Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất: Nghiên cứu phân lập một số hợp chất hóa học từ thân rễ loài thực vật Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC

TỪ THÂN RỄ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU

(Anemarrhena asphodeloides Bunge)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Thái Nguyên - Năm 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC

TỪ THÂN RỄ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU

(Anemarrhena asphodeloides Bunge)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60 44 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHẠM VĂN KHANG

Thái Nguyên - Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết

quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nghiên cứu nào khác.

Học viên

Nguyễn Thúy Quỳnh

NHẬN XÉT CỦA NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

KHOA CHUYÊN MÔN HƢỚNG DẪN

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới TS. Phạm Văn

Khang - người thầy đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập,

nghiên cứu và thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Kho H học, các học viên cao

học K23 và các em sinh viên trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ đã tạo môi trường

nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu. Đ c

iệt tôi xin chân th nh cảm ơn học vi n Đ o M i Phương (K24), Roãn Th hinh

K48 Đinh Th Ho i K49 đã h trợ v giúp đỡ tôi quá tr nh thực hiện đ t i.

Tôi cũng xin chân th nh cảm ơn B n giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Hóa,

Phòng Đ o tạo (bộ phận S u đại học) trường Đại học Sư phạm Thái Nguy n đã tạo

mọi đi u kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn n y.

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Thúy Quỳnh

ii

MỤC LỤC

Trang Trang bìa phụ

Lời c m đo n ................................................................................................................ i

Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii

Mục lục ....................................................................................................................... iii

Danh mục bảng ........................................................................................................... iv

Danh mục hình............................................................................................................. v

Danh mục các từ viết tắt ............................................................................................. vi

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1. Lí do chọn đ tài ...................................................................................................... 1

2. Mục tiêu củ đ tài .................................................................................................. 2

3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2

4. Phương pháp nghi n cứu ......................................................................................... 2

5. Dự kiến kết quả đ tài .............................................................................................. 3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 4

1.1. Khái quát v thực vật họ Thùa (Agavaceae) ........................................................ 4

1.2. Tổng quan v loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) ....................... 4

1.2.1. Tên khoa học ..................................................................................................... 4

1.2.2. Đ c điểm thực vật .............................................................................................. 4

1.2.3. Phân bố trong tự nhiên ...................................................................................... 6

1.2.4. Công dụng của loài Tri mẫu .............................................................................. 6

1.3. T nh h nh nghi n cứu th nh phần h học o i Tri mẫu ...................................... 7

1.3.1. ác hợp ch t g ycoside ...................................................................................... 7

1.3.2. Các hợp ch t aglycon ...................................................................................... 22

1.3.3. Các hợp ch t phenolic ..................................................................................... 25

1.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu ....................................... 27

1.4.1. Hoạt tính sinh học của các saponin ................................................................. 27

1.4.2. Hoạt tính sinh học của các aglycon ................................................................. 29

Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 33

2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 33

2.2. Hóa ch t và thiết b ............................................................................................. 33

2.2.1. Hóa ch t ........................................................................................................... 33

iii

2.2.2. Thiết b ............................................................................................................. 33

2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách v xác đ nh c u trúc các ch t phân

lập được ..................................................................................................................... 34

2.3.1. Xử lý mẫu thực vật .......................................................................................... 34

2.3.2. Chiết tách các ch t ........................................................................................... 34

2.3.3. Xác đ nh c u trúc các ch t ............................................................................... 34

2.4. Phương pháp xác đ nh khả năng ức chế tế o ung thư ..................................... 34

2.4.1. Mẫu thử ............................................................................................................ 34

2.4.2 Vật liệu v phương pháp nghi n cứu ................................................................ 34

2.5. Thực nghiệm ....................................................................................................... 36

2.5.1. Quá trình phân lập các ch t từ phần rễ của loài Tri mẫu ................................. 36

2.5.2. Một số đ c điểm vật củ các ch t phân lập được ........................................ 39

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 40

3.1. Kết quả phân lập các hợp ch t ............................................................................ 40

3.2. Kết quả xác đ nh c u trúc của hợp ch t .............................................................. 40

3.2.1. Hợp ch t 1 .................................................................................................. 40

3.2.2. Hợp ch t 2 .................................................................................................. 44

3.2.3. Hợp ch t AA3 .................................................................................................. 50

3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế o ung thư HeLa (cổ tử

cung v A549 tế o ung thư g n .......................................................................... 57

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 59

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 60

BÀI BÁO ĐƢỢC ĐĂNG TRONG THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ....................... 65

PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Sự tương qu n giữa HC của ch t AA2 ................................................. 49

Bảng 3.2: Sự tương qu n giữa HC của ch t AA3 ................................................. 55

Bảng 3.3: Tác động gây độc tế o ung thư của các mẫu nghiên cứu ...................... 57

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các bộ phận cây Tri mẫu. ............................................................................ 5

Hình 1.2: Rễ cây Tri mẫu ............................................................................................ 6

Hình 1.3: Cây Tri mẫu ................................................................................................. 6 Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của ch t AA1....................................................................... 41 Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của ch t AA1 ..................................................................... 42

Hình 3.3. Phổ DEPT-135 của ch t AA1 .................................................................... 42

Hình 3.4. Phổ HSQC của ch t AA1........................................................................... 43

Hình 3.5. Sự tương qu n giữa HC của ch t AA1 (HMBC) .................................. 43

Hình 3.6. Công thức c u tạo của AA1 ....................................................................... 44

Hình 3.7. Phổ hối ượng củ AA1 ........................................................................... 44 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của ch t AA2....................................................................... 45 Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của ch t AA2 ..................................................................... 46

Hình 3.10. Phổ DEPT-135 của ch t AA2 .................................................................. 47

Hình 3.11. Phổ HSQC của ch t AA2 ........................................................................ 48

Hình 3.12. Sự tương qu n giữa HC của ch t AA2 (HMBC) ................................ 49

Hình 3.13. Phổ hối ượng củ AA2 ......................................................................... 50

Hình 3.14. Công thức c u tạo của AA2 ..................................................................... 50 Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của ch t AA3 ..................................................................... 51 Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của ch t AA3 ................................................................... 52

Hình 3.17. Phổ DEPT-135 của ch t AA3 .................................................................. 53

Hình 3.18. Phổ HSQC của ch t AA3 ........................................................................ 54

Hình 3.19. Sự tương qu n giữa HC của ch t AA3 (HMBC) ................................. 55

Hình 3.20. Phổ hối ượng củ AA3 ......................................................................... 56

Hình 3.21. Công thức c u tạo của AA3 ..................................................................... 56

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1H-NMR

Ký hiệu Từ nguyên gốc STT và từ viết tắt

13C-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 2

TOF-MS Time-of-Flight Mass spectroscopy 3

Heteronuclear Single Quantum Coherence Spectroscopy 4 HSQC

5 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

6 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

Cloroform 7 CHCl3

Diclometan 8 CH2Cl2

Cacbon tetraclorua 9 CCl4

10 EA Etyl Axetat

vi

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Thế giới thực vật r t phong phú v đ dạng, nó cung c p cho con người nguồn

tài nguyên vô cùng quý giá v nhi u ĩnh vực đ c biệt là ứng dụng trong Y–Sinh học.

Theo tổ chức y tế thế giới hiện nay khoảng 80% dân số thế giới sử dụng nguồn dược

liệu để tr bệnh v chăm s c sức khỏe.... Xu hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp ch t

thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật m dược phẩm chữa bệnh

ngày c ng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học. Từ thực tế nhận th y các

hợp ch t thi n nhi n thường có hoạt tính mạnh độ ổn đ nh c o v c độc tính th p so

với các hợp ch t nguồn gốc tổng hợp.

Hóa học các hợp ch t thiên nhiên, một bộ phận của chuyên ngành Hóa hữu cơ

đ ng c xu hướng phát triển mạnh mẽ. Bởi vì, theo các công trình nghiên cứu trên thế

giới cũng như ở Việt Nam nhi u hợp ch t thi n nhi n c dược tính chữa bệnh r t lớn

như hoạt tính kháng khuẩn háng oxi h háng ung thư…. hẳng hạn như hợp ch t

P c it xe T xo c trong cây Thông đỏ dùng làm thuốc hóa tr chữa bệnh ung thư

ho c hợp ch t aglycon có trong loài cây Tri mẫu có khả năng ảo vệ tế o não để

nâng cao khả năng trí nhớ và ức chế tế o ung thư.... Do vậy, việc nghiên cứu các

ch t mang hoạt tính sinh học cao có trong các loài cây, cỏ có tác dụng thiết thực trong

đời sống hàng ngày là v n đ quan tâm của toàn xã hội.

Tri mẫu là một trong những loài thực vật thuộc họ Thù g v ce e đã được

sử dụng từ âu để chữa một số bệnh như: vi m nhiễm, th p khớp, bệnh thần kinh...

Gần đây nhi u nghiên cứu đã chứng minh d ch chiết cao và hợp ch t hóa học được

phân lập từ loài thực vật này có khả năng ức chế nhi u dòng tế o ung thư v ảo vệ

tế o não dưới các tác động gây tổn thương của glutamat, hyperglycemia, beta-

amyloid nhằm đ nh hướng chữa bệnh Alzheimer và Parkinson.

Ở Việt Nam, Tri mẫu thường được dùng trong các bài thuốc tr đ u hớp đ u

dạ d y v vi m đại tr ng.... Nhưng đến nay chỉ có ít các công trình nghiên cứu v

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này, các nghiên cứu này

tương đối đơn giản v chư c tính hệ thống cao, đồng thời dựa trên kết quả của

nhóm nghiên cứu v loài thực vật này chúng tôi nhận th y Tri mẫu có thành phần hóa

1

học đ dạng, có một số nhóm hợp ch t có hoạt tính tốt nên việc tiếp tục tiến hành

nghiên cứu v thành phân hóa học v đánh giá hoạt tính sinh học của loài thực vật

n y để m cơ sở cho việc sử dụng làm thuốc chữa bệnh là r t cần thiết c nghĩ

khoa học và thực tiễn.

D đ chúng tôi đ xu t đ tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất hóa

học từ thân rễ loài thực vật Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)” để

giải quyết v n đ đ .

Trong đ tài này sẽ cung c p các thông tin khoa học giá tr m cơ sở khoa học

quan trọng để sử dụng loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh và sàng lọc các hợp

ch t có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời góp phần v o đ o

tạo nguồn nhân lực cho vùng núi phía Bắc và cả nước.

2. Mục tiêu của đề tài

- Phân lập một số hợp ch t hóa học từ thân rễ loài thực vật Tri mẫu

(Anemarrhena asphodeloides Bunge).

- Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp ch t đã phân ập được.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tổng quan các nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã công bố v loài

Tri mẫu.

