Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính sinh học các hợp chất naphthoquinoes và triterpenoid từ lá cây Thị đài lá rộng - Diospyros fleuryana

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

----------

Hà Huy Tùng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CÁC HỢP CHẤT NAPHTHOQUINOES VÀ TRITERPENOID

TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG - DIOSPYROS FLEURYANA

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

----------

Hà Huy Tùng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CÁC HỢP CHẤT NAPHTHOQUINOES VÀ TRITERPENOID

TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG - DIOSPYROS FLEURYANA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Ninh Thế Sơn

TS. Nguyễn Thị Thu Hà

Hà Nội - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu phân lập và thử

hoạt tính sinh học các hợp chất naphthoquinoes và triterpenoid từ lá cây Thị đài

lá rộng - Diospyros fleuryana” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hướng dẫn

của TS. Ninh Thế Sơn và TS. Nguyễn Thị Thu Hà. Đây không phải là bản sao

chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu,

nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh

giá. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày

trong luận văn này.

Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2021

Học viên

Hà Huy Tùng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi cảm ơn sâu sắc đến TS. Ninh Thế Sơn và TS. Nguyễn Thị Thu

Hà – Phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học &

Công nghệ Việt Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên

cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Để hoàn thành bản luận văn này, Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh

phí từ Qũy phát triển và khoa học công nghệ Quốc gia, MSĐT: Nafosted 104.01-

2017.28

Tôi xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn

thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hóa học – Viện HLKH & CN

Việt Nam, Các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu các

phương pháp Phổ ứng dụng.

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn này bằng tất cả sự

nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót.

Rất mong nhận được những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.

Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2021

Học viên

Hà Huy Tùng

I

MỤC LỤC

I MỤC LỤC .....................................................................................................

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................................... IV

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................ V

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ................................................................... VI

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ...................................................................... VIII

1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................

3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI DIOSPYROS ..................................................... 3

3 1.1.1. Sơ lược về chi Diospyros .....................................................................

3 1.1.2. Các nghiên cứu về ạt tính sinh h c của chi Thị Diospyros .................................................................................

1.1.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa .................................................................. 4

1.1.2.2. Hoạt tính kháng viêm ....................................................................... 6

1.1.2.3. Hoạt tính kháng khuẩn .................................................................... 7

1.1.2.4. Hoạt tính kiểm soát huyết áp ........................................................... 10

1.1.2.5. Hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh .......................................................... 10

1.1.2.6. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư .................................................... 11

1.1.2.7. Hoạt tính điều trị tiểu đường ........................................................... 13

14 1.1.3. Một số nghiên cứu về chi Thị ở Việt Nam .......................................

1.2. GIỚI THIỆU VỀ HỢP CHẤT NAPHTHOQUINONES VÀ

TRITERPENOID ...................................................................................... 16

16 1.2.1. Sơ lược về hợp chất naphthoquinones .............................................

1.2.2. Sơ lược về hợp chất triterpenoid ...................................................... 17

II

1.3. ỨNG DỤNG CỦA CHI THỊ - DIOSPYROS TRONG ỨC CHẾ TẾ

BÀO UNG THƯ VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG ........................ 18

18 1.3.1. Ứng dụng trong ức chế tế bào ung ư ............................................

19 1.3.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường ........................................

20 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 20

2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ................................................ 20

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 21

21 2.3.1. Cá ươ g á gâm iết ............................................................

23 2.3.2. Các ươ g á â í sắc ký ...................................................

2.3.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................ 23

2.3.2.2. Phương pháp sắc ký cột (CC) ............................................................ 26

28 2.3.3. Cá ươ g lý qu g ổ xá định cấu trúc .......................

29 2.3.4. Cá ươ g á g iê ứu hoạt tính sinh h c ............................

2.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào ................................... 29

2.3.4.2. Phương thử hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase .................... 31

33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................

3.1. PHÂN LẬP CÁC VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG ............................................................... 33

33 3.1.1. Quy trình phân lập .............................................................................

35 3.1.2. Cấu trúc và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập ..............................

36 3.1.3. Xá định cấu trúc các hợp chất phân lậ được bằ g ươ g pháp quang phổ ...................................................................................

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHO CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP .. 61

III

61 3.2.1. Hoạ í gây độc tế bào ....................................................................

3.2.2. Hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase ....................................... 64

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 67

4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 67

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 76

IV

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt

Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TLC

Column Chromatography Sắc ký cột CC

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

Phổ khối lượng

MS 1H-NMR Mass Spectroscopy 1H-Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13C-NMR

13C-Nuclear Magnetic Resonance

proton

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

cacbon C-13

HSQC Heteronuclear single quantum Phổ tương tác hai chiều dị

coherence spectroscopy hạt nhân

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác đa liên kết

Correlation hai chiều dị nhân

Proton-Chemical shift Độ dịch chuyển hóa học của H

proton

Carbon-Chemical shift Độ dịch chuyển hóa học của C

cacbon

Coupling constant Hằng số tương tác J

Human epidermic carcinoma Tế bào ung thư biểu mô KB

Hep-G2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan

Human lung carcinoma Tế bào ung thư phổi LU

Human breast carcinoma Tế bào ung thư vú MCF-7

High Performance Liquid High Performance Liquid HPLC

Chromatography Chromatography

Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối IC50

tượng thử nghiệm

V

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ

Bảng 1: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất

DS-1 …………………………………………………………… 37

Bảng 2: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất

DS-2 ……………………………………………………………

42 Bảng 3: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất

DS-3 …………………………………………………………… 48

Bảng 4: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất

DS-4 …………………………………………………………… 44

Bảng 5: Kết quả gây độc tế bào ung thư của các hợp chất thử nghiệm … 62

65 Bảng 6: Kết quả ức chế enzyme alpha-glucosidase của các hợp chất thử nghiệm …………………………………………………………

Sơ đồ 1: Quy trình phân lập hóa học lá cây Thị đài lá rộng ……………. 34

VI

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1: Các hợp chất secoiridoid và lignan phân lập từ lá của loài D. kaki … 5

Hình 2: Các dẫn xuất norbergenin phân lập từ lá của loài D. gilletii ………... 6

Hình 3: Các hợp chất napthquinone và triterpenoid phân lập từ cành của loài D. bipindensis ………………………………………………………..… 7

Hình 4: Cấu trúc hai hợp chất naphthquinone có tác dụng kháng khuẩn …….. 8

Hình 5: Các hợp chất naphthalene glycoside và naphthoquinone phân lập từ cành của loài D. Lycioides ………………………………………….………… 9

Hình 6: Các hợp chất phân lập từ thân cành của loài D. undulata ………..… 12

Hình 7: Các hợp chất phân lập từ D. lotus và D. melanoxylon …….……….. 14

Hình 8: Các hợp chất phân lập từ D. decandra ……………………………... 15

Hình 9: Các hợp chất naphthoquinone phân lập từ D. greenwayi ………….. 17

Hình 10: Cây Thị đài lá rộng-Diospyros fleuryana A. Chev. ex Lecomte ….. 20

Hình 11: Sắc khí bản mỏng khi chấm và chạy trong dung môi ……………... 25

Hình 12: Sắc ký cột …………………………………………………..……… 27

Hình 13: Các hợp chất napthoquione DS-1 và DS-2 và triterpenoid DS-3 và DS-4 phân lập từ lá của loài Thị Đài lá rộng ……………………... 35 Hình 14: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-1 …………..… 36

Hình 15: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-1 …….….……..…………… 38

Hình 16: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-1 ……….………………………… 38

Hình 17: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-1 ……………..…………………… 39

Hình 18: Phổ HSQC của hợp chất DS-1 …………………..………………… 40

VII

Hình 19: Phổ HMBC của hợp chất DS-1 ……………...……..……………… 40

Hình 20: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-2 …..………… 41

Hình 21: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-2 …………….………………….… 43

Hình 22: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-2 ……………….………………… 44

Hình 23: Phổ HSQC của hợp chất DS-2 ………......………………………… 45

Hình 24: Phổ HMBC của hợp chất DS-2 ……...……………….…….……… 46

Hình 25: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-3 …………….. 47

Hình 26: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-3 …………….………………….… 49

Hình 27: Phổ ESI-MS (+) của hợp chất DS-3 …………….…...………….… 50

Hình 28: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-3 ……………….………………… 51

Hình 29: Phổ HSQC của hợp chất DS-3 ………......………………………… 52

Hình 30: Phổ HMBC của hợp chất DS-3 ……...……………….…….……… 53

Hình 31: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-4 ………..…… 54

Hình 32: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-4 …………….…………...… 56

Hình 33: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-4 …………….………………….… 57

Hình 34: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-4 ……………….………………… 58

Hình 35: Phổ HSQC của hợp chất DS-4 ………......………………………… 59

Hình 36: Phổ HMBC của hợp chất DS-4 ……...……………….…….……… 60

VIII

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-1 ……………………….. 76

Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-1 ………………………………. 77

Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-1 ……………………………… 78

Phụ lục 4: Phổ HSQC của hợp chất DS-1 …………………………………. 79

Phụ lục 5: Phổ HMBC của hợp chất DS-1 ………………………………... 80

Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-2 ………………………………. 81

Phụ lục 7: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-2 ……………………………… 82

Phụ lục 8: Phổ HSQC của hợp chất DS-2 …………………………………. 83

Phụ lục 9: Phổ HMBC của hợp chất DS-2 …………………………...…… 84

Phụ lục 10: Phổ ESI-MS (+) của hợp chất DS-3 …………………………. 85

Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-3 ……………………………. 86

Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-3 ……………………………. 87

Phụ lục 13: Phổ HSQC của hợp chất DS-3 ……………………………….. 88

Phụ lục 14: Phổ HMBC của hợp chất DS-3 ………………………………. 89

Phụ lục 15: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-4 ……………………… 90

Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-4 …………………………….. 91

Phụ lục 17: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-4 ……………………………. 92

Phụ lục 18: Phổ HSQC của hợp chất DS-4 ……………………………….. 93

Phụ lục 19: Phổ HMBC của hợp chất DS-4 ………………………………. 94

1

MỞ ĐẦU

Y học Cổ truyền Việt Nam còn gọi là thuốc Nam hay thuốc ta là một ngành

y học thuộc Đông y với nguồn gốc xuất phát từ Việt Nam thay vì từ Trung Hoa.

Đặc tính của thuốc Nam là nguyên liệu dùng những loại thảo mộc bản địa chứ

không phải những dược chất xa lạ. Hiện nay, thảo mộc hay cây dược liệu vẫn

đóng một vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khoẻ con người. Trên thế giới,

từ các thảo dược các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loại thuốc mới có hoạt tính

cao và được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh.

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một

cách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng

cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa. Hiện nay có

khoảng hơn 100 bệnh ung thư ảnh hưởng đến con người như ưng thư tuyến tụy,

ung thư phổi, dạ dày, thực quản, trực tràng, biểu mô, đại tràng, ung thư máu.

Năm 2015 khoảng 90,5 triệu người bị ung thư, trong số đó là 8,8 triệu người

chết (chiếm tỉ lệ 15,7%).

Bệnh tiểu đường, còn gọi là Đái tháo đường là một nhóm bệnh rối loạn

chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu

hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao.

Theo thống kê cho thấy ở Việt Nam hiện có khoảng 5 triệu người mắc bệnh tiểu

đường và nằm trong top 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng người mắc tiểu đường cao

nhất với tỉ lệ tăng 5,5% mỗi năm. Trong đó 80% người bệnh tiểu đường chết do

biến chứng tim mạch và các bệnh về thận.

Việt Nam là quốc gia nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có

hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Trong số này, nguồn tài nguyên cây

làm thuốc chiếm khoảng 30%. Cho đến nay ở Việt Nam, có rất nhiều công trình

nghiên cứu và ứng dụng cây dược liệu trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ

2

con người. Trong đó nổi bật là các bộ phận thực vật của nhiều loài thuộc chi

Diospyros đã được sử dụng làm phương thuốc dân gian thực hành chữa nhiều

bệnh khác nhau điều trị xuất huyết, mất ngủ, tiêu chảy, chống viêm, giảm đau,

hạ sốt, đặc biệt điều trị ung thư và bệnh tiểu đường là hai căn bệnh hiểm nghèo

đáng sợ nhất hiện nay.

Với mục đích tìm ra cây dược liệu có hoạt chất chống ung thư và điều trị

bệnh tiểu đường tôi đã lựa chọn loài Diospyros fleuryana làm đối tượng nghiên

cứu với tên đề tài: ‘‘Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính sinh học các hợp

chất naphthoquinoes và triterpenoid từ lá cây Thị đài lá rộng - Diospyros

fleuryana’’ với mục tiêu được đặt ra như sau:

 Phân lập, xác định cấu trúc các naphthoquinones và triterpenoid có trong

lá cây Thị đài lá rộng.

 Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư và tác dụng giảm đường huyết

của các hợp chất đã phân lập được.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI DIOSPYROS

1.1.1. Sơ lược về chi Diospyros

Chi Thị (danh pháp khoa học: Diospyros) thuộc họ Ebanaceae, bao gồm

khoảng 500 loài. Các loài thuộc chi này đều là cây thân gỗ, lá thường xanh và

rụng sớm. Cao tới 16 m, đường kính 30-50 cm. Thân thẳng, vỏ ngoài màu đen

hay đen xám, nhẵn hoặc đôi khi có bong mảnh dọc nhỏ, thịt nâu xám. Lá đơn

mọc cách, phiến lá hình mác hay hình trứng, đỉnh nhọn, gốc tròn hay hơi hình

tim, mặt trên màu lục sẫm, bóng, khi khô màu nâu, mặt dưới có lông màu nâu đỏ

trên các gân chính và gân bên, khi khô mặt dưới có màu nâu đỏ, lá dài 6-12 cm,

rộng 2-4 cm. Gân bên 4-6 đôi. Cuống lá rất ngắn, có nhiều lông. Hoa đơn tính,

hoa đực 1-3 mọc ở nách lá, gần như không cuống, cánh đài có 4 thùy sâu hình

mác, tràng hình ống trên có 4 thùy lợp sau xòe ra. Nhị đực 14-16 đính ở gốc

tràng. Hoa cái đơn độc ở nách lá, mẫu 4, có cuống ngắn và nhiều lá bắc con,

mang 2-8 nhị lép; bầu có lông, 4 ô, mỗi ô 1 noãn. Mỗi năm cho 2 mùa hoa vào

tháng 2 và tháng 7-8. Quả mọng hình cầu thuôn và có lông, cao 10-15 mm, đỉnh

hơi nhọn mang cánh đài đồng trưởng có lông dài màu vàng. Quả tháng 5-6 và

11-12. Rừng thường xanh, ẩm. < 700 m.

Phần lớn chúng phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chỉ

một số ít loài sinh sống ở vùng ôn đới [1-3].

1.1.2. Các nghiên cứu về thành ph n h a học và hoạt tính sinh học của chi

Thị Diospyros

Chi Thị bao gồm nhiều loài có giá trị kinh tế và thương mại quan trọng,

hoặc là để lấy quả ăn, như cây Hồng (D. kaki) và Thị (D. virginiana), hoặc là để

lấy gỗ. Terpenoid, polyphenol, tannin, acid béo, benzopyrones, và các dẫn xuất

naphthoquinone là lớp chất chính được tìm thấy trong chi Thị. Trong khi đó các

4

nghiên cứu dược học đã chỉ ra rằng, cao chiết và các hợp chất phân lập của một

số loài trong chi này được dùng với mục đích chống oxi hóa, kháng viêm, kháng

khuẩn, kiểm soát huyết áp, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch, …và đặc biệt là

chống ung thư và tiểu đường [1].

