng (đường chạy số 1 và 3). Vector pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv tách từ

KL3 được đọc trình tự và xác nhận tính đúng đắn và sự toàn vẹn của cấu trúc biểu

hiện gen. Như vậy, đã tạo được vector pRTL2 mang cấu trúc biểu hiện

rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA.

3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv

Một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của thí nghiệm

chuyển gen vào thực vật đó là lựa chọn được hệ vector biểu hiện phù hợp. Trong

nghiên cứu này, hệ vector pCAMBIA được lựa chọn do có những ưu điểm như: (1)

Có số lượng bản sao lớn trong E. coli nên lượng DNA thu được lớn; (2) Vùng

replicon pVS1 cho mức độ ổn định cao trong Agrobacterium; (3) Kích thước nhỏ,

7-12 kb tùy thuộc vào từng plasmid; (4) Các điểm cắt enzyme giới hạn cho phép dễ

dàng lắp ráp/ chèn gen quan tâm; (5) Chọn lọc vi khuẩn bằng chloramphenicol hoặc

kanamycin; (6) Chọn lọc thực vật bằng hygromycin B.

Để tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA/rd29A::ZmDREB2.7tv, vector

pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv và vector trống pCAMBIA1300 đồng thời được xử lý

với enzyme cắt giới hạn HindIII. Sản phẩm cắt của vector trung gian được tinh sạch

bằng phương pháp thôi gel đoạn cấu trúc biểu hiện có kích thước khoảng 2,2 kb.

Vector pCAMBIA1300 mở vòng đồng thời được loại nhóm phosphate ở đầu 5’ để

tránh hiện tượng tự đóng vòng trong quá trình ghép nối. Sản phẩm của phản ứng nối

giữa cấu trúc biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv và khung vector pCAMBIA1300

được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β và cấy trải trên đĩa môi trường LB

bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/mL. Đĩa biến nạp được nuôi ở 37°C qua đêm

xuất hiện nhiều khuẩn lạc riêng rẽ.

Tất cả plasmid được tách từ 5 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp

đều cho băng DNA cao hơn plasmid pCAMBIA1300 trống (Hình 3.8). Như vậy,

các plasmid này đều được cho là có mang cấu trúc biểu hiện và do đó được xử lý

với enzyme giới hạn để kiểm tra kích thước của đoạn chèn.

Hình 3.8. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp

pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv

1 - 5 : Plasmid tách từ sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pCAMBIA1300/rd29A: :ZmDREB2.7tv lần lượt là KL1 - KL5; 6: Plasmid pCAMBIA1300 trống (đối chứng).

Ba enzyme gồm: SacI, HindIII và BamHI được lựa chọn để kiểm tra cấu trúc

biểu hiện trong vector tái tổ hợp pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv (Hình

3.9A). Dựa vào sơ đồ vector (Hình 3.9B), nếu vector pCAMBIA1300 mang cấu

trúc biểu hiện gen quan tâm, khi xử lý với enzyme SacI sẽ thu được 3 đoạn với kích

thước xấp xỉ là 0,9 kb, 1,1 kb và 9,1 kb (Hình 3.9A, đường chạy số 3). Trong khi

đó, khi sử dụng enzyme HindIII để cắt vector này, chỉ thu được hai đoạn gồm: cấu

trúc biểu hiện gen ZmDREB2.7tv - 2,2 kb và khung vector pCAMBIA1300 - 9,0 kb

(Hình 3.9A, đường chạy số 2). Kết quả xử lý plasmid từ khuẩn lạc 1 cho thấy, đoạn

cấu trúc rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA đã được sát nhập vào vector

pCAMBIA1300. Ngoài ra, trên vector pCAMBIA1300/rd29A: :ZmDREB2.7tv còn

có hai vị trí nhận biết của enzyme BamHI, một vị trí nằm trên đoạn cấu trúc biểu

hiện gen, một vị trí nằm trên khung vector. Do đó, sử dụng BamHI có thể kiểm tra

được chiều của cấu trúc biểu hiện trong vector pCAMBIA1300 so với chiều của gen

chỉ thị HygR. Nếu gen ZmDREB2.7tv cùng chiều với gen HygR, xử lý enzyme

BamHI sẽ cho hai băng với kích thước xấp xỉ 0,4 kb và 10,8 kb. Trong khi đó, sự

xuất hiện của hai băng với kích thước lần lượt xấp xỉ 2,0 kb và 9,2 kb chứng tỏ gen

ZmDREB2.7tv có chiều ngược lại so với gen HygR. Sản phẩm xử lý vector tái tổ

hợp từ khuẩn lạc số 1 với enzyme BamHI cho hai đoạn DNA kích thước tương ứng

trong trường hợp cấu trúc chuyển gen nằm ngược chiều với gen HygR (Hình 3.9A,

đường chạy số 1). Khi đó, gen có chiều từ bờ trái (LB) sang bờ phải (RB), phần

đuôi polyA nằm gần bờ phải (RB) của T-DNA hơn so với đoạn promoter (Hình

2.1).