- Tiến hành chiết xu t các hợp ch t từ loài thực vật này.

- Phân lập v xác đ nh c u trúc của nó bằng các phương pháp phổ.

- Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp ch t phân lập được.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

4.1. Phƣơng pháp lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp, phân tích tài liệu trong v ngo i nước v loài tri mẫu để

có cái nhìn tổng quan v nó.

- Phân tích tài liệu để c cơ sở khoa học v mối quan hệ giữa hoạt tính và c u

trúc của mẫu nghiên cứu.

4.2. Phƣơng pháp thực nghiệm

- Thu thập mẫu nguyên liệu thực vật

Mẫu thực vật là phần rễ loài Tri mẫu được thu mua ở Hà Giang vào tháng

6/2016.

2

- Xây dựng phương pháp chiết xu t các ch t có trong mẫu.

+ Xác đ nh phương pháp phân tích chính xác thuận tiện nh t cho quá trình

thực hiện.

+ Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu và chiết xu t các hợp ch t từ loài

thực vật trên.

+ Xử lý mẫu thực vật và chiết mẫu bằng dung môi khảo sát để lựa chọn dung

môi an toàn, phù hợp.

- Xây dựng và dự kiến phương pháp để thu được các hợp ch t từ nguyên liệu

đã chọn.

+ Sử dụng phương pháp sắc ký cột bằng các dung môi thích hợp để phân lập

một số hợp ch t h học.

+ Xác đ nh c u trúc hóa học của các hợp ch t bằng phương pháp vật .

- Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học.

Dự đoán hoạt tính sinh học điển hình của các ch t đã phân ập được dựa vào

c u trúc của chúng và tiến hành thử hoạt tính sinh học.

5. Dự kiến kết quả đề tài

- Phân lập một số hợp ch t hóa học từ thân rễ loài Tri mẫu.

- Xác đ nh c u trúc hóa học của các hợp ch t phân lập được.

- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp ch t.

3

Chƣơng 1

TỔNG QUAN

1.1. Khái quát về thực vật họ Thùa (Agavaceae)

Họ Thùa bao gồm khoảng 550-640 loài với khoảng 18-23 chi, phân bố rộng

khắp trong khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới.

Các loài trong họ Thùa có thể là cây mọng nước ho c không mọng nước. Lá

củ chúng c các gân á song song á thường dài và nhọn mũi thường có gai cứng ở

đỉnh đôi hi c các g i phụ mọc dọc theo mép lá [1].

Các loài thực vật họ Thù thường được sử dụng để sản xu t các dạng đồ uống

chứa cồn ở khu vực Trung Mỹ như i pu que v rượu mezcal trong khi các loài khác

có giá tr để l y sợi. Chúng r t phổ biến trong khu vực khô cằn, nhi u loài có hoa s c

sỡ [1].

Lo i Tri mẫu Anemarrhena asphodeloides Bunge m chúng tôi đ ng nghi n

cứu o i duy nh t thuộc chi Anemarrhena củ họ Thù (Agavaceae).

1.2. Tổng quan về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)

1.2.1. Tên khoa học

- Tên Khoa học: Anemarrhena asphodeloides Bunge.

- Tên tiếng Việt: Tri mẫu.

- Tên khác: Rhizoma Anemarrhena, zhimu.

1.2.2. Đặc điểm thực vật

Tri mẫu là cây thảo, sống âu năm. Thân rễ dày, dẹt, mọc ngang bao bọc bởi

những phần còn sót lại của gốc á m u đỏ h y v ng đỏ, m t trong màu vàng. Lá mọc

tụ tập ở gốc thành cụm dày, hình dài, dài 20 - 70 cm, rộng 3 - 6mm, gốc có bẹ to mọc

ốp v o nh u đầu thuôn nhọn, hai m t nhẵn [2].

Rễ cây tri mẫu hình khúc dẹt ho c trụ hơi cong queo c hi phân nhánh d i 3

- 15 cm đường kính 0,8 - 1,5 cm. Một đầu còn sót lại gốc thân và vết cuống lá màu

vàng nhạt. M t ngo i c m u v ng nâu đến nâu. M t trên của thân rễ có một rãnh lớn

và có nhi u đốt vòng xếp sít nh u tr n đốt có nhi u gốc lá còn sót lại màu nâu vàng

mọc ra 2 bên, m t dưới có nếp nhăn v nhi u vết rễ nhỏ hình ch m tròn lồi lõm. Ch t

cứng, dễ bẻ gẫy. M t gẫy màu vàng nhạt. Mùi nhẹ. V hơi ngọt đắng, nhai có ch t nhớt [2].

4

Thân củ cây Tri mẫu được thu hái vào mùa thu ho c mùa xuân. Sau khi loại bỏ

rễ xơ rửa sạch phơi hô v ngâm ngập nước, lột vỏ, thái thành lát mỏng v nướng với muối.

Cụm hoa mọc từ giữ túm á h nh ông hơi cong cán thẳng và dài 0,5 - 1m;

hoa nhỏ thơm nở vào buổi chi u, bao hoa màu trắng hay tía nhạt, chia 6 thùy dính

nhau ở gốc; nh 3, chỉ nh r t ngắn; bầu 3 ô, vòi nhụy hình chỉ[2].

Quả nang, hình trứng, nhọn đầu, có cạnh; hạt 1 - 2 h nh t m giác m u đen[2].

Mùa hoa: tháng 7 – 8 [2].

A: Rễ. B: Cụm hoa. C: Hoa.

D: Tràng hoa với bao ph n gắn li n với bên ngoài lọn cánh đ i.

E: Nhụy hoa. F: Quả nang nẻ ra. G: Hạt hình thoi

Hình 1.1: Các bộ phận cây Tri mẫu.

5

Hình 1.2: Rễ cây Tri mẫu

Hình 1.3: Cây Tri mẫu

1.2.3. Phân bố trong tự nhiên

Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) là loại thảo dược âu năm được

trồng ho c mọc ho ng tr n sườn núi ở Mãn Châu, Mông Cổ, và mi n Bắc của Trung

Quốc [7]. Ở Việt Nam, loài thực vật này chủ yếu phân bố ở các tỉnh phía bắc như

Thái Nguyên, Bắc Kạn, Tuyên Quang,...

1.2.4. Công dụng của loài Tri mẫu

Tri mẫu được dùng tr sốt đái tháo đường ho ho đờm thở dốc, ngực nóng khó

ch u ho o ….

Một số bài thuốc có Tri mẫu [1]:

- Đi u tr các triệu chứng sốt cao, co giật, hôn mê trong viêm não Nhật Bản B:

6

Tri mẫu 16g, thạch cao 40g; kim ngân, huy n sâm sinh đ a, m i v 16g; hoàng liên,

liên ki u, m i v 12g; cam thảo 4g. Sắc uống.

- Chữa viêm phổi trẻ em thể phong nhiệt, sốt cao: Tri mẫu 6g, thạch cao 20g,

kim ngân hoa 16g, tang bạch bì 8g; hoàng liên, liên ki u, hoàng cầm, m i v 6g; cam

thảo 4g. Sắc uống ngày một thang.

- Chữa sốt cao, li bì, mê sảng trong bệnh sởi trẻ em: Tri mẫu 8g; huy n sâm,

gạo tẻ, m i v 12g; sừng trâu 8g, cam thảo 4g. Sắc uống ngày một thang.

- Chữa huyết áp cao, nhức đầu, hoa mắt, khó ngủ: Dùng bài Tri bá bát v hoàn

gia giảm nêu trên, thêm thảo quyết minh sao 20g, chi tử 12g.

- Chữa nóng âm, háo khát, mồ hôi trộm ho h n đái tháo đường: Dùng bài

Tri bá bát v hoàn gia giảm nêu trên, thêm huy n sâm, thiên môn, thiên hoa ph n, m i

v 16g.

1.3. T nh h nh nghiên cứu th nh phần h a học lo i Tri mẫu

1.3.1. Các hợp chất glycoside

Các saponin thuộc loại glycoside steroid. Nên khi phân lập được glycoside chủ

yếu là các hợp ch t saponin.

Hợp ch t được phân lập sớm nh t từ loài thực vật này là Timosaponin A-III

(1). Khi thủy phân ch t này với xit H 2N trong et no 50% thu được

sarsasapogenin, D-galactose và D-glucose. Đây ch t có nhi u ứng dụng và thu

hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhi u nhóm tác giả.

(1)

7

Từ d ch chiết etanol của loài Tri mẫu, Dong và các cộng sự [8] đã t m r một

saponin mới là Anemarsaponin B (2) cùng với h i s ponin đã iết là Anemarsaponin

A1 (3) và Anemarsaponin A2 (4).

(2)

(3)

(4)

8

Nhóm nghiên cứu ở nhật Bản do Nakashima phụ trách đã phân lập được glycoside mới là pseudoprototimosaponin AIII (5) và prototimosaponin AIII (6).

(5)

(6)

Các saponin steroid mới có tên: anemarrhena saponin I-IV (7-10) cùng với các

s ponin đã iết là timosaponin A-III (1), marcogenin diglycoside (11), timosaponin

B-II (12) và mangiferin (13) đãđược Setsuo và cộng sự phân lập từ rễ của loài tri mẫu

v o năm 1994. C u trúc củ chúng đã được xác đ nh bằng các phương pháp phổ [33].

(7): R1=H, R2=OH

(8): R1=OH, R2=H

9

(9) R1=R3=H, R2=OH

(11) R1=R2=H, R3=OH

(10)

(12)

10

(13)

Bằng phương pháp sắc ký cột và v phương pháp sắc ký HPLC, Setsuo và

cộng sự tiếp tục phân lập từ phần rễ của loài tri mẫu được 4 saponine mới là

timosaponin H1 (22), timosaponin H2 (23), timosaponin I1 (24), timosaponin I2(25), vào

năm 1999

(22) R=OH, (23) R=OCH3

(24) R=OH, (25) R=OCH3

Xi ings ponin B 26 được Hong và các cộng sự phân lập được hợp ch t

saponin steroit từ phần rễ của loài Tri mẫu v o năm 1999[11].

11

Hợp ch t (26) là một ch t rắn dạng màu trắng, r t dễ t n trong nước, nhiệt độ

sôi 178 - 180 oC. Công thức được xác đ nh như s u.

(26)

Sáu saponin steroid là timosaponin N (27),timosaponin E1 (16), timosaponin

O (28), timosaponin E2 (17), purpureagitosid (29) và marcogenin-3-O-β-D-

glucopyranosyl- 1→2 -β-D-galactopyranoside (30) được Kang và các cộng sự[19]

đã phân lập từ thân rễ của Tri mẫu vào năm 2006.

Trong đ hợp ch t (28) và (29) là hợp ch t mới và hợp ch t 30 được phân

lập lần đầu tiên từ loài Tri mẫu.