1.1.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa

Căng thẳng do thiếu oxy dẫn đến qua trình kích hoạt miễn dịch tự hủy. Do

đó, chất chống oxy hóa có tầm quan trọng sống còn để khôi phục lại sự cân bằng

và bảo vệ môi trường. Tìm kiếm các hoạt chất chống oxi hóa luôn nhận được sự

quan tâm của các nhà khoa học. Chi Thị là một ví dụ điển hình, đã có rất nhiều

các nghiên cứu áp dụng thành phần hóa học từ các loài thực vật của chi này

trong việc hạn chế sự hoạt dộng của các tác nhân gốc tự do.

Cây Thị (D. kaki) là đối tượng chính trong các nghiên cứu hóa học các hợp

chất thiên nhiên, hóa công nghệ thực phẩm và dược học. Bằng kỹ thuật phân

tách sắc ký, Huang et al. (2016) đã phân lập được 2 hợp chất secoiridoi mới và

10 hợp chất đã biết, bao gồm persimmonoid A-B (1-2), ligustroside (3),

oleuropein (4), (+)-medioresinol (5), (+)-syringaresinol (6), (+)-pinoresinol (7),

(+)-medioresinol monoglucoside (8), (+)- syringaresinol-β-D-glucoside (9), (+)-

pinoresinol-β-D-glucoside (10), (+)-isolariciresinol (11), và (−)-(7′S,8S,8′R)-

4,4′-dihydroxy-3,3′,5,5′-tetramethoxy-7′,9-epoxylignan-9′-ol-7-one (12), trong

đó hợp chất 4, 7, 10 và 12 cho giá trị IC50 nhỏ hơn chất đối chứng dương trolox

(IC50 11,9 µg/mL) [4].

5

Hình 1: Các hợp chất secoiridoid và lignan phân lập từ lá của loài D. kaki

[4]

6

Trong một báo cáo gần đây, 4 dẫn xuất norbergenin, bao gồm norbergenin

(13), 4-O-galloylnorbergenin (14), 4-O-p-hydroxybenzoylnorbergenin (15) và

11-O-(E)-cinnamoylnorbergenin (16), phân lập từ lá loài D. gilletii cũng chứng

minh tác dụng chống oxi hóa vượt trội (IC50 8,2-41,6 µg/mL) so với chất đối

chứng dương ascorbic acid (IC50 50,5 µg/mL), trong khi lớp chất triterpenoid và

sterol không thể hiện tính oxi hóa [5].

Hình 2: Các dẫn xuất norbergenin phân lập từ lá của loài D. gilletii [5]

1.1.2.2. Hoạt tính kháng viêm

NF-κB đóng một vai trò quan trọng trong quá trình viêm, phù nề. Chu trình

này được sinh ra khi bởi các nhân tố kháng viêm như các cytokine, protein,

liposaccharide hay các chất oxy hóa ROS. Cesari et al (2013) đã chứng minh

rằng cao chiết n-hexan, EtOAc, cùng 2 napthquinone plumbagin (17) và ismailin

(18) phân lập từ cành của loài D. bipindensis có khả năng ức chế chu trình NF-

κB vói giá trị ức chế lần lượt là 91, 99, 100 và 100%, trong khi giá trị này đối

7

với napthquinone canaliculatin (19) và triterpenoid betulinic acid (20) chỉ là

20% [6].

Hình 3: Các hợp chất napthoquinone và triterpenoid phân lập từ cành của

loài D. bipindensis [6]

Cùng trong năm 2013, Trongsakul và các đồng nghiệp đã đánh giá các tác

dụng giảm đau, hạ sốt và chống viêm của cao chiết n-hexane của thân khô loài

D. variegata trên động vật thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu đã thể hiện tác dụng

chống viêm đáng kể khi các tác nhân như ethyl phenyl-propiolate (EPP) và

arachidonic acid (AA) gây ra hiện tường phù nề ở chuột [7]. Tương tự, cao chiết

chloroform của rễ loài D. lotus do có chứa napthoquinone có thể ngăn ngừa

viêm từ thí nghiệm phù chân ở chuột [8].

1.1.2.3. Hoạt tính kháng khuẩn

Các cao chiết ether, ethyl acetate, methanol và nước cao chiết từ lá của loài

D. ebenum đã được thử nghiệm để đánh giá khả năng kháng khuẩn của chúng

chống lại các vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Tất cả các các loại cao chiết,

8

ngoại trừ dung dịch nước, thể hiện hoạt tính tốt chống lại sự phát triển của vi

khuẩn Staphylococcus aureus. Hơn nữa, cao chiết methanol thể hiện hoạt tính

tốt hơn đối với Pseudo monas aeruginosa và Salmonella typhimurium so với

amikacin, một loại kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do

vi khuẩn khác nhau [9].

Naphthoquinones phân lập từ chi Thị đóng một vại trò quan trọng trong các

thí nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định. Diosquinone (21) lần đầu tiên được

phân lập từ D. tricolor, sau đó tiếp tục được phân lập từ loài D. mafiensis, D.

zombensis [10-12]. Hợp chất này thể hiện tác dụng tốt trong việc kháng một số

loại vi sinh vật kiểm định như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và

Pseudomonas aeruginosa với giá trị MIC lần lượt là 3, 15, and 16 µg/mL [13].

4-Hydroxy-3,5-dimethoxy-2-naphthaldehyde (22) phân lập từ loài D. assimilis

Bedd. có tác dụng ức chế sự phát triển các bacterial Trypanosoma brucei, T.

cruzi và Leishmania donovani với các giá trị IC50 lần lượt là 19,82, 12,28 và

38,78 µg/mL [14].

Hình 4: Cấu trúc hai hợp chất naphthoquinone có tác dụng kháng khuẩn

[14]

Cao chiết methanol cành của loài D. lycioides đã được tìm thấy để ức chế

sự phát triển của các chủng vi khuẩn răng miệng Streptococcus mutans,

Streptococcus sanguis, Porphyromonas gingivalis và Prevotella continia. Hoạt

9

tính kháng khuẩn này có được là do sự có mặt của các 4 naphthalene glycoside

mới là diospyroside A-D (23-26) và 2 naphthoquinone đã biết là juglone (27) và

7-methyljuglone (28) [15].

Hình 5: Các hợp chất naphthalene glycoside và naphthoquinone phân lập từ

cành của loài D. lycioides [15]

Tannin được chiết xuất từ D. kaki làm giảm nhiễm virut ở các loại virut

cúm H3N2, H5N3, virut herpes simplex-1, virut viêm miệng, virut Sendai và

virut gây bệnh Newcastle, virut bại liệt, virut coxsackie, virut norovirus. Hoạt

động ức chế được trung gian thông qua tập hợp protein [16]. Tương tự, cao chiết

ethyl acetate từ vỏ cây D. glans với sự có mặt của các triterpenoid, cho thấy hoạt

động mạnh mẽ chống lại sự nhân lên của virus sốt xuất huyết, được đánh giá bởi

xét nghiệm RNA polymerase phụ thuộc RNA của virus sốt xuất huyết [17].

10

1.1.2.4. Hoạt tính kiểm soát huyết áp

Lá của cây hồng D. kaki đã được sử dụng để điều trị các bệnh tăng huyết áp

ở Nhật Bản. Các hợp chất flavonoid và flavonoid glycoside như astragalin,

isoquercitrin, kaempferol-3-O-(2''-O-galloyl) glucoside và quercetin-3-O-(2''-O-

galloyl) glucoside được phân lập từ lá của cây hồng được tìm thấy có tác dụng

ức chế sự hoạt động của enzyme angiotensin (ACE) với những liều lượng độc

lập; enzyme này đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát huyết áp [18]. Cao

chiết nước của lá loài D. mespiliformis làm giảm giải phóng canxi do caffeine

gây ra với liều lượng độc lập. Tác dụng này có thể giải thích việc sử dụng chúng

như là thuốc chống tăng huyết áp trong y học cổ truyền, bằng cách ức chế giải

phóng canxi nội bào [19].

1.1.2.5. Hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh

Các chất chống oxy hóa và chống viêm đang đóng vai trò quan trọng trong

các bài thuốc y học cổ truyền chữa các bệnh về thần kinh. Về mặt này, cao chiết

ethanol (80%) của vỏ cây D. fischeri gây ra ức chế các rung động thần kinh ở

chuột, ở mô hình chuột bị gây động kinh bởi picrotoxin [20]. Những kết quả này

hỗ trợ việc sử dụng D. fischeri để điều trị bệnh động kinh.

Tương tự, Bei et al. (2007) đã chỉ ra rằng thuốc có nguồn gốc từ lá D. kaki

khi dùng đường uống với 5 liều 20 mg/mL, bảo vệ khỏi tổn thương do thiếu máu

cục bộ, tái tạo cấu trúc máu bằng cách ngăn ngừa tắc nghẽn động mạch do thiếu

oxy [21]. Flavonoid thu được từ lá của loài D. kaki khi dùng đường uống trong 5

ngày, giảm mức độ thromboxane B2 và giảm nguy cơ huyết khối (máu đông tại

các mạch máu) não. Những kết quả này cho thấy rằng flavonoid từ lá Hồng có

thể ức chế huyết khối não một cách hiệu quả, cải thiện việc cung cấp máu cho

não và làm giảm tổn thương bệnh lý do thiếu máu cục bộ, dẫn đến tình trạng

thiếu máu cục bộ não [22].

11

1.1.2.6. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Ung thư là một bệnh phức tạp, đa yếu tố. Độc tính gây độc tế bào đối với

các tế bào bình thường là không mong muốn, nhưng đối với các tế bào ác tính là

một yêu cầu cần thiết để kiểm soát ung thư. Đối với vấn đề này, việc áp dụng

cao chiết và các hợp chất phân lập từ các loài thực vật trong chi Diospyros trong

việc gây độc tế bào ung thư cho thấy một số lợi ích.

Bằng việc quá trình lặp lại phân lập sắc ký cột cho cao chiết methanol của

thân cành loài D. undulata, 2 hợp chất mới cis-isoshinanolone-4-acetate (29) and

3,4-dihydro-4β-hydroxy-5,6-dimethoxy-2α-methyl-1(2H)-naphthalenone (30),

cùng 12 chất khác cis-isoshinanolone (31), plumbagin (17), 2-hydroxymethyl-5-

methoxy-1,4-naphthoquinone (32), isodiospyrin (33), maritinone (34), 3,3′-

biplumbagin (35), umckalin (36), scopoletin (37), friedelin (38), 28-O-

acetylbetulin (39), betulin (40), and betulinic acid (20) đã được phân tách [23].

Trong đó hợp chất 17 và 34-35 cho chống lại sự phát triển dòng tế bào ung thư

MCF-7 với giá trị IC50 1,38 - 6,4 µM, so với chất đối chứng dương (IC50 11,8

µM [23].

12

Hình 6: Các hợp chất phân lập từ thân cành của loài D. undulata [23]

Yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF) và thụ thể của nó Met dẫn đến tiên

lượng xấu do thúc đẩy di căn và kháng hóa chất trong ung thư biểu mô tế bào

gan (HCC). Do đó, các chất ức chế nhắm vào con đường HGF/Met được coi là

những loại thuốc có triển vọng chống lại HCC. Theo một nghiên cứu gần đây

cao chiết ethanol của lá D. kaki có tác dụng ngăn chặn rõ rệt sự di cư và xâm

nhập của tế bào qua trung gian HGF thông qua việc điều hòa CDH1 và giảm

13

SNAI1, VIM, MMP1, MMP2 và MMP9. Hơn nữa, cao chiết này làm tăng độc

tính tế bào của sorafenib, vốn bị giảm bởi HGF, và giảm sự biểu hiện của các

dấu hiệu thân cây KRT19 và CD44. Quan trọng hơn cả, cao chiết này làm giảm

hoạt động Met và làm giảm hoạt động của JNK/c-Jun qua trung gian HGF. Phát

hiện này chứng minh rằng cao chiết ethanol cây Hồng có thể cải thiện HCC có

tiên lượng xấu thông qua cách ngăn chặn tín hiệu HGF/Met [24].

Theo một đánh giá khác của Sagar et al (2010) cơ chế hoạt động chống ung

thư của các hợp chất naphthoquinone phân lập từ chi Thị là do các phản ứng oxy

hóa loài ROS [25]. Các dẫn xuất này có thể ức chế DNA topoisomerase-II, tạo

ra gốc hydroxy, gây đứt gãy các chuỗi DNA.

1.1.2.7. Hoạt tính điều trị tiểu đường

Bệnh tiểu đường hay đái tháo đường, là một bất thường về trao đổi chất

trong cơ thể. Sử dụng thuốc và điều chỉnh lối sống là những liệu pháp được đề

xuất cho bệnh mãn tính này, và một cách để kiểm soát nó là thông qua can thiệp

chế độ ăn uống. Proanthocyanidin là thành phần chính được phân lập từ vỏ

hồng. Khi lớp chất này được sử dụng trong việc điều trị chuột bị tiểu đường do

streptozotocin (STZ) gây nên, nó làm giảm peroxid hóa lipid, ức chế tạo ra các

loại oxy phản ứng và làm giảm glucose huyết thanh, hemcosylated hemoglobin

(HbA1C), protein tiết niệu, và các sản phẩm cuối glycation thận tiên tiến trong

điều kiện tiểu đường [26].

Cao chiết methanol của quả cây D. peregrina làm giảm mức đường huyết ở

chuột mắc bệnh tiểu đường. Ngoài ra, cao chiết này còn có tác dụng làm giảm

nồng độ các chất phản ứng lipid và thiobarbituric acid (TBARS) trong huyết

thanh và cải thiện hoạt động của các enzyme chống oxy hóa như SOD, CAT và

GSH [27]. Tương tự, phân đoạn chiết có chứa epigallocatechin-3-O-gallate của

cây D. kaki được báo cáo là có hoạt tính hạ đường huyết của chuột [28].

14

Các hợp chất phân lập từ các loài thực vật trong chi Thị đã và đang đem lại

tiềm năng to lớn trong việc ứng dụng chúng vào phòng và điều trị bệnh tiểu

đưởng. Một ví dụ điển hình đến từ nghiên cứu của Sang et al (2015), trong 3 hợp

chất myricitrin (41), myricetin (42) và caffeic acid (43) phân lập từ lá loài D.

lotus, thì hợp chất 41 ức chế enzyme alpha-glucosidase lên đến 98,08% khi so

sánh với chất đối chứng dương acarbose (83,03%) [29]. Tương tự, hợp chất

triterpenoid mới trong thiên nhiên phân lập từ lá của loài D. melanoxylon, có tên

là lup-20 (29)-ene-3,6 β-diol (44), có tác dụng làm giảm tới 81,27 ±11.63

(mg/dl) lượng đường trong máu chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozotocin

[30].