Hình 3.9. Kết quả tạo plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv A. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn. M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1 - 3: Sản phẩm xử lý plasmid từ KL1 với các enzyme giới hạn lần lượt là SacI, HindIII, BamHI. B. Sơ đồ vector pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv

3.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens EHA105 mang vector biểu hiện

Vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv được

chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Sản phẩm biến

nạp được cấy trải trên đĩa YEP có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/mL. Hiệu

suất biến nạp cao với mật độ khuẩn lạc mọc dày đặc sau hai ngày. Bốn khuẩn lạc

được chọn ngẫu nhiên để thực hiện thí nghiệm PCR sàng lọc với cặp mồi

ZmDREB2.7_SacI_F/R nhân gen ZmDREB2.7tv. Kết quả trên hình 3.10 cho thấy,

trừ khuẩn lạc số 2 (đường chạy số 4), ba khuẩn lạc còn lại đều cho một băng sản

phẩm PCR đậm và sáng, bằng với đối chứng dương và đúng với kích thước lý

thuyết 1,1 kb. Như vậy, đã tạo được chủng A. tumefaciens EHA105 mang vector

Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang

vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). 1: Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; 2: Sản phẩm PCR với khuôn là nước;3-6: Sản phẩm PCR với khuôn là khuẩn lạc A. tumefaciens tái tổ hợp lần lượt KL1-4.

biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA.

3.3. Kết quả tạo cây ngô biến đổi gen mang gen ZmDREB2.7tv

3.3.1. Chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô thế hệ T0

Trong nghiên cứu này, nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm chuyển gen là phôi

non của dòng ngô K7 đã được Viện Nghiên cứu Ngô chọn lọc, thử nghiệm và

chứng minh là có khả năng nhận gen ngoại lai tốt. Thí nghiệm chuyển gen với 3037

phôi non thông qua vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 mang vector chuyển

gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv được tiến hành trong ba lần thí

nghiệm (Bảng 3.1). Thời gian từ lúc lây nhiễm phôi đến khi chuyển cây ra nhà lưới

ở ba lần chuyển gen khác nhau, tuy nhiên đều kéo dài trong khoảng ba tháng. Qua

các giai đoạn khác nhau, phôi được chuyển sang các môi trường có bổ sung các chất

điều hòa sinh trưởng và kháng sinh chọn lọc phù hợp (Bảng 2.2). Số lượng phôi sau

khi nuôi cấy trên các môi trường giảm dần theo thí nghiệm chuyển gen và tái sinh

Hình 3.11. Quá trình chuyển gen vào ngô trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium.

cây chuyển gen (Hình 3.11; Bảng 3.1).

A. Các phôi chưa non trên môi trường đồng nuôi cấy sau khi lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector pCAMBIA1300/rd29A:ZmDREB2.7tv. B. Các phôi ngô trương lên và bắt đầu tạo mô sẹo sau khi đặt trên môi trường phục hồi, 10 ngày sau lây nhiễm. C và D. Môi sẹo đang phôi hóa ở môi trường chọn lọc I và II, 24 và 38 ngày sau lây nhiễm. E và F. Các chồi hình thành từ mô sẹo trong môi trường tái sinh I và II, 48 và 62 ngày sau lây nhiễm. G. Cây con tái sinh trong môi trường ra rễ, 84 ngày sau lây nhiễm .

Phôi non từ các bắp ngô sau khi thụ phấn 9-13 ngày (thời gian thay đổi dựa

theo mùa vụ) sẽ được tách trong điều kiện vô trùng. Các phôi được lựa chọn có màu

vàng sáng, có đường kính khoảng 1,0 - 1,2 mm. Các phôi quá non dễ chết và khó tái

sinh trong quá trình nuôi cấy mô. Trong khi đó, các phôi quá già khó nhận gen

chuyển và do đó cũng nhanh bị loại bỏ trong quá trình chuyển gen. Trong quá trình

lấy phôi khỏi hạt, các thao tác có thể tạo ra nhiều vết cắt nhỏ, đây là các vị trí để vi

khuẩn Agrobacterium xâm nhập và chuyển T-DNA vào tế bào. Tuy nhiên, nếu vết

cắt ảnh hưởng đến vùng lá mầm trong phôi, quá trình mô sẹo hóa của phôi sẽ thấp.

Phôi sau khi lấy khỏi bắp được giữ ẩm trong môi trường đồng nuôi cấy không có vi

khuẩn trước khi lây nhiễm. Thời gian phôi lây nhiễm với vi khuẩn trong môi trường

lỏng, mật độ của vi khuẩn cũng như nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập của

vi khuẩn. Tuy nhiên, nghiên cứu này không tiến hành tối ưu các điều kiện mà sử

dụng điều kiện nhóm tác giả Frame và cộng sự đã công bố cho phôi non của dòng

nền Hi-II [14].

Các phôi sau đó tiếp tục được đồng nuôi cấy với vi khuẩn trên môi trường

thạch trong tối, trong 3 ngày ở 21°C (Hình 3.11A). Trong giai đoạn này, vi khuẩn

tiến hành chuyển T-DNA vào trong tế bào và sát nhập cấu trúc chuyển gen vào hệ

gen nhân của cây. Nhiệt độ 21°C làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn do vi

khuẩn A. tumefaciens sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28°C. Trong hai đợt chuyển gen

đầu tiên, số lượng phôi sau giai đoạn này giữ nguyên. Tuy nhiên, ở đợt chuyển gen

thứ 3, khoảng 1/3 số phôi bị chết. Nguyên nhân là do phôi non được thu trong vụ

thu đông có nhiệt độ thấp và độ dài ngày ngắn; do đó, dù sau thụ phấn 12 ngày,

phôi vẫn chưa đạt được độ trưởng thành như ở vụ xuân hè. Các phôi bị chết trong

đợt chuyển gen ở giai đoạn đồng nuôi cấy là các phôi có kích thước bé và non. Phôi

chết sẽ có màu trắng ngà, cấu trúc mềm và dễ bị vỡ. Trong khi đó, các phôi sống sót

sau giai đoạn hút nước và trương lên, cấu trúc phôi rắn hơn so với thời điểm thu

phôi non.