Sáu hợp ch t thu được đ u ở dạng bột màu trắng, phản ứng Molisch và phản

ứng Liebermann-Burchard cho kết quả dương tính. Phản ứng thuốc thử Ehrlich hiển

th m u đỏ chỉ ra các hợp ch t này là saponin furostanol. Qua phân tích phổ FAB - MS, 1H NMR và13C NMR, c u trúc hóa học của các ch t được xác đ nh như dưới đây [19].

12

(27) R1=OH, R2=H, R3=H, (28) R1=OH, R2=H, R3=CH3

(29)

(30)

Hai saponin mới : timos ponin IV 31 v timos ponin B IV 32 được

Peng và các cộng sự[39] đã t m r từ phần rễ khô của loài Tri mẫu v o năm 2007

bằng phương pháp đun hồi ưu mẫu khô (5,0 kg) với EtOH 70%. Phần c n thu được tiếp tục được chiết trong ete dầu, EAvà BuOH.

13

(31)

(32)

Timosaponin B V (33) đã được Zhang và các cộng sự[41] nghiên cứu thành

phần d ch chiết của phần rễ loài Tri Mẫu v o năm 2008.

(33)

14

Timosaponin X (38), timosaponin Y (39), một pregnane glycoside là timopregnane

B (40), 25S-timosaponin BII (41), protodesgalactotigonin (42) và timosaponin BII-a (43) đãđược Yuan và cộng sự[13] phân lập từ rễ của loài Tri mẫu v o năm 2014.

R1=S1

R1=S1, R2=S3 (38) (39)

R1=S2, R2=S3

R1=S2 (40) (41)

R1=S4, R2=S3 R1=S5, R2=S3

(42) (43)

15

Timosaponin A-III (1) được Kawasaki và cộng sự [16] phân lập từ loài Tri

mẫu v o năm 1963. Khi thủy phân saponin này với axit HCl 2N trong etanol 50% thu được sarsasapogenin, D-galactose và D-glucose. C u trúc hóa học của (1) là:

16

(1)

Một saponin mới là Anemarsaponin B (2) cùng với h i s ponin đã iết là

nem rs ponin 1 3 v nem rs ponin 2 4 được Dong và các cộng sự[8] tìm

ra từ d ch chiết etanol của loài Tri mẫu v o năm 1991.

(2)

17

(3)

(4)

Pseudoprototimos ponin III 5 được Nakashima và cộng sự[25]đã phân lập

từ loài Tri mẫu v được so sánh với ch t đã iết prototimos ponin III 6 v o năm

1993.

(5)

(6)

Hai saponin spirostanol mới có tên là anemarsaponin F (14) và G (15) được

Ma B và các cộng sự[5] t m r năm 1997. Tr n cơ sở phân tích quang phổ, c u trúc

18

của (14) và 15 được xác đ nh tương ứng là neogitogenin3-O-β-glucopyranosyl-

1→2 [β-xylopyranosyl- 1→3 ]-β-glucopyranosyl 1→4 -β-galactopyranoside)

(14) và lilagenin 3-O-β-glucopyranosyl- 1→2 - [β-xylopyranosyl- 1→3 ]-β-

glucopyranosyl- 1→4 -β-galactopyranoside (15).

(14)

(15)

Hai saponin steroid mới có tên anemarnoside A (34) và anemarnoside B (35),

cùng với ba hợp ch t đã iết là timosaponin J (36), timosaponin B II (12), và

timosaponin B (37) được Liu và các cộng sự[31] phân lập từ loài Tri Mẫu v o năm

2013.

19

(34)

(35)

(36)

(12)

20

(37)

Timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17) được Meng Z và các cộng

sự[44] phân lậptừ loài Tri mẫu bằng phương pháp sắc ký silicagel và phương pháp

sắc kí HPLC v o năm 1998.

(16)

(17)

21

Năm 1998, nhóm nghiên cứu này tìm ra bốn hợp ch t saponin mới là

s= 186-190oC). Cả bốn ch t n y đ u ở dạng bột, màu trắng[23].

timosaponin B-IV (18), timosaponin B-V(19), timosaponin B-VI(20), timosaponin D (21) ( to

(18)

(19) R=H

(20) R=CH3

(21)

1.3.2. Các hợp chất aglycon

1.3.2.1. Nghiên cứu th nh phần aglycon

Năm 1999 Liu v các cộng sự đã đư r một nghiên cứu v việc xác đ nh

thành phần sarsasapogenin (44) từ loài Tri mẫu bằng phương pháp hệ thống sắc ký

khí (GC)[36]. Ngo i r cũng c một số tài liệu đ cập đến việc phân lập aglycon này

22

từ loài Tri mẫu và thử nghiệm hoạt tính sinh học như hoạt tính bảo vệ tế bào, cải thiện

trí nhớ, ức chế tế o ung thư v hạ đường huyết…[14],[22],[43].

(44)

Năm 2017 nh m nghi n cứu củ chúng tôi đã th nh công trong việc phân ập h i

hợp ch t g ycon 44 v 44 các dẫn xu t củ s rs s pogenin[17]

1.3.2.2 Tổng hợp dẫn xuất của sarasasapogenin

Năm 2012 Peng v cộng sự [30] đã tổng hợp 8 hợp ch t dạng este ở v trí

cacbon số 3 bằng các phản ứng este h . Đồng thời nhóm nghiên cứu n y cũng thử

khả năng chống lão hóa thông qua sự ức chế của nó với enzym β-gal. Nhận th y ch t

2 2

-

(56), (57), (61), (63) có khả năng chống lão hóa tốt.

(60) R=C6H5COO - (61) R=C15H31COO - (62) R= Cl - (63) R=Br - (56) R=HSO4 (57) R=HCOO - (58) R=CH3COO - (59) R=C2H5COO -

23

Gần đây một số nghiên cứu đã đ cập đến việc tối ưu h c u trúc của

sarsasapogenin nhằm nâng cao hoạt tính của aglycon này.

Trong báo cáo gần đây nh t v o năm 2016 heng và các cộng sự[20] đã phân

lập được sarsasapogenin từ loài Tri mẫu và tiến hành bán tổng hợp được 9 dẫn xu t

trong đ dẫn xu t (48), (49), (53), (54) và (55) có khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào

Năm 2017 nh m nghi n cứu đã tiến h nh án tổng hợp được một số hợp

N2A-APPswe tốt hơn so với sarsasapogenin.

ch t c hoạt tính ảo vệ tế o v tăng cường hả năng trí nhớ củ chuột thực

nghiệm [27].

Như vậy từ thành phần aglycon trong loài Tri mẫu có thể bán tổng hợp ra

nhi u dẫn xu t mới có hoạt tính sinh học tốt hơn v c giá tr thức tiễn.

Đến nay chỉ có một số công trình phân lập aglycon s rs s pogenin để nghiên cứu

hoạt tính sinh học và bán tổng hợp khung cacbon này. Còn các khung aglycon khác hiện

n y chư c áo cáo n o v việc phân lập chúng dưới dạng tinh khiết v xác đ nh c u

trúc hóa học, bán tổng hợp và thử hoạt tính sinh học.

24

1.3.3. Các hợp chất phenolic

Trong loài Tri mẫu, ngoài thành phần chính là các saponin và sapogenin thì

còn có các hợp ch t pheno ic cũng c há nhi u công trình nghiên cứu v hợp ch t

này.

1.3.3.1 Phân lập từ rễ loài tri mẫu

Các hợp ch tphenolic: 7,4'-dihydroxy homoisoflavonoid (70); (2S)-7,4'-

dihydroxy-5-methoxyflavaone (71); 4,4'-dihydroxychalcon (72), 2'-O-

methylphlorethin (73); 1,3-bis-di-phydroxyphenyl-4-penten-1-one (74) và 2,4'-

dihydroxy-4-metoxy enzophenon 75 đãđượcYoun và các cộng sự[15] phân lập từ rễ

Tri mẫu v o năm 2009.Trong đ hợp ch t (70)- 73 được phân lập lần đầu tiên từ loài

thực vật này.

(70) (71)

(72) (73)

(74) (75)

1.3.3.2 Phân lập từ lá loài Tri mẫu

Hai hợp ch t m giferin 68 v neom giferin 69 đãđượcnhóm nghiên cứu

của Qin[21] phân lập từ lá loài Tri mẫu v o năm 2008. M giferin v neom giferin ở

dạng bột màu vàng.

25

(68): R1=H, R2=Glu

(69):R1=Glu, R2=Glu

Bốn hợp ch t phenolic: 2,6,4-trihydroxy-4-methoxybenzophenone (64), 7-

hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman (65), broussonin B (66) và nyasol (cis-

hinokiresinol) (67) đã được Tsukamoto và các cộng sự[32] phân tách từ loài Tri mẫu

ở Nhật Bản v o năm 2005. Các hợp ch t đã được khảo sát khả năng ảo vệ tế bào

thần kinh và khả năng ức chế proteasom.

(64) (65)

(66) (67)

26

1.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu

1.4.1. Hoạt tính sinh học của các saponin

Saponin là thành phần hóa học chủ yếu trong loài thực vật Tri mẫu, có nhi u

lợi ích cho sức khỏe con người. Các nghiên cứu v hoạt tính sinh học của loài Tri

mẫu đã chứng minh các tác dụng có lợi trên mức cho estero trong máu ung thư sức

khỏe củ xương v ích thích hệ miễn d ch.... Trong đ đáng chú hơn cả là tác

dụng ức chế tế o ung thư tác dụng bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ trên chuột thực

nghiệmvà tác dụng hạ đường huyết.

1.4.1.1. Tác dụng ức chế tế b o ung thƣ

Khả năng ức chế sự tăng trưởng và kích thích sự chết của tế bào tự hủy từ loại

thảo dược Tri mẫu ở các dòng tế bào ung thư dạ dày là một nghiên cứu quan trọng

đượcYoshio Takeda và các cộng sự [40] đư ra vào năm 2001. Sau khi kết thúc quá

trình nghiên cứu, Yoshio Takeda và các cộng sự kết luận rằng Tri mẫu có khả

năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 và Kato-III và có thể gây ra quá

trình tự chết của tế bào này.

Hợp ch t Timosaponin A-III (1)một saponin phân lập từ thân rễ của Tri mẫu

có ti m năng được phát triển như là một tác nhân chống ung thư với dòng tế bào HeLa

đượcChi-Ming Che và các cộng sự[18] chỉ ra. Bên cạnh đ ch t n y cũng thể hiện khả

năng ức chế nhi u tế o ung thư như: ung thư iểu bì (SUNE-1 ung thư g n HepG2

ung thư vú M F-7) vớicác giá tr IC50 dao động từ 8.5 - 10.1 (μmol/l).