Hình 7: Các hợp chất phân lập từ D. lotus [29] và D. melanoxylon [30]

1.1.3. Một số nghiên cứu về chi Thị ở Việt Nam

Theo sách của Phạm Hoàng Hộ, chi Thị gồm loài phân bố trên khắp cả

nước [31]. Thực vật học dân tộc áp dụng các loài trong chi Thị cho các bài thuốc

15

cổ truyền, trong đó tiêu biểu nhất phải kể đến cây Thị. Trong nhân dân, thường

dùng lá Thị phơi khô cho hút để gây đánh trung tiện, lá tươi giã đắp vào mụn

nhọt cho chóng tan. Thịt quả Thị ăn nhiều vào lúc đói có thể trị được giun

kim. Năm 1961, bệnh viện Phú Thọ đã dùng nước sắc lá thị (100 g lá thị phơi

khô, sắc với nước và lấy đúng 100 mL), mỗi ngày cho uống 10-30 mL, đồng

thời lấy bông tẩm nước sắc này đắp vào rốn để chữa bệnh không trung tiện được

sau khi mổ. Kết quả rất tốt [32].

Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài trong chi

Thị ở Việt Nam vẫn còn ở mức độ sơ khai. Năm 2018, Phạm Thị Ninh và các

cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất 2Z-3,7,11,15,19-pentamethyleicos-2-en-1-

ol (45), astragalin (46), β-sitosterol (47), daucosterol (48) và bacosine (49) từ lá

và vỏ cây D. decandra thu hái tại Hưng Yên [33].

Hình 8: Các hợp chất phân lập từ D. decandra [33]

Theo báo cáo gần đây nhất, Lê Thị Xoan và các cộng sự (2020) cũng đã

xác định hoạt tính ức chế enzyme acetylcholine của cao chiết nước (50 µg/mL)

16

và ethanol (50 µg/mL) của lá cây Hồng thu hái tại Lạng Sơn lần lượt đạt 22,5 ±

7,5% và 25,6 ± 9,38% [34].

Cây Thị đài lá rộng (Diospyros fleuryana A. Chev. ex Lecomte) thuộc chi

Thị (Dyospyros), họ Thị (Ebenaceae). Loài này được A. Chev. ex Lecomte mô

tả khoa học đầu tiên năm 1930. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ, cây Thị đài lá

rộng là cây đại mộc cao 15 m, vỏ đỏ trổ nâu đen, nhánh xám sậm, vàng lúc non.

Phiến lá bầu dục hay tròn dài, không lông, dày như da cứng, gân-phụ nhiều, gân

tam cấp thành mạng rõ; cuống to, có đốt ở đáy. Hoa đực, hoa cái 4-5 phân, lá đài

gần như xoan tròn cao đến 1 cm, tiểu nhụy lép 7-8. Trái xoan tròn, vàng có lông

mịn, to đến 4,5 x 3 cm, trên cọng ngắn, hột 4-5. Gỗ vàng. Sống trong rừng, ở độ

cao 700-1500 m. Phân bố từ Thanh Hóa, vào đến Nha Trang, Tây Ninh [31].

Đến thời điểm hiện tại chưa có bất kỳ nghiên cứu về thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học cho loài này D. fleuryana.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ HỢP CHẤT NAPHTHOQUINONE VÀ TRITERPENOID

1.2.1. Sơ lược về hợp chất naphthoquinone

Từ vỏ thân cây của loài D. greenwayi. Các nhà khoa học Tanzania [51] đã

tách chiết và định lượng tìm ra một naphthoquinone mới 5,5’-dihydroxy-2,7’-

dimethyl-3,8’-binaphthalene-1,1’,4,4’-tetrone với tên gọi là habibone (50), cùng

với các thành phần khác của cây 7 Methyljuglone (51), isodiospyrin (52).

17

Hình 9: Các hợp chất naphthoquinone phân lập từ D. greenwayi [51]

Hai naphthoquinon đã biết được xác định bằng cách so sánh dữ liệu quang

phổ và vật lý của chúng với dữ liệu của các mẫu xác thực. Hợp chất (50) được

gán công thức phân tử (HRMS) C22H14O6. Phổ UV-VIS cho thấy lMeOH tối

đa (log. E): 212 (3,97), 250 (3,63), 285 (3,32) và 420 (3,09) điển hình của mô

hình chung được quan sát đối với peri-hydroxynaphthoquinones [52]. Phổ IR

cho thấy sự hấp thụ C.O được chelat hóa đặc trưng đối với các naphthoquinone

[52].

Naphthoquinones phân lập từ chi Thị đóng một vại trò quan trọng trong các

thí nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định. Diosquinone lần đầu tiên được phân lập

từ D. tricolor, sau đó tiếp tục được phân lập từ loài D. mafiensis, D. zombensis

[10-12]. Hợp chất này thể hiện tác dụng tốt trong việc kháng một số loại vi sinh

vật kiểm định như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và Pseudomonas

aeruginosa với giá trị MIC lần lượt là 3, 15, and 16 µg/mL [13].

1.2.2. Sơ lược về hợp chất triterpenoid

Từ lá và vỏ của loài cây Thị D. decandra thu hái tại Hưng Yên, Việt Nam.

Năm 2018 Phạm Thị Ninh và các cộng sự [33] đã tách và định lượng xác định

cấu trúc hoá học các hợp chất bằng các phương pháp quang phổ IR, MS và

18

NMR, các triterpenoid có khung lupan phân lập được gồm: 2Z-3,7,11,15,19-

pentamethyleicos-2-en-1-ol, astragalin, β-sitosterol, daucosterol và bacosine.

Các hợp chất phân lập từ các loài thực vật trong chi Thị đã và đang đem lại

tiềm năng to lớn trong việc ứng dụng chúng vào phòng và điều trị bệnh tiểu

đưởng. Hợp chất triterpenoid mới trong thiên nhiên phân lập từ lá của loài D.

melanoxylon, có tên là lup-20 (29)-ene-3,6 β-diol, có tác dụng làm giảm tới

81,27 ±11.63 (mg/dl) lượng đường trong máu chuột bị tiểu đường gây ra bởi

streptozotocin [30].

1.3. ỨNG DỤNG CỦA CHI THỊ - DIOSPYROS TRONG ỨC CHẾ TẾ BÀO

UNG THƯ VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

1.3.1. Ứng dụng trong ức chế tế bào ung thư

Độc tính gây độc tế bào đối với các tế bào bình thường là không mong

muốn, nhưng đối với các tế bào ác tính là một yêu cầu cần thiết để kiểm soát

ung thư. Đối với vấn đề này, việc áp dụng cao chiết và các hợp chất phân lập từ

các loài thực vật trong chi Diospyros trong việc gây độc tế bào ung thư cho thấy

một số lợi ích.

Bằng việc quá trình lặp lại phân lập sắc ký cột cho cao chiết methanol của

thân cành loài D. undulata, bốn hợp chất plumbagin, isodiospyrin, maritinone,

3,3′-biplumbagin đã được phân tách được cho tác dụng chống lại sự phát triển

dòng tế bào ung thư MCF-7 với giá trị IC50 1,38 - 6,4 µM, so với chất đối chứng

dương IC50 11,8 µM [23].

Theo một nghiên cứu gần đây cao chiết ethanol của lá D. kaki có tác dụng

ngăn chặn rõ rệt sự di cư và xâm nhập của tế bào qua trung gian HGF thông qua

việc điều hòa CDH1 và giảm SNAI1, VIM, MMP1, MMP2 và MMP9. Hơn nữa,

cao chiết này làm tăng độc tính tế bào của sorafenib, vốn bị giảm bởi HGF, và

giảm sự biểu hiện của các dấu hiệu thân cây KRT19 và CD44. Quan trọng hơn

19

cả, cao chiết này làm giảm hoạt động Met và làm giảm hoạt động của JNK/c-Jun

qua trung gian HGF. Phát hiện này chứng minh rằng cao chiết ethanol cây Hồng

có thể cải thiện HCC có tiên lượng xấu thông qua cách ngăn chặn tín hiệu

HGF/Met [24]

1.3.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường

Proanthocyanidin là thành phần chính được phân lập từ vỏ hồng. Khi lớp

chất này được sử dụng trong việc điều trị chuột bị tiểu đường do streptozotocin

(STZ) gây nên, nó làm giảm peroxid hóa lipid, ức chế tạo ra các loại oxy phản

ứng và làm giảm glucose huyết thanh, hemcosylated hemoglobin (HbA1C),

protein tiết niệu, và các sản phẩm cuối glycation thận tiên tiến trong điều kiện

tiểu đường [26].

Cao chiết methanol của quả cây D. peregrina làm giảm mức đường huyết ở

chuột mắc bệnh tiểu đường. Ngoài ra, cao chiết này còn có tác dụng làm giảm

nồng độ các chất phản ứng lipid và thiobarbituric acid (TBARS) trong huyết

thanh và cải thiện hoạt động của các enzyme chống oxy hóa như SOD, CAT và

GSH [27]. Tương tự, phân đoạn chiết có chứa epigallocatechin-3-O-gallate của

cây D. kaki được báo cáo là có hoạt tính hạ đường huyết của chuột [28].

Các hợp chất phân lập từ các loài thực vật trong chi Thị đã và đang đem lại

tiềm năng to lớn trong việc ứng dụng chúng vào phòng và điều trị bệnh tiểu

đưởng. Một ví dụ điển hình đến từ nghiên cứu của Sang et al (2015), trong 3 hợp

chất myricitrin, myricetin và caffeic acid phân lập từ lá loài D. lotus, thì hợp

chất myricitrin ức chế enzyme alpha-glucosidase lên đến 98,08% khi so sánh với

chất đối chứng dương acarbose (83,03%) [29]. Tương tự, hợp chất triterpenoid

mới trong thiên nhiên phân lập từ lá của loài D. melanoxylon, có tên là

lup-20 (29)-ene-3,6 β-diol , có tác dụng làm giảm tới 81,27 ±11.63 (mg/dl)

lượng đường trong máu chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozotocin [30].

20

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Lá cây Thị đài lá rộng được thu hái ở Ngọc Lạc-Thanh Hóa vào tháng 01

năm 2018. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, viện

Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Giám định thực

vật bởi TS. Nguyễn Quốc Bình Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 10: Cây Thị đài lá rộng - Diospyros fleuryana A. Chev. ex Lecomte

2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ

Sắc ký bản mỏng TLC: Sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254

Merk, độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột pha thường silica gel (0,040- 0,063 mm), sắc

ký cột Sephadex LH-20

Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại (Vilber) ở bước sóng 254 và 365

nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4)2, vanilin (Sigma).

Các dung môi như n-hexane, ethyl axetate, diclchoromethane, acetone và

methanol (hóa chất công nghiệp) đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc

ký cột và sắc ký bản mỏng.

21

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance

500 MHz với TMS (Tetra methyl silane) là chất chuẩn nội và được thực hiện

do tại Viện Hóa Học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Medium), các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC)

Môi trường nuôi cấy tế bào: môi trường DMEM (Dulbeccos Modified Eagle

57TM), huyết thanh bò FBS (Merk).

gồm Hep-G2 (HB - 8065TM), MCF-7 (HTB - 22TM), KB (CCL -17TM), LU-1 (HTB -

Chất tham khảo ellipticine (Sigma) trong phép thử hoạt tính gây độc tế bào

ung thư, chất tham khảo acarbose (Sigma) trong phép thử hoạt tính ức chế

enzyme alpha-glucosidase.

Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250 oC, -800 oC,

buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (BIOTEK), bình nitơ lỏng

bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Các phương pháp ngâm chiết

Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và cách

chiết. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung cho tất cả các

dược liệu [53].

Hiện nay có hai phương pháp ngâm chiết phổ biến:

 Phương pháp 1: Phương pháp ngâm chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu

sơ bộ khi chưa biết rõ thành phần hóa học của dược liệu, dùng phương pháp cổ

điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để

phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu [53]. Ví dụ: sử dụng dãy dung môi: n-

hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và cuối cùng là nước.

22

 Phương pháp 2: Phương pháp ngâm chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ

thành phần trong duợc liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc ethanol

(80-100%). Nhất là methanol được xem như là dung môi vạn năng, nó hòa tan

được chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các

nhóm phân cực khác. Dịch chiết với methanol thu được, đem loại hết dung môi

thu được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu. Khi cần tách phân

đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa lẫn với nước và có

độ phân cực từ yếu đến mạnh [53]. Ví dụ dãy dung môi: ether dầu, ether,

chloroform, ethyl acetate, n-buthanol.

Tiến hành:

 Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu

trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (qui định riêng cho từng

loại dược liệu), rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một

lượng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành

khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần

hoàn cưỡng bức dung môi).

 Có nhiều cách ngâm: Có thể ngâm tĩnh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc

ngâm lạnh, ngâm một lần hoặc nhiều lần (còn gọi là ngâm phân đoạn hay ngâm

nhiều mẻ).

 Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn

giản, rẻ tiền.

 Nhược điểm: Nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn:

năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu). Nếu chỉ chiết

một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu. Nếu chiết nhiều lần

thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết.

Về cách chiết có hai cách chiết:

23

 Chiết ngâm lạnh: Là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa.

Sau khi chuẩn bị dược liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dược liệu trong bình

chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết. Để tăng cường

hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi đổ

lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần [53].

 Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một

cách mãnh liệt - gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất cần

chiết xuất. Phương pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phương pháp chiết

xuất bằng ngâm lạnh nhưng có nhược điểm là chỉ áp dụng được với quy mô nhỏ

[53].

2.3.2. Các phương pháp phân tích sắc ký

2.3.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp phân tách lý - hóa trong đó các chất

được tách ra khỏi một hỗn dựa trên sự “phân bố” liên tục của chúng giữa 2 pha,

một pha không chuyển động (pha tĩnh) thường là silica gel, aluminium oxit được

phủ trên một mặt phẳng chất trơ. và một pha chuyển động (pha động) bao gồm

dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút

lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân

cực của các thành phần trong dung dịch [53].



Sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:



Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.



Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa.



Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc.



Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn.

Giám sát các phản ứng hữu cơ.

Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa

một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc ký lớp mỏng và cho số liệu chính

24

xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high

performance TLC - HPTLC) [53].

Chuẩn bị sắc ký

Bản sắc ký được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một

lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như canxi sulfat (thạch cao), và nước. Hỗn hợp

này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh,

nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc ký này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung

nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường

là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2 mm cho sắc ký lớp mỏng

dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc ký đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh [53].

Kỹ thuật

Phương pháp tiến hành giống với sắc ký giấy với lợi thế là nhanh hơn,

tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi

tính đơn giản và nhanh, sắc ký lớp mỏng thường được dùng để giám sát

các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.

Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng

1 cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp,

như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di

chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử

lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với

tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác

nhau trong dung môi.

Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động

để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha

tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác

nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn

25

và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất

có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc ký (kết quả là hệ

số lưu Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn

hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra

khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc ký sẽ dịch

chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl

axetat và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu

Rf cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc ký. Thay đổi độ phân cực của

pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc

ký. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc ký, một pha tĩnh không phân

cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica.

Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung môi có

tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa

tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn,

và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của

các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực,

hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.

Hình 11: Sắc khí bản mỏng khi chấm và chạy trong dung môi

26

Phân tích

Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương



pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:

Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-

activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát

được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV254). Lớp hấp phụ vì



thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.



Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.

Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc ký vào,



hoặc phun lên bản sắc ký.

Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một

màng polyvinylidene florua (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn,

chẳng hạn như khối phổ.

Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác

định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách

di chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung

môi được sử dụng và các loại bản sắc ký, và không phải là hằng số.

2.3.2.2. Phương pháp sắc ký cột (CC) [54]

Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp

phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể

triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như

sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất,

những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và

những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong 15 quá trình sắc ký.

Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính

chất của chất được sử dụng làm cột.

27

Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong

4 giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô

và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.

Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách

nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi. Sau khi đơn chất hấp phụ lên cột,

rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không

được để khô dung môi trong cột.

Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân

tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đơn

chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách

lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…

Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà

áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở

đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích.

Hình 12: Sắc ký cột

28

2.3.3. Các phương lý h a và quang phổ xác định cấu trúc

Phương pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự

kết hợp xác định giữa các thông số vật lý như điểm nóng cháy, độ quay cực

[α]D… với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối lượng (MS), các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và

DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được sử dụng để nhận

dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập).

Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)

Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định

khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+…, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử [55].

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp

chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên

tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thông số có đặc

trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học

δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D

NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo [56].

Các hợp chất sau khi được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký sẽ được tiến hành đo phổ NMR. Trước tiên, các hợp chất sẽ được đo phổ proton 1H-

NMR. Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ được tiến hành đo tiếp phổ cacbon 13C-NMR và DEPT. Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể xác định được cấu trúc chỉ với số liệu cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H- NMR, 13C-NMR và DEPT). Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm

các phổ NMR hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ IR, phổ X-ray

để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc. Hợp chất sau khi đã được

29

xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ đã nêu sẽ được khẳng định công

thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HRMS [56].

2.3.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học

2.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:

- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn

được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.

- Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan.

- LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.

- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.

Phương pháp thử độ độc tế bào: Được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm

hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường

nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37 oC, độ ẩm 98%, vô trùng

tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy

chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc

tính [57-58].

Nguyên lý của phương pháp MTT:

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng

phổ biến. Muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó

đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý

của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới

tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím

30

formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương

pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt

động của tế bào [57-58].

Thử độc tế bào:

- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128, 32, 8, và 2 µg/ mL. Bổ xung 190 µL dung dịch tế bào ở pha loãng nồng độ 3 x 104 tế bào/mL vào mỗi

giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào Hep-G2,

MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200 µL dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 37oC/ 5% CO2 trong 72h.

- Sau 72h thêm 10 µL MTT (5mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37 OC/4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc

đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ BIOTEK Epoch 2. Thí

nghiệm được lặp lại với n = 3.

IC: Phần trăm kìm hãm sự phát triển

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát

triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.

31

2.3.4.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme alpha-glucosidase được thực

hiện trên đĩa 96 giếng với tổng thể tích phản ứng là 200 µL/giếng [59-62].

Nguyên lý của phương pháp:

Alpha-glucosidase là enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân

carbohydrate tạo glucose trong cơ thể. Do đó, các chất ức chế alpha-glucosidase

có thể làm chậm quá trình giải phóng và hấp thụ glucose, qua đó không làm tăng

đường huyết sau ăn. Vì vậy, một số chất ức chế alpha-glucosidase như acarbose

và miglitol đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị tiểu đường type 2 [59-62].

Phương pháp dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-Nitrophenyl-α-D-

glucopyranoside nhờ tác động của enzyme alpha-glucosidase, qua đó giải phóng

sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng [59-62].

α-Glucosidase

p-Nitrophenyl-α-D-Glucoside α-D-glucose + p-nitrophenol

Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút

sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh

hoạt độ của enzyme alpha-glucosidase [59-62].

Thử ức chế enzyme alpha-glucosidase:

Mẫu thử được pha loãng bằng DMSO 100% hoặc nước cất vô trùng đến

nồng độ cuối cùng trong phản ứng là 1024, 256, 64, 16, 4, 1 mg/mL. Acarbose

được sử dụng làm chất tham khảo.

Các thành phần phản ứng bao gồm:

- Phosphate buffer 100 mM pH 6,8 : 40 µL

- Alpha-glucosidase 0,4 U/ml : 25 µL

32

- Mẫu thử : 10 µL

- p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside 2,5 mM : 25 µL

Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm

được ủ ở nhiệt độ 37 ºC. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3.

Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410

nm (A).

Khả năng ức chế enzyme alpha-glucosidase của mẫu thử được xác định bằng

công thức:

( ) ( ) ( ) ( )

IC50 (half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50%

hoạt động của enzyme a-glucosidase, được tính bằng phần mềm Table curve.

33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG

3.1.1. Quy trình phân lập

Lá cây Thị đài lá rộng sau khi thu hái, được phơi trong bóng mát cho khô

tự nhiên. Mẫu được xay nhỏ (1,16 kg) và ngâm chiết với ethyl axetat (EtOAc) bằng siêu âm trong 45 phút ở 45oC/3 lần, lọc lấy phần dịch và cất loại dung môi

dưới áp suất giảm thu được cao EtOAc (155,0 gram). Cao chiết này được phân

tách sơ bộ trên cột silica gel (10 x 50 cm, 300.0 g) với hệ dung môi rửa giải là n-

hexan-aceton gradient (9:1→ 0:10, v/v) rồi đến hệ aceton-metanol gradient

(9:1→0:10, v/v), thu được 15 phân đoạn ký hiệu từ F1-F15. Tiến hành phân lập

sắc ký phân đoạn F2 (3.0 g) trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-

hexan-diclometan (9:1, v/v), thu được 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F21-F27. Phân

đoạn F23 (113.0 mg) tiếp tục được phân lập sắc cột Sephadex với hệ dung môi

metanol-diclometan (9:1, v/v), thu được 3 phân đoạn nhỏ từ F231-F233. Phân

đoạn nhỏ F232 (30.0 mg) được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ

dung môi 100% diclometan được chất DS-3 Lupeol (10.0 mg) kết tủa hình kim

màu trắng. Phân đoạn F3 (1.5 g) hòa trong dung môi diclometan thu được 2

phần là phần dịch F31 và phần tủa F32. Hòa tan F31 (0,15 g) bằng dung môi

metanol và đưa lên cột Sephadex với hệ dung môi metanol-diclometan (9:1,

v/v), thu được 3 phân đoạn, kí hiệu từ F311-F313. Hợp chất DS-1 Isodiospyrin

(5,0 mg) và DS-2 8'-Hydroxyisodiospyrin (6,0 mg) được phân lập từ phân đoạn

F312 (20.0 mg) bằng phương pháp sắc ký điều chế n-hexan-aceton (8:2, v/v).

Tương tự, tinh chế phân đoạn F313 (50,0 mg) bằng phương pháp điều chế bản

mỏng với hệ n-hexan-aceton (8:2, v/v) ta thu được hợp chất DS-4 Betulin (11,0

mg) kết tủa tinh thể hình kim màu trắng, không hấp thụ UV. Quy trình phân lập

được trình tóm tắt bởi sơ đồ 1.

Bột lá (1,16 kg)

1, EtOAC, 45 oC, 3 lần x 45 phút 2, Cô quay thu hồi dung môi

Cao EtOAC (155,0 g)

1, Silica gel, n-hexan-aceton (9:1→ 0:10, v/v) 2, Silica gel, aceton-metanol (9:1→ 0:10, v/v)

F1

F4-F15

F2 (3,0 g)

F3 (1,5 g)

Silica gel n-hexan-CH2Cl2 (9:1, v/v)

Hòa tan trong CH2Cl2 (100%)

F32 (rắn)

F21-F22

F23 (113,0 mg)

F24-F27

F31 (tan, 0,15 g)

Sephadex LH-20 CH3OH-CH2Cl2 (9:1, v/v)

Sephadex LH-20 CH3OH-CH2Cl2 (9:1, v/v)

F233

F311

F312 (20,0 mg)

F313 (50,0 mg)

F232 (30,0 mg)

F231

Sắc ký điều chế TLC n-hexan-aceton (8:2)

34

Sắc ký điều chế TLC CH2Cl2 (100%) DS-3 (10,0 mg)

DS-1 (5,0 mg)

DS-2 (6,0 mg)

DS-4 (11,0 mg)

Sơ đồ 1: Quy trình phân lập hóa học lá cây Thị đài lá rộng

Từ 1,16 kg bột lá cây Thị đài lá rộng như sơ đồ 1: Các hợp chất DS-1 (5,0

mg) tương ứng với hiệu suất tách chiết từ bột lá là 0,43%; DS-2 (6,0 mg) tương

ứng với hiệu suất tách chiết từ bột lá là 0,52%; DS-3 (10,0 mg)tương ứng với

hiệu suất tách chiết từ bột lá là 0,86%; DS-4 (11,0 mg) tương ứng với hiệu suất

tách chiết từ bột lá là 0,95%.

35

3.1.2. Cấu trúc và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập

Hình 13: Các hợp chất naphthoquione DS-1 và DS-2 và triterpenoid DS-

3 và DS-4 phân lập từ lá của loài Thị Đài lá rộng

Hợp chất DS-1: Isodiospyrin Bột màu vàng; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, H ppm) và 13C-NMR (125

MHz, CDCl3, C ppm): Bảng 1.

Hợp chất DS-2: 8'-Hydroxyisodiospyrin Bột màu đỏ; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, H ppm) và 13C-NMR

(125MHz, CDCl3, C ppm): Bảng 2.

36

Hợp chất DS-3: Lupeol Tinh thể hình kim; đnc 208-210 oC; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, H

ppm) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, C ppm): Bảng 3.

Hợp chất DS-4: Betulin Tinh thể hình kim; đnc 251-252 oC; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, H ppm)

và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, C ppm): Bảng 4.

3.1.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp quang phổ

Hợp chất DS-1: Isodiospyrin

Hình 14: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-1

Hợp chất DS-1 được phân lập dưới dạng bột màu vàng. Phân tích TLC

cho thấy hợp chất này có Rf = 0,4 (n-hexane-acetone, 3:1, v/v). Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-1 xuất hiện peak ion giả phân tử m/z 357.0870 [M+H]+,

điều đó chứng minh rằng công thức phân tử của hợp chất DS-1 là C22H14O6. Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-1 cho phép xác định một naphthoquinone dạng dime

(Bảng 1), bao gồm 4 proton thuộc kiểu hệ spin AB nằm trong 2 vòng quinone

[H-2 (H 6,94, J = 10,5 Hz), H-3 (H 6,92, J = 10,5 Hz); H-2' (H 6,72, J = 10,5

Hz), H-3' (H 6,94, J = 10,5 Hz)] và 2 proton thơm singlet ở độ dịch chuyển H-8 (H 7,61) và H-6' (H 7,30) thuộc về hai vòng phenyl. Phổ 1H-NMR còn cho 4

37

tín hiệu singlet thuộc về 2 nhóm metyl [7-CH3 (H 2,01), 7'-CH3 (H 2,03)] và 2

nhóm hydroxyl [12-OH (H 12,05), 12'-OH (H 12,43)] liên kết trực tiếp với

vòng thơm: Hình 14.

Bảng 1: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất DS-1

STT DS-1 DS-1

STT

C H (J, Hz) C H (J, Hz)

1 184,4 7' 148,2

1' 184,9 121,4 7,61 (s) 8

2 139,6 6,94 (d, 10,5) 8' 130,3

2' 140,1 6,72 (d, 10,5) 9 128,6

3 137,7 6,92 (d, 10,5) 9' 128,8

3' 138,8 6,94 (d, 10,5) 10 113,2

4 190,1 10' 114,2

4' 190,3 2,01 (s) 7-CH3 20,4

5 158,6 2'-CH3

5' 162,0 2,03 (s) 7'-CH3 20,6

6 135,1 5-OH 12,05 (s)

6' 125,7 7,30 (s) 5'-OH 12,43 (s)

7 145,5 8'-OH

[M+H]+

38

Hình 15: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-1

Hình 16: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-1

39

Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-1 xuất hiện tín hiệu của 5 cacbon metin

thơm trong vùng trường thấp C 121,4-140,1 ppm, 10 cacbon bậc bốn trong vùng

C 113,2-162,0 ppm, 4 cacbon cacbonyl C 184,4-190,3 ppm và 2 cacbon metyl

7-CH3 (H 20,4) và 7'-CH3 (H 20,6).

Hình 17: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-1

Cấu trúc của hợp chất DS-1 còn được chứng minh bởi phổ hai chiều

HSQC và HMBC (Hình 17,18). Hai hệ vòng quinone có các tương tác HMBC

đặc trưng như H-3/C-1, C-2, C-4 và C-10, H-2'/C-1', C-9' và C-10', H-3'/C-1' và

C-3'. Trên hệ vòng phenyl, 2 nhóm OH liên kết trực tiếp cacbon C-5 và C-5' với

các tương tác HMBC 5-OH/C-5, C-6 và C-10, 5'-OH/C-5', C-6' và C-10', 2

nhóm metyl liên kết trực tiếp với cacbon C-7 và C-7' với các tương tác HMBC

quan trọng như 7-CH3/C-6, C-7 và C-8, 7'-CH3/C-6' và C-7'. Hai proton singlet

H-8 và H-6' có các tương tác HMBC đặc trưng như H-8/C-6 và C-10, H-8'/C-7'

và C-10'. Tương tác HMBC 7'-CH3/C-6 xác định một cầu nối giữa hai cacbon C-

6 và C-8' của hai hệ vòng naphthoquinone. So sánh với tài liệu tham khảo chúng

tôi xác định hợp chất DS-1 có tên là isodiospyrin [35-38].

40

Hình 18: Phổ HSQC của hợp chất DS-1

Hình 19: Phổ HMBC của hợp chất DS-1

41

Hợp chất DS-2: 8'-Hydroxyisodiospyrin

Hình 20: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-2

Hợp chất DS-2 được phân lập dưới dạng bột màu đỏ. Phân tích TLC cho

thấy hợp chất này có Rf = 0,6 (n-hexane-acetone, 5:1, v/v). Tương tự hợp chất DS-1, phổ 1H-NMR cho phép xác định hợp chất DS-2 là một naphthoquinone

dạng dime (Bảng 2). Trong đó 4 proton doublet (J = 10 Hz) thuộc về 2 hệ spin

AB tương ứng [hệ 1: H-2 (H 6,77), H-3 (H 6,94); hệ 2: H-6' (H 7,29), H-7' (H 7,28)]. Phổ 1H-NMR của hợp chất này còn có sự xuất hiện 4 tín hiệu singlet

trong vùng trường thấp thuộc về 1 nhóm metin thơm H-6 (H 7,30), và 3 nhóm

OH [5-OH (H 12,34), 5'-OH (H 12,31) và 8'-OH (H 12,66)], cũng như 2 tín

hiệu singlet nằm trong vùng trường cao thuộc về 2 nhóm metyl liên kết trực tiếp

với nhân thơm [7-CH3 (H 2,19), 2'-CH3 (H 1,86)].