Khi chuyển sang môi trường nuôi cấy phục hồi (Hình 3.11B), chỉ có phôi

ngô mới có thể sống sót và sinh trưởng do môi trường có chứa kháng sinh kháng

khuẩn mạnh (cefotaxim 100mg/L và vancomycin 100mg/L). Sau 7 ngày nuôi cấy,

vi khuẩn Agrobacterium bị loại hoàn toàn khỏi mẫu nuôi cấy. Đồng thời, phôi sau

giai đoạn này có sự thay đổi về kích thước và cấu trúc phôi. Phần lá mầm và rễ

mầm trong phôi dài ra và được cắt bỏ. Việc cắt bỏ hai cấu trúc này là cần thiết để

phôi chuyển sang dạng mô sẹo. Phôi rắn và bắt đầu có dấu hiệu mô sẹo hóa. Một số

lượng đáng kể phôi bị bỏ đi trong bước này (đợt 1 - 29,8%, đợt 2 - 28,8%, đợt 3 -

11,1%, trung bình - 25,1%).

Giai đoạn chọn lọc và tạo mô sẹo được xảy ra đồng thời khi phôi được

chuyển sang môi trường chọn lọc 1 và chọn lọc 2 (Hình 3.11C, D). Môi trường

chọn lọc được bổ sung kháng sinh hygromycin. Đây là một aminoglycoside gây

chết vi khuẩn, nấm và các tế bào nhân thực bằng cách ức chế tổng hợp protein.

Hygromycin B đã được sử dụng như là một nhân tố chọn lọc hiệu quả trong các

nghiên cứu chuyển gen thực vật và nhiều hệ vector chuyển gen sử dụng kháng sinh

này. Do trong cấu trúc của T-DNA mang gen ZmDREB2.7tv, có thêm cấu trúc biểu

hiện của gen kháng kháng sinh hygromycin - HygR, nên các phôi được lây nhiễm

mới có khả năng sống sót. Sau 4 tuần nuôi cấy, phôi được mô sẹo hóa hoàn toàn với

đặc điểm có màu trắng sáng, cấu trúc chắc chắn và đặc trưng (Hình 3.11C, D). Các

phôi không mang gen chuyển sẽ chuyển dạng mềm, màu sẫm và đen. Số lượng phôi

sống sót trung bình đạt 13,7% trên tổng số phôi sau giai đoạn nuôi phục hồi.

Các phôi được giữ lại sẽ chuyển sang môi trường tái sinh 1 và 2 để tạo thành

cây con (Hình 3.11E, F). Do môi trường tái sinh không có thành phần 2,4-D, các

mô sẹo không được duy trì mà bắt đầu tạo chồi. Sau 1 tuần đặt trên môi trường tái

sinh 1 trong tối, các mô sẹo được chuyển sang môi trường tái sinh 2 và đặt dưới ánh

sáng. Môi trường tái sinh 2 không có kháng sinh chọn lọc và được bổ sung thêm

nước dừa như là một nguồn chất kích thích sinh trưởng tự nhiên. Dưới ánh sáng, các

cấu trúc màu xanh nhạt bắt đầu xuất hiện và phát triển dần thành các chồi nhỏ

(trung bình 2-5 chồi/ mô sẹo) (Hình 3.11F). Các chồi bình thường sẽ được chuyển

sang bình môi trường mới sau mỗi 1 tuần cho đến khi đạt kích thước đủ để chuyển

sang môi trường ra rễ. Số phôi ở giai đoạn này giảm khoảng một nửa ở cả ba lần thí

nghiệm. Nguyên nhân là do nhiều chồi phát sinh có hình thái không bình thường: lá

cong, chồi ngắn, hình thái dị dạng. Hơn nữa, việc chuyển bình môi trường liên tiếp

dễ gây tạp nhiễm do đó nhiều bình nuôi cấy mô bị loại do chứa nấm. Như vậy, tổng

của ba lần thí nghiệm, từ 280 mô sẹo, 127 chồi xuất hiện và được chuyển sang môi

trường ra rễ.

Sau khoảng ba tuần ở môi trường ra rễ (Hình 3.11G), các cây tái sinh đủ

khỏe mạnh được chuyển sang trồng trên giá thể trấu hun trong nhà lưới. Cây tái sinh

được trồng trong điều kiện độ ẩm 80% bằng cách phun sương. Giai đoạn này giúp

các rễ tái sinh khỏe mạnh và đủ cứng cáp để chuyển sang trồng trên đất trong nhà

lưới. Kết quả thu được 91 cây tái sinh, tuy nhiên 15 cây bị chết do rễ bị hỏng khi

trồng trên giá thể trấu.