1.4.1.2. Tác dụng bảo vệ tế bào và cải thiện trí nhớ

OU Yang Shi và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của timosaponin đến khả

năng cải thiện trí nhớ trên chuột được OUYang Shi và các cộng sự nghiên cứu vào

năm 2005 thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương β-amyloid peptide (Aβ). Aβ

có thể gây suy giảm trí nhớ ở chuột một cách trầm trọng, nó làm hạ th p hoạt động

superoxide dismutase (SOD) và khả năng chống oxy h cũng như tăng mức độ

malonaldehyde (MDA) trong tế bào. So sánh giữa những con chuột nh thường với

những con chuột được tác động bởi timosaponin thì th y những con chuột sau khi

được xử lí bởi các hợp ch t timosaponin(12), Timosaponin E1(16), timosaponin J(36)

thì hoạt động SOD và khả năng oxy h được nâng c o đồng thời mức độ MDA

27

giảm. Từ đ cho th y các timosaponin có thể nâng c o đáng ể năng ực trí nhớ ở

chuột thí nghiệm.

Khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp ch t saponin

được chỉ ra trong các nghiên cứu gần đây của Cheng và các cộng sự[20] v o năm

2016. Các giá tr IC50 (μM được ghi nhận như s u: hợp ch t Timosaponin A-III (1):

IC50 = 2.3±0.2, TA1: IC50 = 6.1±2.8, TA IV: IC50 = 4.2±1.2, timosaponin B1: IC50>

100, hợp ch t timosaponin (12) > 100. Kết quả trên cho th y khả năng ức chế Aβ42

trên tế bào N2A-APPswe củ các s ponin tương đối tốt, nh t là hợp ch t

Timosaponin A-III (1).

Hợp ch t (1) có khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase (một tác nhân

gây bệnh zheimer để cải thiện trí nhớ được Dong và các cộng sự (2009) chỉ ra. ơ

chế của quá trình bảo vệ tế bào não của ch t này có thể được giải thích bằng sự chống

viêm củ n . N cũng thể hiện khả năng ức chế sự truy n dẫn tín hiệu NF-kB trong tế

bào BV-2 và trong tế bào não SK-N-SH trên mô hình chuột thực nghiệm đây một

trong những thành tố có ảnh hưởng lớn đến sự m t trí nhớ.

Ngoài ra, d ch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu được Jung và các cộng sự

đư r ết quả nghiên cứu v khả năng ảo vệ tế o não v o năm 2007.

Sự thiếu máu cục bộ xảy ra khi b tắc ở động mạch não phải. D ch chiết tổng

số của loài thực vật Tri mẫu ức chế đáng ể sự xâm nhập bạch cầu của các mô não

thiếu máu cục bộ đi u n y được xác đ nh dựa trên hoạt động của enzym MPO. MPO

đã giảm đáng ể khi dùng d ch chiết từ loài Tri mẫu trong vùng thể vân và vỏ não.

Những phát hiện n y đ ng một vai trò r t quan trọng trong việc đi u tr ch n thương

não do thiếu máu cục bộ gây ra, và dự đoán o i Tri mẫu có thể là một loại thảo dược

chính được sử dụng để bảo vệ tế bào não sau khi b tổn thương do thiếu máu cục bộ.

1.4.1.3. Tác dụng hạ đƣờng huyết

Một chế phẩm cổ truy n được bào chế từ thân rễ Tri mẫu được thử nghiệm trên

chuột nhắt KK-Ay (chuột mắc một típ đái tháo đường không phụ thuộc insulin). Chế

phẩm này (1700 mg/kg), làm giảm đường máu ở chuột nhắt KK-Ay từ 557 ± 17 xuống

383 ± 36 (mg/1000 ml) trong vòng 7h sau khi cho uống một li u thuốc (P < 0,001).

Thuốc cũng m giảm đường máu v m tăng sự dung nạp glucose trong vòng 5 tuần

sau khi cho uống những li u l p lại trên chuột nhắt KK - Ay.

28

D ch chiết etanol của Tri mẫu có tác dụng kích thích sự tiết insulin củ đảo tụy ở

chuột nh thường và chuột đái tháo đường ở nồng độ 2,4 và 8 (mg/ml) đã được Hoa và

các cộng sự chứng minh v o năm 2004.

1.4.1.4. Một số hoạt tính sinh học khác

Các hợp ch t s ponin được phân lập từ các d ch chiết etanol và d ch chiết nước

từ phần rễ Tri mẫu có khả năng chống enteroviruts 71(EV71) gây bệnh tay chân

miệng đi u n y được đư r trong nghi n cứu của Liu và cộng sự v o năm 2014.

Trong số các saponin, hợp ch t timosaponin B-II (12) có chỉ số IC50 (4,3 ± 2,1 mM, SI

= 92,9), ch t đối chứng là ribavirin(IC50 = 361,7 ± 104,6 mM, SI = 2,4). So sánh 2 hợp

ch t này thì th y hợp ch t timosaponin B-II 12 c SI c o hơn g p 40 lần so với ch t đối chứng [24].

Timos ponin E1 16 v timos ponin E2 17 được phân lập từ loài Tri Mẫu có

tác dụng chống oxi hóa, gây ảnh hưởng đến gốc superoxide trong bạch cầu của con

người được công bố trong báo cáo của Hiroyuki và các cộng sự v o năm 2000. Hợp

ch t timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17) ức chế đáng ể N-formyl-

methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) - tác nhân gây ra gốc superoxide. Ngoài ra,

protein tyrosine kinase tham gia vào gốc superoxide cũng giảm đáng ể trong bạch cầu củ con người khi dùng hợp ch t timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17).

Anemarsaponin B (ASB) (2) thể hiện khả năng chống viêm ti m tàng. Kết quả

nghiên cứu cho th y tác dụng chống viêm của ASB trong LPS ở đại thực bào RAW

264,7 có sự liên kết với sự ức chế hoạt động của enzym NF- kB thông qu con đường kích hoạt p38 MAP.[12]

Ngoài ra, các saponin của loài Tri mẫu đi u tr hiệu quả sự oãng xương ở

chuột thông qua sự hình thành xương nhưng hông ức chế sự tái h p thu xương[8] và

còn có tác dụng chống oxi hóa.[28]

1.4.2. Hoạt tính sinh học của các aglycon

Aglyconsarsasapogenin (44) hung cơ ản nh t của loài Tri mẫu. Đến nay

chỉ có một số công trình phân lập aglyconsarsasapogenin để nghiên cứu hoạt tính sinh học.

Khả năng ảo vệ tế o não để nâng cao khả năng trí nhớ và ức chế tế o ung thư

hoạt tính sinh học điển hình nh t của khung aglycon này.

29

1.4.2.1. Tác dụng bảo vệ tế bào

Khả năng nâng c o trí nhớ của khung aglycon sarsasapogenin được Hu và các

cộng sự[37] thử trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương my oid β-

peptide, kết quả cho th y nhóm thực nghiệm với ch t này có thể cải thiện khả năng

nhớ và học tập với nh m đối chứng t crin v o năm 2005.

Sự ảnh hưởng củ g ycon n y đến vai trò của phần kết nối vòng AMP

REB đối với độ dầy đ c của thụ thể M1 trên tế bào CHOm1 trong quá trình trình

gi đi n c hả năng nâng c o độ dầy đ c của thụ thể M1 tốt cho các CREB và

phosphor- REB để chống lại quá trình lão hóa[10] được Hu và các cộng sự chứng

minh v o năm 2010.

Năm 2011 W ng v các cộng sự [14] đã chứng minh Sự ảnh hưởng của

s rs s pogenin đến sự phát triển theo hình cây của tế bào thần kinh vỏ não, kết

quả cho th y ch t này có khả năng m tăng sự phát triển của các tế bào thần kinh

hình cây trên vỏ não với các nồng độ hác nh u thông qu con đường kích thích

PI3K/Akt/mTOR được Wang và các cộng sự[14] chứng minh v o năm 2011. Đi u

này r t tốt cho việc bảo vệ tế bào và kích thích sự ghi nhớ.

Yue [43] cùng cộng sự đã nghi n cứu thực nghiệm và chứng minh rằng

Sarsasapogenin có thể bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não bởi sự tác động gây tổn thương

của axit glutamic, kết quả cũng cho th y ch t này có khả năng ảo vệ tế bào này thông

qu con đường kích hoạt sự truy n dẫn thông tin của PI3K/Akt/mTOR v m tăng

hoạt tính của protein caspase-3 và μ-c p in đượcYue [43] và cộng sự nghiên cứu thực

nghiệm và chứng minh v o năm 2012.

Khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp ch t aglycon

được Cheng và các cộng sự[20] cũng chỉ r v o năm 2016. ác giá tr IC50 (μM được

ghi nhận như s u: hợp ch t sarsasapogenin (44): IC50 = 53.0±9.0; các hợp ch t được

bán tổng hợp từ (44) là (48), (49), (53), (54), (55) có giá tr IC50 lần ượt là: 6.5±2.1,

27.0±8.0, 7.2±2.2, 9.3±3.5, 7.3±4.0. Còn các hợp ch t g ycon hác như: tigogenin,

smi genin… c giá tr IC50 > 100. Kết quả trên cho th y khả năng ức chế Aβ42 trên

tế bào N2A-APPswe củ các g ycon tương đối tốt, nh t là các dẫn xu t được bán

tổng hợp từ ch t sarsasapogenin.

30

1.4.2.2. Tác dụng ức chế tế b o ung thƣ

Khả năng ức chế tế o ung thư xương người 1547 của aglycon sarsasapogenin

thông qua việc gây ra sự chết của tế bào này dựa vào chu trình khép kín của tế bào

trong ph G2/M được Trouillas và cộng sự chứng minh v o năm 2005[29].

Vai trò cần cho sự sống trong việc gây chết tế o ung thư HepG2 v HeL

đượcNi và cộng sự [42] chứng minh v o năm 2008. Kết quả cho th y rằng, sarsasapogenin

thúc đẩy phản ứng oxy hóa (ROS) ti thể xảy ra sớm giúp kích hoạt quá trình tự chết

của tế o v cytochrome được giải phóng nhi u hơn từ đ ước đầu kết luận

sarsasapogenin có khả năng gây r quá tr nh tự chết tế bào HepG2. Bao và cộng

sự[35] cũng đã chỉ ra sự phụ thuộc của nồng độ và thời gian vào khả năng sống được

của tế bào HepG2.

Sarsasapogenin có thể ức chế khối u trong các thực nghiệm in vitro v cũng c

thể ức chế tế o ung thư HeL gây r ởi các quá tr nh oxi h stress được Shen và

cộng sự [34] chứng minh v o năm 2013.

1.4.2.3. Một số hoạt tính sinh học khác

Những ảnh hưởng củ s rs s pogenin được phân lập từ loài Tri mẫu đến hoạt

động chống trầm cảm ở chuột trong bài kiểm tr c t n mô h nh ơi cưỡng bức

the forced swimming được tìm ra từ mục đích nghi n cứu của Wu và các cộng

sự[38] đư r v o năm 2006 . Bộ dụng cụ là một bình hình trụ được làm bằng po yc r on te c o 25cm đường ính 10 cm nước (24o được cho v o nh đến

mức 15cm. Chuột thí nghiệm được cho uống s rs s pogenin 60 phút trước khi làm

thí nghiệm. Chuột được đ t vào bình và thử nghiệm trong 6 phút. Cho chuột ơi tự

do trong 2 phút đầu và từ phút thứ 3, thời gian b t động của chuột được ghi nhận.

Kết quả cho th y khi dùng sarsasapogenin với li u 12.5, 25 và 50 mg/ kg thì

giảm thời gian b t động tương ứng với kết quả là 26,6% (P< 0,05), 32,7% (p< 0,05)

và 48,7% (p<0,01). Nghiên cứu này chỉ ra khả năng chống trầm cảm ti m năng của

sarsasapogenin từ loài Tri Mẫu dựa vào các dẫn chứng v tâm í dược lý, hóa học và

các tài liệu v thần kinh.

Ngoài ra, sarsasapogenin còn có tác dụng hạ sốt. Phân đoạn saponin từ thân rễ

tri mẫu và sản phẩm thủy phân s rs s pogenin cũng như dẫn ch t hemisuciny đ u có

31

tác dụng ức chế mạnh trên Na+/K+-ATPase và làm giảm ượng oxy thu nhận trong gan

được xử lý với thyroxin. Tác dụng ức chế của dẫn ch t hemisucinyl còn mạnh hơn cả tác dụng củ ou in. S rs s pogenin cũng ức chế Na+/K+-ATPase của hồng cầu

người. Tác dụng ức chế chậm và có thể tăng n do ion n tri từ n ngo i v đối

kháng bởi ion rubidi từ bên ngoài. Tác dụng ức chế trên ATPase có thể có liên quan

với tác dụng hạ sốt của sarsasapogenin.

Kết luận: Như vậy, các ch t được phân lập từ loài tri mẫu có r t nhi u hoạt

tính quan trọng và thiết thực trong đ timos ponin -III và aglycon sarsasapogenin

được nghiên cứu nhi u hơn cả đ c biệt là tác dụng bảo vệ tế bào não, chống tế bào

ung thư v hạ đường huyết.

32

Chƣơng 2

THỰC NGHIỆM

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu khô loài Tri mẫu được thu mua tại Hà Giang,Việt

Nam (6/2016). Mẫu được s y hô v bảo quản cẩn thận trước khi tiến hành nghiên cứu.

2.2. Hóa chất và thiết bị

2.2.1. Hóa chất

2.2.1.1. Hóa chất

ác dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đ u dùng loại tinh khiết.

Dung môi được sử dụng là: n-hexan, etylaxetat (EA), axeton, clorofom,

cacbontetraclorua, ete dầu là các dung môi tinh khiết.

Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh Merc v sắc ớp

mỏng TL 254F Merc .

2.2.1.2. Hóa chất v tế b o dùng để thử hoạt tính sinh học

- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)

- Đĩ 96 giếngnhự orning US pippette eppendorf máyđọc ELISA 96

giếng (Bio-rad)

- Ch t tham khảo: Ellipticine

- Các hóa ch t thông thường khác

- Các dòng tế o ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto Trường Đại học Hawaii

v GS. Je nette M ier trường Đại học Milan, Italia cung c p.

2.2.2. Thiết bị

Máy c t quay chân không, các thiết b phụ trợ cho thí nghiệm phân lập ch t

hữu cơ. Máy Bruker 500MHz để đo Phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Máy đo sắc ỏng

hối phổ L -MS Kho H Đại học Kho học Tự nhi n . Sắc ký lớp mỏng (TLC)

phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính và bản mỏng nhôm silicagel tráng sẵn

(dày 0,2 mm). Hiện màu với thuốc thử là dung d ch C2H5OH/H2SO4 v đèn UV 254

nm. ân phân tích máy đo OD ELIS P te Re der Bio-Rad). Máy đo nhiệt độ

n ng chảy RY-1 Kho H Đại học Sư phạm – ĐHTN

33

2.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách v xác định cấu trúc các chất

phân lập đƣợc

2.3.1. Xử lý mẫu thực vật

Từ mẫu khô của loài Tri mẫu được s y ở 50o ảo quản trong túi ni on để

dùng cho nghiên cứu.

2.3.2. Chiết tách các chất

Mẫu phần thân rễ của loài Tri mẫu được ch t nhỏ và chiết hồi ưu với etanol ở 90oC. Quay c t thu hồi dung môi dưới áp su t giảm thu được c n chiết etanol. C n đ

chiết lần ượt với các dung môi c độ phân cực tăng dần etylaxetat (EA), n-butanol.

S u đ c t thu hồi dung môi dưới áp su t giảm thu được các c n tổng số.

Phân lập c n tổng số và các c n ở các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột

trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp.

2.3.3. Xác định cấu trúc các chất

C u trúc của các hợp ch t được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H, cacbon 13C, phổ hai chi u HSQ

v HMBC, phổ khối ượng ESI-MS và một số phương pháp hác.

2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng ức chế tế b o ung thƣ

2.4.1. Mẫu thử

- Tên mẫu: 3 mẫu AA1, AA2, AA3

- Mẫu thử: AA1 ở dạng bột chư ph AA2 dạng d ch đã ph với nồng độ

10mg/0,2ml, AA3 dạng d ch đã ph nồng độ 10mg/0,5ml.

- Các dòng tế bào thử nghiệm:

+ 549: Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma)

+ Hela: Ung thư tử cung ở người (human cervix adenocarcinoma)

- Thời hạn thử nghiệm: tháng 4/2017

2.4.2 Vật liệu v phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.2.1. Vật liệu

- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)

- Đĩ 96 giếngnhự orning US pippette eppendorf máyđọc ELIS 96

giếng Bio-rad)

34

h t th m hảo: Ellipticine

ác h ch t thông thường hác

ác dòng tế o ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto Trường Đại học H w ii v

GS. Je nette M ier trường Đại học Mi n It i cung c p.

2.4.2.2. Phƣơng pháp xác định tính độc tế b o ung thƣ (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế o ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gi

Ho Kỳ N tion ncer Institute – N I xác nhận phép thử độ độc tế o chuẩn

nhằm s ng ọc phát hiện các ch t c hả năng m hãm sự phát triển ho c diệt

TBUT ở đi u iện in vitro. Phép thử n y được thực hiện theo phương pháp củ

Mon s 1991 . Phép thử tiến h nh xác đ nh h m ượng protein tế o tổng số dự

v o mật độ qu ng học OD – Optic Density đo được hi th nh phần protein củ

tế o được nhuộm ằng Su forhod mine B SRB . Giá tr OD máy đo được tỉ ệ

thuận với ượng SRB gắn với phân tử protein do đ ượng tế o c ng nhi u ượng

protein c ng nhi u th giá tr OD c ng ớn. Phép thử được thực hiện trong đi u iện

cụ thể như s u:

- h t thử được ph th nh các dải nồng độ thích hợp

- Trypsin h tế o thí nghiệm để m rời tế o v đếm trong uồng đếm để

đi u chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- h t thử đã ph ở các nồng độ v o các giếng củ đĩ 96 giếng đư tế o ở

nồng độ phù hợp v o các giếng n y s o cho nồng độ ch t thử trong giếng 100

g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml và 0,8 g/ml. Ủ trong tủ m 48 giờ. Giếng hông c ch t

thử nhưng c TBUT 180 sẽ được sử dụng m đối chứng ng y 0. S u 1 giờ tế o

sẽ được cố đ nh ằng Trich or cetic cid – T ở các giếng đối chứng ng y 0.

- S u 48 giờ tế o được cố đ nh ằng T trong 1 giờ được nhuộm ằng SRB

trong 30 phút ở 37 o rử 3 ần ằng cetic cid rồi để hô ở nhiệt độ phòng.

- 10 mM unbuffered Tris se để hò t n ượng SRB ắcnhẹtrong 10 phút.

- Đọc ết quả OD ở ước s ng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader

(Bio-Rad).

- Phần trăm ức chế sự phát triển củ tế o hi c m t ch t thử sẽ được xác

đ nh thông qu công thức s u:

35

[OD ch tthử - OD(ngày 0)] x 100

% ức chế = 100% - OD đốichứngâm - OD(ngày 0)

- Phép thử được p ại 3 ần để đảm ảo tính chính xác. E ipticine ở cácnồngđộ

10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/m được sử dụng như ch t đối chứng dương;

- DMSO10% uôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá tr I 50 nồng độ ức chế

50% sự phát triển sẽ được xác đ nh nhờ v o phần m m máy tính T e urve 2Dv4.

- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), c n chiết được

coi có hoạt tính tốt với IC50  20 μg/ml, trong khi ch t tinh khiết được coi có hoạt

tính tốt khi IC50  5 μM [3], [4], [6],[ 9],[26].

2.5. Thực nghiệm

2.5.1. Quá trình phân lập các chất từ phần rễ của loài Tri mẫu

2.5.1.1. Chiết xuất cao etanol từ thân rễ của loài Tri mẫu

10 kg mẫu khô từ thân rễ của loài tri mẫu sau khi l y v được đem ch t nhỏ

sáy hô và chiết hồi ưu với etanol 90% ở nhiệt độ 70˚ trong thời gian 3 giờ và l p

lại 3 lần. C t thu hồi dung môi được c n chiết etanol và phân bố đ u trong ượng

nước vừ đủ. D ch chiết cồn được chiết với etylaxetat v n-butanol.

2.5.1.2. Phân lập, tinh chế các hợp chất từ cao chiết etyl axetat

Phần cao chiết EA tiến hành phân lập các ch t trên sắc ký cột silica gel. Hòa

t n ượng cao chiết s u đ được h p phụ trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm).

Khu y đ u cho đến khi silica gel h p phụ đ u hết dung d ch mẫu cho đến khi khô

đ u cho một h n hợp bột m n.

Nhồi cột khô silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm) vào cột sắc ích thước

9x100 cm với 1 kg silicagel. Ổn đ nh cột bằng dung môi CH2Cl2. Hệ dung môi rửa

giải là: CH2Cl2: MeOH với tỉ lệ từ 30:1 đến 5:1.Thu được các phân đoạn. Kiểm tra

các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng các phân đoạn giống nh u đem gộp lại phân

tách ch t tinh khiết bằng sắc ký cột.

Tại phân đoạn 5 ta tiếp tục tiến hành phân lập các ch t trên sắc ký cột silica gel

với hệ dung môi rửa giải là: n-hexan/CH2Cl2 với tỉ lệ 5:1 thu được ch t rắn màu trắng

(ch t AA1 ). Ch t rắn n y được m hô đem đi đo phổ để xác đ nh c u trúc.

36

Tại phân đoạn 9 c tỉ ệ dung môi rử giải CH2Cl2 : MeOH với tỉ lệ 15:1

v/v ết tinh ại trong xeton/ 4 5/1 thu được ch t AA3 c m u trắng. Tại phân

đoạn 10 c tỉ ệ dung môi rử giải CH2Cl2 : MeOH với tỉ lệ từ 10:1 (v/v) thu được

ch t rắn m u trắng ết tinh ại trong xeton thu được ch t AA2 c m u trắng. ả h i

ch t AA2 v AA3 đ u t n tốt trong met no ch t AA2 cũng t n tốt trong nước. Ch t

rắn n y được m hô đem đi đo phổ để xác đ nh c u trúc.

Quy trình phân lập, tinh chế các hợp ch t từ d ch chiết etyl axetat của loài Tri Mẫu

được n u trong sơ đồ 2.1 dưới đây:

37

Cao EA

- Chạy sắc kí cột silicagel - Hệ dung môi:CH2Cl2: MeOH = 30:1 đến 5:1 (v/v)

PĐ 2: ống 6-9

PĐ 5: ống 47-66

PĐ 1: ống 1-5

PĐ 3: ống 10-25

PĐ 4: ống 26-46

PĐ 6: ống 67-70

PĐ 7: ống 71-73

PĐ 8: ống 74-75

PĐ 9: ống 76-80

PĐ 10: ống 76-80

- Chạy sắc kí cột silicagel. - Hệ dung môi: n-hexan:CH2Cl2=5:1 (v/v) - Thông cột bằng MeOH

- Chạy sắc kí cột silicagel. - Hệ dung môi:CH2Cl2 : MeOH = 15:1 (v/v) - ết tinh ại trong axeton/CCl4 (5/1)

Ch t rắn màu trắng (ch t AA1 )

Ch t rắn màu trắng (ch t AA3)

- Chạy sắc kí cột silicagel. - Hệ dung môi:CH2Cl2 : MeOH = 10:1 - ết tinh ại trong xeton

Ch t rắn màu trắng (ch t AA2 )

PĐ 10: ống 76-80

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân lập hợp ch t

38

2.5.2. Một số đặc điểm vật lý của các chất phân lập đƣợc

2.5.2.1. Chất AA1

L ch t m u trắng dạng vô đ nh h nh nhiệt độ n ng chảy tnc = 83-84oC. Giá

tr phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ch t AA1 được tiến h nh đo tr n hệ máy cộng

hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học Đại học KHTN-ĐHQG trong dung môi D 3,

ch t chuẩn đối chứng là TMS.

2.5.2.2. Chất AA2

L ch t m u trắng dạng tinh thể nhiệt độ n ng chảy tnc = 287-288oC. Giá tr

phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ch t AA2 cũng được tiến h nh đo tr n hệ máy cộng

hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học Đại học KHTN_ĐHQG trong dung môi D 3,

ch t chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả dữ liệu phổ của ch t AA2 được tổng hợp ở

bảng 3.1.

2.5.2.3. Chất AA3

L ch t m u trắng dạng tinh thể nhiệt độ n ng chảy t nc = 154-156oC . Giá tr

phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ch t AA3 được tiến h nh đo tr n hệ máy cộng

hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học Đại học KHTN_ĐHQG trong dung môi

CDCl3, ch t chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả dữ liệu phổ của ch t AA3 được tổng

hợp như ảng 3.2.

39

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập các hợp chất

10 kg mẫu khô từ thân rễ của loài tri mẫu sau khi l y v được đem ch t nhỏ và

chiết hồi ưu với etanol 90% ở nhiệt độ 70˚ trong thời gian 3 giờ và l p lại 3 lần. C t

thu hồi dung môi được c n chiết etanol (700 gam) và phân bố đ u trong ượng nước vừa

đủ. D ch chiết cồn được chiết với ety xet t 80 g m v n-butanol (320 gam).

ác ch t AA1, AA2 v AA3 được phân ập ằng phương pháp sắc cột với

các hệ dung môi rử giải hác nh u v ết tinh ại để tinh chế ch t như đã tr nh y ở

phần thực nghiệm. Kết quả thu được như s u:

- h t AA1: 28 mg.

- h t AA2: 65 mg.

- h t AA3: 120 mg.

ác ch t rắn n y được được dùng m thực nghiệm đo phổ để xác đ nh cậu trúc v

đánh giá hoạt tính sinh học.

3.2. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất

3.2.1. Hợp chất AA1

Hợp ch t AA1 đã được phân lập từ phân đoạn số 5 theo sơ đồ h nh 2.1 của phần cao

chiết etyl axetat. Giá tr phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ch t AA1 được tiến h nh đo

trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa hóa học Đại học KHTN_ĐHQG trong

dung môi CDCl3, ch t chuẩn đối chứng là TMS.

40

Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của ch t AA1

Phổ 1H-NMR của ch t AA1 cho một tín hiệu của triplet tại δH 0.88 (t, J = 7.6

Hz, 3H) tương ứng với 3 proton củ nh m mety i n ết với một nh m H2. Một tín

hiệu của triplet tại δH 3.64 (t, J = 7.4 Hz, 2H) tương ứng với 2 proton củ nh m

mety en i n ết với một nh m H2 v c hả năng i n ết với nh m OH.

41

Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của ch t AA1

Tr n phổ c các tín hiệu c c on tương ứng với nguy n tử i n ết với oxi δC

= 63.1 ppm v c c on trong nh m metyl (δC = 14.1 ppm v các nguy n tử c c on

củ các nh m metylen được xác đ nh dự tr n dữ iệu phổ DEPT-135.

Hình 3.3. Phổ DEPT-135 của ch t AA1

42

Tr n phổ tương qu n h i chi u HSQ v HMB t nhận th y các tín hiệu

tương tác trực tiếp v gián tiếp củ các nguy n tử c c on v hidro.

Hình 3.4. Phổ HSQC của ch t AA1

Hình 3.5. Sự tương qu n giữa HC của ch t AA1 (HMBC)

43

Kết hợp với phổ hối ượng c pe ion m/z 413 [M+3H]+ 100% do đ công thức c u tạo củ hợp ch t

Hình 3.6. Công thức c u tạo của AA1

Hình 3.7. Phổ hối ượng củ AA1 Kết luận: ăn cứ các giá tr phổ 1H-NMR và 13C-NMR, và phổ tương qu n

hai chi u HMB v phổ hối của ch t AA1 có thể kết luận AA1 là octacosan-1-ol.

Đây hợp ch t c trong ú m v trong một số o i côn trùng như sâu eo

(Spodoptera frugiperda . Đây ch t ần đầu ti n phân ập được từ o i thực vật n y.

3.2.2. Hợp chất AA2

Hợp ch t AA2 đã được phân lập từ phân đoạn số 10 theo sơ đồ h nh 2.1 của phần

cao chiết etyl axetat. Giá tr phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ch t AA2 được tiến

h nh đo tr n hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa hóa học Đại học

KHTN_ĐHQG trong dung môi D 3, ch t chuẩn đối chứng là TMS.

44

Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của ch t AA2

Phổ 1H-NMR của ch t AA2 cho các tín hiệu của 2 doublet tại δH 2.72 ppm (d, J

= 16.56, 9.03 Hz, 1H) v 2.63 ppm (d, J = 16.56 v 3.85 Hz, 1H tương ứng với 2 2 ở v trí -2. Ngo i r c h i protong ở proton δH trên nh m mety en c i n ết với sp

dạng sing et c δH = 7.00 v 7.68 ppm c thể các nguy n tử proton củ nh m

hydroxyl .

45

Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của ch t AA2

Trên phổ 13C-NMR của hợp ch t AA2 cho th y sự xu t hiện của 4 tín hiệu cộng

hưởng tương ứng với 4 nguyên tử c c on. 2 tín hiệu cộng hưởng ở δC = 173.22 v

169.40 ppm c thể tương ứng với các nguy n tử củ nh m – OO- ho c nh m –

CONH-. Tín hiệu cộng hưởng tại δC = 51.34 ppm tương ứng với nguy n tử c i n

2 .

ết với Oxi v tại δC = 36.27 ppm tương ứng với tín hiệu cộng hưởng củ nguy n tử

i n ết với sp

46

Hình 3.10. Phổ DEPT-135 của ch t AA2

Kết hợp với phổ 13 -NMR v phổ DEPT-135 của hợp ch t AA2 cho th y AA2

c 1 nguy n tử trong nh m -CH2- 1 nguy n tử c c on dạng – H- ho c –CH3 i n

ết với oxi . Đồng thời c h i c c on ậc 4 c δC = 173.22 v 169.40 ppm.

47

Hình 3.11. Phổ HSQC của ch t AA2

Tr n phổ tương qu n -H h i chi u HSQ nhận th y nguy n tử c δC =

36.27 ppm i n ết với 2 nguy n tử H ở δH 2.72 ppm (d, J = 16.56, 9.03 Hz, 1H) v

2.63 ppm (d, J = 16.56 v 3.85 Hz 1H tương ứng với 2 proton δH tr n nh m mety en.

B n cạnh đ c thể nhận th y nguy n tử c c on c δC = 51.34 ppm i n ết trực tiếp

với nguy n tử hidro c δH hoảng 3.36 ppm chùm ẫn trong pe dung môi . H i

nguy n tử H c δH = 7.00 v 7.68 ppm các proton hông i n ết trực tiếp với

c c on. Proton c δH = 7.00 c thể proton củ nguy n tử Hidro củ nh m OH c i n

ết hidro.

48

Hình 3.12. Sự tương qu n giữa HC của ch t AA2 (HMBC)

Bảng 3.1: Sự tƣơng quan giữa HC của chất AA2

Chất AA2 (DMSO-d6) Vị trí HMBC(HC) δH δC

1 169.40

3.36 ppm 2 51.34 C-3, C-1, C-4

2.72 ppm (d, J = 16.56, 9.03 C-2, C-1, C-4

Hz, 1H) 3 36.27 2.63 ppm (dz, J = 16.56 v C-2, C-4

3.85 Hz, 1H)

4 173.22

Qu phổ HMB c các tín hiệu tương tác giữ các nguy n tử proton với nguy n

tử : 3.36 ppm H-2 tương tác với -3 -1 -4. Proton ở δH 2.72 ppm (d, J = 16.56,

9.03 Hz, 1H) tương tác với C-2, C-1, C-4 v 2.63 ppm (d, J = 16.56 v 3.85 Hz, 1H))

tương tác với C-2, C-4.

49

Hình 3.13. Phổ hối ượng củ AA2

Tr n phổ MS củ hợp ch t AA2 c pe ion m/z 157 100% M+H +. Qu phổ

c c on c thể nhận th y AA2 c 4 nguy n tử nhiệt độ n ng chảy củ AA2 287o c o hơn so với nhiệt độ n ng chảy củ axit 2-hydroxysuccinic (130-132 do

đ ch t AA2 c thể muối n tri củ xit 2-hydroxysuccinic nên AA2 :

Hình 3.14. Công thức c u tạo của AA2

3.2.3. Hợp chất AA3

Hợp ch t AA3 đã được phân lập từ phân đoạn số 9 theo sơ đồ h nh 2.1 của phần cao

chiết etyl axetat. Giá tr phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ch t AA3 được tiến h nh đo

50

trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa hóa học Đại học KHTN_ĐHQG trong

dung môi CDCl3, ch t chuẩn đối chứng là TMS.

Phổ 1H-NMR của ch t AA3 cho các tín hiệu của 1 triplet tại δH1.09 ppm (t, J =

7.0 Hz, 3H)tương ứng với 3 protoncủa nh m mety i n ết với nh m mety en -CH2- .

Tín hiệu cộng hưởng tại δH3.45 ppm (dd, J = 13.9, 6.8 Hz, 2H) tương ứng với nh m

mety en c i n ết với nh m mety v i n ết với nguy n tử c độ âm điện ớn như

oxi . D đ trong AA3 c thể c nh m ety -C2H5 i n ết trực tiếp với oxi. B n

cạnh đ tr n phổ 1H NMR củ AA3 còn c tác tín hiệu cộng hưởng củ các nguy n

tử H trong hoảng 3.50 ppm – 4.60 ppm tương ứng với các pronton tr n các nguy n

tử c c on c i n ết trực tiếp với oxi ho c các proton củ các nh m hydroxy .

Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của ch t AA3

51

Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của ch t AA3 Trên phổ 13C-NMR của hợp ch t AA3 cho th y sự xu t hiện của 8 tín hiệu cộng

hưởng c thể tương ứng với 8 nguyên tử c c on. tín hiệu cộng hưởng ở δC =

100.79 ppm c thể tương ứng với nguy n tử i n ết với 2 nguy n tử Oxi trong

vòng xic o củ phân tử monos cc rit. Tín hiệu cộng hưởng tại δC = 16.05ppm

tương ứng với nguy n tử củ nh m mety v 6 tín hiệu cộng hưởng củ các

nguy n tử cacbon i n ết với nguy n tử oxi.

52

Hình 3.17. Phổ DEPT-135 của ch t AA3 Kết hợp phổ với phổ 13 -NMR v phổ DEPT-135 của hợp ch t AA3 cho th y

AA3 c 3 nguy n tử trong nh m -CH2- 1 nguy n tử c c on dạng–CH3 hông

i n ết với oxi . Nguy n tử c c on c δC = 100.79 ppm hông i n ết với nguy n

tử hidro v nguy n tử c c on dạng nh m mety en.

53

Hình 3.18. Phổ HSQC của ch t AA3

Tr n phổ tương qu n -H h i chi u HSQ nhận th ynguy n tử c δC = 16.05 ppm

i n ết với 3 nguy n tử H ở δH 1.09 (t, J = 7.0 Hz, 3H) nh m mety i n ết với

nh m mety en. Proton ở δH 3.45 ppm (dd, J = 13.9, 6.8 Hz, 3H) i n ết với nguy n tử

c c on c δC = 51.34 ppm i n ết với nh m mety en. ác i n ết hác được mô tả

trong ảng 3.2.

Tr n phổ phổ HSQ cũng cho th y nguy n tử c c on c δC = 100.79 ppm

nguy n tử c c on ậc 4 hông c i n ết với hydro.

54

Hình 3.19. Sự tương qu n giữa HC của ch t AA3 (HMBC)

Bảng 3.2: Sự tƣơng quan giữa HC của chất AA3

Chất AA3 (DMSO-d6) Vị trí HMBC(HC) δH δC

100.79 C-5, C-7, C-4 1

2 3.73 ppm (m, 1H) 69.74 C-1, C-3

3 3.57 ppm (m, 1H) 69.82 C-5, C-7, C-4

4 3.74 ppm (m, 1H) 69.44 C-1, C-2, C-3, C-6

5 3.35-3.56 (m, 2H) 64.30 C-1, C-2, C-4,

6 3.45-3.58 (m, 2H) 62.51 C-3, C-4, C-1

3.45 ppm (dd, J = 13.9, 6.8 C-1, C-8 7 51.34 Hz, 2H)

8 1.09 (t, J = 7.0 Hz, 3H) 16.05 C-7

55

Qu phổ HMB c các tín hiệu tương tác giữ các nguy n tử proton với

nguy n tử : proton H-8 tương tác với c c on -7 H-7 tương tác với -1 với -8

do d -7 i n ết với -1 qu cầu nguy n tử oxi; H-4 tương tác với -1 do đ -1

i n ết với -4 qu cầu nguy n tử oxi..

Hình 3.20. Phổ hối ượng củ AA3 Tr n phổ MS củ hợp ch t AA3 c pe ion m/z 253.26 (100%) [M-C2H5OH-H]+

phân tử c 8 nguy n tử dự iến c 16 proton n n công thức phân tử củ AA3 C8H16O6. h t AA3 c nhiệt độ n ng chảy 154-156o . Kết hợp phổ NMR 1D v 2D) ch t AA3 c thể 1-ethoxy-1,4-bis(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2,3-dio

h y 1-ethoxyfructofur nose đây ch t ần đầu ti n được phân ập r từ o i thực

vật n y.

Hình 3.21. Công thức c u tạo của AA3

56

3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế b o ung thƣ HeLa (cổ

tử cung) v A549 (tế b o ung thƣ gan)

Ung thư cổ tử cung v ung thư g n những oại hối u ác tính thường g p

nh t trên thế giới. Để làm giảm tỉ lệ tử vong, chuẩn đoán sớm và phát triển phác

đồ đi u tr tiên tiến, bao gồm cả các loại thuốc, gen và các liệu pháp miễn d ch

cũng như các iện pháp phòng ngừ ung thư cổ tử cung là hết sức quan trọng. Vì

vậy tìm kiếm các dược ch t mới chống khối u và nghiên cứu các giá tr y học của

các hợp ch t đ đã trở thành một v n đ lớn v c nghĩ qu n trọng.

ăn cứ vào thực tế đã v đ ng sử dụng trong dân gian làm thuốc của cây Tri

mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) v các ết quả nghi n cứu gần đây,

chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính ức chế tế bào trên dòng tế o ung thư HeLa

(cổ tử cung) v tế o ung thư g n A549) của các hợp phân lập được từ thân rễ cây

Tri mẫu.

ác ước thực nghiệm được tr nh y ở chương 2. Kết quả thí nghiệm được

tr nh y ở ảng 3.3.

Bảng 3.3: Tác động gây độc tế b o ung thƣ của các mẫu nghiên cứu

% ức chế

AA1 AA2 Nồng độ (µg/ml) Nồng độ (µg/ml) Hela Hela A549 A549

60.46

15.35

32.18

69.90

100

100

22.15

8.72

16.12

29.84

20

20

7.38

4.23

2.56

10.05

4

4

-0.71

-0.88

-0.89

6.84

0.8

72.36±3.02 54.68± 2.73

>100

>100

IC50

0.8

Ellipticine

IC50

AA3

Nồng độ (µg/ml)

Hela

Hela

A549

A549

10

Nồng độ (µg/ml)

41.98

97.36

89.97

48.31

2

100

16.59

73.44

72.98

21.46

0.4

20

1.70

48.16

47.20

2.15

0.08

4

0.19

20.24

22.42

1.03

0.8

>100 0.49± 0.03 0.51± 0.09 >100 IC50

57

Kết quả tr n cho th y mẫu AA1 thể hiện hoạt tính tốt nh t với giá tr IC50 = 54.6

v 72.36 µg/ml trên cả 2 dòng tế o ung thư dùng trong thử nghiệm. H i mẫu còn ại

chư thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghi n cứu. h t đối chứng dương E ipticine hoạt động ổn đ nh trong thí nghiệm. ác ết quả tr n chính xác với r2≥ 0 99.

 Kết luận

 AA1 thể hiện hoạt tính tốt nh t với giá tr IC50 = 54.68, 72.36 µg/ml trên cả 2

 H i mẫu còn ại chư thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghi n cứu.

dòng tế o ung thư v tế bào lành dùng trong thử nghiệm;

58

KẾT LUẬN

Luận văn tốt nghiệp: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất hóa học từ

thân rễ loài thực vật Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)” thực hiện

nhiệm vụ nghiên cứu phân lập một số hợp ch t h học từ thân rễ loài Tri mẫu. Luận

văn đã ho n th nh các nhiệm vụ nghiên cứu v đạt được các kết quả chính sau:

1- Đã xây dựng được quy trình chiết xu t mẫu nghi n cứu ằng dung môi

etanol và EA.

2- Đã phân tích sắc kí lớp mỏng d ch chiết EA để xác đ nh đi u kiện sắc ký cột

phù hợp.

3- Đã phân ập được 3 hợp ch t h học trong d ch chiết EA. 4- Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và

HSQC, HMBC v phổ hối ượng đã xác đ nh được c u trúc của 3 hợp ch t đã phân

lập được từ thân rễ loài Tri mẫu là:

- Ch t AA1 :octacosan-1-ol

- Ch t AA2 :Muối n tri củ xit 2-hydroxysuccinic

- Ch t AA3:1-ethoxy-1,4-bis(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2,3-diol

6- Đã xác đ nh hoạt tính ức chế tế o ung thư HeL v 549 của 3 hợp ch t

phân ập được. Kết quả cho th y ch t AA1 c hoạt tính ức chế tế o ung thư ch t

AA2 v AA3 hông thể hiện hoạt tính tại nồng độ nghi n cứu

Kết quả nghiên cứu trên sẽ đ nh hướng cho việc sử dụng loài Tri mẫu

(Anemarrhena asphodeloides Bunge) trong y dược v khả năng đi u tr ung thư.

KIẾN NGHỊ

Sau quá trình thực hiện uận văn để hoàn thiện hướng nghiên cứu ứng dụng

loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh chúng tôi xin có vài kiến ngh như s u:

 Trong các phân đoạn chư tiến hành sắc ký cần tiếp tục triển khai.

 Đánh giá hoạt tính ức chế tế o ung thư…

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đ Huy Bích và các cộng sự (2004), "Cây thuốc v động vật làm thuốc ở Việt

Nam", Tập II, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, Hà Nội.

2. Đ T t Lợi (2007), Những cây thuốc và v thuốc Việt Nam, chủ biên, In Lần Thứ

14.-Hà Nội: Y Học, 2006.

3. Scudiero Dominic A et al (1988), "Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan

assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor

cell lines", Cancer research. 48(17), pp. 4827-4833.

4. Monks Anne et al (1991), "Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using

a diverse panel of cultured human tumor cell lines", Journal of the National

Cancer Institute. 83(11), pp. 757-766.

5. Ma Baiping et al (1997), "New spirostanol glycosides from Anemarrhena

asphodeloides", Planta medica. 63(04), pp. 376-379.

6. Alley Michael C et al (1988), "Feasibility of drug screening with panels of human

tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay", Cancer research. 48(3),

pp. 589-601.

7. Wiart Christophe (2012), Medicinal plants of China, Korea, and Japan:

ioresources for tomorrow’s drugs nd cosmetics R Press.

8. JX Dong and GY Han (1991), "Studies on the active constituents of Anemarrhena

asphodeloides Bunge", Yao xue xue bao= Acta pharmaceutica Sinica. 27(1), pp.

26-32.

9. Shoemaker Robert H et al (2002), "Application of high-throughput, molecular-

targeted screening to anticancer drug discovery", Current topics in medicinal

chemistry. 2(3), pp. 229-246.

10. Hu Haiyan et al (2010), "Role of CREB in the regulatory action of

sarsasapogenin on muscarinic M1 receptor density during cell aging", FEBS

letters. 584(8), pp. 1549-1552.

11. Z ng GM Hong Yongfu Sun LN H n GY JiGZ 1999 " “Iso tion nd

identifaction of steroidal saponins from Anemarrhena asphideloides Bunge”".

Acta Phar pp. 518-521.

60

12. Kim Ji-Yeon et al (2009), "Anti-inflammatory effect of anemarsaponin B isolated

from the rhizomes of Anemarrhena asphodeloides in LPS-induced RAW 264.7

macrophages is mediated by negative regulation of the nuclear factor-κB nd p38

pathways", Food and chemical toxicology. 47(7), pp. 1610-1617.

13. Yuan Jian-Chao et al (2014), "New steroidal glycosides from the rhizome of

Anemarrhena asphodeloides", Journal of Asian natural products research. 16(9),

pp. 901-909.

14. Wang Jin-ning et al (2011), "The effects of sarsasapogenin on dendritic

development in cultured cortical neurons and the mechanisms of signal

transduction", Chin. Pharmacol. Bull. 11, pp. 1565-1569.

15. Youn Ui Joung et al (2009), "Articles: Minor Phenolic Constituents of the

Anemarrhenae Rhizoma", Natural Product Sciences. 15(4), tr. 203-207.

16. Toshio Kawasaki and Tatsuo Yamauchi (1963), "Saponins of Timo (

Anemarrhenae Rhizoma). II. Structure of Timosaponin A-III", Chemical and

Pharmaceutical Bulletin. 11(10), pp. 1221-1224.

17. Pham Van Khang, Dao Mai Phuong and Lei Ma (2017), "New steroids from

Anemarrhena asphodeloides rhizome nd their α-glucosidase inhibitory activity",

Journal of Asian natural products research. 19(5), pp. 468-473.

18. Lai-King Sy et al (2008), "Timosaponin A-III induces autophagy preceding

mitochondria-mediated apoptosis in HeLa cancer cells", Cancer research. 68(24),

pp. 10229-10237.

19. Kang LP et al (2006), "Two new furostanol saponins from the rhizomes of

Anemarrhena asphodeloides", Yao xue xue bao Acta pharmaceutica Sinica.

41(6), pp. 527-532.

20. Cheng Lu et al 2016 "Identific tion of “s rs s pogenin- g yconed”

timos ponins s nove β-lowering modulators of amyloid precursor protein

processing", Chemical Science. 7(5), pp. 3206-3214.

21. Qin Luping et al (2008), "Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian

Decoction, a traditional Chinese herbal formula", Journal of ethnopharmacology.

118(2), pp. 271-279.

61

22. Yang M et al (2007), "Effects of sarsasapogenin on the endocrine hormones and

anti-oxidation activities in ovaricetomized rats. Chin. Tradit. Herb", Drugs. 38,

pp. 245-247.

23. Xu X Meng Z 1998 " “Three New furist no S ponin from Anemarrhena

asphodeliodes Bunge”". J of Sheny ng ph r Uni pp. 130-131.

24. Liu Mengshun et al (2014), "Folding fan mode counter-current chromatography

offers fast blind screening for drug discovery. Case study: finding anti-

enterovirus 71 agents from Anemarrhena asphodeloides", Journal of

Chromatography A. 1368, pp. 116-124.

25. Nakashima Noboru et al (1993), "Isolation of pseudoprototimosaponin AIII from

rhizomes of Anemarrhena asphodeloides and its hypoglycemic activity in

streptozotocin-induced diabetic mice", Journal of Natural Products. 56(3), pp.

345-350.

26. Hughes James P et al (2011), "Principles of early drug discovery", British journal

of pharmacology. 162(6), pp. 1239-1249.

27. Hui Pan, Pham Van Khang et al (2017), "Synthesis and SAR study of novel

sarsasapogenin derivatives as potent neuroprotective agents and NO production

inhibitors", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27(3), pp. 662-665.

28. Yingming Pan et al (2004), "Antioxidant activities of several Chinese medicine

herbs", Food chemistry. 88(3), pp. 347-350.

29. Trouillas Patrick et al (2005), "Structure–function relationship for saponin effects

on cell cycle arrest and apoptosis in the human 1547 osteosarcoma cells: a

molecular modelling approach of natural molecules structurally close to

diosgenin", Bioorganic & medicinal chemistry. 13(4), pp. 1141-1149.

30. Li L. Z. Peng Y. Li . L. Li X. Liu Q. B. Song S. J 2012 "“Iso tion

derivatives synthesis and activities of sarsasapogenin from rhizomes of

Anemarrhena asphodeloides”". pp. 927-932.

31. Liu Qing-Bo et al (2013), "Steroidal saponins from Anemarrhena

asphodeloides", Journal of Asian natural products research. 15(8), pp. 891-898.

62

32. Tsukamoto Sachiko et al (2005), "7-Hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl) chroman and

broussonin B: Neurotrophic compounds, isolated from Anemarrhena

asphodeloides Bunge, function as proteasome inhibitors", Biological and

Pharmaceutical Bulletin. 28(9), pp. 1798-1800.

33. SAITO Setsuo, Satoshi NAGASE and Koki Ichinose (1994), "New steroidal

saponins from the rhizomes of Anemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)",

Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 42(11), pp. 2342-2345.

34. Shen Shuying et al (2013), "Sarsasapogenin induces apoptosis via the reactive

oxygen species-mediated mitochondrial pathway and ER stress pathway in HeLa

cells", Biochemical and biophysical research communications. 441(2), pp. 519-524.

35. Bao Wenna et al (2007), "The apoptotic effect of sarsasapogenin from

Anemarrhena asphodeloides on HepG2 human hepatoma cells", Cell biology

international. 31(9), pp. 887-892.

36. Liu Y et al (1999), "Determination of sarsasapogenin in Anemarrhena

asphodeloides Bunge by GC", Zhongguo Zhong yao za zhi Zhongguo zhongyao

zazhi China journal of Chinese materia medica. 24(9), pp. 554-5, 575.

37. Hu Yaer et al (2005), "A new approach to the pharmacological regulation of

memory: Sarsasapogenin improves memory by elevating the low muscarinic

acetylcholine receptor density in brains of memory-deficit rat models", Brain

research. 1060(1), pp. 26-39.

38. Wu Ying-Liang et al (2006), "Antidepressant-like effects of sarsasapogenin from

Anemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)", Biological and Pharmaceutical

Bulletin. 29(11), pp. 2304-2306.

39. Peng Ying et al (2007), "Two new saponins from Anemarrhena asphodeloides

Bunge", Chinese Chemical Letters. 18(2), pp. 171-174.

40. Yoshio Takeda et al (2001), "Growth inhibition and apoptosis of gastric cancer

cell lines by Anemarrhena asphodeloides Bunge", Journal of gastroenterology.

36(2), pp. 79-90.

41. ZHANG Yu-jing et al (2008), "A new furostanol saponin from Anemarrhena

asphodeloides Bunge.[J]", Journal of Shenyang Pharmaceutical University. 4,

pp. 009.

63

42. Ni Yuan et al (2008), "Mitochondrial ROS burst as an early sign in

sarsasapogenin-induced apoptosis in HepG2 cells", Cell biology international.

32(3), pp. 337-343.

43. Sui H. J. Yue L. H. Qu W. H. Yu S. X. Liu Z. Jin Y 2012 "“Protective

effects of sarsasapogenin on glutamic acid-induced neurotoxicity in the cultured

cortic neurons in r ts nd the mech nisms”". Zhongy o Y o i Yu Linchu ng

28, pp. 31-36.

44. Meng Z, S Xu and L Meng (1998), "Timosaponins E1 and E2", Yao xue xue bao

Acta pharmaceutica Sinica. 33(9), pp. 693-696.

64

BÀI BÁO ĐƢỢC ĐĂNG TRONG THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nguyễn Thúy Quỳnh, Phạm Văn Kh ng “Th nh phần hóa học của lá loài giảo

cổ lam tại Thái Nguyên và hoạt tính sinh học củ chúng” Tạp chí khoa học & Công

nghệ Đại học Thái Nguyên, tập 155, số 10, 2016.

65

PHỤ LỤC

H nh S1: Phổ giãn 1H-NMR củ AA1

H nh S2: Phổ giãn 13 -NMR củ AA1

H nh S3: Phổ giãn DEPT-135 củ AA1

H nh S4: Phổ giãn DEPT-135 củ AA1

H nh S5: Phổ giãn HSQ củ AA1

H nh S6: Phổ giãn HMB củ AA1

H nh S7: Phổ giãn 1H-NMR củ AA2

H nh S8: Phổ giãn 13 -NMR củ AA2

H nh S9: Phổ giãn DEPT-135 củ AA2

H nh S10: Phổ giãn HSQ củ AA2

H nh S11: Phổ giãn 1H-NMR củ AA3

H nh S12: Phổ giãn 13 -NMR củ AA3

H nh S13: Phổ giãn 13 -NMR củ AA3

H nh S14: Phổ giãn DEPT-135 củ AA3

H nh S15: Phổ giãn HSQ củ AA3

H nh S16: Phổ giãn HMB củ AA3