42

Bảng 2: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất DS-2

DS-2 DS-2

STT STT

C H (J, Hz) C H (J, Hz)

129,7 7,28 (d, 10,0) 7' 1 184,9

8 127,1 1' 186,6

8' 158,8 2 139,7 6,77 (d, 10,0)

9 129,2 2' 147,3

9' 112,2 3 138,0 6,94 (d, 10,0)

10 114,0 3' 143,0

10' 112,1 4 190,1

4' 186,1 2,19 (s) 7-CH3 20,6

5 162,1 1,86 (s) 2'-CH3 13,4

5' 158,9 7'-CH3

6 125,7 7,30 (s) 5-OH 12,34 (s)

6' 129,7 7,29 (d, 10,0) 5'-OH 12,31 (s)

7 146,8 8'-OH 12,66 (s)

43

Hình 21: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-2

Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-2 cho phép xác định hợp chất này có 22

nguyên tử cacbon, bao gồm 5 nhóm metin thơm ở độ dịch chuyển hóa học H

125,7-139,7 ppm, 11 cacbon bậc bốn thơm ở độ dịch chuyển C 112,2-162,1

ppm, 4 cacbon cacbonyl [C-1 (C 184,9), C-4 (C 190,1), C-1' (C 186,6) và C-4'

(C 186,1)] và 2 nhóm metyl [7-CH3 (C 20,6), 2'-CH3 (C 13,4)].

44

Hình 22: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-2

Cấu trúc hợp chất DS-2 còn được khẳng định bởi dữ kiện phổ hai chiều

HSQC và HMBC (Hình 23,24). Trong đó, 2 nhân quinone đặc trưng với các

tương tác H-2/C-3 và C-4, H-3/C-1 và C-2, H-6'/C-8' và H-7'/C-5'. Proton thơm

H-6 có tương tác HMBC với C-8 và C-10. Các tương tác HMBC 5-OH/C-5, C-6

và C-10, 5'-OH/C-5', C-6' và C-10', 8-OH/C-7', C-8' và C-9' cho phép xác định

các nhóm OH liên kết với các cacbon C-5, C-5' và C-8'. Tương tự, các tương tác

HMBC 7-CH3/C-6, C-7 và C-8, 2'-CH3/C-1', C-2' và C-3' xác định vị trí của hai

nhóm metyl ở cacbon C-7 và C-2', đồng thời chứng minh vị trí tương đối giữa

hai đơn vị mono-naphthoquione (Hình 20). So sánh với tài liệu tham khảo, hợp

chất DS-2 được xác định là 8'-hydroxyisodiospyrin [39-42].

45

Hình 23: Phổ HSQC của hợp chất DS-2

46

Hình 24: Phổ HMBC của hợp chất DS-2

47

Hợp chất DS-3: Lupeol

Hình 25: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-3

Hợp chất DS-3 kết tủa dưới dạng tinh thể hình kim với điểm nóng chảy 208-210 oC. Kiểm tra bản mỏng TLC cho thấy hợp chất này hiện màu xanh với

thuốc thử Ce(SO4)2 với Rf = 0,8 (n-hexane-acetone, 6:1, v/v). Phổ ESI-MS (+) của hợp chất DS-3 xuất hiện peak ion giả phân tử m/z 409.3 [M-H2O+H]+, điều đó chứng minh rằng công thức phân tử của hợp chất DS-3 là C30H50O. Phổ 1H-

NMR của hợp chất DS-3 xuất hiện các tín hiệu singlet mở rộng của 7 nhóm

metyl H-23 (H 0,78), H-24 (H 0,97), H-25 (H 0,89), H-26 (H 1,10), H-27 (H

1,00), H-28 (H 0,85) và H-30 (H 1,69), trong đó nhóm metyl singlet ở H 1,69

cho thấy nhóm này liên kết với một nối đôi. Tín hiệu doublet-doublet ở độ dịch

chuyển H 3,15 (dd, 5,0, 11,5 Hz) thuộc về nhóm nguyên tử hydroxy metin ở vị trí cacbon carbinol C-3. Phổ 1H-NMR còn có sự xuất hiện tín hiệu của một

nhóm exo-metilene H2-29 [H 4,58 (dd, 1,0, 7,5) và H 4,70 (d, 2,5) và các tín

hiệu multiplet ở vùng trường cao thuộc về các nhóm metin và metilene bão hòa

(Bảng 3).

48

Bảng 3: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất

DS-3

DS-3 DS-3

STT STT

C H (J, Hz) C H (J, Hz)

40,1 16 36,7 1 1,41 (m) 1,50 (m)

28,0 17 44,1 - 2 0,97 (dd, 5,0, 9,0) 1,72 (m) 1,60 (m) 1,66 (m)

79,7 3,15 (dd, 5,0, 11,5) 18 49,5 1,42 (m) 3

39,9 - 19 48,5 2,42 (m) 4

56,8 0,72 (t, 9,5) 20 152,0 - 5

19,6 21 30,9 6

35,5 22 41,0 7 1,44 (m) 1,55 (m) 1,45 (m) 1,47 (m) 1,38 (m) 1,97 (m) 1,22 (m) 1,40 (m)

42,1 - 23 16,1 0,78 (s) 8

51,9 1,31 (t, 2,0) 24 28,6 0,97 (s) 9

10 38,3 - 25 16,7 0,89 (s)

11 22,1 26 16,6 1,10 (s)

12 26,5 27 15,0 1,00 (s) 1,27 (m) 1,44 (m) 1,14 (dd, 5,0, 13,0) 1,73 (m)

13 39,5 1,74 (m) 28 18,4 0,85 (s)

14 44,0 - 29 110,1 4,58 (dd, 1,0, 7,5) 4,70 (d, 2,5)

15 28,6 30 19,6 1,69 (s) 1,04 (m) 1,73 (m)

49

Hình 26: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-3

[M-H2O+H]+

50

Hình 27: Phổ ESI-MS (+) của hợp chất DS-3

Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-3 phù hợp với kết quả của phổ 1H-NMR,

xác định rằng hợp chất DS-3 là một triterpenoid khung lupane bao gồm 30

nguyên tử cacbon. Cacbon cacbinol C-3 trong dung môi đo phổ CD3OD được

tìm thấy ở độ dịch chuyển hóa học C 79,7 ppm. 7 Nhóm metyl có độ dịch

chuyển hóa học nằm trong vùng trường cao C 15,0-28,6 ppm, trong khi đó 2

olefinic cacbon xuất hiện ở vùng trường thấp với độ dịch chuyển là C-20 (C

152,0) và C-29 (C 110,1).

51

Hình 28: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-3

52

Cấu trúc của hợp chất DS-3 còn được chứng minh bằng dữ kiện phổ hai

chiều HSQC và HMBC (Hình 29,30), trong đó các nhóm metyl được xác định

liên kết trực tiếp với các nguyên tử cacbon C-4, C-8, C-10, C-14, C-17 và C-20

bởi các tương tác HMBC H-23/C-3 và C-4, H-24/C-3 và C-5, H-25/C-10, H-

26/C-8, H-27/C-14, H-28/C-17 và H-30/C-19 và C-20. Nhóm hydroxy duy nhất

liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon C-3 với các tương tác HMBC đặc trưng

như H-3/C-1 và C-5, H-1/C-3. Trên phổ HMBC, olefinic proton H-29 có tương

tác HMBC quan trọng với cacbon C-19. So sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất

DS-3 được xác định là một triterpenoid có tên là lupeol [43,44]. Hợp chất này

cho các hoạt tính tốt trong các nghiên cứu chống ung thư, tiểu đường, kháng

viêm, kháng khuẩn [45].

Hình 29: Phổ HSQC của hợp chất DS-3

53

Hình 30: Phổ HMBC của hợp chất DS-3

54

Hợp chất DS-4: Betulin

Hình 31: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-4

Hợp chất DS-4 kết tủa dưới dạng tinh thể hình kim với điểm nóng chảy 251-252 oC. Kiểm tra bản mỏng TLC cho thấy hợp chất này hiện màu xanh với

thuốc thử Ce(SO4)2 với Rf = 0,7 (n-hexane-acetone, 6:1, v/v). Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-4 xuất hiện peak ion giả phân tử m/z 443.3889 [M+H]+ và 425.3785 [M-H2O+H]+, điều đó chứng minh rằng công thức phân tử của hợp

chất DS-4 là C30H50O2.

55

Bảng 4: Dữ kiện 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất

DS-4

DS-4 DS-4

STT STT

C H (J, Hz) C H (J, Hz)

1 38,9 29,8 16 1,41 (m) 1,94 (m)

2 27,1 50,9 - 17 0,91 (dd, 4,0, 5,0) 1,69 (m) 1,55 (m) 1,63 (m)

3 79,0 3,18 (dd, 5,0, 11,5) 18 48,8 1,60 (m)

4 38,7 - 47,8 2,38 (dt, 5,5, 11,0) 19

5 55,3 0,68 (t, 9,0) 150,5 - 20

6 18,3 29,2 21 1,43 (m) 1,53 (m)

7 34,0 1,40 (m) 33,4 22 1,26 (m) 1,93 (m) 1,01 (m) 1,02 1,84 (dd, 1,0, 8,5)

8 40,9 - 28,0 0,76 (s) 23

9 50,4 1,29 (m) 15,4 0,96 (s) 24

10 37,2 - 16,0 0,82 (s) 25

11 20,8 16,1 1,07 (s) 26

12 25,2 14,8 0,98 (s) 27 1,25 (m) 1,44 (m) 1,18 (m) 1,67 (m)

13 37,3 1,68 (m) 60,6 28

14 42,7 - 109,7 29 3,34 (d, 10,5) 3,80 (dd, 1,5, 10,5) 4,58 (dd, 2,0, 8,5) 4,68 (d, 2,0)

15 27,4 19,1 1,68 (s) 30 1,06 (m) 1,71 (m)

[M-H2O+H]+

[M+H]+

56

Hình 32: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-4

Tương tự hợp chất DS-3, dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR cũng chứng

minh hợp chất DS-4 là một triterpenoid khung lupane. Trong phổ NMR một

chiều, 6 nhóm metyl có độ dịch chuyển hóa học lần lượt là H-23 (H 0,76)/C-23

(C 28,0), H-24 (H 0,96)/C-24 (C 15,4), H-25 (H 0,82)/C-25 (C 16,0), H-26

(H 1,07)/C-26 (C 16,1), H-27 (H 0,98)/C-27 (C 14,8), H-30 (H 1,68)/C-30 (C

19,1) tín hiệu doublet-doublet ở H 3,18 (dd, 5,0, 11,5) thuộc vể proton metin

của nhóm 3-CHOH cacbinol. Nhóm exo-metilene H2-29 được tìm thấy ở độ dịch

chuyển hóa học H 4,58 (dd, 2,0, 8,5) và H 4,68 (d, 2,0). Sự khác biệt giữa hợp

chất DS-3 và DS-4 được xác định rằng nhóm metyl ở vị trí cacbon C-28 của hợp

chất DS-3 được thay thế bởi nhóm hydroxyl metilene [H 3,34 (d, 10,5) và H

3,80 (dd, 1,5, 10,5)/ C 60,6] trong hợp chất DS-4 (Bảng 4). Cấu trúc hợp chất

này còn được khẳng định bởi dữ kiện phổ hai chiều HSQC và HMBC, tương tác

57

HMBC H-28/C-16, C-17 và C-22 cho phép xác định rằng nhóm hydroxyl

metilene liên kết trực tiếp với cacbon C-17. So sánh với tài liệu tham khảo, hợp

chất DS-4 được xác định có tên là betulin [46-48], một triterpenoid được tìm

thấy ở nhiều loài thực vật bậc cao với nhiều hoạt tính đặc biệt là hoạt tính chống

tiểu đường [49].

Hình 33: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-4

58

Hình 34: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-4

59

Hình 35: Phổ HSQC của hợp chất DS-4

60

Hình 36: Phổ HMBC của hợp chất DS-4

61

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHO CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP

Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ban đầu cho cao chiết EtOAc và 4 hợp chất

phân lập được, chúng tôi nhận thấy rằng cao chiết EtOAc và hai naphthoquinone

DS-1 (isodiospyrin) và DS-2 (8'-hydroxyisodiospyrin) có tác dụng lên các dòng

tế bào ung thư thử nghiệm, trong khi đó 2 triterpnoid DS-3 (lupeol) và DS-4

(betulin) lại thể hiện hoạt tính tốt trong phép thử ức chế enzyme alpha-

glucosidase. Chính vì lý do này, cao chiết tổng EtOAc và 2 napthoquinone được

dùng cho thí nghiệm gây độc tế bào, 2 triterpenoid còn lại dùng cho thí nghiệm

chống tiểu đường ức chế enzyme alpha-glucosidase.

3.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC được dùng

cho thí nghiệm này là ung thư biểu mô KB (human epidermic carcinoma) (CCL -17TM), ung thư gan Hep-G2 (hepatocellular carcinoma) (HB - 8065TM), ung

thư phổi LU (human lung carcinoma) (HTB - 57TM) và ung thư vú MCF-7

(human breast carcinoma) (HTB - 22TM).

Phương pháp thử độ độc tế bào: Được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm

hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Như đã mô tả ở

Chương 2, trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng phương pháp MTT cho việc

đánh giá mức độ sống sót của 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Dòng tế bào

được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh

dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) có bổ sung 7-10%

FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác. Tế bào được

nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37°C, vô

trùng tuyệt đối). Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.

Kết quả được trình bày ở Bảng 5.

62

Bảng 5: Kết quả gây độc tế bào ung thư của các hợp chất thử nghiệm

Ph n trăm ức chế

STT Nồng độ

KB Hep-G2 Lu MCF7

128 90,2 86,6 85,2 86,6

32 77,4 53,2 40,0 35,8

8 37,2 21,0 26,6 11,0

Cao chiết EtOAc (µg/mL)

2 13,1 4,0 7,4 7,5

15,8±1,2 29,75±2,5 53,33±3,14 60,23±7,12 IC50

128 (µg/mL) 88,0 85,5 88,4 79,6

32 62,7 50,0 30,9 34,6

8 37,0 20,7 23,0 29,4 DS-1 MW=374

2 20,5 16,5 15,2 19,2

20,48±1,5 32,0±2,32 65,1±4,0 66,13±4,15 IC50 (µM)

90,4 92,02 84,5 128 (µg/mL) 88,6

32 82,3 81,7 77,0 50,0

8 79,6 50,0 33,5 34,2 DS-2 MW=390

2 46,5 43,0 14,1 24,0

2,27±0.4 8,0±0.58 17,27±1,85 32,0±3,05 IC50 (µM)

1,26 1,56 1,67 2,19 Ellipticine IC50 (µM)

63

Các hợp chất naphthoquinone từ chi Diospyros được biết đến như các tác

nhân gây độc tế bào ung thư tiềm năng. Ví dụ điển hình như, plumbagin và 3,3'-

biplumbagin cho các giá trị IC50 lần lượt là 130,8 và 82,1 µM trong việc ức chế

sự phát triển dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 [50]. Trong thí nghiệm này,

cao chiết EtOAc từ lá cây Thị đài lá rộng thu hái tại Thanh Hóa cho giá trị IC50 ở

mức độ trung bình, lần lượt là 15,8±1,2 và 29,75±2,5 µg/mL trong việc ức chế

hai dòng tế bào KB và Hep-G2, nhưng cho hoạt tính yếu đối với hai dòng tế bào

ung thư Lu và MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 53,33±3,14 và 60,23±7,12

µg/mL. Hợp chất DS-1 cho giá trị IC50 ở mức độ trung bình được tìm thấy với

hai dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 là 20,48±1,5 và 32,0±2,32 µM, nhưng

hoạt tính yếu với hai dòng tế bào ung thư còn lại với giá trị IC50 lần lượt là

65,1±4,0 và 66,13±4,15 µM. Đặc biệt hơn cả, hợp chất DS-2 cho kết quả tốt. Ở

nồng độ 128 µg/mL, hợp chất này ức chế sự phát triển cả 4 dòng tế bào ung thư

với giá trị phần trăm ức chế lớn hơn 84%. Naphtoquinone DS-2 cho giá trị IC50

mạnh là 2,27±0.4 µM đối với việc ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư biểu

mô KB, và giá trị IC50 trong khoảng 8,0±0.58-32,0±3,05 µM đối với 3 dòng tế

bào ung thư thử nghiệm còn lại. Kết quả nghiên cứu này khá tương đồng nghiên

cứu về Thị Đợn - Diospyros undulata với hợp chất maritinone cho giá trị IC50

mạnh là 2,57 và 3,02 µM đối với việc ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư

biểu mô KB và ung thư vú MCF7 [23]. Như vậy, kết quả nghiên cứu đưa ra kết

quả khá tương đồng với các nghiên cứu về chi Thị.

Dựa trên kết quả luận văn chúng tôi đã xuất bản ra một bài báo: “Nguyen Thi Thu Ha, Pham Van Cuong, Nguyen Thanh Tra, Nguyen Van Tuyen, Le Thi Tu Anh, Ba Thi Cham, Ha Huy Tung, Ninh The Son, Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros fleuryana leaves, Discovery Phytomedicine 2020, Volume 7, 42-46. doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117”.

64

3.2.2. Hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase

Enzyme alpha-glucosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy

phân carbohydrate tạo glucose trong cơ thể. Do đó, các chất ức chế alpha-

glucosidase có thể làm chậm quá trình giải phóng và hấp thụ glucose, qua đó

không làm tăng đường huyết sau ăn. Dưới tác dụng của enzyme alpha-

glucosidase cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside bị phân cắt qua đó giải

phóng sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng.

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme alpha-glucosidase được

thực hiện trên đĩa 96 giếng với tổng thể tích phản ứng là 200 µL/giếng.

Hai hợp chất triterpenoid DS-3 và DS-4 được pha loãng bằng DMSO

100% thành dải các nồng độ 256, 64, 16, 4, 1 mg/mL. Acarbose được sử dụng

làm chất tham khảo. Các thành phần phản ứng bao gồm: Phosphate buffer 100

mM pH 6,8 (40 µL), alpha-glucosidase 0,4 U/mL (25 µL), mẫu thử (10 µL), p-

nitrophenyl α-D-glucopyranoside 2,5 mM (25 µL).

Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm

được ủ ở nhiệt độ 37 ºC. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3.

Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410

nm (A). Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Bảng 6. Kết quả cho thấy

tương đồng với hợp chất myricitrin cho phần trăm việc ức chế hoạt động của

enzyme alpha-glucosidase lên đến 98,07%, so với chất tham khảo acarbose là

83,03% [29]. Trong khi một số chất ức chế a- glucosidase như Acarbose và

Miglitol đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị tiểu đường type 2.

65

Bảng 6: Phần trăm ức chế enzyme alpha-glucosidase của các hợp chất thử

nghiệm

STT Nồng độ Ph n trăm ức chế

256 (µg/mL) 89.0

64 77.5

16 58.3

4 44.78 DS-3 MW=427

1 32.8

9,14 IC50 (µg/mL)

21,4±1,8 IC50 (µM)

256 (µg/mL) 90.2

64 84.7

16 68.0

4 45.0 DS-4 MW=443

1 19.3

6,61 IC50 (µg/mL)

14,9±0.92 IC50 (µM)

248,06±15.52 Acarbose IC50 (µM)

Kết quả Bảng 6 cho thấy cả hai hợp chất triterpenoid đều cho kết quả tốt

trong việc ức chế hoạt động của enzyme alpha-glucosidase. Ở nồng độ 256

µg/mL, cả DS-3 và DS-4 ức chế tới 90%, trong khi đó ở dải nồng độ thấp hơn 4

66

- 16 µg/mL, phần trăm ức chế của cả hai hợp chất cũng đạt trung bình 60%. Giá

trị IC50 của triterpenoid betulin DS-4 đạt 14,9±0.92 µM, so với giá trị này của

lupeol DS-3 là 21,4±1,8 µM. Điều này xác định rằng việc thay thế nhóm metyl ở

vị trí cacbon 17 trong hợp chất DS-3 bằng nhóm hydroxyl metilene trong hợp

chất DS-4 là nguyên nhân chính cho sự khác nhau này. Ngoài ra, cả hai hợp chất

thử nghiệm đều cho giá trị IC50 thấp hơn so với chất tham khảo acarbose (IC50

248,06±15.52 µM). Từ kết quả nghiên cứu này, định hướng cho việc sử dụng

các hợp chất thuộc lớp chất triterpenoid từ chi Thị - Diospyros trong việc hỗ trợ

phòng và điều trị bệnh tiểu đường.

67

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Đã phân tách và xác định được cấu trúc hai hợp chất napthoquinone là isodiospyrin (DS-1) và 8'-hydroxyisodiospyrin (DS-2) và hai hợp chất triterpenoid là lupeol (DS-3) và betulin (DS-4) từ cao chiết EtOAc của cây Thị đài lá rộng.

Cao chiết EtOAc và hai hợp chất napthoquinone isodiospyrin và 8'- hydroxyisodiospyrin có tác dụng ức chế gây độc tế bào ung thư, đặc biệt hợp chất 8'-hydroxyisodiospyrin có hoạt tính tốt trên hai dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 với giá trị IC50 lần lượt là 2,27±0.4và 8,0±0.58 µM.

Hai hợp chất triterpenoid lupeol và betulin kìm hãm tốt hoạt động của enzyme alpha-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 21,4±1,8 và 14,9±0.92 µM.

4.2. KIẾN NGHỊ

Tiếp tục phân tách và xác định cấu trúc các hợp chất ở các phân đoạn còn

lại của cao chiết EtOAc cũng như cao chiêt MeOH của lá cây Thị đài lá rộng.

Hai hợp chất triterpenoid DS-3 và DS-4 có khả năng ức chế sự hoạt động enzyme alpha-glucosidase, đem lại giá trị tiềm năng to lớn trong việc sử dụng các hợp chất này trong việc phòng và điều trị bệnh tiểu đường, cần tiếp tục có các nghiên cứu sâu hơn về mặt cơ chế tác dụng của chúng.

68

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abdur R, Ghias U, Seema P, Ajmal K, Sobia AH, Saud B, Khalid A, Naveed

M, Mohammad SM, Diospyros, an under-utilized, multi-purpose plant

genus: A review, Biomedicine & Pharmacotherapy, 91 (2017) 714-730.

2. Sinha BN, Bansal SK, A review of phytochemical and biological studies of

Diospyros species used in folklore medicine of Jharkhand, Journal of

Natural Remedies, 8 (2008) 11-17.

3. Chunyan X, Zhishen X, Xinjun X, Depo Y, Persimmon (Diospyros kaki L.)

leaves: a review on traditional uses, phytochemistry and pharmacological

properties, Journal of Ethnopharmacology, 2 (2015) 229-240.

4. Shun WH, Jin WQ, Xue S, Pin YG, Ling ZL, Qing BL, Bei S, De LW, Shao

JS, Secoiridoids and lignans from the leaves of Diospyros kaki Thunb. with

antioxidant and neuroprotective activities, Journal of Functional Foods, 24

(2016) 183-195.

5. Nathalie SJT, Carine MA, Gervais MH, Marcel F, Hans-Georg S, Beate N,

Bruno NL, Norbert S, Augustin EN, Antioxidant norbergenin derivatives

from the leaves of Diospyros gilletii De Wild (Ebenaceae), Phytochemistry

Letters, 36 (2020) 63-67

6. Cesari I, Hoerle M, Simoes-Pires C, Grisoli P, Queiroz EF, Dacarro C,

Marcourt L, Moundipa PF, Carrupt PA, Cuendet M, Caccialanza G,

Wolfender JL, Brusotti G Anti-inflammatory, antimicrobial and antioxidant

activities of Diospyros bipindensis (Gurke) extracts and its main constituents,

Journal of Ethnopharmacology, 146 (2013) 264-270.

7. Trongsakul S, Panthong A, Kanjanapothi D, Taesotikul T, The analgesic,

antipyretic and anti-inflflammatory activity of Diospyros variegata Kruz,

Journal of Ethnopharmacology, 85 (2003) 221-225.

69

8. Uddin G, Rauf A, Siddiqui BS, Muhammad N, Khan A, Shah SUA, Anti-

nociceptive, anti-inflammatory and sedative activities of the extracts and

chemical constituents of Diospyros lotus L, Phytomedicine 21 (2014) 954-

959.

9. Baravalia Y, Kaneria M, Yaghasiya Y, Parekh J, Chanda S, Antioxidant and

antibacterial activity of Diospyros ebenum roxb. leaf extracts, Turkey

Journal of Biology, 33 (2009) 159-164.

10. Rao LR, Rao CS, SundarRaMaiah T, The chemical examination of

Diospyros species, Current Science, 35 (1966) 457-459.

11. Gupta RK, Mahadevan V, Chemical examination of the heartwood of

Diospyros ebenum, Indian Journal of Pharmacology, 29 (1967) 289-293.

12. Sidhu GS, Sankaram AV, Ali SM, Extractives from Diospyros species. 3.

New naphthaquinone and naphthols from heartwood of Diospyros

melanoxylon Roxb, Indian Journal of Chemistry 6 (1968) 681-685.

13. Lajubutu BA, Pinney RJ, Roberts MF, Odelola HA, Oso BA, Antibacterial

activity of diosquinone and plumbagin from the root of Diospyros

mespiliformis (Hostch) (Ebenaceae), Phytotherapy Research, 9 (1995) 346-

350.

14. Ganapaty S, Steve Thomas P, Karagianis G, Waterman PG, Brun R,

Antiprotozoal and cytotoxic naphthalene derivatives from Diospyros

assimilis, Phytochemistry, 67 (2006) 1950-1956.

15. Cai L, Wei G.X., Van der Bijl P, Wu CD, Namibian chewing stick,

Diospyros lycioides, contains antibacterial compounds against oral

pathogens, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48 (2000) 909-914.

16. Peyrat LA, Eparvier V, Eydoux C, Guillemot JC, Stien D, Litaudon M,

Chemical diversity and antiviral potential in the pantropical Diospyros genus,

Fitoterapia 112 (2016) 9-15.

70

17. Hazra S, Ghosh S, Sarma DM, Sharma S, Das M, Saudagar P, Prajapati VK,

Dubey VK, Sundar S, Hazra B, Evaluation of a diospyrin derivative as anti-

leishmanial agent and potential modulator of ornithine decarboxylase of

Leishmania donovani, Experimental Parasitology. 135 (2013) 407-413.

18. Kameda K, Takaku T, Okuda H, Kimura Y, Inhibitory effects of various

flavonoids isolated from enzyme activity leaves of Persimmon on

angiotensin converting enzyme activity, Journal of Natural Products, 50

(1987) 680-683.

19. Belemtougri RG, Constantin B, Cognard C, Raymond G, Sawadogo L,

Effects of two medicinal plants Psidium guajava L. (Myrtaceae)

and Diospyros mespiliformis L. (Ebenaceae) leaf extracts on rat skeletal

muscle cells in primary culture, Journal of Zhejiang University Science B, 7

(2006) 56-63.

20. Fatemeh F, Shaghayegh T, Vahid RA, Elham A, Hamid RS, Protective effect

of Diospyros kaki against glucose oxygen serum deprivation induced PC12

cells injury, Advances in Pharmacological and Pharmaceutical

Sciences, 2016 (2016) ID 3073078, 5 pages

21. Weijian B, Wenlie P, Linquan Z, Zhiyong X, Dehui H, Anlong X,

Neuroprotective effects of a standardized extract of Diospyros kaki leaves on

MCAO transient focal cerebral ischemic rats and cultured neurons injured by

glutamate or hypoxia, Planta Medica, 73 (2007) 636-643.

22. Mainen JM, Pax JM, Ramadhani SON, Zakaria HM, Modest CK, Makuru M,

Fikira K, Anticonvulsant activity of extracts of Diospyros Fischeri stem bark,

African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 4

(2007) 94-98.

71

23. Natcha PS, Nattawut S, Kwanjai K, Kitisak P, Panawan M, Somdej K, Two

new naphthalenones from Diospyros undulata stem bark and their cytotoxic

activity, Phytochemistry Letters, 24 (2018) 132-135.

24. Hyeonseok K, Gyuwonh H, Sang HJ, Hyukjoon K, Youngsic J, Young NP,

Young JK, Diospyros kaki leaves inhibit HGF/Met signaling-mediated EMT

and stemness features in hepatocellular carcinoma, Food and Chemical

Toxicology, 142 (2020) 111475.

25. Sunil S, Mandeep K, Kenneth PM, Vladimir BB, Anti-cancer activities of

diospyrin, its derivatives and analogues, European Journal of Medicinal

Chemistry, 45 (2010) 3519-3530.

26. Samir D, Shalini J, Hariom Y. Exotic fruits as therapeutic complements for

diabetes, obesity and metabolic syndrome, Food Research International, 47

(2011) 1856-1865.

27. Saikat D, Anup M, Ranabir S, Tarun KD, Vivekananda M, Effective control

of type 2 diabetes through antioxidant defense by edible fruits of Diospyros

peregrina, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011

(2011) ID 675397, 7 pages.

28. Kyoung YL, Ju YJ, Mee YL, Dayoung J, Eun SC, Hwa YS, Diospyros

blancoi attenuates asthmatic effects in a mouse model of airway

inflammation, Inflammation, 35 (2012) 623-632.

29. Sang JK, Ji AK, Da HK, Seol HK, Kang YY, Seon J, Seon-Young K,

SeungJ, Bio-assay guided isolation and identification of α-glucosidase

inhibitors from the leaves of Diospyros lotus, Korean Journal of

Pharmacognosy, 46 (2015) 105-108

30. Anil KS, Tek CS, Ruchi S, Pratibha P, Rajnish G, Mahesh CS, A novel

compound lup-20 (29)-ene-3α,6β-diol identified in petroleum ether extract

72

of Diospyros melanoxylon Roxb. leaves and to reveal its antidiabetic activity

in Rats, Pharmacognosy Magazine, 14 (2018) S245-S248.

31. Phạm Hoàng Hộ, Cây Cỏ Việt Nam, Nhà Xuất Bản Trẻ, Tập 1 (2003) 641-

659.

32. WWW.Caycanhhaidang.com/Cay Thi Canh.

33. Phạm Thị Ninh, Huỳnh Thị Kim Mỹ, Trần Thị Phương Thảo, Nghiên cứu

thành phần hóa học của lá và vỏ cây thị (Diospyros decandra) thu hái tại

tỉnh Hưng Yên, Việt Nam, Tạp Chí Hóa Học, 56 (2018) 65-69.

34. Lê Thị Xoan, Phí Thị Xuyên, Nguyễn Thị Thùy Dương, Phạm Thị Nguyệt

Hằng, Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of some

Vietnamese medicinal plants, Vietnam Journal of Science, Technology and

Engineering, 62 (2020) 77-82.

35. Seru G, Pannakal Steve T, Serge F, Hartmut L Antitermitic quinones from

Diospyros sylvatica, Phytochemistry 65 (2004) 1265-1271.

36. Kunitoshi Y, Michiko T, Shinsaku N, Naphthoquinone derivatives from the Ebenaceae. II1) Isodiospyrin, bisisodiospyrin, and mamegakinone from

Diospyros lotus L. and D. morrisiana Hance, Chem Pharm Bull, 19 (1971)

2308-2313.

37. BA, Fong HHS, Pezzuto JM, Luyengi L, Odelola HA, Antibacterial

activity of diospyrin, isodiospyrin and bisisodiospyrin from the root

of Diospyros piscatoria (Gurke) (Ebenaceae), Phytotherapy Research 14

(2000) 112-117.

38. Chun YT, Chia TH, Hsiang-Ting H, Jin-Shan S, Tzong-Yueh C, Woan-Yuh

T, Yao-Haur K, Jacqueline WP, Leroy FL, Jaulang H, Isodiospyrin as a

novel human DNA topoisomerase I inhibitor, Biochemical Pharmacology 66

(2003) 1981-1991.

73

39. Ganapaty S, Thomas PS, Karagianis G, Waterman PG, Brun R,

Antiprotozoal and cytotoxic naphthalene derivatives from Diospyros

assimilis, Phytochemistry 67 (2006) 1950-1956.

40. Abdur R, Ghias U, Noor J, Zarka A, Mohamed FR, Haroon K, Alia B, Taibi

BH, Mumtaz A, Bioassay guided isolation of antioxidants from Diospyros

lotus roots, Chemistry of Natural Compounds, 53 (2017) 946-948.

41. Abdur R, Ghias U, Haroon K, Mohammad A, Bina SS, Bioassay-guided

isolation of antibacterial constituents from Diospyros lotus roots, Natural

Products Research, 30 (2016) 426-428.

42. Dev MJA, Rajrajeshwari N, Phytoconstituents isolated from Diospyros

oocarpa Thwatist, Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical

Sciences, 3 (2013) 50-54.

43. Bulus A, Ben AC, Florence DT, Oluwakanyinsola AS, Ogbaji JI, Isolation

and analgesic property of lupeol from Diospyros mespiliformis stem bark,

Journal of Medicinal Plants Research, 9 (2015) 813-819.

44. Kedar R, Rajesh S, Sagar M, Simultaneous quantification of two bioactive

lupane triterpenoids from Diospyros melanoxylon stem bark, Journal of

Planar Chromatography - Modern TLC, 24 (2011) 376-380.

45. Gallo MBC, Sarachine MJ, Biological activities of lupeol, International

Journal of Biomedical and Pharmaceutical Science, 3 (2009) 46-66.

46. Jeffrey JAD, Zakaria MB, Waterman PG, 3′-methoxydiospyrin, a 7-

methyljuglone dimer from diospyros mannii, Phytochemistry, 22 (1983)

1832-1833.

47. Chien-Chih C, His-Jung Y, Jun-Chih O, Tzu-Ming P, Constituents of the

heartwood of Diospyros Eriantha, Journal of The Chinese Chemical Society,

41 (1994) 195-198.

74

48. Kuo YH, Chang CI, Kuo YH, Triterpenes from Diospyros maritima,

Phytochemistry, 46 (1997) 1135-1137.

49. Sylwia KK, Michał K, Adolfo RM, Andrzej S, Comprehensive review on

betulin as a potent anticancer agent, BioMed Research International, 2015

(2015) ID 584189, 11 pages.

50. Aronsson P, Munissi JJE, Gruhonjic A, Fitzpatrick PA, Landberg G,

Nyandoro SS, Erdelyi M. Phytoconstituents with radical scavenging and

cytotoxic activities from Diospyros shimbaensis. Diseases 4 (2016) 3, 9

pages.

51. Khan RM, Rwekika E. Một binaphthoquinone từ Diospyros greeniwayi .

Phương pháp hóa học 1998; 49: 2501-2503.

52. Thomson, R. H., Naturally Occurring Quinones, 2nd edn. Academic Press,

London, New York, 1971.

53. Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, Phương pháp nghiên cứu hóa học

cây thuốc, NXB. Y học, TP. Hồ Chí Minh, 1985.

54. Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan và Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích

môi trường, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, NXB. Nông nghiệp, Hà Nội,

2008, trang 49-59.

55. Nguyễn Đình Triệu, Bài tập và thực tập các phương pháp phổ, NXB Đại học

Quốc gia Hà Nội, 2001.

56. Phạm Luận, Phương pháp phân tích phổ nguyên tử, NXB ĐH Quốc gia Hà

Nội, 2006.

57. Fresney R.I (1993): Culture of animal Cells; John Wiley & Sons Inc., New

York. A manual of basis techniques, 3rd Edition

58. Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Kenneth D.P., Monks A., Tierney S.,

Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D., Boyd M.R. (1988) Evaluation of a

soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in

75

culture using human and other tumor cell lines. Cancer Reseach. 48: 4827-

4833.

59. Kim Y. M., Wang M. H., Rhee H. I. (2004), “A novel a-glucosidase

inhibitor from pine bark”, Carbohydr. Res., 339, 715–717.

60. Li T., Zhang X. D., Song Y. W., Liu J. W. (2005), “A Microplate-Based

Screening Method for a-Glucosidase Inhibitors”, Nat. Prod. Res. Dev., 10,

1128–1134.

61. Haimin Chen, Xiaojun Yan, Wei Lin, Li Zheng, Weiwei Zhang (2004), “A

New Method for Screening a-Glucosidase Inhibitors and Application to

Marine Microorganisms”, Pharmaceutical Biology, 42(6), 416–421.

62. Hakamata W, Kurihara M, Okuda H, Nishio T, Oku T. (2009), “Design and

screening strategies for alpha-glucosidase inhibitors based on enzymological

information”, Curr. Top. Med. Chem., 9(1),3-12.

76

[M+H]+

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-1

77

Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-1

78

Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-1

79

Phụ lục 4: Phổ HSQC của hợp chất DS-1

80

Phụ lục 5: Phổ HMBC của hợp chất DS-1

81

Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-2

82

Phụ lục 7: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-2

83

Phụ lục 8: Phổ HSQC của hợp chất DS-2

84

Phụ lục 9: Phổ HMBC của hợp chất DS-2

[M-H2O+H]+

85

Phụ lục 10: Phổ ESI-MS (+) của hợp chất DS-3

86

Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-3

87

Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-3

88

Phụ lục 13: Phổ HSQC của hợp chất DS-3

89

Phụ lục 14: Phổ HMBC của hợp chất DS-3

[M-H2O+H]+

[M+H]+

90

Phụ lục 15: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-4

91

Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR của hợp chất DS-4

92

Phụ lục 17: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-4

93

Phụ lục 18: Phổ HSQC của hợp chất DS-4

94

Phụ lục 19: Phổ HMBC của hợp chất DS-4

ORIGINAL ARTICLE

Discovery Phytomedicine 2020, Volume 7, Number 1: 42-46

Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros fleuryana leaves

Original Article

CrossMark

Doi: Discovery Phytomedicine.2020.117

Nguyen Thi Thu Ha,1,2 Pham Van Cuong,3 Nguyen Thanh Tra,1,2 Nguyen Van Tuyen,1,2 Le Thi Tu Anh,1 Ba Thi Cham,1 Ha Huy Tung,2 Ninh The Son1,*

ABSTRACT

Volume No.: 7

Issue: 1

isolation of two naphthoquinones

In the search for anti-cancer plants in Vietnam, the leaves of Diospyros fleuryana were selected for chemical investigation. Phytochemical analysis of the ethyl acetate (EtOAc) extract led isodiospyrin,1 and to the 8’-hydroxyisodiospyrin,2 and one isoflavone 7-O-methylbiochanin A.3 The chemical structures of isolated compounds were determined

by 1D-NMR (1H, and 13C-NMR), 2D-NMR spectra (HSQC, and HMBC), and MS spectroscopy. Compound 3 was isolated from genus Diospyros for the first time. Regarding the strong IC50 values of 2.27, and 8.0 µM against KB, and Hep cell lines respectively, cytotoxic examination suggested that compound 2 is a promising agent in anti-cancer treatment.

First page No.: 42

Keywords: Diospyros fleuryana; naphthoquinone; isoflavone, cytotoxicity

RH_Author: XXX

INTRODUCTION

RESULT AND DISCUSSION

From EtOAc extract of leaves, two naphthoqui- nones 1-2, and one isoflavone 3 were isolated from D. fleuryana species for the first time, and their chemical structures are discussed in detail.

*Correspondence to: Ninh The Son (Ph.D): Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST); 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam. yamantson@gmail.com

Cite This Article: Ha, N.T.T., Cuong, P.V., Tra, N.T., Tuyen, N.V., Anh, L.T.T., Cham, B.T., Tung, H.H., Son, N.T. 2020. Cytotoxic naphthoqui- nones from Diospyros fleuryana leaves. Discovery Phytomedicine 7(1): 42-46. DOI:10.15562/ phytomedicine.2019.117

anti-inflammatory,

Genus Diospyros belongs to the family Ebanaceae, comprising of about 500 species and widely distrib- uted in tropical and subtropical regions.1 As a rich resource of active compositions, the plants of this genus are always seeking in both phyto- chemical and pharmacological aspects. A diver- sity of isolated metabolites such as polyphenols, terpenoids, hydrocarbons, lipids, benzopyrones, especially naphthoquinones has been reported.2 In the meantime, in-vitro, in-vivo, and clinical studies dealt with the uses of Diospyros extracts, as well as their isolated compounds in treating anti-oxidant, anti-diabetic, anti-bacterial, anti-oxidant, anti-hy- pertensive, cosmeceutical, enzyme-inhibitory, cardioprotective and neuropro- tective activities.2

In Vietnam, D. fleuryana species, also known as Thi Dai La Rong, is now available from Thanhhoa to Nhatrang, and Tayninh.3 To the best of our knowledge, there have not been studies on chem- ical composition and biological activity for D. fleu- ryana species. With the deepest aim to search for potentially bioactive compounds from Vietnamese plants,4-12 we herein reported the chromatographic isolation, and structural elucidation of two naph- thoquinones 1-2, and one isoflavone 3, together with their cytotoxic assay on four cancer lines KB, Hep, Lu, and MCF7.

Compound 1 was isolated as a yellow amor- phous powder. The molecular formula of 1 was determined to be C22H14O6, based on the quasi-mo- lecular ion peak observed at m/z 375.0 [M+H]+ in the positive ESI-MS spectrum. The 1HNMR spectrum of compound 1 showed characteristics of a dimeric naphthoquinones (Table 1), in which each monomeric part included 3 proton signals [2  doublet protons H-2 (dH 6.94, 10.5 Hz) and H-3 (dH 6.92, 10.5 Hz), and 1 singlet proton H-8 (dH 7.61); 2 doublet protons H-2’ (dH 6.72, 10.5 Hz) and H-3’ (dH 6.94, 10.5 Hz), and 1 singlet proton H-6’ (dH 7.30)]. The 1HNMR spectrum in CDCl3 was also composed of 2 methyl groups [7-CH3 (dH 2.01, s) and 7’-CH3 (dH 2.03, s)] in upfield, and 2 hydroxy groups [5-OH (dH 12.05, s) and 5’-OH (dH 12.43, s)] in downfield. The 13CNMR spectrum of compound 1 featured 22 carbon signals assign- able to 2 methyl carbons (dC 20.4 and 20.6 ppm) 6 methine carbons (dC 121.4-140.1), 10 aromatic quaternary carbons (dC 113.2-162.0), and 4 carbonyl carbons (dC 184.4-190.3). The chemical structure of compound 1 was further confirmed by 2D-NMR spectroscopies (HSQC and HMBC). As shown in

1Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST), 18 Hoang Quoc Viet, Caugiay, Hanoi, Vietnam 2Graduate University of Sciences and Technology, VAST 3Institute of Marine Biochemistry, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST), 18 Hoang Quoc Viet, Caugiay, Hanoi, Vietnam

www.phytomedicine.ejournals.ca

42 Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46. doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117

Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros ...

Nguyen Thi Thu Ha, et al.

Table 1

1H (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of compounds 1-2 in CDCl3

Compound 1

Compound 2

Position

dH (J in Hz)

dH (J in Hz)

dC

dC

184.4

184.9

1

184.9

186.6

1’

139.6

139.7

6.94 (d, 10.5)

6.77 (d, 10.0)

2

140.1

147.3

6.72 (d, 10.5)

2’

137.7

138.0

6.92 (d, 10.5)

6.94 (d, 10.0)

3

138.8

143.0

6.94 (d, 10.5)

3’

190.1

190.1

4

190.3

186.1

4’

158.6

162.1

5

162.0

158.9

5’

135.1

125.7

7.30 (overlap)

6

125.7

129.7

7.30 (s)

7.28 (overlap)

6’

145.5

146.8

7

148.2

129.7

7.28 (overlap)

7’

121.4

127.1

7.61 (s)

8

130.3

158.8

8’

128.6

129.2

9

128.8

112.2

9’

113.2

114.0

10

114.2

112.1

10’

20.4

20.6

2.01 (s)

2.19 (s)

20.6

13.4

2.03 (s)

1.86 (s)

12.05 (s)

12.34 (s)

7-CH3 7’-CH3 5-OH

12.43 (s)

12.31 (s)

5’-OH

12.66 (s)

8’-OH

Table 2

1H (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of compound 3 in CD3OD

Compound 3

δc

Position

dH (J in Hz)

1

155.0

8.11 (s)

2

124.5

3

182.2

4

Figure 1, naphtholquinone nuclei were established due to the key HMBC correlations H-3/C-1, C-2, C-4, and C-10, H-6/C-8, and C-10; H-2’/C-4’, C-9’, and C-10’, and H-3’/C-1’, and C-3’, H-6’/C-8’, and C-10’. Hydroxy groups located at carbons C-5 and C-5’ because of HMBC correlations 5-OH/C-5, C-6, and C-10; 5’-OH/C-5’, C-6’, and C-10’. HMBC correlations 7-CH3/C-7, and 7’-CH3/C-7’ allowed to determine the position of 2 methyl groups at carbons C-7, and C-7’, respectively. Finally, the key HMBC cross peak between 7’-CH3/C-6 indicated that two monomeric units connected through C-6–C-8’ bridge. From the above findings and comparison with literature, compound 1 was to be a dimeric naphtholquinone, named isodiospyrin.13 Compound 2 was obtained as a red amorphous powder. Its molecular formula was found to be C22H14O7 from the positive ESIMS quasi-molec- ular ion peak at m/z 391.0 [M+H]+. The 1HNMR spectrum of compound 2 (in CDCl3) revealed the similar pattern of compound 1, with remarkable resonance signals of naphthoquinone nuclei at [H-2 (dH 6.77, d, 10.0 Hz), H-3 (dH 6.94, d, 10.0 Hz), and H-6 (dH 7.30, overlap); H-6’ and H-7’ (dH 7.28, over- lap)], hydroxyl singlet signals at 5-OH (dH 12.34), 5’-OH (dH 12.31), and 8’-OH (dH 12.66), methyl singlet signals at 7-CH3 (dH 2.19), and 2’-CH3 (dH 1.86). The 13CNMR spectrum of compound 2 contained 22 carbon signals, including 2 methyl carbons, 5 methine carbons, 11 aromatic quater- nary carbons, and 4 carbonyl carbons (Table  1). The chemical structure of compound 2 was also determined by 2D-NMR spectra (HSQC and HMBC). Naphthoquinone nuclei have associated with the key HMBC correlations H-2/C-3, and C-4, H-3/C-1, and C-2, H-6/C-8, and C-10, H-6’/C-8’, and H-7’/C-5’; three hydroxy groups substituted at carbons C-5, C-5’, and C-8’ with the important HMBC cross peaks H-5/C-5, C-6, and C-10, H-5’/ C-5’, C-6’, and C-10’, and H-8’/C-7’, C-8’, and C-9’. Moreover, HMBC evidence H-7/C-6, C-7, and C-8, and H-2’/C-1’, C-2’, and C-3’ implied that methyl groups located at carbons C-7, and C-2’. From these results and a comparison with a previous report,14 the structure of compound 2 was assigned to be 8’-hydroxyisodiospyrin.

161.3

5

100.2

6.24 (d, 2.0 Hz)

6

166.0

7

56.1

3.91 (s)

94.8

6.37 (d, 2.0 Hz)

7-OCH3 8

156.7

9

105.6

10

124.6

1’

131.3

7.50 (d, 9.0 Hz)

2’, 6’

Compound 3 was precipitated out of EtOAc extract of D. fleuryana leaves as a yellow amorphous powder. The 1H-NMR was the characteristics of isoflavone, in which methine proton H-2 was found to be associated with a singlet signal at δH 8.11, two double signals resonating at δH 6.24, and δH 6.37 were assigned to aromatic methine protons H-6, and H-8, respectively. Two methoxy group 7-OCH3, and 4’-OCH3 gave singlet signals at 3.91, and 3.85 ppm, respectively. Symmetric phenyl unit (ring B of flavone) was found to appear at δH 7.50 (2H, d,

www.phytomedicine.ejournals.ca

Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46. doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117 43

Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros ...

Nguyen Thi Thu Ha, et al.

Table 2 Continued

Compound 3

Position

δc

3’, 5’

114.9

dH (J in Hz) 7.01 (d, 9.0 Hz)

4’

159.7

55.8

3.85 (s)

4’-OCH3

Table 3 The results in cytotoxic assay

Inhibitory percentage

No

Concentration

KB

Hep

MCF7

Lu

85

86

86

128 (µg/mL)

90

40

35

53

32

77

26

11

21

EtoAc extract

8

37

7

7

4

2

13

15.8

29.75

53.33

60.23

88

79

85

IC50 (µM) 128 (µg/mL)

88

30

34

50

32

62

23

29

20

Compound 1

8

37

15

19

16

2

20

assay emphasized on using constituents from Vietnamese plant D. fleuryana species for cytotoxic activities. As resulted in Table 3, EtOAc extract has generated the moderate IC50 values of 15.8 and 29.75 µM repellent the growth of KB and Hep cell lines, and the weak IC50 of values of 53.33 and 60.23 µM with regards to Lu and MCF7 cell lines, respectively. Similarly, isodiospyrin1 was found to inhibit KB and Hep cell lines with the moderate IC50 values of 20.48 and 32.0 µM, respectively, but suppress Lu and MCF7 cell lines with the weak IC50 values of 65.1 and 66.13 µM. Of particular interest, respecting to the inhibition of KB and Hep cell lines, 8’-hydroxyisodiospyrin (2) has shown to consist of the strong IC50 values of 2.27 and 8.0 µM, respectively. Compound 2 also revealed the signif- icant IC50 values of 17.27 and 32.0 µM towards Lu and MCF7 cell lines. Isoflavone 3 mostly controlled the growth of four tested cancer cell lines at a high concentration of 128.0 µg/mL, and induced a range of IC50 values of 57.79-69.67 µM. The currently cytotoxic record from D. fleuryana species is the first time, thereby expecting that the extensive evidence on mechanisms is willing.

20.48

32.0

65.1

66.13

92

84

90

IC50 (µM) 128 (µg/mL)

88

EXPERIMENTAL

77

50

81

32

82

33

34

50

Compound 2

8

79

14

24

43

2

46

2.27

17.27

32.0

8.0

98

92

99

IC50 (µM) 128 (µg/mL)

98

20

32

24

32

19

11

18

12

Compound 3

8

14

0

11

4

2

9

69.67

64.84

68.92

57.79

Ellipticine

0.31 ± 0.02

0.38±0.02

0.41±0.03

0.54±0.05

IC50 (µM) IC50

General experimental procedures ESI-MS spectrum was obtained with Thermo spectrometer Scientific LTQ Orbitrap XL (USA). NMR spectra were recorded on a Bruker 500.13 MHz spectrometer, operating at 125.76 MHz for 13C NMR and at 500.13 MHz for 1H NMR. Silica gel (40-63 µm), Sephadex LH-20 (25-100 μm), and RP-18 (Cosmosil C18-Prep, Kyoto-Japan) were used for column chromatography (CC). TLC silica gel 60 F254 (Merck) was used for thin-layer chro- matography (TLC). Compounds were visualized under UV radiation (254, and 365 nm), and by spraying plates with 10% H2SO4 followed by heating with a heat gun.

Plant materials Leaves of D. fleuryana was collected in Ngoclac - Thanhhoa province in January 2018. A voucher specimen VN-310 was identified by taxonomist Dr. Nguyen Quoc Binh, Institute of Ecology and Biological Resources. The plant sample was depos- ited in Laboratory of Application Biochemistry, Institute of Chemistry.

9.0 Hz, H-2’, H-6’), and δH 7.01 (2H, d, 9.0 Hz, H-3’, H-5’). Based on the 13C-NMR/DEPT data [seven aromatic methines at δC 94.8-155.0 ppm, seven quaternary carbons at δC 105.6-166.0, and δC 182.2 (CO), together with two methoxy groups at δC 55.1 (7-OCH3), and 55.8 (4’-OCH3)], and compared with literature compound,15 isolated compound 5 was unambiguously determined to be a isofla- vone, which trivially named 7-O-methylbiochanin A. Despite the fact that this compound is now avail- able in nature but this is the first time to found in genus Diospyros, to date.

Naphthoquinones derived Diospyros plants are recognized as useful agents in cytotoxic treatments. For instance, plumbagin and 3,3’-biplumbagin from D. shimbaensis exerted the IC50 values of 130.8, and 82.1 µM, respectively, against the growth of MDA-MB-231 breast cancer cell.16 Our current

Extraction and isolation The dried ground leaves powder of D. fleuryana (1.16 kg) was ultrasonically extracted 3 times with EtOAc (10 L × 3) for 45 min at 45 °C, and the combined extract was then concentrated under vacuum (20~30 mbar) at 50°C to give a EtOAc

www.phytomedicine.ejournals.ca

44 Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46. doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117

Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros ...

Nguyen Thi Thu Ha, et al.

Figure 1

Chemical structures 1-3 and their key correlations in HMBC spectroscopy

residue (155.0 g). This residue was subjected to silica gel (10 × 50 cm, 300.0 g) column chroma- tography, eluting with a gradient of n-hexane-ac- etone (9:1→ 0:10, v/v) and acetone-methanol (9:1→0:10, v/v), to yield 15 fractions (Fr.1-Fr.15). The fraction Fr.3 (1.5 g) was then diluted by dichloromethane to afford the soluble part (Fr.31), and the insoluble residue (Fr.32). The fraction Fr.31 (0.15 g) was chromatographed on Sephadex LH-20, eluting with methanol-dichlorometh- ane (9:1, v/v), to yield 3 fractions Fr.311-Fr.313. Compounds 1 (5.0 mg), and 2  (6.0 mg) were isolated from the fraction Fr.312 (20 mg) by preparative TCL (n-hexane-acetone, 8:2, v/v). Similarly, the fraction Fr.7 (3.2 g) was subjected to silica gel column chromatography, eluting with dichloromethane-methanol (6:1, v/v), to yield 6 fractions (Fr.71-Fr.76). Utilizing the reverse RP-18 column [methanol-water (1:1, v/v)] for the fraction Fr. 713 (50 mg), compound 3 (3.1 mg) was isolated as a pure compound.

Isodiospyrin (1): Yellow amorphous powder; ESI-MS (+): 375.0 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): see Table 1.

Cytotoxic activity assay MTT assay was used to determine the cytotoxic activity of EtoAc extract and isolated compounds 1-3 with human cancer cell lines (KB, LU-1, Hep-G2 and MCF-7) acquired from the American Type Culture Collection (ATCC).17 Cells were cultured in medium DMEM supplemented with 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% Penicillin and Streptomycin and 1% L-glutamine, under a humid- ified atmosphere of 5% CO2 at 37°C. Compounds were dissolved in DMSO at 20 mg/mL and a series of dilutions for each compound was prepared to final concentrations of 128, 32, 8, 2 and 0.5 µg/mL. Cells were separated with trypsin and seeded in each well with 3 x104 cells per ml and were treated with sample different concentrations on 96-well plates. Untreated cells represented the controls. After 72h of treatment, an MTT solution (10 µl, 5 mg/mL) of phosphate buffer was added to each well for 4  hrs until intracellular purple formazan crystals are visi- ble. Remove MTT and add DMSO solution (100 µL). The optical density of the solution was determined by a plate reader BIOTEK at 540 nm. The inhibition ratio was calculated based on the optical densities from the three replicate tests.

ACKNOWLEDGMENT

8’-Hydroxyisodiospyrin (2): Red amorphous powder; ESI-MS (+): 391.0 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): see Table 1.

This research was supported by the Vietnam National Foundation for Science and Technology Development (NAFOSTED) under grant number 104.01-2017.28.

7-O-Methylbiochanin A (3): Yellow amor- phous powder; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) and 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): see Table 2.

www.phytomedicine.ejournals.ca

Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46. doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117 45

Cytotoxic naphthoquinones from Diospyros ...

Nguyen Thi Thu Ha, et al.

DISCLOSURE STATEMENT

inhibitory activity

No potential conflict of interest was reported by the authors.

9. Khanh PN, Duc HV, Huong TT, Son NT, Ha VT, Van  DT, Tai BH, Kim JE, Jo AR, Kim YH, Cuong NM. Alkyphloroglucinol derivatives and triterpenoids with solube epoxide hydrolase from Callistermon citrinus. Fitoterapia, 2016; 109:39-44 http:// dx.doi.org/10.1016/j.fifitote.2015.10.013.

REFERENCES

10. Son NT. Genus Miliusa: A review of phytochem- istry and pharmacology. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:ID 8314693 https://doi. org/10.1155/2019/8314693.

11. Son NT. Genus Erythrophleum: Botanical description, traditional use, phytochemistry and pharmacology. Phytochem Rev. 2019;18:571-599 https://doi.org/10.1007/ s11101-019-09640-0.

1. Ganapaty S, Thomas PS, Karagianis G, Waterman  PG, Brun R. Antiprotozoal and cytotoxic naphthalene derivatives from Diospyris assimilis. Phytochemistry 2006; 67:1950- 1956 https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2006.05.039. 2. Abdur R, Uddin G, Patel S, Khan A, Halim SA, Bawazeer S, Ahmad K, Muhammad N, Mubarak MS. Diospyros, an under-utilized, multi-purpose plant genus: A review. Biomed Pharmacother. 2017;91:714-730 http://dx.doi. org/10.1016/j.biopha.2017.05.012.

12. Son NT. Secondary metabolites of genus Pandanus-an aspect of phytochemistry. Mini Rev Org Chem 2019;16:689-710 https://doi.org/10.2174/15701 93X16666181206102740.

13. Khan RM, Rwekika E. A binaphthoquinone from Diospyros greeniwayi. Phytochemistry 1998;49:2501-2503 https:// doi.org/10.1016/S0031-9422(98)00294-5.

4.

14. Amar Dev MJ, Rajarajeshwari N. Phytoconstituents iso- lated from Diospyros oocarpa Thwatist. Asian J Biomed Pharm Sci. 2013;3:50-54.

3. Hang PTT, Viet CTB, Son NT. The proliferation and differentiation of pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells formulations. Discovery drug from Vietnamese Phytomedicine. http://dx.doi. 2019;6:172-173. org/10.15562/phytomedicine.2019.96. Son NT, Suenaga M, Matsunaga Y, Chinh LV, Kubo M, Harada K, Cuong NM, Fukuyama Y. Serine protease inhibitors and activators from Dalbergia tonkinensis spe- cies. J Nat Med. 2019 http://dx.doi.org/10.1007/s1141 8-019-01347-y.

15. Lee SJ, Baek HJ, Lee CH, Kim HP. Antiinflammatory activ- ity of isoflavonoids from Pueraria Radix and biochanin A derivatives. Arch Pharm Res. 1994;17:31-35 https://doi. org/10.1007/BF02978244.

16. Aronsson P, Munissi JJE, Gruhonjic A, Fitzpatrick PA, Landberg G, Nyandoro SS, Erdelyi M. Phytoconstituents with radical scavenging and cytotoxic activities from Diospyros shimbaensis. Diseases 2016;4:3 https://doi. org/10.3390/diseases4010003.

6.

and

structural-bioactive

17. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65:55-63. https://doi. org/10.1016/0022-1759(83)90303-4.

7.

8.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-Non Commercial-No Derivatives 4.0 International License. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

5. Huong TT, Ha VT, Cuong TD, Son NT, Toan TQ, Anh HTN, Tram NTT, Woo SH, Kim YH, Cuong NM. New constituents from the roots and stems of Paramignya trimera. Nat Prod Commun 2019:1-5 http://dx.doi. org/10.1177/1934578X19861015. Son NT, Oda M, Hayashi N, Yamaguchi D, Kawagishi  Y, Takahashi F, Harada K, Cuong NM, Fukuyama Y. Antimicrobial activity of the constituents of Dalbergia tonkinensis highlights. Nat Prod Commun. 2018;13:157-161 https://doi. org/10.1177/1934578X1801300212. Son NT, Harada K, Cuong NM, Fukuyama Y. Two new carboxyethylflavanones from the heartwood of Dalbergia tonkinensis and their antimicrobial activi- ties. Nat Prod Commun. 2017;12:1721-1723. https://doi. org/10.1177/1934578X1701201115. Tram NCT, Son NT, Nga NT, Phuong VTT, Cuc NT, Phuong DT, Truan G, Cuong NM, Thao DT. The hepa- toprotective activity of a new derivative kaempferol gly- coside from the leaves of Vietnamese Phyllanthus acidus (L.) Skeels. Med Chem Res. 2017;26:2057-2064 https://doi. org/10.1007/s00044-017-1914-x.

www.phytomedicine.ejournals.ca

46 Discovery Phytomedicine 2020; 7(1): 42-46. doi: 10.15562/phytomedicine.2020.117