Bảng 3.1. Kết quả chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô

Số lƣợng phôi trong thí nghiệm chuyển gen

Môi trƣờng/Tiêu chí Đợt 1* Đợt 2* Đợt 3** Tổng cộng

Đồng nuôi cấy 1037 1063 937 3037

Nuôi phục hồi 1037 1063 624 2724

Chọn lọc 1 728 757 555 2040

Chọn lọc 2 291 301 444 1036

Tái sinh 1 112 104 64 280

Tái sinh 2 112 104 33 249

Môi trường ra rễ 52 57 28 137

Nhà lưới sống sót 25 28 27 76

Cây T0 dương tính 7 8 15 30

* Chuyển gen vụ xuân hè, ** Chuyển gen vụ thu đông

Cây T0 tự thụ phấn 4 2 0 6

Như vậy, sau 3 đợt chuyển gen, từ 3037 phôi ban đầu đã tạo ra 76 cây

chuyển gen T0 sống sót và trồng trong nhà lưới (Bảng 3.1). Các cây này được thu lá

để tiến hành tách chiết DNA tổng số và đánh giá sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv.

3.3.2. Đánh giá cây chuyển gen thế hệ T0

Các cây tái sinh thế hệ T0 được đánh giá ở mức độ phân tử bằng thí nghiệm

PCR. Ban đầu, lá của các cây này được thu và tách chiết DNA tổng số. Kết quả

trình bày trên hình 3.12 cho thấy DNA đã được tách chiết từ các cây tái sinh thế hệ

T0 mặc dù có một số đứt gãy nhưng vẫn đảm bảo chất lượng cho thí nghiệm tiếp

Hình 3.12. Điện di đồ DNA tổng số tách từ các cây chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T0

1 - 12: DNA tổng số của cây chuyển gen tương ứng.

theo.

Để đánh giá sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv, phản ứng PCR được thực hiện

sử dụng cặp mồi nhân đoạn từ cuối promoter rd29A (rd29A_F) đến cuối gen

(ZmDREB2.7_SacI_R). Do trong cây ngô có gen nội sinh ZmDREB2.7, việc sử

dụng cặp mồi này tránh hiện tượng dương tính giả, nhờ vậy chỉ những cây mang

cấu trúc rd29A::ZmDREB2.7tv mới cho băng sản phẩm PCR trên bản điện di. Kết

quả PCR với DNA tổng số của cây WT cho thấy không cho băng sản phầm PCR

nào với kích thước như lý thuyết (Hình 3.13). Điều này chứng tỏ việc sử dụng cặp

mồi hiệu quả trong việc sàng lọc cây chuyển gen. Trong khi đó, đối với một vài cây

chuyển gen T0 đã thu được sản phẩm PCR với kích thước mong muốn (Hình 3.13,

Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv

trong cây chuyển gen thế hệ T0 M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). + : Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; - : Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của cây không chuyển gen;1-14: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của các cây chuyển gen ZmDREB2.7tv tương ứng.

đường chạy số 1 - 5, 9 - 11)

Đồng thời, bên cạnh việc xác định sự có mặt của gen quan tâm, sự có mặt

của gen chỉ thị HygR trong cây chuyển gen cũng được kiểm tra bằng thí nghiệm

PCR. Đôi khi, kể cả có mặt gen quan tâm, nhưng phản ứng PCR không khuếch đại

được gây ra hiện tượng âm tính giả. Việc kiểm tra đồng thời sự có mặt của HygR

giúp đảm bảo chắc chắn thu được các cây có tiềm năng. Hình 3.14 cho thấy các cây

chuyển gen dương tính với đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv cũng dương tính với gen

HygR.

Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HygR trong cây chuyển

gen thế hệ T0 M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). +: Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; - : Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của cây không chuyển gen;1-11: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của các cây chuyển gen tương ứng.

Từ kết quả sàng lọc bằng thí nghiệm PCR trên tổng số 76 cây T0 tái sinh, 30

cây chuyển gen thế hệ T0 dương tính đồng thời với sự có mặt của đoạn

rd29A::ZmDREB2.7tv và gen HygR. Có thể thấy, tỷ lệ cây tái sinh mang gen

ZmDREB2.7tv không cao (30/91 = 32,97%). Điều này là kết quả của nhiều mô sẹo

không nhận gen chuyển nhưng vẫn có khả năng thoát khỏi áp lực chọn lọc bằng

hygromycin và sau đó, có cơ hội tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Khi ở môi trường

chọn lọc, các mô sẹo thực chất là thể khảm bao gồm các tế bào có sự chèn của T-

DNA và tế bào bình thường ban đầu. Mặc dù đặt dưới áp lực chọn lọc, các tế bào

không chứa T-DNA vẫn được bảo vệ do kích thước của mô sẹo lớn [15]. Điều này

giúp các tế bào không được chuyển gen vẫn có khả năng sống sót và phát triển. Hơn

nữa, khi phân tách mô sẹo và chuyển sang môi trường tái sinh 2, các tế bào bình

thường này phát triển thành cây bình thường do không còn kháng sinh hygromycin

trong môi trường nữa. Đồng thời, mật độ cao của mô sẹo trên một đĩa petri cũng có

thể là nguyên nhân giúp các tế bào không chứa cấu trúc mang gen ZmDREB2.7tv

sống sót.

Hiệu suất chuyển gen được tính bằng tổng số cây tái sinh mang gen chuyển

trên tổng số phôi được lây nhiễm với giá trị trung bình của ba lần chuyển gen là

0,99%. Con số này tương đối thấp so với các công bố trên thế giới, tuy nhiên cao

hơn so với một vài công bố ở nước ta. Nguyên nhân có thể là do các nghiên cứu

trước đây tiến hành chuyển gen ngô trên các nguyên liệu khác nhau. Năm 2014,

Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự thực hiện chuyển gen vào nguyên liệu là mô sẹo

trên ba dòng nền là V152N, C436 và C7N với hiệu suất chuyển gen lần lượt là

0,9%, 0,28% và 0,5% [5]. Như vậy, đặc điểm dòng nền và nguyên liệu chuyển gen

có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chuyển gen.

3.3.3. Tạo và đánh giá cây chuyển gen thế hệ T1

Nhìn chung, các cây T0 thường có kiểu hình thấp bé và còi cọc so với cây

không chuyển gen. Trong số 17 cây chuyển gen T0 dương tính với đoạn

rd29A::ZmDREB2.7tv và gen HygR, 6 cây phát sinh cờ và bắp bình thường và tự

thụ phấn. Các cây còn lại có kích thước bắp và cờ bé, hoặc thời gian tung phấn và

tung râu không đồng thời.

Bảng 3.2: Kết quả phân ly của gen ZmDREB2tv trong cây chuyển gen thế hệ T1

Số hạt T1 Số cây T1 Tỷ lệ phân ly Tên dòng T0 hữu thụ Cây T1 dƣơng tính với gen đích Cây T1 âm tính với gen đích Giá trị chi bình phƣơng (χ2) Tỷ lệ nảy mầm (%)

58,82 17 10 D4 4 6 - -

52,63 19 10 D5 6 4 3:1 1,2

66,67 15 10 D6 2 8 - -

75,00 28 21 D7 4 17 - -

41,93 31 13 D14 11 2 3:1 0,64

57,14 35 20 D15 6 14 - -

Số lượng hạt T1 của các cây T0 cũng hạn chế do kích thước các bắp của cây

T0 nhỏ, số lượng hạt phấn ít. Tổng cộng, 6 cây T0 thu được 145 hạt T1. Các hạt T1

thường nhỏ, có nhiều hạt lép nên tỷ lệ nảy mầm thành cây của các hạt T1 không cao

với giá trị nằm từ 41 - 75% (Bảng 3.2). Các dòng T1 được kí hiệu, theo dõi và chăm

sóc theo cây T0 tương ứng. Lá của cây T1 được thu thập, tách chiết DNA và sàng

lọc bằng phản ứng PCR.

Dựa trên số lượng cây T1 dương tính với sự có mặt của gen đích qua kết quả

PCR, thử nghiệm chi bình phương được sử dụng để xác định tỷ lệ phân ly phù hợp

cho mỗi dòng T1. Có thể nhận thấy, trong 6 dòng cây T1 được khảo sát, bốn tập

hợp có tỷ lệ phân ly bất thường (Bảng 3.2). Điều này có thể là do các cây T1 được

khảo sát có số lượng thấp và không mang tính đại diện cho quần thể. Nguyên nhân

là do hạt T1 có khả năng nảy mầm không cao và không đồng đều. Trong khi đó, hai

dòng D5 và D14 phân ly phù hợp với tỷ lệ 3:1. Điều này cho thấy gen chuyển được

sát nhập vào hệ gen của cây ngô T0 tại một vị trí duy nhất (một locus), các gen

được di truyền cho các cây ở thế hệ kế tiếp theo định luật phân ly của Mendel (Bảng

3.2).

3.3.4. Ước lượng số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ

Từ kết quả sàng lọc bằng PCR và phân tích quy luật phân ly của gen

ZmDREB2.7tv trong thế hệ T1, hai dòng D5 và D14 được cho là có mang gen

chuyển tại một locus nhất định trong hệ gen. Để khảo sát và kiểm chứng kĩ hơn, số

bản sao của gen ZmDREB2.7tv được ước lượng bằng phương pháp real-time PCR

định lượng trên 6 cây T1 dương tính của dòng D5.

Đường chuẩn của mỗi gen được xây dựng dựa theo phương pháp được mô tả

ở mục 2.2.10 với các thông số được liệt kê ở bảng 3.3. Các chỉ số của hai đường

chuẩn đều cho kết quả chấp nhận được. Từ các thông số của đường chuẩn (Bảng

3.3) và giá trị chu kì ngưỡng trung bình của mỗi mẫu thí nghiệm (Bảng 3.4), tỷ lệ

Z0/G0 được tính toán dựa trên công thức {1} (Mục 2.2.10 phần phương pháp).

Bảng 3.3. Đường chuẩn khuếch đại của hai gen ZmDREB2.7tv và Glb-1

Thông số ZmDREB2.7tv Glb-1

Hệ số góc (S) -3,47 -3,95

Hiệu suất phản ứng 1,94 1,79

Error 0,27 0,9

Hệ số tương đương (R2) 0,99 0,94

Số chu kì bão hòa (Y-intercept (I) 20,3 24,81

Glb-1 là một gen quản gia (house-keeping gene) trong cây, mã hóa cho

protein globulin-1 và được kiểm tra trên cơ sở dữ liệu maizegdb.org là có một bản

sao trong cây ngô. Do đó, gen Glb-1 được sử dụng để làm gen nội chuẩn cho thí

nghiệm. Cặp mồi nhân đặc hiệu đoạn gen Glb-1 được thiết kế và kiểm tra bằng

công cụ primer-BLAST để đảm bảo không khuếch đại các đoạn không đặc hiệu

trong cây ngô và có thể dẫn đến kết quả ước lượng sai. Cặp mồi nhân đoạn gen

ZmDREB2.7tv gồm mồi ngược nhận biết vị trí trong gen và mồi xuôi nhận biết vị trí

trên promoter rd29A. Điều này giúp phản ứng real-time PCR không khuếch đại gen

ZmDREB2.7 nội sinh trong cây ngô K7 và ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Do

dòng nền K7 được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen là dòng thuần, gen Glb-1

được coi là nằm trên một locus và ở trạng thái đồng hợp, tức mang hai bản sao của

gen này trong hệ gen của cây chuyển gen. Như vậy, từ tỷ lệ Z0/G0 có thể ước lượng

được số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T1.

Bảng 3.4. Giá trị Ct và số lượng bản sao gen ZmDREB2.7tv của trong các cây

chuyển gen thế hệ T1

Giá trị CtZ trung bình Z0/G0 Số bản sao gen ZmDREB2.7tv Cây T1 ZmDREB2.7tv Glb-1

31,60 36,07 0,39 1 D5.1

31,25 36,09 0,50 1 D5.4

31,68 36,34 0,44 1 D5.5

30,33 36,4 1,11 2 D5.8

30,75 35,61 0,53 1 D5.9

34,53 39,71 0,47 1 D5.10

Trong số 6 cây T1 dương tính với sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv, 5 cây

mang một bản sao của gen ZmDREB2.7tv, điều đó có thể được hiểu rằng gen

ZmDREB2.7tv đã sát nhập tại một vị trí trong hệ gen và ở trạng thái dị hợp (Bảng

3.4). Cây T1 còn lại - D5.8 cho tỷ lệ Z0/G0 xấp xỉ bằng 1 nên được cho có hai bản

sao của gen ZmDREB2.7tv. Với kết quả phân tích phân ly ở mục 3.3.4 và kết quả

real-time PCR định lượng của các cây T1 nói trên, có thể cho rằng cây T1 D5.8

mang gen ZmDREB2.7tv tại một locus trong hệ gen và ở trạng thái đồng hợp tử.

3.3.5. Đánh giá sự biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển

gen thế hệ T2

Mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 được đánh giá trong các

cây chuyển gen thế hệ T2 ở mức độ phiên mã ở hai điều kiện thí nghiệm: bình

thường và hạn. Các hạt T2 có nguồn gốc từ cây T1 D5.8 được gieo và các cây con

được kiểm tra sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv bằng thí nghiệm PCR trước khi tiến

hành đánh giá sự biểu hiện của gen quan tâm (Hình 3.16).

Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm trong cây chuyển

gen ZmDREB2.7tv thế hệ T2

1: Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; 2: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của cây không chuyển gen;3-4: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của các cây chuyển gen thế hệ T2 của cây T1 D5.8

Như mô tả ở phần phương pháp, cây không chuyển gen và cây chuyển gen

ZmDREB2.7tv dương tính với sự có mặt của gen quan tâm được gây hạn nhân tạo

bằng dung dịch PEG6000 20%. Lá của các cây được thu để đánh giá mức độ biểu

hiện của gen ZmDREB2.7 trong các cây ngô này ở giai đoạn trước xử lý (0h) và sau

Hình 3.17. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 của cây

chuyển gen khi gặp hạn.

xử lý hạn (6h).

Do cặp mồi thiết kế nằm trong vùng trình tự mã hóa của gen ZmDREB2.7tv,

sản phẩm của gen ZmDREB2.7 nội sinh cũng được khuếch đại. Vì vậy, kết quả của

phản ứng real-time PCR định lượng thể hiện mức độ biểu hiện tương đối của gen

ZmDREB2.7 nói chung trong cây (Hình 3.17). Trước khi xử lý hạn (điều kiện bình

thường), sự biểu hiện của gen ZmDREB2.7 là tương đương giữa cây không chuyển

gen và không chuyển gen do gen ZmDREB2.7tv được điều khiển bởi promoter cảm

ứng rd29A. Tuy nhiên, sau 6 giờ xử lý hạn, mức độ biểu hiện của gen ZmDREB2.7

tăng lên đáng kể ở tất cả các cây thí nghiệm. Trong đó, hai cây chuyển gen có mức

độ biểu hiện của gen ZmDREB2.7 cao hơn so với cây không chuyển gen. Điều này

có thể được giải thích là do bên cạnh gen ZmDREB2.7 nội sinh, cây chuyển gen có

thêm gen ZmDREB2.7tv và do đó số lượng sản phẩm phiên mã tăng lên. Như vậy,

các cây chuyển gen thế hệ T2 có sự biểu hiện của cấu trúc chuyển gen

ZmDREB2.7tv ở mức độ phiên mã khi đáp ứng với điều kiện thiếu nước.

KẾT LUẬN

1. Đã phân lập và xác định trình tự nucleotide đoạn mang gen DREB2.7 từ

giống ngô địa phương chịu hạn Tẻ vàng 1. Gen ZmDREB2.7tv có độ tương đồng

98% so với gen ZmDREB2.7 của cây ngô tham chiếu B73. Protein suy diễn

ZmDREB2.7tv có một vài thay đổi trên trình tự amino acid tuy nhiên vùng bám

DNA vẫn được bảo toàn.

2. Đã thiết kế vector trung gian và vector chuyển gen thực vật mang đoạn

trình tự mã hóa của gen ZmDREB2.7tv, trong đó, đoạn gen ZmDREB2.7tv được

điều hòa bởi promoter cảm ứng với hạn rd29A. Đồng thời, đã tạo được chủng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen thực vật

pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA.

3. Đã tạo được cây ngô chuyển gen ZmDREB2.7tv với hiệu suất chuyển gen

đạt 0,99%. Cây chuyển gen được kiểm chứng bằng các thí nghiệm sinh học phân tử

để đánh giá sự có mặt, ước lượng số lượng bản sao và đánh giá biểu hiện của cấu

trúc rd29A::ZmDREB2.7tv ở mức độ phiên mã. Cây chuyển gen thế hệ T2 thuộc

dòng D5.8 mang gen ZmDREB2.7tv cho thấy tăng cường sự biểu hiện của gen này

trong thí nghiệm xử lý hạn nhân tạo.

KIẾN NGHỊ

1. Thực hiện các thí nghiệm để kiểm tra ảnh hưởng của gen ZmDREB2.7tv

lên các gen khác liên quan đến con đường chống chịu hạn của cây.

2. Thực hiện các thí nghiệm đánh giá về sinh lý, sinh hóa của cây chuyển

gen.

3. Thực hiện các thí nghiệm đánh giá tính trạng chịu hạn của cây chuyển gen

trong nhà lưới ở các giai đoạn khác nhau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2017), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch tháng 12 năm 2017 Ngành Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

https://www.mard.gov.vn/ThongKe/Lists/BaoCaoThongKe/Attachments/132 /Baocao_T12_2017.pdf .

2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên (2013), ‖Thiết kế vector biểu hiện gen chịu hạn NTCB-ZmNF-YB2 ở ngô‖. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn, 7, tr. 31-37.

3. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), ‖Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22‖. Tạp chí Khoa học và công nghệ,

11, tr.3-9.

4. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy Hưng, Lê

Huy Hàm (2015), ‖Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn NF-YB2 vào một số

dòng ngô Việt Nam‖. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 7,

e.3530

5. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Văn Trường, Bùi Mạnh Minh, Đoàn Thị Bích THảo, Nguyễn Xuân Thắng, Nông Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2014), ‖Thiết

kế vector biểu hiện mang gen modiCspB và chuyển gen này vào cây ngô‖.

Tạp chí công nghệ sinh học, 12(1), tr. 125 – 132.

Tài liệu Tiếng Anh

6. Ashraf, M., & Akram, N. A. (2009), ―Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering: an analytical

comparison‖. Biotechnology advances, 27(6), pp. 744-752.

7. Brookes, G., Barfoot, P. (2017), ―Farm income and production impacts of using GM crop technology 1996–2015‖. GM crops & food, 8(3), pp. 156-193. 8. Chapman, S. C., Edmeades, G. O. (1999), ―Selection improves drought tolerance in tropical maize populations: II. Direct and correlated responses among secondary traits‖. Crop Science, 39(5), pp. 1315-1324.

9. Chaves, M. M., Maroco, J. P., & Pereira, J. S. (2003), ―Understanding plant responses to drought—from genes to the whole plant‖. Functional plant

biology, 30(3), pp. 239-264.

10. Chen, J. Q., Meng, X. P., Zhang, Y., Xia, M., & Wang, X. P. (2008), ―Over- expression of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice‖. Biotechnology letters, 30(12), pp. 2191-2198.

11. Chen, J., Xia, X., & Yin, W. (2009). ―Expression profiling and functional characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica”.

Biochemical and Biophysical Research Communications, 378(3), pp.483-

487.

12. Claassen, M. M., & Shaw, R. H. (1970), ―Water deficit effects on corn. I. Grain

components‖. Agronomy journal, 62(5), pp. 652-655.

13. Edmeades, G.O., Bolaños, J. J., Elings, A., Ribaut, J-M., Bänziger, M., Westgate., M. E. (2000), The role and regulation of the anthesis-silking

interval in maize. pp. 43-73. In: M.E. Westgate and K.J. Boote (eds.).

Physiology and modeling kernel set in maize. CSSA Special Publication No.

29. CSSA, Madison, WI

14. Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang., K. (2015), Maize (Zea mays L.). In Wang K, eds. Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology, vol

1223. Springer, New York, NY.

15. Fromm, M. E., Morrish, F., Armstrong, C., Williams, R., Thomas, J., Klein, T. M. (1990), ―Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of

transgenic maize plants‖. Nature Biotechnology, 8(9), pp.833-839.

16. Haake, V., Cook, D., Riechmann, J., Pineda, O., Thomashow, M. F., & Zhang, J. Z. (2002), ―Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation

in Arabidopsis‖. Plant physiology, 130(2), pp. 639-648.

17. Hu, H., Xiong, L. (2014), ―Genetic engineering and breeding of drought-

resistant crops‖. Annual review of plant biology, 65, pp. 715-741.

18. ISAAA. 2016. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016.

ISAAA Brief No. 52. ISAAA: Ithaca, NY.

19. ISAAA. 2017. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops in 2017: Biotech Crop Adoption Surges as Economic Benefits Accumulate in 22

Years. ISAAA Brief No. 53. ISAAA: Ithaca, NY.

20. Kasuga, M., Miura, S., Shinozaki, K., & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2004), ―A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A

promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer‖. Plant and Cell Physiology, 45(3), pp.346-350.

21. Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Miura, S., Yamaguchi-Shinozaki, K., & Shinozaki, K. (1998), ―Two transcription factors, DREB1 and DREB2,

with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal

transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene

expression, respectively, in Arabidopsis‖. The Plant Cell, 10(8), pp. 1391-

1406.

22. Liu, S., Wang, X., Wang, H., Xin, H., Yang, X., Yan, J., ... & Qin, F. (2013), ―Genome-wide analysis of ZmDREB genes and their association with natural

variation in drought tolerance at seedling stage of Zea mays L‖. PLoS

genetics, 9(9), e1003790.

23. Novillo, F., Alonso, J. M., Ecker, J. R., & Salinas, J. (2004), ―CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression

and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis”. Proceedings of

the National Academy of Sciences, 101(11), pp. 3985-3990.

24. Ohme-Takagi, M., Shinshi, H. (1995), ―Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element‖. Plant Cell, 7, pp.

173–182.

25. Rogers, S. O., & Bendich, A. J. (1989), ―Extraction of DNA from plant tissues‖. In Plant molecular biology manual, pp. 73-83. Springer, Dordrecht. 26. Sakuma, Y., Maruyama, K., Osakabe, Y., Qin, F., Seki, M., Shinozaki, K., & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2006), ―Functional analysis of an Arabidopsis

transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene

expression‖. The Plant Cell, 18(5), pp. 1292-1309.

27. Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual (No. Ed. 2). Cold spring harbor laboratory press. 28. Wang, H., & Qin, F. (2017), ―Genome-wide association study reveals natural variations contributing to drought resistance in crops‖. Frontiers in plant science, 8, pp. 1110.

29. Weng, H., Pan, A., Yang, L., Zhang, C., Liu, Z., & Zhang, D. (2004), ―Estimating number of transgene copies in transgenic rapeseed by real-time

PCR assay withHMG I/Y as an endogenous reference gene‖. Plant

Molecular Biology Reporter, 22(3), pp.289-300.

30. Yoshida, T., Mogami, J., & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2014), ―ABA-dependent and ABA-independent signaling in response to osmotic stress in plants‖.

Current opinion in plant biology, 21, pp. 133-139.

Trang web

31. FAO, http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC, cập nhật ngày 28/05/2018. 32. USDA, https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/biotechnology/permits-

notifications-petitions/sapermits/ctstatus, cập nhật ngày 19/11/2018. 33. USDA (2018) ―World Agricultural Production, Circular Series WAP 11-18‖ Released 08/11/2018. https://usda.library.cornell.edu/concern/publications/-

5q47rn72z?locale=en

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------

Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

Hà Nội - 2018

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2018

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

A

B

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Luận án Tiến sĩ: Bồi dưỡng cho học sinh năng lực thích nghi trí tuệ nhằm nâng cao hiệu quả dạy học hình học không gian ở trường Trung học phổ thông

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của lượng phân bón đến sinh trưởng và năng suất một số giống lúa lai triển vọng tại Nam Trực, Nam Định

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá đặc điểm nông sinh học và khả năng kết hợp của một số dòng thuần phục vụ công tác chọn tạo giống ngô làm thức ăn gia súc

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của lượng phân bón và mật độ trồng đến sinh trưởng, năng suất và chất lượng của dòng khoai lang 15D-1-16 tại Thanh Trì, Hà Nội

Luận văn Thạc sĩ Khoa học máy tính: Web 2.0 và mạng xã hội

Luận văn Thạc sĩ Khoa học giáo dục: Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá trình độ sức mạnh cho nam sinh viên chuyên sâu cầu lông trường Đại học Sư phạm Thể dục Thể thao Hà Nội

Luận văn Thạc sĩ Khoa học giáo dục: Một số biện pháp tổ chức trò chơi lắp ghép - xây dựng nhằm phát triển tính sáng tạo cho trẻ 5-6 tuổi ở trường mầm non

Luận văn Thạc sĩ Khoa học giáo dục: Hoạt động trải nghiệm trong dạy học chủ điểm Nhớ nguồn ở Sách giáo khoa tiếng Việt 5 (Tập hai)

Luận văn Thạc sĩ Khoa học hệ thống điện: Nghiên cứu các biện pháp nâng cao ổn định điện áp của lưới phân phối điện trung áp

Luận văn Thạc sĩ Khoa học giáo dục: Tổ chức hoạt động khám phá thực vật cho trẻ mẫu giáo 5-6 tuổi theo hướng tích hợp

Luận văn Thạc sĩ Khoa học giáo dục: Biện pháp dạy trẻ mẫu giáo 5-6 tuổi định hướng độ dài thời gian

Luận văn Thạc sĩ Khoa học xây dựng: Hiện trạng canh tác và ảnh hưởng của rhodopseudomonas palustris đến năng suất, chất lượng của dưa lê trong điều kiện nhà lưới

Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Chế tạo vật liệu khung cơ kim (MOF) ứng dụng cho siêu tụ điện

Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase của loài Camellia phanii ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Nghiên cứu chế tạo điện cực polymer và khảo sát tính chất của chúng

Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Nghiên cứu chế tạo vật liệu compozit từ polylactic, dầu hạt đen và sợi gai xanh AP1

Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Nhiên cứu thành phần saponin và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase từ cây Lan thạch hộc (Dendrobium officinale Kimura & Migo)

Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ loài Sầm tám sóng (Memecylon octocostatum Merr. & Chun)

Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Nghiên cứu liposome hóa hoạt chất α-mangostin và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP