Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân lập và thiết kế vector mang gen mã hóa NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) ở người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn T T n N

PHÂN LẬP VÀ T T T R N GEN MÃ HÓA

NAD(P)H: N N R T N Ở NGƢỜ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn T T n N

PHÂN LẬP VÀ T T T R N GEN MÃ HÓA

N N N R T N Ở NGƢỜ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜ ƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. NG N Đ NG T N

TS. LÊ HỒNG Đ P

Hà Nội – 2014

2

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Nguyễn

Đăng Tôn, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam cùng TS. Lê Hồng Điệp, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN đã

luôn hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu

trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Nông Văn Hải, Viện

Trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen cùng các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Nghiên

cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đặc biệt, là TS.

Nguyễn Hải Hà, Ths. Nguyễn Văn Phòng, Ths .Đỗ Mạnh Hưng đã chỉ bảo cho

tôi từng bước thực hiện cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, cho tôi

những lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa

sinh học đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Trường

ĐHKHTN - ĐHQGHN đã tạo điệu kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

học tập và hoàn thành luận văn.

Luận văn được hỗ trợ bởi đề tài “Nghiên cứu biến đổi gen, nhiễm sắc thể ở

những người có nồng độ dioxin trong máu cao”, mã số KHCN-33.06/11-15 thuộc

chương trình KHCN-33, do Bộ Tài nguyên và Môi trường quản lý.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Nga

1

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

CÁC CHỮ VI T TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

Amp

Ampicilin ARE antioxidant response element

BHA Butylated hydroxyanisole

bp Base pair

cDNA Compelementary DNA

ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate

DMEM Dulbecco's modified eagle medium

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

DQ Duroquinone

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr Ethidium Bromide

EtOH Ethanol

FAD flavin adenine dinucleotide

GSH Glutathione

HCT human colon cancer

IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside

JHH Human hepatocellular carcinoma

Kb Kilo base

2

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

Kilo Dalton kD

Kelch-like ECH-associated protein 1 KEAP1

Luria Bertani LB

L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine

nuclear factor erythroid 2-related factor 2 NRF2

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 NQO1

Michigan Cancer Foundation-7 MFC-7

Messenger RNA mRNA

ornithine decarboxylase ODC

pcDNA3.1B his-myc Vector pcDNA3.1B his-myc

Polymerase Chain Reaction PCR

Ribonucleic acid RNA

Ribonuclease RNase

Reactive oxygen species ROS

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel SDS-PAGE electrophoresis

UV Ultraviolet

TAE Tris-Acetate-EDTA

3

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số bảng Tên bảng Trang

Kích thước các exon và intron của gen mã hóa enzyme 5 Bảng 1

NQO1

Trình tự cặp mồi được sử dụng 24 Bảng 2

Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật 25 Bảng 3

Tương quan giữa nồng độ gel agarose và kích thước đoạn 29 Bảng 4

DNA cần phân tách

4

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Số hình Tên hình Trang

4 Hình 1 Vị trí của gen mã hóa NQO1 trên NST số 16

5 Hình 2 Cấu trúc gen NQO1 với các intron và exon

6 Hình 3 Con đường Keap1/Nrf2/ARE.

15 Hình 4 Cấu trúc bậc hai dạng dimer của NQO1

16 Hình 5 Mật độ điện tích trên mô hình NQO1 tinh thể khi liên kết với

phân tử

21 Hình 6 Cấu trúc vector biểu hiện pcDNA3.1(+)myc-his B

(Theo hãng Invitrogen).

Sơ đồ quy trình phân lập và thiết kế vector biểu hiện mang 40 Hình 7

đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1

41 Hình 8 Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%.

42 Hình 9 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa NQO1

trên gel agarose 0,8%.

44 Hình 10 Cấu trúc vector tái tổ hợp pcDNA3.1B myc-his-NQO1

45 Hình 11 Điện di sản phẩm PCR và vector pcDNA 3.1B sau khi xử lý

bằng enzyme giới hạn trên gel agarose 0,8%

47 Hình 12 Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli 10β

48 Hình 13 Điện di kết quả tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%

Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới 49 Hình 14

hạn trên gel agarose 0,8%

5

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Số hình Tên hình Trang

53 Hình 15 So sánh trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của các

dòng plasmid mang cDNA mã hóa protein NQO1 ở người

55 Hình 16 Trình tự amino acid suy diễn của các plasmid pcDNA3.1-

NQO1-15 mang đoạn cDNA mã hóa NQO1 và trình tự đã

công bố NM_000903.2

56 Hình 17 Tế bào được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung

huyết thanh

58 Hình 18 Điện di kết quả biểu hiện tạm thời protein trên gel

polyacrylamide 12,6%.

6

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1

ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U ........................................................................ 3

1.1. Tổng quan về gen NQO1 .................................................................................... 3

1.1.1 Giới thiệu chung về gen NQO1 ..................................................................... 3

1.1.2. Cấu trúc gen NQO1 ...................................................................................... 4

1.1.3 Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE. .................................... 5

1.1.4 Đa hình gen NQO1 ....................................................................................... 6

1.2 Tổng quan về protein NQO1 ............................................................................... 8

1.2.1 Vai trò của NQO1 .......................................................................................... 8

1.2.2 Cấu trúc của phân tử protein NQO1 ........................................................... 14

1.2.3 Các trạng thái liên kết chuyển hóa để ổn định và hoạt hóa protein ............. 17

1.3. Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp ................................ 17

1.4. Vector biểu hiện pcDNA3.1 B myc-his B ........................................................ 19

1.5. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 22

ƣơn 2 ẬT LI À ƢƠNG Á NG ÊN ỨU .......................... 24

2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 24

2.2. Phương pháp ..................................................................................................... 25

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số ............................................................................. 25

2.2.2. Tổng hợp cDNA ......................................................................................... 26

2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR ...................................................... 27

2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................................... 28

2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn ............................................................. 30

2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose ................................................... 31

2.2.7. Ghép nối DNA ............................................................................................ 32

2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ....................... 32

2.2.9. Tách chiết DNA plasmid ............................................................................ 33

2.2.10. Xác định trình tự DNA ............................................................................. 34

2.2.11. Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào động vật. ........... 36

7

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ................................ 38

ƣơn 3. T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 40

3.1. Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................................... 40

3.2. Tách chiết RNA tổng số ................................................................................... 40

3.3. Tạo dòng và thiết kế vector biểu hiện gen NQO1 ............................................ 41

3.3.1 Thiết kế cặp mồi và PCR ............................................................................. 41

3.3.2 Thiết kế vector tách dòng và biểu hiện pcDNA3.1B-NQO1 ...................... 43

3.3.3 Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 trong vector pcDNA3.1B .. 44

3.4 Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp trong tế bào động vật ................... 54

3.4.1 Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK 293. ....................................................... 54

3.4.2 Chuẩn bị vector pcDNA3.1-NQO1 cho chuyển gen ................................... 56

3.4.3 Biểu hiện nhanh NQO1 trong tế bào động vật. ........................................... 56

K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ .................................................................................. 59

TÀI LI U THAM KHẢO ........................................................................................ 60

8

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

MỞ ĐẦU

Quinon đại diện cho một lớp các chất trung gian độc hại mà có thể tạo ra một

loạt các tác động nguy hại trong cơ thể, bao gồm cả khả năng gây độc cấp tính,

immunotoxicity, và ung thư. Các cơ chế tác động ảnh hưởng do quinon gây ra là rất

phức tạp, và nó gây tổn hại cho tế bào có thể xảy ra thông qua quá trình alkyl hóa

các protein quan trọng hay cả DNA của tế bào. Ngoài ra quinon là các phân tử hoạt

động oxi hóa khử cao có thể tạo các semiquinone dẫn đến hình thành dạng phản ứng

oxi hóa (ROS) đặc biệt bao gồm cả superoxide, hydrogen peroxide, và cuối cùng là

gốc hydroxyl. Sự sản xuất ROS có thể gây bất lợi oxi hóa nghiêm trọng trong tế bào

thông qua sự hình thành các phân tử lớn của tế bào bị oxi hóa bao gồm cả chất béo,

protein và DNA, tạo cơ sở cho lão hóa và ung thư. Quinon phổ biến trong tự nhiên

và là một phần quan trọng cuả các hợp chất tự nhiên có trong thực vật, nấm và vi

khuẩn. Chúng ta tiếp xúc với quinon không chỉ thông qua chế độ ăn uống mà còn

thông qua các chất gây ô nhiễm như benzen, các hydrocarbon mạch vòng hay do

chính chúng ta tạo ra như estrogen, catecholamin. Nhiều bằng chứng mạnh mẽ cho

thấy cơ chế độc tính của quinon liên quan tới các bệnh lý đã được biết đến của các

hợp chất trên. Tế bào chúng ta cũng có rất nhiều cơ chế để chống lại những ảnh

hưởng tiêu cực của quinon và một trong số đó chính là NAD(P)H:quinone

oxidoreductae 1 (NQO1), một enzyme đi đầu trong hàng rào bảo vệ tế bào chống lại

các tác động gây độc của các hợp chất quinon.

Enzyme oxi hóa khử quinon chất nhận NADH- NQO1 là một flavoprotein

được phân bố rộng rãi, phụ thuộc FAD, thúc đẩy sự khử 2 điện tử quinon,

quioneimines, nitroaromatics, và azo dyes. Sự khử này làm giảm mức quinon và

giảm thiểu cơ hội tạo phản ứng oxy trung gian và giảm các nhóm thiol nội bào.

NQO1 là một enzyme cảm ứng mạnh được điều khiển bởi con đường

Keap/Nrf2/ARE. Bằng chứng cho thấy tầm quan trọng chức năng chống oxi hóa của

NQO1 trong stress oxi hóa được cung cấp bởi các mức độ biểu hiện cảm ứng NQO1

(knockout hoặc knockdown) liên quan đến tăng và giảm khả năng nhạy cảm tương

ứng với stress oxi hóa. Hơn nữa độc tính benzen được tăng cường rõ rệt khi NQO1

1

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

suy giảm hoạt tính. Ở người các đa hình ức chế hoạt động của NQO1 liên quan đến

sự tăng cường khuynh hướng bệnh tật. Nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra vai trò

bảo vệ mới của NQO1, dường như không liên quan đến hoạt động của enzyme.

NQO1 bám vào giúp ổn định nhân tố ức chế khối u p53 chống lại sự phân hủy của

proteasomal. Hơn nữa NQO1 xuất hiện để điều khiển tính phân hủy của protein

khác. Những phát hiện này có thể cho thấy một vai trò chọn lọc “gatekeeping” trong

việc điều khiển sự phân hủy proteasomal của các protein đặc hiệu, do đó mở rộng

vai trò bảo vệ tế bào của NQO1 vượt xa khả năng chống oxi hóa hiệu quả cao của

nó. Để cung cấp một mô hình nghiên cứu xác định vai trò của NQO1 trong hoạt hóa

các yếu tố bioreductive, chúng tôi thực hiện đề tài phân lập và thiết kế vector biểu

hiện gen mã hóa enzyme NQO1 với mục tiêu:

1. Tạo ra vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mã hóa enzyme NQO1.

2. Thiết kế vector biểu hiện tạm thời thành công đoạn gen đó trong tế bào

động vật HEK.

2

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U

1.1. Tổng quan về gen NQO1

1.1.1 Giới thiệu chung về gen NQO1

Gen NQO1 mã hóa cho enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 là

enzyme có nhiều vai trò bảo vệ tế bào, ngoài chức năng xúc tác còn có chức năng

mở rộng [56]. NQO1 là một flavoprotein phụ thuộc FAD được phân bố rộng rãi xúc

tác cho sự phân giải quinon, quinoneimines, nitroaromatics, và azo dyes. NQO1 đã

được phát hiện và đặt tên DT-diaphorase (DPNH=NADH và TPNH=NADPH) bởi

Lars Ernster vào năm 1958, và được thể hiện thông qua sự ức chế phản ứng oxi hóa

khử vitamin K do dicoumarol đã được mô tả bởi Marki và Martius. Vai trò chống

oxi hóa trực tiếp cơ bản của NQO1 trong cơ chế xúc tác: làm giảm 2 điện tử ở một

loạt các quinon thành hydroquinone tương ứng bằng cách sử dụng NADPH hoặc

NADH như chất cho điện tử [24]. Như vậy, NQO1 chuyển điện tử của quinon tham

gia vào các phản ứng hoặc làm suy giảm sulfhydryl hoặc giảm sự mất 1 điện tử tạo

ra semiquinone và các phản ứng khác nhau tạo ra các hợp chất oxi hóa trung gian

như kết quả chu trình oxi hóa khử. Thêm vào đó, các sản phẩm hydroquinone của

các phản ứng NQO1 có thể chuyển hóa glucuronide và các gốc sulfate do đó dễ

dàng được bài tiết ra ngoài. Đáng chú ý, sự khử quinon được tìm thấy ở hàng loạt

các sinh vật nhân chuẩn từ nấm men đến động vật có vú [27]. Mặc dù trong nhiều

hệ thống, các chức năng và sự điều hòa của các enzyme phức tạp vẫn được tìm hiểu,

nhưng rõ ràng là trong các trường hợp khử quinon là đi đầu trong bảo vệ tế bào với

điều kiện là có nhiều lớp bảo vệ [28, 30, 34]. Xung quanh thời điểm khám phá ra

NQO1, Williams-Ashman và Huggins [68] đã tìm thấy enzyme này đã phản ứng

mạnh trong gan chuột bởi azo dye và các hydrocarbon mạch vòng. Hơn nữa với sự

hiệu quả của NQO1 trong bảo vệ chống lại độc tố và khả năng gây ung thư của các

hydrocarbon mạch vòng, Huggins cho thấy sử dụng định lượng hoạt tính NQO1

như một phương pháp sàng lọc để xác định hiệu quả các tác nhân bảo vệ. Trong

những năm cuối thập niên 80 Hans Prochaska và các cộng sự [55] phát triển thử

nghiệm sinh học định lượng cao trong đĩa 96 giếng cho NQO1 tế bào gan chuột.

3

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Thử nghiệm này hiện đang được sử dụng rộng rãi để sàng lọc cho hoạt tính gây cảm

ứng NQO1 của các hợp chất tinh khiết hay hỗn hợp phức tạp, phân đoạn cho các

hỗn hợp đó và xác định chính xác tác dụng của các chất gây cảm ứng [32]. Hơn

nữa, nhiều hợp chất hóa học đã được tìm thấy cảm ứng NQO1 trong thử nghiệm

này đã trực tiếp chỉ ra vai trò bảo vệ chống lại các độc tố và gây ung thư của hàng

loạt chất gây ung thư trong một số tổ chức đích và ngược lại.

1.1.2. Cấu trúc gen NQO1

Gen NQO1 nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể 16 tại vị trí 16q22.1

(Hình 1). Gen NQO1 có kích thước khoảng 20 kb, trong đó kích thước mRNA là

2912bp và có sáu exon bị gián đoạn bởi năm intron.

Hình 1. Vị trí của gen mã hóa NQO1 trên NST số 16 [72]

Exon đầu tiên là dài 118 bp và mã hóa cho hai loại axit amin G, M và một

codon khởi đầu đầu tiên của exon thứ hai. Exon thứ sáu là lớn nhất trong số các

exon, có chiều dài là 1833 bp. Phân tích trình tự của exon thứ sáu cho thấy sự hiện

diện của 4 chuỗi tín hiệu tiềm năng polyadenylation (AATAAA). Trong tất cả các

intron, intron thứ hai là nhỏ nhất (116 bp). Trong đó, trình tự nucleotide mã hóa cho

protein NQO1 chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của gen (Bảng 1).

Bảng 1. Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho enzyme NQO1.

Exon

íc t ƣớc(bp)

Intron

íc t ƣớc (bp)

1

519

1

7898

2

165

2

116

3

131

3

3045

4

114

4

1834

5

102

5

1746

6

1881

4

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Gen NQO1 được sắp xếp theo trình tự 20kb nhưng phần trình tự mã hóa cho

protein chỉ là 825bp tương ứng với 274aa (không tính mã kết thúc). Trình tự gen và

promoter NQO1 đã được xác định lần lượt là 2423bp và 2123bp. Trong nghiên cứu

Asma Chinigarzadeh cùng cộng sự (2012) đã phân lập thành công đoạn 2.123 bp

từ vị trí bắt đầu phiên mã tham gia vào điều hòa sự sao chép của gen NQO1 [21].

Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu tiềm năng vị trí điều hòa ARE nằm ở -

477 tính từ vị trí bắt đầu phiên mã.

Hình 2. Cấu trúc gen NQO1 với các intron và exon [72]

1.1.3 Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE

Một dãy các chất hóa học có khả năng cảm ứng [29] tăng cường NQO1 được

thông qua con đường trung gian KEAP1/ Nrf2/ARE. Bằng cách kiểm soát biểu hiện

một dãy hơn 100 gen bảo vệ tế bào, con đường này là cần thiết cho sự thích ứng của

tế bào động vật và các sinh vật khác với rất nhiều tác nhân gây stress như ái lực và

oxi hóa [44, 50, 51]. Như tên của con đường, ba thành phần tế bào là trung tâm

quan trọng đối với các cơ chế bởi sự phiên mã của nhiều gen được điều hòa:

- Yếu tố phản ứng chống oxi hóa (ARE), trình tự DNA có mặt ở vùng điều hòa

trước của gen và liên ứng TGAG/CNNNGC. Trong trường hợp gen NQO1 chuột

trình tự chính xác đã được sửa bởi John Hayes và cộng sự [39, 52] đã chỉ ra rằng

các nucleotide nhất định trước đây được cho là dư thừa trong ARE chức năng có vai

trò thiết yếu, trong khi những nucleotide khác trước đó được coi là thiết yếu thì

không cần thiết.

- Nrf2 một nhân tố phiên mã zitrer leucine cơ bản của họ cap-n’collar liên kết

như một heterodimer với protein nhỏ Maf, tới ARE do đó tăng cường tín hiệu phiên

mã.

5

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

- Keap1 (Kelch- như protein liên kết ECH), protein cảm biến các tác nhân gây

cảm ứng một protein ức chế đa domain họ Keap cái mà gắn với Nrf2 và thúc đẩy

uquitination và phân hủy proteasomal [42] bởi chức năng như một adaptor nối Cul3

dựa trên E3 [70].

Hình 3. Con đường Keap1/Nrf2/ARE [15]

Trong điều kiện cơ bản (mũi tên nét đứt), protein hai domain Keap1 nối kết yếu tố phiên

mã Nrf2 qua miền Kelch và thúc đẩy sự ubiquitination và sự phân hủy proteasomal của

yếu tố phiên mã có chức năng như một bộ chuyển đổi cho Cul3 dựa trên ligase E3. Gây

cảm ứng cho tất cả đều phản ứng với nhóm sulfhydryl, thay đổi hóa học cụ thể phản ứng

mạnh aa cysteine của Keap1 mà sau đó mất khả năng nhằm vào đích Nrf2 cho sự phân

hủy. Do đó, Nrf2 được ổn định và di chuyển (mũi tên) vào nhân nơi mà nó liên kết với

AREs và gây nên biểu hiện của NQO1 và một dãy > 100 gen bảo vệ tế bào khác.

Một vài mô hình khác nhau được đề xuất cho cơ chế về sự điều hòa của con

đường Keap/Nrf2/ARE. Mô hình phổ biến rộng rãi nhất là cảm ứng, tất cả các phản

ứng với nhóm sulfhydryl [40], phản ứng mạnh thay aa cystein của chất cảm biến

Keap cái mà sau đó mất khả năng phân hủy đích Nrf2. Do đó Nrf2 được ổn định và

tích lũy trong nhân nơi mà nó liên kết với AREs và gây ra sự biểu hiện của các gen

bảo vệ tế bào. Điều thú vị là mặc dù con đường Keap1/Nrf2/ARE đã được nghiên

cứu nhiều trong những năm gần đây nhưng có nhiều điểm tương đồng giữa động vật

và thực vật liên quan đến cảm ứng biểu hiện gen, và sự khử quinon đại diện cho một

6

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

ví dụ điển hình của enzyme bảo vệ tế bào được cảm ứng ở cả động vật và thực vật

trong đáp ứng với các ion. Hơn nữa, trong mô và tế bào chuột và người, NQO1 là

một trong những gen cảm ứng mạnh mẽ giữa các thành viên trong họ gen bảo vệ tế

bào. Phát hiện sớm này đã được xác định nhóm gen chung biểu hiện trong một số

hệ thống sử dụng cả cảm ứng dược học của con đường Keap1/Nrf2/ARE và

knockdown Keap1 hay knockout trực tiếp gen [15]. Mặc dù tác dụng bảo vệ tế bào

hoạt hóa Nrf2 chống lại ung thư và các bệnh mãn tính khác đã được quan sát trong

nhiều mô hình động vật là chắc chắn do hoạt động kết hợp của nhiều protein bảo vệ

tế bào có sự biểu hiện gen được điều hòa bởi yếu tố phiên mã này, vai trò của

NQO1 là nổi bật và nó được gọi là một ví dụ hoàn hảo enzyme bảo vệ tế bào.

1.1.4 Đa hình gen NQO1

Ở người có hai kiểu đa hình gen mã hóa cho NQO1. Nổi bật nhất là đột

biến do bị thay thế một amino acid đơn lẻ (c: 609C-T) NQO1*2 [57]. Kết quả này

thay thế nucleotide trong một proline để thay serine vị trí 187 của chuỗi axit amin

của protein. Đột biến NQO1*2 tạo ra protein không ổn định, và nhanh chóng bị

ubiquitin hóa và phân hủy bởi các proteasome. Do đó hoạt tính NQO1 hầu như

không thể phát hiện ở người mang kiểu gen NQO1*2/2. Các cá nhân mang kiểu gen

này dễ nhiễm độc và ung thư do tác động của benzen. Thiếu NQO1 tăng nguy cơ

phát triển bệnh ung thư bạch cầu sau khi tiếp xúc với benzen. Tần xuất của tính đa

hình gen trong những cộng đồng dân cư khác nhau khoảng 2 - 5%. Các nghiên cứu

với knockout NQO1 ở chuột cũng tìm thấy tăng tính nhạy cảm nhiễm độc máu do

benzen khi so với chuột thường [22]. Một điều tra dịch tễ lớn với dân cư tiếp xúc

với benzen đã chỉ ra rằng đồng hợp tử NQO1*2 thể hiện nguy cơ nhiễm độc tủy cao

gấp 7 lần so với bình thường, dẫn đến nguy cơ dễ mắc các bệnh như thiếu máu bất

sản hay bệnh bạch cầu. Nhiều nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình NQO1*2 với

nguy cơ mắc các bệnh như nhiễm độc máu, ung thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư

vú đang được thực hiện [46, 64]. Các ngiên cứu ở Anh đã chỉ ra rằng các đột biến

NQO1 tăng nguy cơ bệnh bạch cầu lymphoblastic mãn tính đặc biệt là ở trẻ nhỏ,

liên quan đến đột biến NQO1 (P187S). Một nghiên cứu ở Trung Quốc đã được thực

7

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

hiện nghiên cứu đa hình 609 C-T gen NQO1 liên quan với khởi phát muộn bệnh

Alzheimer.

1.2 Tổng quan về protein NQO1

1.2.1 Vai trò của NQO1

a- Các hoạt động chống oxi hóa của NQO1

Từ việc cộng tác giữa phòng thí nghiệm của Helmut Sies và Paul Talalay chỉ

ra một minh chứng rõ ràng rằng NQO1 có hoạt tính chống oxi hóa trực tiếp. Khi

phần nổi dịch mô gan được ủ với menadione trong sự có mặt của NADPH, quan sát

thấy sự giải phóng mức thấp ánh sáng đỏ. Đây là sự phát quang bằng phản ứng hóa

học từ sự hình thành superoxide và mức đơn oxy (singlet) trong vòng khử quinon

kèm theo sự khử một điện tử của menadione được xúc tác bởi chất khử cytochrome

P450- NADPH. Dịch mô gan từ những con chuột được cho ăn BHA (một chất

chống oxi hóa), có hoạt tính NQO1 tăng lên 13 lần so với chuột đối chứng đã được

sử dụng trong thí nghiệm tương tự, sự phát quang giảm rất nhiều. Ngược lại thêm

chất ức chế dicumarol để điều hòa tăng tín hiệu phát quang cho thấy rõ rệt NQO1 đã

xúc tác sự khử 2 điện tử menadione do đó chuyển nó từ oxi hóa 1 điện tử trong

vòng phản ứng oxi hóa khử. Nghiên cứu này đã thiết lập bằng chứng sự NQO1 kết

tinh trong ty thể dịch nổi gan chuột, kết quả ức chế quá trình phát quang hóa học

phụ thuộc menadione. Mức độ ức chế là giống nhau giữa phần được chuẩn bị từ

động vật xử lý BHA và với động vật đối chứng có mức tăng giống nhau về NQO1

ngoại sinh. Đáng chú ý hơn ngoài vai trò xúc tác cho trong sự khử quinon, NQO1

đã được báo cáo là khử superoxide trực tiếp, mặc dù ít hiệu quả hơn so với

superoxide dismutase (SOD) [60, 71]

b- Sự bảo vệ chống lại estrogen quinones

Ngày nay chúng ta tìm ra NQO1 là cần thiết cho sự bảo vệ chống lại ảnh

hưởng có hại không chỉ đối với quinines ngoại sinh mà cả nội sinh trong quá trình

trao đổi chất như estrogen quinone. Mặc dù là một vấn đề cần cân nhắc [26], có

bằng chứng vững chắc là NQO1 có khả năng khử estradiol-3,4-quinone [36]. Hơn

nữa, sự cảm ứng NQO1 chống lại estrogen cảm ứng tạo ra sự khử N7- G và N3-A,

8

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

oxi hóa gây hư hỏng DNA và gây ung thư vú [49]. Ngược lại sự điều hòa ngược

NQO1 tăng mức trao đổi estrogen quinone và tăng cường sự chuyển thể của 17β-

estradiol [49]. Thêm vào đó hoạt tính NQO1 thấp cùng với hoạt động cao của

CYP1B1 trong mô vú đã được báo cáo trong 5 trường hợp ung thư vú người so với

4 đối chứng khỏe mạnh [62]. Kì lạ ở chỗ hoạt động NQO1 gan ở nữ cao hơn ở nam,

hầu như các phản hồi xảy ra trong sự cảm ứng của biểu hiện gen bởi trao đổi quinon

của estrogen như vai trò bảo vệ của enzyme chống lại độc tố các chất trao đổi. Hơn

nữa, các tác giả đã chỉ ra rằng estradiol 3-4 quinone gây ra sự biểu hiện gen phụ

thuộc ARE gần 6 lần ở các tế bào ung thư vú người MFC-7 được chuyển với một

luciferase (một loại enzyme oxi hóa luciferin trong tế bào phát sáng) dưới sự kiểm

soát của nhân tố phản ứng chống oxi hóa (ARE). Ngược lại, thể hiện 2-

hydroxyestradiol, 4- hydroxyestradiol hay 4- hydroxyesrtrone chỉ có một ảnh hưởng

vừa phải trên biểu hiện của luciferase; tuy nhiên sự cảm ứng có khả năng 4-5 lần dưới các điều kiện ủng hộ sự hình thành estrogen quinone trong sự có mặt của Cu 2+

và O2. Gần đây Singh cộng sự [63], đã tạo ra dòng tế bào biểu mô vú biểu hiện cả

kiểu hoang dại và dạng đột biến NQO1. So sánh các tế bào chuyển với gen bình

thường, các tế bào chuyển với biểu hiện của protein đột biến thấp hơn 2 lần, trong

khi estradiol-3,4 quinone được biểu hiện thấp khả năng khử quinon và bao gồm

mức thấp hơn 2 lần của catechol tự do, thấp hơn 3 lần của methylated catechol, và

2,5 lần tăng lượng đề purin DNA. Cùng với đó, đề xuất đa hình NQO1 có thể tăng

khả năng xảy ra đột biến gen trong biểu hiện estrogen các tế bào biểu mô vú. Hơn

nữa một nghiên cứu kết thúc gần đây đã đề xuất một dạng đa hình P187S trở thành

yếu tố dự đoán tiên lượng trong ung thư vú và sự di căn [31]. Kì lạ hơn, Lu cùng

cộng sự [48] đã báo cáo rằng trong dòng tế bào biểu mô vú MCF-10F, resveratrol

được cảm ứng NQO1 thông qua sự ổn định của yếu tố phiên mã Nrf2 nhưng thêm

nữa là dẫn đến sự tái phân bố dưới tế bào của các protein như NQO1 được quan sát

không chỉ trong tế bào chất mà còn có trong nhân các tế bào. Như vậy có thể suy

đoán rằng NQO1 trong nhân có thể quan trọng trong bảo vệ chống lại estrogen

quinone gây cảm ứng đề purin DNA ở vị trí hình thành chúng.

9

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

c- Hướng bảo vệ thần kinh của NQO1

Lớp cơ chất khác của NQO1 là dẫn xuất của quinon trong dopamine, L-

DOPA, norepinephrine, epinephrine,và 3,4-dihydroxyphenylacetic acid như các

chất chuyển hóa vòng aminochrome, dopachrome, noradrenochrome,

adrenochrome, và furanoquinone. Zafar cùng cộng sự [69] chứng minh như vòng

quinon hoặc các phản ứng oxi trung gian trong suốt chu trình oxi hóa khử ức chế

proteasome và NQO1 chống lại sự ức chế này. Thêm vào đó biểu hiện quá mức

NQO1 đã bảo vệ các tế bào thần kinh người SK-N-MC chống lại hoạt tính gây độc

tế bào của dopamine, ngược lại superoxide dismutase và catalase đã không có hiệu

quả bảo vệ. Trước khi xử lý các tế bào thần kinh PC12 với dopamine, NQO1 và

glutathione tăng cường bảo vệ tế bào khỏi bị chết bởi chất gây độc cô đặc của

dopamine hay 6- hydrodopamine [43]. Tương tự sự cảm ứng của NQO1 và GSH

bởi dimethyl fumarate, 3H-1,2-dithiole-3-thione or tert-butylhydroquinone (tBHQ)

bảo vệ các tế bào thần kinh chống lại gây độc do dopamine, 6-hydroxydopamine,

4-hydroxy-2-nonenal, hoặc H2O2. Trong các tế bào PC12 được xử lý với H2O2, sự

cảm ứng dược lý của NQO1 đã làm giảm sự hình thành các quinone protein-bound

(bị giới hạn bởi protein) và bảo vệ tế bào chống lại tác hại oxi hóa [45]. Tương tự

như vậy trong các tế bào SH- SY5Y, sự hình thành các phản ứng oxi hóa trung gian

phụ thuộc vào H2O2 đã được khử do được xử lý với tác nhân bảo vệ thần kinh

ladostigil, kèm theo sự cảm ứng của NQO1 và các enzyme chống oxi hóa khác.

Trong một dòng tế bào liên quan dopamine có nguồn gốc từ u não của chuột gây

nhiễm mang kháng nguyên SV40T dưới sự kiểm soát phiên mã của gen tyrosine

hydroxylase chuột, xử lý methamphetamine đã được báo cáo là dẫn đến sự hình

thành các quinines liên kết protein đi kèm bởi sự cảm ứng NQO1. Trước khi xử lý

với BHA, NQO1 đã bảo vệ chống lại sự tạo ra quinone protein-bound phụ thuộc

methamphetamine và tế bào chết sau đó. Đáng chú ý sự cảm ứng dược lý của

NQO1 là thường đi kèm với sự phối hợp nâng cao sự biểu hiện của rất nhiều các

protein bảo vệ tế bào và do đó tác dụng của các phân tử nhỏ gây cảm ứng là hầu

như do ảnh hưởng kết hợp của các protein bảo vệ tế bào gây ra. Tuy nhiên, khả

10

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

năng là NQO1 trực tiếp thúc đẩy giải độc các chất chuyển hóa quinon trong việc

bảo vệ tế bào chống lại ảnh hưởng gây độc thần kinh.

Có đề xuất rằng khả năng chuyển hóa nội sinh của dopamine thành cảm

ứng ức chế proteasomal và apoptosis có thể góp phần gây mất các noron liên quan

đến dopamine (một hợp chất hóa học họ catecholamine và phenethylamine đóng vai

trò quan trọng trong não người và động vật) ở bệnh Parkinson. Sự biểu hiện NQO1

đã được báo cáo tăng cao đáng kể trong phần nigra ở các bệnh nhân Parkinson [66]

và trong noron rối và noron vùng đồi thị ở bệnh nhân Alzheimer [58]. Mức cao

NQO1 nhiều khả năng là kết quả của sự tăng cường biểu hiện gen do các chất

chuyển hóa dopamine quinone và có thể đại diện cho phản ứng thích nghi chống lại

sự tích lũy. Chúng ta đã biết rằng sự biểu hiện gen phụ thuộc ARE đã được tăng

cường khi các tế bào tiếp xúc với dopamine hoặc L-DOPA trong sự có mặt của O2 hay Cu2+ các điều kiện ưu tiên chống oxi hóa của catechol moiety.

Từ các noron dopaminergic bị hư hại trong các điều kiện nhất định noron bị

suy thoái, chẳng hạn ở bệnh Parkinson, có dopamine và các chất chuyển hóa liên

quan đến bệnh. Giả thuyết đưa ra rằng NQO1 có vai trò bảo vệ chống lại các điều

kiện trên. Mặc dù số liệu dịch tễ học và mối quan hệ đa hình NQO1 và tỷ lệ mắc

bệnh Parkinson và Alheimer vẫn còn gây tranh cãi, một nghiên cứu gần đây đã báo

cáo kiểu NQO1 hoang dại có khả năng bảo vệ chống lại sự phát triển của bệnh

Alzheimer trong khi đó allele C609T có thể trở thành yếu tố nguy cơ mắc bệnh [67].

NQO1 cũng liên quan đến duy trì coenzyme Q và vitamine E ở dạng khử và

dạng hoạt động. Do đó, NQO1 ở chuột có thể khử các đồng đẳng của CoQ cả ngắn

(CoQ1 và CoQ3) và dài (CoQ9 và CoQ10) độ dài chuỗi bên isoprenoid khi kết hợp

vào túi lipid, và bảo vệ chống lại 2,2′-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) peroxi hóa

lipid [23]. Thêm vào đó, trong khi khử CoQ bảo vệ giữ cho tế bào gan chống tổn hại

oxi hóa do adriamycin, sự bảo vệ này bị mất khi thêm dicumarol ức chế NQO1.

NQO1 tái tổ hợp ở người xúc tác sự khử α-tocopherylquinone (một sản phẩm oxi

hóa của α- tocopherol) thành α-tocopherylhydroquinone một chất chống oxi hóa tế

bào, đề xuất một vai trò của NQO1 trong trao đổi chất α- tocopherol [59].

11

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Trong khi so sánh hầu hết enzyme oxi hóa khử phụ thuộc nicotinamine,

NQO1 là khác thường trong khả năng sử dụng cả NADH và NADPH không kém

phần hiệu quả. NQO1 có thể đóng góp vào sự điều hòa cân bằng oxi hóa khử bằng

cách điều chỉnh tỷ lệ oxi hóa/khử của nucleotide pyridine [47]. Sự ức chế NQO1 có thể dẫn đến mất NAD+, có thể ảnh hưởng polymerase poly ADP- ribose và chức năng của các protein phụ thuộc NAD+. Phù hợp với giả thuyết này thì khi knockout

NQO1 chuột được so sánh với chủng hoang dại có mức thấp hơn nucleotide

nicotinamine trong gan, thận, và da [35, 41]. Ngược lại, sự cảm ứng NQO1 bởi

sulforaphane cũng kết hợp gây cảm ứng các gen mã hóa cho các enzyme tái tạo

NADPH của tế bào như glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate

dehydrogenase, và enzyme malic.

Bằng cách sử dụng phương pháp hóa học liên quan đến sàng lọc, 1500 dẫn

xuất purine, NQO1 được xác định như là một chất điều hòa tiềm năng cho ổn định

microtubule ở trứng Xenopus. David Siegel cùng cộng sự đã thực hiện thí nghiệm

quan sát phân bố NQO1 trong tế bào người và đã phát hiện sự liên quan giữa NQO1

với thoi phân bào [61]. Cho dù NQO1 tương tác với các protein trên thoi phân bào

để tạo thuận lợi trong việc ổn định và tái phân phối của các protein được lựa chọn

như p53 hiện đang được nghiên cứu. Gần đây, các nhà khoa học đã chỉ ra rằng biểu

hiện liên tục của NQO1 dẫn đến kích hoạt p62 qua trung gian Nrf2 tạo điều kiện ổn

định phân bào phụ thuộc p53, hỗ trợ vai trò của NQO1 trong sự ổn định của p53

phân bào [25]. Mặc dù cơ chế vẫn chưa được biết đến, các tác giả đã đề xuất khả

năng NQO1 bảo vệ microtubule do xúc tác khử quinon nội sinh, có thể gây

depolymerization microtubule.

d- NQO1 gatekeeper của proteosome 20S

Sự ổn định của các protein ức chế khối u p53, p73α, p33 gần đây được tìm ra

là liên quan tới vai trò của NQO1, đặc biệt quan trọng dưới điều kiện bất lợi biểu

hiện NQO1 cần được tăng cao. Năm 2001, Asher [19] báo cáo rằng NQO1 ức chế

sự phân hủy p53 trong tế bào ung thư ruột người HCT-116. Tiếp xúc với với các

chất ức chế NQO1, dicumarol (3,3′-methylenebis(4-hydroxycoumarin) cũng như

12

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

các chất các chất ức chế khác cạnh tranh với NADPH, sự tăng cường phân hủy

proteosomal ở p53, và tác động này bị đảo ngược bởi các chất ức chế proteosome

[20]. Sự ổn định p53 bởi NQO1 đặc biệt dễ thấy dưới điều kiện bất lợi oxi hóa hoặc

tiếp xúc với γ-irradiation hay benzo [α]pyrene [38] xảy ra thông qua một cơ chế

khác và không phụ thuộc vào Mdm-2 và ubiquitin.

Một điều thú vị là khi so sánh p53 wild-type, một vài đột biến điểm thường

thấy trong các ung thư người p53 R175H và p53 R273H thể hiện ái lực cao với

NQO1, mặc dù nó vẫn duy trì nhạy cảm với sự phân hủy qua trung gian Mdm-2-

ubiquitin. Quan sát các chất ức chế đặc hiệu không đảo ngược của NQO1 như

ES936 [16] (5-methoxy-1,2 dimethyl-3- [(4-nitrophenoxy)methyl]indole-4,7-dione)

không ảnh hưởng tới sự phân hủy p53 biểu thị chức năng xúc tác của enzyme không

cần thiết cho sự ổn định p53 và thúc đẩy nghiên cứu một tương tác vật lý giữa 2

protein. Các thí nghiệm kết tủa miễn dịch ở tế bào ung thư ruột người HCT-116, tế

bào gốc sừng, tế bào biểu mô vú cũng như các nghiên cứu trong hệ thống vitro

phiên mã /dịch mã sử dụng dịch tan tế bào lưới thỏ khẳng định có sự kết hợp như

vậy và nó không bị ảnh hưởng bởi ES936. Ngược lại dicumarol, các chất ức chế

cạnh tranh NADPH phá vỡ các liên kết của NQO1 với p53 và gây ra phân hủy p53

mà không phụ thuộc ubiquitin [17], trong khi đó liên kết giữa NQO1 và p53 được

tăng cường bằng cách bổ sung NADH [17]. Cấu trúc tinh thể của NQO1 người

trong phức với dicumarol cho thấy chất ức chế này gây ra những thay đổi liên quan

đến Tyr128 và Phe232. Thú vị là những thay đổi lớn hơn xảy ra khi liên kết với

ES936, dẫn đến các tác giả cho rằng sắp xếp phân tử xung quanh Tyr 128 và

Phe232 [18] đóng vai trò quan trọng để liên kết p53. Ngoài p53, NQO1 cũng điều

hòa sự phân hủy 20S proteosomal không phụ thuộc ubiquitin của p73α [17], p33

[37] và mới nhất là p63γ [53, 54]. Hơn nữa, trong dịch đồng nhất của gan chuột

phân đoạn chính của NQO1 được tìm thấy liên quan đến 20S proteasomal, các tác

giả đã dề xuất NQO1 hoạt động như người gác cổng phân hủy protein thông qua

proteasomal 20S. Giả thiết này ngày càng được củng cố thêm khi phát hiện sự phân

hủy của ornithine decarboxylase (ODC) được điều hòa bởi NQO1. Trong điều kiện

13

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

cơ bản, sự biểu hiện mạnh NQO1 giúp ODC ổn định, trong khi đó knockout NQO1

gây mất ổn đinh ODC nội sinh. Ngược lại với sự ổn định p53 dưới điều kiện bất lợi,

tuy nhiên xử lý H2O2 làm giảm khả năng bảo vệ ODC của NQO1 khỏi sự phân hủy.

Do đó ODC bị suy giảm, ngăn chặn một quá trình tăng oxidative stress do sự hoạt

hóa ODC. Gần đây người ta thấy rằng NQO1 bảo vệ yếu tố khởi đầu dịch mã ở

eukaryotic (eIF) 4GI khỏi sự phân hủy proteasomal và do vậy có thể tham gia vào

điều hòa dịch mã [14].

1.2.2 Cấu trúc của phân tử protein NQO1

C u trúc toàn diện: NQO1 là một homodimer được tạo thành bởi 2 monomer

nối với nhau thông qua một trục cuộn xoắn. Mỗi monomer có 2 domain: 1 domain

xúc tác với nếp gấp α/β tương tự flavodoxin (phần 1-220) và một domain đầu C là

bộ phận của vị trí liên kết của phần adenosine của NAD. Domain xúc tác bao gồm

một trung tâm của 5 sợi (mạch) β song song (β1-β5) qua lại với 5 xoắn (α1-α5).

Giữa sợi β2 và α2 có một sự cài vào một vùng nhỏ (aa 41-82) bao gồm 2 xoắn α6 và

α7 và 2 sợi không song song β6 và β7. Các vòng L1-L8 kết nối các yếu tố khác

nhau của cấu trúc bậc hai. Domain đầu C bao gồm một phần L8 β8 L9 β9α9 và

vùng loop cuối L10. 2 vị trí xúc tác tương đương hình thành bởi cả hai monomer,

được thể hiện ở bề mặt chung dimer. Phần loop L1(aa 11-16), L4 (aa 104-110), L6

(aa 150-164) và L7 (aa190-197) của 1 monomer, và L3’ (58-66), L5’ (121-140) của

monomer khác liên kết với mỗi 2 FAD trong 1 dimer. Các phần này cùng với

L9’(230-236) hình thành 2 vị trí xúc tác tương tự trên mỗi dimer. Vị trí xúc tác có 3

vùng khác biệt: một liên kết FAD, một liên kết phần adenine ribose của NAD(P), và

một phần khác liên kết với chất nhận H hay chất cho H. Sự khớp nối chất nhận H và

vị trí cho là phù hợp với cơ chế ping-pong của NQO1 [33].

14

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

A B

Hình 4. Cấu trúc phân tử của protein NQO1 [33]

A: Cấu trúc bậc hai dạng dimer của NQO1.Các vùng tương ứng được đánh số tương

ứng, vị trí liên kết với FAD được thể hiện

B: Các vùng cấu trúc tương ứng với các acid amin mã hóa NQO1

ị tr gắn kết D nhóm prostetic FAD liên kết chặt chẽ với hNQO1 và

không tách khỏi enzyme dễ dàng dưới điều kiện tự nhiên. Sự tương tác FAD-NQO1

gồm phần đầu từ một trong hai monomer của dimer. Nửa isoalloxazine của FAD

trong hNQO1 trong hầu hết monomer được đặt trung tâm loop L4, chứa phần loop

L6. Nó có liên kết rộng với L4 đặc biệt với các nguyên tử chuỗi chính và với các

nguyên tử chuỗi bên Leu-103 và Gln-104. Cả 4 nhóm của vòng isoalloxazine A tạo

ra các liên kết H với các nhóm của protein. Ribotol, diphosphate, và adenosine nằm

trong các khe giữa các vùng N-terminal của xoắn α1 và α5. Hầu hết các tương tác

FAD- enzyme trong NQO1 người và chuột tương đồng cao tuy nhiên vẫn có một số

khác biệt đáng kể liên quan Gln-104 thay thế bằng một Tyr ở NQO1chuột và một

vài phân tử nước không có ở NQO1 chuột. Phần Gln-104 chuỗi bên NQO1 tiếp xúc

với C5A và C6 trên mặt re của isoalloxazine. Trên mặt khác, 2 phân tử nước bảo

thủ (W1 W2) tạo liên kết ngắn với nhóm methyl của vòng C. W1 tạo ra liên kết H

với chuỗi bên N 1 của Trp-105 như đã biết với CO2 trong phần monomer thứ hai

Glu-117 và Phe-120 và với W2. W2 được điều phối bởi phân tử nước khác cái mà

liên kết H với chuỗi chính NH của Gly 122’ và với chuỗi bên OH của Ser-71’. Hai

15

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

phân tử nước thêm vào được liên kết với O3 của ribitol, hai phân tử cũng được liên

kết H với nhau, cái mà quay lại được liên kết H với N 1 của Gln-104

ị tr liên kết NAD adenosine: Phần cấu tạo vị trí liên kết adenosine và

diphosphate được xác định trong cấu trúc NQO1chuột/NADH đã được báo cáo

trước đó. Trong cấu trúc NQO1 người có phần L9 thay đổi, và một monomer ẩn

trong liên kết H giữa OH chuỗi bên của Tyr- 132’và N 2 của His-161 bám chặt đầu

C của L5’.

Hình 5. Mật độ điện tích trên mô hình NQO1 tinh thể

khi liên kết với phân tử FAD [33]

ị tr không liên kết với cơ ch t (cho /nhận): các vùng trống không cho cơ chất bám vào của cấu trúc apo NQO1 rộng khoảng 100A, sâu 90 A, và dài 40A. Phe-

106, carbonyl mạch chính của Gly-174’, Phe-178’, và Trp-105 hình thành bức

tường bên trong, Tyr-126’ và Tyr-128’ tạo ra phần trên của khoang, và vòng

isoalloxazine của FAD tạo thành nền khoang. His-161 và 2 phân tử nước (W1 W2)

hình thành mặt ngược lại của khoang. Cổng vào khoang được giới hạn bởi Gly-149,

150, His-194 và Pro-68’ từ đầu N của xoắn α7’ của monomer thứ hai. Ở NQO1 mật

độ điện tích Tyr-128 không được xác định và đã thể hiện đa hình dạng cấu tạo. Tuy

nhiên khi có mặt cơ chất, hầu hết NQO1liên quan đến thích hợp của Tyr-128’ là

một trong những mạch bên gắn với Phe-232 và His-161 của monomer khác, bảo vệ

vùng khỏi dung môi và có thể phản ứng với O2.

ị tr gắn cơ ch t với ch t nhận : Duroquinone (DQ) liên kết với enzyme: 2

cấu trúc NQO1-DQ ở người và chuột chỉ ra các xúc tác gắn liền với các cơ chất

16

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

nhỏ. Tổng bề mặt bị che lấp bởi DQ là khoảng 4270A. DQ liên kết với vị trí hoạt

động thông qua một dãy tương tác bao gồm flavin và một vài phần kị nước và ưa

nước. Cơ chất bị k p giữa vòng Phe-178’ và vòng isoalloxazine của A và B. 5 vòng

thơm Phe-178’, Trp-105, Phe-106, Tyr-126’, và Tyr-128’ – Gly-150 và trung tâm

phần của isoallxazine của FAD tham gia tương tác. Ở người, NQO1, 1DQ liên kết

H với phân tử nước thông qua His 161 và Tyr-128’ [39].

1.2.3 Các trạng thái liên kết chuyển hóa để ổn định và hoạt hóa protein

Sự thể hiện mức NQO1 trong tế bào là nhạy cảm với sự thay đổi mức FAD

tự do hé lộ một liên kết điều hòa giữa hoạt hóa NQO1 và trạng thái trao đổi chất của

tế bào. Cụ thể là các tế bào trở nên hoạt động trao đổi chất mạnh hơn, mức FAD tự

do sẽ tăng, đồng thời sự gia tăng stress oxi hóa. Trong những điều kiện như vậy sẽ

dẫn đến sự tăng tính ổn định NQO1 và do đó hoạt động của nó trong một thời điểm

khi cần thiết nhất đối với hoạt tính khử, chống stress oxi hóa, và tăng dần mức các

protein điều hòa bằng cách ngăn sự phân hủy chúng [14, 16]. Như trong trường hợp

các khối u, nơi hoạt động trao đổi chất tăng lên và thực sự một loạt các nghiên cứu

đã chỉ ra mức NQO1 tăng lên trong các tế bào đó [57]. Nhìn chung hiện tượng này

thêm một ví dụ hấp dẫn về các protein ít được biết đến với chức năng được phối

hợp với các trạng thái trao đổi chất và không những quan trọng với hoạt tính của

enzyme mà còn cho quá trình điều hòa.

1.3. Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp

Công cụ chính trong công nghệ sinh học hiện đại là công nghệ DNA tái tổ

hợp hay còn gọi là kỹ thuật di truyền. Công nghệ này cho phép thao tác trực tiếp

trên các nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt. Bằng cách đưa các thông tin

di truyền ngoại lai vào trong các cơ thể vi sinh vật, các tế bào động vật và thực vật

sinh trưởng nhanh, chúng ta có thể sản xuất ra các sản phẩm của gen ngoại lai (các

protein) với các tốc độ và hiệu suất cao hơn mà thường không thể thực hiện ở các hệ

thống tế bào khác.

Hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn E. coli có rất nhiều ưu điểm quan trọng để đáp

ứng là một vật chủ thích hợp cho quá trình biểu hiện gen ngoại lai như: dễ nuôi cấy;

17

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

môi trường, trang thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản và không tốn kém. Do đó, góp

phần hạ giá thành sản phẩm; tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu

hiện gen tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản

phẩm protein tái tổ hợp. Bên cạnh đó, hệ thống biểu hiện DNA tái tổ hợp ở vi khuẩn

vẫn còn tồn tại một số điểm hạn chế. Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào cực kỳ

đơn giản, do đó, không giống như các cơ thể đa bào, các vi khuẩn không có khả

năng tiến hành các biến đổi hóa học đặc hiệu đối với protein sau khi protein đã được

dịch mã từ trình tự DNA. Trong khi đó, hầu hết các protein trị liệu ở người lại cần

các dạng biến đổi này để hoàn thiện cấu hình không gian chức năng của chúng.

Để khắc phục những điểm yếu khi biểu hiện gen ở vi khuẩn, các hệ thống

biểu hiện là các sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, chẳng hạn như nấm men (ví dụ,

Saccharomyces cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) đang ngày

càng được sử dụng rộng rãi. Ưu điểm của nấm men là chúng có thể tiến hành rất

nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh

sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá đơn giản, không sản sinh nội độc tố

và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy mô lớn. S. cerevisiae là nấm men

được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các protein tái tổ hợp [9].

Hiện nay, hệ thống tế bào động vật có vú như tế bào thận người (Human

Embryonic Kidney - HEK), tế bào thận chuột chưa trưởng thành (Baby Hamster

Kidney - BHK) và tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary -

CHO) thường được lựa chọn để sản xuất các protein trị liệu cho người. Mặc dù, hệ

thống này có rất nhiều nhược điểm như: sản lượng protein thu được khá thấp và giá

thành sản xuất các sản phẩm sử dụng các hệ thống này khá cao, do tốc độ sinh

trưởng của tế bào chậm và môi trường nuôi cấy đắt tiền nhưng trong nhiều trường

hợp tạo protein tái tổ hợp nó vẫn là lựa chọn duy nhất.

Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng chọn hệ biểu hiện là tế bào động vật

(HEK293) để biểu hiện enzyme NQO1 do enzyme này cũng cần phải trải qua quá

trình dimer để thực hiện được chức năng xúc tác. HEK293 là một dòng tế bào có

nguồn gốc từ tế bào thận phôi người phát triển trong nuôi cấy mô. Dòng đặc biệt

18

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

này được khởi xướng bởi sự chuyển đổi và nuôi các tế bào HEK bình thường với

cài DNA adenovirus 5. Việc chuyển đổi dẫn đến sự kết hợp của khoảng 4,5

kilobases từ bộ gen của virus vào nhiễm sắc thể 19 của các tế bào HEK. Dòng tế

bào HEK đã được nuôi bởi nhà khoa học Alex Vander Eb, trong những năm 1970,

tại phòng thí nghiệm của ông tại Đại học Leiden, Hà Lan. Việc chuyển nhiễm được

thực hiện bởi Frank Graham, một nhà khoa học trong phòng thí nghiệm Vander Eb,

người phát minh ra phương pháp calcium phosphate cho transfecting tế bào. Tên

HEK293 được đặt vì đó là thí nghiệm 293 của Frank Graham. Là một dòng tế bào

thực nghiệm, HEK293 dễ dàng thao tác với nuôi cấy và biến nạp đơn giản và có thể

được sử dụng trong các thí nghiệm hoạt động của tế bào cần quan tâm. Thông

thường các thí nghiệm biến nạp một gen quan tâm và sau đó phân tích sự biểu hiện

của protein. Dòng tế bào được sử dụng rộng rãi do khả năng chuyển nhiễm dễ dàng

bằng các kỹ thuật khác nhau, bao gồm cả calcium phosphate, lipofectamine, hiệu

suất biến nạp gần 100%. Một biến thể quan trọng của dòng tế bào này là dòng 293T

chứa thêm T-antigen (kháng thể) SV40 large, cho phép episomal sao chép plasmid

có vùng origin SV40 được nhân lên [65].

Đi kèm với hệ thông biểu hiện trong tế bào động vật là một hệ thống vector

biểu hiện hỗ trợ cho việc biểu hiện các protein ngoại lai nhằm nâng cao sản lượng

protein cần biểu hiện như các hệ thống vector pcDNA3.1, p CMV/hygro, p MAM-

neo cho kết quả tốt. Các hệ thống vector biểu hiện này còn giúp cho quá trình phát

hiện, thu hồi và tinh sạch protein cần biểu hiện một cách dễ dàng và nhanh chóng.

Nghiên cứu này của chúng tôi lựa chọn thiết kế sử dụng vector biểu hiện

pcDNA3.1B his-myc để tách dòng và biểu hiện gen NQO1 trong tế bào động vật

HEK293.

1.4. Vector biểu hiện pcDNA3.1 B myc-his B

pcDNA3.1 myc-his B (5497bp) là một vector thuộc hệ thống pcDNA kết quả

nghiên cứu của Invitrogen, vector này được thiết kế nhằm biểu hiện, tinh sạch và

phát hiện các protein tái tổ hợp ở các dòng tế bào động vật có vú. Biểu hiện có mức

ổn định cao được thực hiện ở hầu hết các tế bào động vật. Ưu điểm của vector nằm

19

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

ở chỗ với một đuôi C-terminal mã hóa cho epitop myc và một peptide polyhistidine

liên kết kim loại. Đuôi polyhistidine là một phần protein gồm 6 acid amin histidine

(CAC hoặc CAT) được gắn vào đầu C của protein thường được gọi hexa histidine-

tag hay 6xHis-tag. Các đuôi polyhistidine được thêm vào đầu N sau Methionine

hoặc đầu C trước một stop codon, trong trình tự mã hóa của protein quan tâm. Sử

dụng exopeptidases có thể loại bỏ các đuôi His từ đầu N, loại bỏ các đuôi đầu C sẽ

đòi hỏi việc sử dụng các kỹ thuật khác.

Có hai cách để thêm polyhistidines. Đơn giản nhất là để chèn DNA mã hóa

các protein trong một vector mã hóa một his-tag để nó sẽ được tự động gắn liền với

một trong những kết thúc của nó. Kỹ thuật khác là để thực hiện một phương pháp

PCR với mồi là codon lặp đi lặp lại của his ngay bên cạnh codon start hoặc stop

ngoài một số nucleotide (16 trở lên) căn cứ từ một đầu của DNA mã hóa các protein

được gắn đuôi.

Đuôi his thường được sử dụng để tinh sạch protein tái tổ hợp có gắn đuôi

his biểu hiện ở E. coli và các hệ thống biểu hiện khác thông qua phương pháp sắc kí

ái lực sau đó độ tinh sạch và lượng protein được đánh giá bởi SDS-PAGE và

Western blotting. Các đuôi his cũng được dùng để phát hiện protein thông qua

kháng thể anti-histidine tag hoặc nhuộm gel SDS-PAGE với đầu dò huỳnh quang

mang ion kim loại. Điều này rất hữu ích cho việc xác định vị trí khu trú protein

trong tế bào bằng phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang hay ELISA,

Western blotting.

Đối với hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật, để tăng độ tinh sạch của

protein được biểu hiện thường có 2 đuôi peptide được thiết kế trong vector. Ngoài

đuôi His, vector còn có thêm đuôi c-myc, một đoạn peptide có nguồn gốc từ gen c-

myc với chuỗi peptide N-EQKLISEEDL-C (1202 Da) có ứng dụng tương tự. Người

ta sử dụng kháng thể Anti-myc để phát hiện protein tái tổ hợp có được biểu hiện

trong tế bào vật chủ hay không cũng như xác định vị trí của protein trong tế bào

bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hay Western Blotting.

20

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Ngoài ra vector còn mang các nhân tố di truyền giúp cho quá trình phát hiện

tinh sạch

T7 promoter/priming (có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T7) điều khiển quá

trình phiên mã của gen ngoại lai. Đây là promoter hoạt động mạnh trong tế bào E.

coli.

Vị trí đa điểm (MCS) bao gồm các trình tự nhận biết của các enzyme giới hạn

thông thường giúp đưa đoạn chèn vào vector biểu hiện trở nên thuận tiện cho tách

dòng.

Trình tự BGH reverse priming giúp cho quá trình giải trình tự xuyên suốt đoạn

chèn. Tín hiệu polydenylation của hormone sinh trưởng bò (BGH) và SV40 làm

tăng hiệu suất kết thúc phiên mã và bổ sung chuỗi poly(A) của mRNA.

Trình tự gen kháng Neomycin đóng vai trò chọn lọc thể nhận ổn định trong

các tế bào động vật.

Trình tự gen kháng Ampicillin (β-lactamase) giúp chọn lọc E. coli mang

vector.

Promoter sớm cytomegalovirus (CMV) giúp tăng cường biểu hiện protein tái

Hình 6. Cấu trúc vector biểu hiện pcDNA3.1myc-his B (+)

(Theo hãng Invitrogen). [73]

21

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

tổ hợp ở mức cao trong một loạt các dòng tế bào động vật.

Promoter SV40 (có nguồn gốc từ virus Simian vacuolating 40) làm tăng hiệu

suất, biểu hiện mức cao gen kháng Neomycin và sự tái bản episomal trong các dòng

tế bào được tiềm nhiễm với SV40.

Như vậy vector pcDNA 3.1 myc-his B (+) không những mang các đặc điểm

thuận lợi cho việc tách dòng gen mà còn giúp cho việc biểu hiện và tinh sạch protein

tái tổ hợp dễ dàng trong các dòng tế bào động vật.

1.5. Tình hình nghiên cứu protein tái tổ hợp ở tron nƣớc

Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh

phẩm sử dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận

nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây. Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành

phân lập, xác định trình tự một số gen từ các nguồn sinh vật khác nhau, bao gồm

các gen của người để nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất dược phẩm công nghệ

sinh học. Viện Công nghệ Sinh học đã nghiên cứu biểu hiện và tinh chế được các

protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật như: Trichobakin từ cây qua lâu, có khả

năng ức chế các dòng tế bào ung thư [12]; protein bất hoạt ribosome (RIP) từ cây

mướp đắng có hoạt tính kháng virus, nấm [6]. Viện cũng đã nghiên cứu tách dòng

và biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người với chaperon groesl và thioredoxin

trong E. coli BL21 [13], rh-IL2MM dạng đột biến và kháng nguyên CD25 nhằm sử

dụng trong điều trị và chẩn đoán ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng [1],

[2]. Các nghiên cứu tạo vaccine tái tổ hợp cũng được quan tâm nghiên cứu ở các

phòng thí nghiệm [4]. Một hướng nghiên cứu mới đang phát triển nhanh và rộng là

biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào động vật. Trong đó, đề tài biểu hiện protein

huỳnh quang (GFP) trong tế bào CHO-S đã được thực hiện làm công cụ cho các

nghiên cứu hiện tượng trong tế bào và cơ thể [7]. Gần đây, nhóm nghiên cứu TS

Nguyễn Thùy Dương đã nghiên cứu biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mô

người (h-tPA) ở tế bào CHO [8, 11], hay nhóm nghiên cứu Trường Đại học Công

nghiệp thành phố Hồ Chí Minh đã hoàn thành đề tài sản xuất protein erythropoietin

thông qua quá trình chuyển gen trên tế bào CHO-K1 [3]. Thêm vào đó là các nghiên

22

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

cứu hợp tác trong và ngoài nước giữa các đơn vị như đánh giá sự biểu hiện của

Cyp11b trong dòng tế bào HCT116 và COS-1 [10], biểu hiện gen yếu tố sinh trưởng

nguyên bào sợi 10 người (HFGF-10) trong tế bào COS-7 [5].

23

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

ƣơn 2 ẬT LI À ƢƠNG Á NG ÊN ỨU

2.1. Vật liệu

 Mẫu nghiên cứu

Tế bào JHH5, HEK293 từ Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

 Chủng vi sinh vật

Chủng E. coli DH10β của hãng Invitrogen được sử dụng để chọn dòng và nhân

dòng gen.

 Các vector

Vector tách dòng và biểu hiện: pcDNA3.1B his-myc (invitrogen)

 Các cặp mồi

Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa

trên trình tự cDNA chuẩn công bố trên Genbank (NM_000903.2) và đặt tổng hợp

hãng IDT (Mỹ) có trình tự như sau:

Bảng 2. Trình tự các cặp mồi được sử dụng.

STT Tên mồi

Trình tự nucleotide

NQO1-F-

5’-CTGAAGCTTAGCCATGGTCGGCAGAAGAGC-3’

HindIII

1

NQO1-R-

5’-GGAACTCGAGTTTCTAGCTTTGATCTGGTTG-3’

XhoI

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F/R) để nhân toàn bộ

cDNA mã hóa NQO1

 Hóa chất

Các enzyme giới hạn HindIII, XhoI...; các hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR

(đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq DNA polymerase) được đặt mua tại hãng

Fermentas.

Các hóa chất dùng để tách RNA, DNA plasmid hay điện di protein của hãng

BioRad (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merk (Đức).

24

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Các bộ Kit tổng hợp cDNA, tinh sạch sản phẩm PCR, tinh sạch DNA plasmid...

của hãng Promega (Mỹ), Invitrogen (Mỹ).

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được trình bày trong Bảng 3

Bảng 3. Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật.

Môi trường

Cao nấm

pH

Trypton (g) NaCl (g) Thạch (g) Hóa chất khác (g)

(1 lít)

men (g)

LB lỏng

7,0 5

10

10

NaOH: 0,144

LB đặc

7,0 5

10

10

15

NaOH: 0,144

Môi trường nuôi cấy, biến nạp tế bào động vật Invitrogen (Mỹ) như lipofectamin

TM 2000, DMEM, FBS (Biowest), NEAA 100X, PBS 10X Solution (Sigma).

 Trang thiết b

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị của Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen:

- Tủ lạnh sâu -20oC, -80oC (Sanyo, Nhật Bản), lò vi sóng (Hàn Quốc), pipetman các loại (Gilson, Pháp), cân phân tích (Mettler Toledo 10-4 g, Thụy Sĩ),

máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ), máy soi DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ),

máy điện di (PowerPac 300, BioRad, Mỹ), máy PCR (GeneAmp PCR System

9700), máy xác định trình tự ABI PRISM 3100- Genetic Analyzer, box nuôi cấy vi

sinh vật….

2.2. ƣơn p áp

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số

Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ tế bào gan dòng JHH5 người được

mô tả chi tiết theo quy trình sau:

 Đồng nhất mẫu Tế bào dòng JHH5 được nuôi đạt mật độ 106 tế bào và rửa tế bào bằng đệm

PBS lạnh, gạn bỏ dung dịch giữ lại tế bào, tiếp tục ủ với dung dịch Trypsin 0,2%

trong 2 - 5 phút để tách rời nhau hoàn toàn, bổ sung với 1 ml trizol lắc tròn để tế

25

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

bào bị phá vỡ thành dạng dịch phá vỡ tế, chuyển dịch mẫu vào ống Eppendorf 1,5

ml.

 Tách pha có chứa RNA

Bổ sung 0,2 ml chloroform, lắc đều trong 15 giây. Để hỗn hợp thu được ở nhiệt

độ phòng trong 10 phút.

Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.

Hút pha lỏng không màu ở trên cùng sang một ống Eppendorf sạch.

 Kết tủa RNA

Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ thể tích (1:1), trộn đều và để hỗn hợp trong 10

phút ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa RNA.

 Rửa RNA

Bổ sung 1 ml ethanol 70%, vortex để rửa RNA. Ly tâm 7.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, thu RNA và để khô kết tủa trong

không khí.

 Hòa tan RNA

Bổ sung 50 µl H2O đã được xử lý với DEPC 0,01%.

Lắc đều và ủ hỗn hợp trong 10-15 phút ở nhiệt độ phòng.

 Kiểm tra chất lƣợng và số lƣợng RNA

Xác định nồng độ RNA dựa trên giá trị OD260.

Điện di biến tính 4 l RNA tổng số để kiểm tra mức độ nguyên v n của RNA

tổng số.

RNA được lưu giữ ở -80oC.

2.2.2. Tổng hợp cDNA

cDNA sợi một được tổng hợp từ khuôn RNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn của Kit tổng hợp cDNA SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for

RT-PCR (Invitrogen). Các phân tử RNA thông tin có đuôi polyA ở đầu 3’ nên các

oligo (dT) sẽ bắt cặp bổ sung với đuôi poly A và dưới sự xúc tác của enzyme SuperScriptTM II Reverse Transcriptase tổng hợp nên các sợi cDNA. Sau cùng,

26

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

RNase H sẽ phân hủy toàn bộ RNA khuôn và sản phẩm thu được sẽ chứa toàn các

cDNA sợi đơn được gắn với đuôi oligo (dT) ở đầu 5’.

Phản ứng tổng hợp cDNA được tiến hành trong tổng thể tích 10 µl (0,3 µg RNA

tổng số, 1 µl dNTPS 10 mM, 1 µl mồi oligo (dT)12-18 0,5 µg/µl và H2O). Hỗn hợp được ủ ở 65oC trong 5 phút và làm lạnh trong đá trong ít nhất 1 phút.

Bổ sung 9 µl thể tích hỗn hợp (2 µl 10X RT buffer, 4 µl MgCl2 25 mM, 2 µl DTT 0,1 M và 1 µl RNaseOUTTM 40 U/µl) vào hỗn hợp trên và ủ phản ứng ở 42oC

trong 2 phút.

Bổ sung 1 µl SuperScriptTM II RT 50U/µl vào hỗn hợp và tiếp tục phản ứng ở

42oC trong 60 phút.

Dừng phản ứng ở 70oC trong 15 phút và làm lạnh nhanh trên đá. Bổ sung 1 µl RNaseH 2 U/µl vào hỗn hợp và ủ ở 37oC trong 30 phút. Giữ mẫu ở -20oC.

2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR

 ơ sở lý thuyết của PCR

PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA

in vivo trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp DNA kéo dài từ mồi dựa trên

nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo

dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn

chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba

bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả sau khoảng 2-3 giờ, lượng DNA

sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần.

 Quy trình kỹ thuật

 Một chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn sau:

Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép ban đầu tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt

độ cao (94 – 95oC) trong thời gian ngắn.

 Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ thích hợp (khoảng 50 – 60oC), hai mồi là các

oligonucleotide dài từ 15 – 30 nucleotide sẽ bám vào hai đầu của đoạn DNA đích

theo nguyên tắc bổ sung.

27

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

 Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên khoảng 70 - 80oC là nhiệt độ thích hợp để Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi,

tránh hiện tượng kết hợp không đặc hiệu.

 Thành phần của phản ứng:

Một mẫu phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 μl gồm có các

thành phần sau

Thành phần

Thể tíc μl

(17,8 – X)

H2O

Dung dịch đệm (10x)

2,5

dNTP (2,5 Mm)

2,5

Mồi xuôi (10 pmol)

1,0

Mồi ngược (10 pmol)

1,0

DNA khuôn

X

Taq polymerase

0,2

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân cDNA mã hóa cho NQO1

như sau:

2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Sản phẩm DNA (tách chiết từ E. coli, mô, từ phản ứng PCR…) được phân

tích định tính nhờ phương pháp điện di trên gel agarose. Agarose là một loại

polyme tách từ rong biển, cấu tạo của chúng gồm 2 monome là D-galactose và 3,6-

anhydro L-galactose.

28

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

 Nguyên tắc

DNA là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện

trường đều có hiệu điện thế và cường độ dòng điện thích hợp, chúng sẽ di chuyển từ

cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ nghịch với kích thước đoạn

DNA. Từ đó mà DNA được tách thành các vạch khác nhau trên bản gel.

Nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần

phân tách. Đoạn DNA có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng gel agarose càng

lớn và ngược lại. Bảng 4 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose cần sử

dụng để phân tách các trình tự DNA có kích thước xác định.

Bảng 4. Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn DNA cần phân

tách.

àm

lƣợng agarose

trong

íc t ƣớc các đoạn DNA cần

gel(%w/v)

phân tách (kb)

0,3

5 - 60

0,6

1 - 20

0,7

0,8 - 10

0,9

0,5 - 7

1,2

0,4 - 6

1,5

0,2 - 3

2,0

0,1 - 2

Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide

(EtBr) trong khoảng 10 phút. Các phân tử EtBr có khả năng gắn xen giữa các base

của DNA và phát huỳnh quang dưới tách dụng của tia UV, do đó các đoạn DNA sẽ

được biểu hiện hiện thành vạch đỏ da cam dưới ánh sáng đèn UV. Để ước lượng

kích thước các trình tự DNA trong gel agarose người ta dùng yếu tố đánh dấu trọng

lượng phân tử (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự

DNA có kích thước đã biết (Marker DNA).

29

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

 ác bƣớc tiến hành

Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cho 0,8 g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đem đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 60oC

thì đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã cài lược sẵn. Bề dày gel khoảng 5mm

là thích hợp. Sau 30 - 40 phút khi agarose đã được polyme hóa hoàn toàn là có thể

điện di được.

Tra mẫu DNA vào giếng điện di: DNA được trộn với đệm tra mẫu, sau đó tra

vào các giếng trên bản gel. Mẫu DNA được chạy điện di cùng với marker DNA để

xác định kích thước phân tử của DNA.

Chạy điện di: Chạy điện di với chương trình: Hiệu điện thế (U = 50 - 100 V),

cường độ dòng điện (I = 80 - 100 mA).

Nhuộm DNA: Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra và nhuộm trong dung

dịch EtBr nồng độ 0,5 µg/ml khoảng 10 - 15 phút. Sau đó lấy bản gel ra và rửa bằng

cách ngâm trong nước sạch 2 lần, mỗi lần 5-10 phút.

Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV254nm,

và được chụp ảnh.

2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn

 ơ sở lý thuyết

Sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành hai mảnh dạng đầu

bằng hay đầu dính tại các vị trí xác định nhờ trình tự nhận biết đặc hiệu.

 Quy trình

Một phản ứng cắt của enzyme giới hạn thường được tiến hành trong tổng thể

tích là 10 µl gồm các thành phần sau:

Thành phần

Thể tích (µl)

6,5

H2O

Đệm 10X của enzyme

1,0

DNA

2,0

Enzyme giới hạn

0,5

30

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Hỗn hợp phản ứng cắt được trộn đều, ủ ở 37oC với thời gian thích hợp tùy

từng loại enzyme. Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng cách điện di trên gel

agarose 0,8%.

2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose

Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector biểu hiện,

các sản phẩm PCR bằng cách điện di trên gel 0,8% agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV. Quy trình

tinh sạch DNA gồm các bước sau:

Làm tan gel:

 Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng và chuyển gel

vào ống Eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được.

 Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ: 10 μl dung dịch / 10 mg gel.

 Voltex và ủ ở 65oC cho đến khi gel tan hoàn toàn.

Gắn DNA lên màng của cột tinh sạch:

 Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch).

 Chuyển hỗn hợp gel đã tan vào cột tinh sạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1

phút.

 Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 2 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection.

Rửa màng:

 Bổ sung 700 μl dung dịch rửa màng (đã bổ sung cồn). Ly tâm 12000

vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới cột Collection.

 Rửa lại một lần bằng cách bổ sung tiếp 500 μl dung dịch rửa, ly tâm 12000

vòng/phút trong thời gian 5 phút. Loại bỏ phần dịch phía dưới cột Collection.

Thu DNA:

 Nh nhàng chuyển cột SV sang một ống Eppendorf 1,5 ml sạch.

 Bổ sung 50 μl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, ly

tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 2 phút.

 Loại bỏ cột SV và giữ DNA ở 4oC hoặc -20oC.

31

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Kiểm tra DNA bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%.

2.2.7. Ghép nối DNA

 ơ sở lý thuyết

Dưới sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các cầu nối phosphodieste sẽ

được hình thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau trên cùng một mạch (gốc

phosphat đầu 5’của nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của

nucleotide của đoạn DNA kia), đồng thời giải phóng một phân tử nước.

 Quy trình

Thành phần của một phản ứng ghép nối (10 µl):

Thành phần Thể tích (µl)

T4 DNA ligase buffer 10X 1

Sản phẩm PCR 4

DNA plasmid 1

T4 DNA ligase 1

3 H2O

Tổng 10

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 16oC trong khoảng 3 giờ.

2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

 Quy trình

Tạo tế bào khả biến cho mục đích chọn dòng:

 Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH10β trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc

200 vòng/phút ở 37oC qua đêm.

 Chuyển 0,5 ml dịch nuôi tế bào qua đêm sang 50 ml môi trường LB lỏng (pha loãng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục nuôi lắc ở 200 vòng/phút, 37oC

đến khi OD600 nm đạt 0,4 - 0,6. Dịch nuôi cấy sau khi chuyển sang ống ly tâm được

để trong đá 20 phút.

32

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

 Ly tâm 4.000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào.

 Tế bào sau khi ly tâm được hòa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phút ở

0oC, ly tâm 4.000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút để thu tế bào.

 Hoàn tan tế bào vào 25 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 25 phút ở 0oC, ly tâm 4.000

vòng/phút ở 4oC trong 10 phút để thu tủa tế bào.

 Hòa tế bào vào 1200 µl dung dịch chứa (800 µl CaCl2 0,1 M và 400 µl

glycerol 60%).

 Chia vào các ống Eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 µl dịch tế bào cho ngay vào

nitơ lỏng và bảo quản ở -80oC.

Biến nạp:  Tế bào khả biến được lấy ra từ -80oC và được làm tan trên đá trong 30 phút

(tránh sốc nhiệt).

 Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 µl mẫu sản phẩm ligation (DNA +

Vector + T4 DNA ligase), đảo nh nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào

khả biến. Sau đó, đặt toàn bộ trên đá trong thời gian 15 phút

 Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trên đá được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC trong 70 giây với sản phẩm ligation. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong thời gian 5 phút. Bổ sung 0,5 ml SOC, lắc hỗn hợp tế bào ở 37oC

trong 60 phút.

 Hút toàn bộ dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng

sinh Amp 100 µg/ml. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.

2.2.9. Tách chiết DNA plasmid

 ơ sở lý thuyết

Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa

chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn, biến tính các

phân tử protein và giải phóng các plasmid của vi khuẩn. Khi thay đổi giá trị pH của

dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali-acetat, các phân tử protein và DNA hệ

gen sẽ bị tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. RNA được loại bỏ

bằng cách bổ sung RNase.

33

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

 Quy trình

- Cấy chuyển một khuẩn lạc của tế bào E. coli mang plasmid cần tách vào trong

ống nghiệm chứa 1,7 ml môi trường LB có bổ sung Amp (100 µg/ml), nuôi lắc qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút.

- Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 6 phút tốc

độ 7.000 vòng/phút. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào.

- Hòa đều tế bào thu được với 150 µl dung dịch Sol I bằng máy vortex, để trên

đá 5 phút.

- Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II, đảo đầu ống Eppendorf nhanh, nh nhàng để

tránh đứt gẫy DNA, ủ trên đá 5 phút.

- Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch Sol III và đảo nh 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất

hiện kết tủa trắng, ủ trong đá 5 phút.

- Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút, 4oC.

- Thu dịch nổi và chuyển sang ống Eppendorf mới. Bổ sung 500 µl dung dịch

phenol/chloroform, trộn thật đều và ly tâm 15 phút, tốc độ 12.000 vòng/phút.

- Hút pha trên chuyển sang ống Eppendorf và lặp lại bước trên với 450 µl hỗn

hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1).

- Tủa dịch pha trên với 2,5 lần thể tích ethanol 100%, thêm dung dịch muối natri acetate (pH 5,2) tới nồng độ cuối cùng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa ở -20oC

khoảng 2 giờ.

Thu DNA kết tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Phần tủa

DNA được rửa 2 lần với ethanol 70%, mỗi lần 1 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút

trong 10 phút.

- Tủa DNA được làm khô bằng máy Speed-Vac, hòa tan DNA plasmid bằng 50 µl H2O có chứa RNase nồng độ cuối cùng là 10 µg/ml, ủ hỗn hợp ở 37oC trong thời

gian 30 phút.

- Điện di kiểm tra DNA plasmid trên gel agarose 0,8%.

2.2.10. Xác định trình tự DNA

 Nguyên tắc chung

34

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của phương

pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc

bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng

các ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1

Cycle Sequencing Kit đã có sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để

xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung

thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặcDNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp.

Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các

màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm:

Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15

μl.

 Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96oC – 1 phút; (96oC – 10 giây; 50oC – 5 giây; 60oC – 4 phút)x 25 chu kỳ. Sau đó giữ sản phẩm ở 4oC.

 Tinh sạch sản phẩm PCR bằn p ƣơn p áp t / T

Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 μl EDTA 125 mM, 60 μl EtOH 100% và để hỗn

hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút

để tủa DNA có trong đó.

Loại bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 μl EtOH 70%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10

phút.

Làm khô tủa và bổ sung 10 μl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95oC trong 5

phút.

Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI

PRISMTM 3100 Genetic Analyzer.

Kết quả được thu nhận và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant

Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2.

 Phân tích trình tự gen

35

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Kết quả nhận được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing

Analysis 5.2; Bioedit 7.0; Seqscape 2.5. Từ các chương trình này tiến hành:

So sánh trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.

Phân tích những sai khác để đưa ra những dự đoán cần thiết.

2.2.11. Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào động vật

 Quy trình

- Nuôi phục hồi tế bào

- Lấy ống giữ chủng được cất giữ trong bình nitơ lỏng ra, nhanh chóng để ống giữ chủng vào tủ nuôi 37oC hoặc bể ổn nhiệt 37oC để cho ống chủng chuyển từ

dạng đóng băng sang dạng lỏng.

- Dùng pipet hút toàn bộ phần dịch lỏng trong ống giữ chủng sang ống etrendrf

2 ml. Ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.

- Rửa tế bào 1 lần với PBS 1X. Ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 5

phút. Loại bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 1 ml môi trường nuôi mới và dùng pipet đảo nh nhàng để các tế bào

tách dời nhau. Chuyển tế bào sang đĩa nuôi có đường kính 60 mm để nuôi và bổ

sung môi trường nuôi vào đĩa nuôi.

- Quan sát đĩa nuôi cấy dưới kính hiển vi trước khi chuyển đĩa nuôi vào tủ nuôi.

- Quan sát tế bào sau khi khôi phục thường xuyên vào mỗi buổi sáng trong ngày

để đánh giá sự phát triển của tế vào.

- Biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào

Biểu hiện tạm thời dùng để kiểm tra nhanh hoạt động của các vector biểu hiện

tái tổ hợp. Quá trình này được thực hiện như mô tả từng bước như sau: Ngày 0: Chia 0,5.106 tế bào vào một đĩa nuôi (35x10 mm) trong 2 ml môi trường

nuôi với mục đích để ngày hôm sau biến nạp tế bào phát triển đạt từ 90-95% bề mặt

đĩa nuôi.

Ngày 1: Trước 30 phút biến nạp tiến hành thay môi trường Opti-MEM cho tế

bào ở đĩa nuôi.

36

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Chuẩn bị mẫu biến nạp: Chuẩn bị 2 ống Eppendorf 2 ml (ký hiệu A và B) chứa

250 µl môi trường Opti-MEM, bổ sung 4 µg DNA plasmid vào Eppendorf A và 10µl lipofectamineTM2000 vào Eppendorf B rồi để 5 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp

theo, trộn hỗn hợp A với B và để 20 phút ở nhiệt độ phòng. Trong thời gian này

tránh làm dung ống hay di chuyển ống vì giai đoạn này đang diễn ra sự hình thành

tủa DNA-lipofectamine.

Nhỏ từng giọt dung dịch chứa kết tủa DNA-lipofectamine vào đĩa nuôi tế bào tới

khi kết thúc và đặt đĩa nuôi lại tủ nuôi 37oC, 5% CO2 tiếp tục nuôi.

Sau 4 - 6 giờ biến nạp thì tiến hành thay môi trường không có kháng sinh cho tế

bào và lại tiếp tục nuôi.

Ngày 2-3: Tế bào lúc này có thể đem đi phân tích sự biểu hiện protein

- Chọn dòng tế bào biểu hiện gen ổn định

Chuyển vector tái tổ hợp mang gen biểu hiện vào tế bào được nuôi trên các

đĩa (35x10 mm) theo phương pháp lipofectamine. Khoảng 24 giờ sau biến nạp thay

môi trường có bổ sung kháng sinh geneticin với nồng độ cuối cùng 1mM. Môi

trường mới có bổ sung kháng sinh geneticin được thay hàng ngày và liên tục trong 7

ngày. Đây là thời gian cần thiết để geneticin tác động lên các tế bào không được

nhận DNA plasmid, làm cho chúng bong ra khỏi bề mặt đĩa nuôi và bị loại bỏ trong

mỗi lần thay môi trường. Khi tất cả các tế bào trên đĩa nuôi đối chứng đã hoàn toàn

bị chết, có thể thực hiện bước chọn dòng.

- Chuẩn bị 2 - 3 đĩa 96 giếng, bổ sung vào mỗi giếng 80 µl môi trường nuôi

có kháng sinh geneticin. Trypsin các tế bào từ đĩa nuôi sao cho các tế bào tách rời

nhau hoàn toàn ra và hòa tế bào vào ống falcon 15 ml. Thực hiện pha loãng (1:10)

từ 1 đến 2 lần rồi tiến hành đếm tế bào. Tiếp tục pha loãng tế bào cho tới khi đếm

được 3 - 6 tế bào trong một buồng đếm.

- Chuẩn bị dung dịch có chứa 5 tế bào trên 20 µl, các bước đếm tế bào phải

được tiến hành nhanh để tránh các tế bào lại co cụm lại với nhau. Bổ sung 20 µl

dịch tế bào đã pha loãng vào mỗi giếng.

37

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

- Để tế bào phát triển trên các giếng trong khoảng 15 ngày, quan sát tế bào

hàng ngày để đánh dấu những giếng chứa các tế bào phát triển từ một tế bào duy

nhất. Khoảng 5 ngày sau khi phát hiện sự phát triển tế bào, bổ sung 100 µl môi

trường có bổ sung kháng sinh geneticin vào các giếng nuôi để thiết lập nồng độ

kháng sinh và tránh các giếng bị nhiễm.

- Khi một khuẩn lạc chiếm khoảng 1/6 bề mặt giếng nuôi, chuyển tế bào sang

đĩa (35x10 mm). Tế bào sau khi phát triển tốt ở đĩa nuôi này sẽ chuyển sang đĩa

(60x15 mm), và (100x20 mm). Ở giai đoạn nuôi ở đĩa (100x20 mm) có thể giữ

chủng giống và thu tế bào để phân tích sự biểu hiện protein.

- Phương pháp chiết protein tổng số từ tế bào đã biến nạp

Tế bào sau biến nạp được nuôi 2-3 ngày tiến hành thu tế bào Bổ sung đệm

chiết ProteoJET Mammalian cell lysis reagent với thể tích gấp 20 lần thể tích sinh

khối tế bào. Làm tan tế bào trong đệm chiết bằng pipet hoặc vortex. Lắc dung dịch

đệm chiết chứa tế bào trong 30 phút trên đá ở điều kiện 900-1200 vòng/phút. Sau

đó, xác tế bào được loại bỏ bằng ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Chuyển

dịch trong chứa protein tổng số sang ống falcon mới. Dịch protein tổng số này có thể sử dụng phân tích ngay hoặc giữ ở -20oC. Protein tổng số được xác định nồng

độ bằng phương pháp Brardford và điện di kiểm tra trên gel acrylamide 12,6%.

2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE

SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli UK, 1970 với

các thiết bị của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lượng từ 12 - 68

kDa, chúng ta sử dụng gel ở nồng độ 10%, 12,5% và 15% (w/v). SDS-PAGE được

tiến hành trên gel 12,5%.

Thành phần các loại gel sử dụng trong điện di SDS-PAGE.

- Gel gom mẫu 5% ( 2 ml): 0,5 ml 0,5M Tris-HCl pH 6,8; 10l 10% (w/v)

SDS; 0,35 ml 30% (w/v) acrylamide; 1,3 ml H2O; 20 l 10% (w/v) APS; 2 l

TEMED

38

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

- Gel phân tách 12,5% (4,5 ml): 1,125 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; 45 l

10% (w/v) SDS; 0,9 ml 50% glycerol; 1,89 ml 30% (w/v) acrylamide; 0,55 ml H2O;

30 l 10% (w/v) APS; 3 l TEMED

Thành phần các loại đệm sử dụng trong điện di SDS-PAGE

- Đệm mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol; 14,4 mM β-mercaptoethanol; 2% (w/v)

SDS; 0,1 (w/v) bromophenol blue; 60 mM Tris-HCl pH 6,8

- Đệm điện di :25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% (w/v) SDS; pH 8,3

- Thang protein chuẩn (kDa): β-galactosidase (116), albumin huyết thanh bò

(66.2), ovalbumin (45), lactate dehydrogenase (35), endonuclease giới hạn

(25), lysozyme (14.4)

Để phân tích mức độ biểu hiện của protein, các bản gel được nhuộm bằng

Coomassie Brilliant Blue (CBB). Sau khi ủ với dung dịch nhuộm trong 30 phút, bản

gel được tẩy rửa bằng dung dịch tẩy cho đến khi có thể quan sát thấy các băng

protein.

39

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

ƣơn 3. K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ơ đồ thí nghiệm

Hình 7. Sơ đồ quy trình phân lập và thiết kế vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa

enzyme NQO1

3.2. Tách chiết RNA tổng số

NQO1 là một enzyme oxi hóa khử đặc trưng đóng vai trò quan trọng trong

giải độc tế bào bảo vệ tế bào trước tác nhân là các hợp chất quinon có hại, bên cạnh

đó gan là cơ quan chính trong việc giải độc cho cơ thể nơi các quá trình oxi hóa khử

diễn ra mạnh mẽ. Hơn nữa, các nghiên cứu đã chứng minh được ở các tế bào ung

thư, NQO1 được biểu hiện mạnh hơn rất nhiều. Chính vì thế chúng tôi đã chọn

dòng tế bào ung thư gan ở người là JHH5 là mẫu nghiên cứu.

Sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ mẫu tế bào gan bằng phương pháp

trizol được điện di biến tính trên gel agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện rõ các

40

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

băng 28S, 18S và 5S rRNA, không có hiện tượng bị phân hủy do quá trình tách

chiết.

Hình 8. Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%.

1 - Sản phẩm RNA tổng số của mẫu tế bào gan JHH5.

Như vậy, chúng tôi đã tách chiết được RNA tổng số từ mẫu tế bào gan ở

người. Mẫu RNA tổng số tách từ tế bào gan được sử dụng làm nguyên liệu cho việc

tổng hợp đoạn cDNA mã hóa NQO1.

3.3. Tạo dòng và thiết kế vector biểu hiện gen NQO1

3.3.1 Thiết kế cặp mồi và PCR

Để phân lập được đoạn cDNA mã hóa cho protein NQO1 từ cDNA tổng số,

cần phải có một cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng nhân đoạn gen NQO1 bằng kỹ thuật

PCR. Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa protein NQO1 của người đã công bố trên

Ngân hàng trình tự gen Quốc tế GENBANK/DDBJ/EMBL (mã số NM_000903.2),

chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân đoạn cDNA mã hóa NQO1 như sau:

NQO1- 5’-CTGAAGCTTAGCCATGGTCGGCAGAAGAGC-3’

HindIII

NQO1-R 5’-GGAACTCGAGTTTCTAGCTTTGATCTGGTTG-3’

XhoI

41

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Hình 9. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa NQO1

trên gel agarose 0,8%.

M: Marker 100bp (Fermentas);

1: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen NQO1 từ khuôn là cDNA từ phản ứng RT-PCR

Cặp mồi NQO1F/R đã được chúng tôi thiết kế mang các trình tự nhận biết

của enzyme giới hạn để sử dụng cho các quá trình ghép nối gen và kiểm tra sản

phẩm. Việc thiết kế thêm trình tự nhận biết của các enzyme giới hạn vào mồi tuân

theo một số nguyên tắc như trình tự nhận biết chỉ có một vị trí trong vùng đa điểm

cắt của vector và không có mặt trong gen cần tạo dòng. Số nucleotide phía ngoài

trình tự nhận biết từ 3-6 nucleotide nhằm bảo vệ các trình tự này và giúp các

enzyme cắt tốt hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai enzyme là XhoI

và HindIII, vì chúng thỏa mãn điều kiện có mặt trong vùng cắt gắn đa điểm của

vector biểu hiện pcDNA3.1B. Các enzyme này đều không có điểm cắt trên đoạn

cDNA mã hoá NQO1.

Từ nguồn tổng hợp cDNA được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân cDNA

mã hóa cho NQO1 chúng tôi sử dụng enzyme Taq DNA polymerase cùng với cặp

mồi đặc hiệu (F/R). Trong phản ứng nhân cDNA mã hóa NQO1, chúng tôi đã tối ưu

42

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

được nhiệt độ thích hợp nhất cho việc gắn mồi là 58oC. Sản phẩm PCR sau đó được

kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 9).

Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu được một băng đặc hiệu có kích

thước khoảng 0,8 kb phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của cDNA mã hóa

cho NQO1. Như vậy, cặp mồi được thiết kế và chu trình phản ứng PCR là phù hợp,

sản phẩm PCR chính là đoạn cDNA của gen NQO1 được tổng hợp thành công, đạt

độ đặc hiệu về kích thước và đảm bảo về nồng độ để sử dụng cho các thí nghiệm

tiếp theo.

3.3.2 Thiết kế vector tách dòng và biểu hiện pcDNA3.1B-NQO1

Mục đích của việc tạo dòng là thu được một lượng lớn bản sao của một trình

tự DNA xác định. Do vậy đặc điểm của vector tách dòng là có trình tự xác định đầy

đủ, có khả năng tự sao chép trong tế bào vật chủ và có chứa các gen chỉ thị hoặc gen

đánh dấu để nhận để nhận biết vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn để cài các

đoạn DNA ngoại lai. Tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA mong muốn tạo dòng và

mục đích tạo dòng mà chúng ta sử dụng loại vector phù hợp. Đối với đoạn DNA

cần tách dòng < 10kb thì vector plasmid được sự dụng nhiều nhất. Trong khi đó

mục đích của vector biểu hiện được thiết kế là tạo ra lượng lớn các phân tử m RNA

ổn định. Vector biểu hiện được dùng để đưa một hay nhiều gen xác định vào tế bào

vật chủ. Khi vector biểu hiện được đưa vào tế bào vật chủ, protein ngoại lai được

tạo ra nhờ vào bộ máy phiên mã và dịch mã của tế bào vật chủ. Vector thường mang

các trình tự hoạt động như promoter và các enhencer điều khiển quá trình hoạt động

gen đích. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pcDNA3.1B, một vector

mang đầy đủ điều kiện cho cả việc tách dòng và biểu hiện. Đây là thế hệ vector

thương mại do hãng Invitrogen sản xuất, mang tính ưu việt với các đặc điểm đáp

ứng cho mục đích tách dòng trong tế bào E. coli: có vị trí đa điểm MCS được thiết

kế cùng với gen bla, mã hóa cho enzyme β lactamase giúp chỉ những tế bào chứa

plasmid mang gen ngoại lai mới có khả năng sinh trưởng bình thường trên môi

trường bổ sung kháng sinh Ampicillin. Ngoài ra pcDNA3.1B còn mang nhiều đặc

điểm tiêu biểu cho vector biểu hiện trong tế bào động vật: sử dụng promoter CMV-

43

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

một promoter mạnh cùng trình tự gen kháng Neomycin đóng vai trò chọn lọc thể

nhận ổn định trong các tế bào động vật. Trong nghiên cứu này sau khi được ghép

nối vào pcDNA3.1B, gen NQO1 mã peptide trưởng thành của protein NQO1 sẽ

được dung hợp với his-tag và c-myc tag giúp dễ dàng phát hiện cũng như tinh sạch

protein NQO1thông qua phản ứng ELISA, SDS-PAGE và Western blotting với sự

có mặt của Anti-Myc hay Anti-His.

Hình 10. Cấu trúc vector tái tổ hợp pcDNA3.1B myc-his-NQO1

3.3.3 Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 trong vector pcDNA3.1B

 Xử lý sản phẩm PCR và vector pcDNA3.1B bằng enzyme giới hạn XhoI và

HindIII

Để việc gắn đoạn cDNA vào vector tách dòng đạt hiệu quả, sản phẩm PCR

phải được tinh sạch, chỉ thu một băng đặc hiệu và đồng thời loại bỏ được các thành

phần tạp chất có trong sản phẩm PCR như mồi, đệm, enzyme, dNTPs... Bằng cách

này, chúng ta có thể thu lại được khoảng 85% sản phẩm PCR. Sau đó, kết quả tinh

sạch được kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Như trong phần thiết kế mồi đã đề cập chúng tôi đã đưa trình tự nhận biết

của 2 enzyme giới hạn XhoI và HindIII vào hai đầu đoạn gen NQO1. Do đó để tiến

hành ghép nối đoạn gen NQO1 vào vector pcDNA3.1B thì sản phẩm PCR sau khi

tinh sạch sẽ được cắt tạo đầu dính để dễ dàng gắn vào vector, đồng thời vector

44

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

pcDNA3.1B cũng được tiến hành phản ứng cắt mở vòng với đồng thời cả hai

enzyme XhoI và HindIII. Sau khi các enzyme cắt hoàn toàn, cả sản phẩm PCR và

vector pcDNA3.1B được thu, tinh sạch bằng cách cho qua cột Qiagen như đã được

trình bày trong phần vật liệu và phương pháp. Kết quả tinh sạch lại được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 0,8% để chuẩn bị cho phản ứng ghép nối tạo vector tái

tổ hợp.

Hình 11. Điện di sản phẩm PCR và vector pcDNA 3.1B sau khi xử lý bằng

enzyme giới hạn trên gel agarose 0,8%

M: Maker 1kb 1: Sản phẩm PCR xử lý với XhoI+HindIII

2: Sản phẩm xử lý pcDNA3.1B với XhoI+ HindIII

Kết quả điện di ta thấy ở đường chạy số 1 có băng với kích thước 0,8kb tương

ứng với chiều dài của đoạn gen NQO1 (825bp) chứng tỏ gen NQO1 đã được thu lại

tốt sau khi tinh sạch qua cột Quiagen. Mặt khác vector pcDNA3.1B cũng được cắt

và thu hồi nên khi điện di phân tách trên gel agarose thì DNA tập trung tạo thành

một băng sắc nét có kích thước khoảng 5,5kb đúng như tính toán lý thuyết.

 Ghép nối gen NQO1 vào vector pcDNA3.1B

Sau khi cắt sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen NQO1 và vector

pcDNA3.1B bằng hai enzyme XhoI và HindIII tiếp đó thu và tinh sạch, chúng tôi

45

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

đã tiến hành phản ứng ghép nối nhờ tác dụng của enzyme T4-DNA ligase. Đây là

enzyme có nguồn gốc từ tế bào E. coli bị nhiễm thực khuẩn thể T4, được sử dụng

rộng rãi trong phản ứng nối ghép gen do có khả năng xúc tác hình thành liên kết

phosphodiester giữa các nucleotide cạnh nhau. T4-DNA ligase không chỉ có khả

năng ghép nối các đoạn DNA đầu dính mà còn có thể nối các DNA đầu bằng với

nhau.Vector tái tổ hợp thu được đặt tên là pcDNA3.1B-NQO1.

Ủ hỗn hợp phản ứng ghép nối ở nhiệt độ phòng trong 40 phút. Bảo quản ở 4oC qua đêm. Sau đó, chúng tôi đã lấy 5 μl sản phẩm ghép nối này và biến nạp vào

tế bào khả biến E. coli chủng DH10β để tiến hành chọn dòng.

 Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E. coli DH10 β

Sản phẩm của phản ứng ghép nối bao gồm các plasmid tái tổ hợp

pcDNA3.1B mang gen NQO1, các plasmid tự đóng vòng hay các đoạn DNA ghép

nối ngẫu nhiên. Chính vì vậy cần phải tiến hành sàng lọc chọn ra được plasmid tái

tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn, chúng tôi thực hiện biến nạp sản phẩm ghép

nối vào tế bào E. coli DH10 β, sử dụng bộ máy di truyền của chúng để sao chép các

plasmid thành lượng lớn sau đó tách chiết DNA plasmid các dòng đó để kiểm tra.

Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH10β bằng

phương pháp sốc nhiệt. Để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao, chúng tôi tiến hành

tạo tế bào khả biến E. coli DH10β. Tế bào khả biến sau khi được tạo ra sẽ được bảo quản -80 oC để tế bào không có khả năng sinh trưởng và vẫn giữ được trạng thái

thành tế bào xốp. Phương pháp tạo tế bào khả biến cũng như quá trình biến nạp sốc

nhiệt đã được trình bày rõ ở phần vật liệu và phương pháp.

 Chọn lọc các dòng mang plasmid tái tổ hợp

Các tế bào E. coli sau khi biến nạp sẽ được đem cấy trải trên môi trường LB

đặc bổ sung thêm kháng sinh Ampicillin và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37ºC.

Kết quả chúng tôi đã thu được rất nhiều khuẩn lạc trên đĩa. Theo lý thuyết

cơ chế chọn lọc kháng sinh thì các tế bào E. coli DH10β không mang plasmid ngoại

lai không thể sinh trưởng trên môi trường có kháng sinh, đồng thời các khuẩn lạc

mọc được trên đĩa là các khuẩn lạc có mang vector pcDNA3.1B tái tổ hợp. Tuy

46

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

nhiên, để xác định các khuẩn lạc đó có thực sự mang vector pcDNA3.1B tái tổ hợp

hay không, chúng tôi đã tiến hành tách chiết plasmid từ khuẩn lạc để kiểm tra kích

thước plasmid.

Hình 12. Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β

 Tách chiết DNA plasmid

Các dòng khuẩn lạc sẽ được chọn lọc nuôi trong môi trường LB lỏng để thu

sinh khối và tách DNA plasmid. Để tách chiết DNA plasmid, cần tiến hành nuôi cấy

một số khuẩn lạc trong môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh Amp với nồng độ 100 μg/ml ở 37oC trong khoảng thời gian từ 12-14 giờ (qua đêm) và tiến hành tách

chiết DNA plasmid như đã trình bày. Kết quả tách chiết DNA plasmid được kiểm

tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%.

Chúng tôi đã tiến hành tách DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc kết quả

được thể hiện trên hình 13. Các dòng plasmid mang đoạn chèn là các plasmid có

kích thước lớn hơn so với kích thước của vector (đối chứng âm). Như trên hình ảnh

điện di ta có thể tạm thời kết luận các dòng plasmid có DNA ở các giếng 2, 4, 8 là

các dòng có khả năng mang đoạn chèn tương ứng với các dòng pcDNA3.1B-

NQO1-10, pcDNA3.1B-NQO1-15 và pcDNA3.1B -NQO1-19)

47

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Hình 13. Điện di kết quả tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose

0,8%

1 :Đối chứng âm (DNA plasmid vector pcDNA3.1B his-myc

2-14: DNA các dòng plasmid sau khi được biến nạp

 Kiểm tra sự có mặt của cDNA của NQO1 trong vector tái tổ hợp

pcDNA3.1B

Chúng tôi đã tiến hành xử lý plasmid của các dòng: pcDNA3.1B-NQO1-10,

pcDNA3.1B-NQO1-15 và pcDNA3.1B-NQO1-19 bằng hai enzyme giới hạn

HindIII và XhoI để kiểm tra kích thước đoạn chèn.

Kết quả cho thấy, plasmid của 3 dòng này khi được xử lý bằng hai enzyme

nói trên đã cho hai băng: một băng có kích thước khoảng 5,5kb (tương đương với

kích thước của vector pcDNA3.1B) và một băng có kích thước khoảng 0,8 kb

(tương đương kích thước của sản phẩm PCR) đúng như tính toán theo lý thuyết. Từ

đó, chúng tôi có thể tạm thời kết luận được đã thành công trong việc tách dòng và

thiết kế vector biểu hiện pcDNA3.1B- NQO1.

48

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Hình 14. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

trên gel agarose 0,8%

M: Marker 1kb 4: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa NQO1

1-3 : Sản phẩm xử lý pcDNA3.1 B –NQO1 với enzyme XhoI + HindIII của các dòng lần

lượt là pcDNA3.1B-NQO1-10, pcDNA3.1B -NQO1-15 và pcDNA3.1B -NQO1-19)

5: Sản phẩm xử lý pcDNA3.1B với enzyme XhoI+ HindIII

 Trình tự nucleotide của NQO1

Để khẳng định chính xác sản phẩm tách dòng là đoạn cDNA của gen NQO1

vào vector pcDNA3.1B, cũng như kiểm tra độ chính xác trình tự nucleotide sau khi

ghép nối vào vector có bị sai lệch hay không trước khi sử dụng vector tái tổ hợp này

cho mục đích biểu hiện sản phẩm được tiếp tục xác định trình tự nucleotide. Sau khi

phân tích trình tự cả ba dòng plasmid tái tổ hợp, đoạn cDNA có chiều dài 825bp,

khung dịch mã được xác định mã hóa enzyme NQO1 gồm 274 amino acid kể cả mã

kết thúc.

Tiến hành so sánh trình tự cDNA đầy đủ của gen NQO1 được phân lập từ tế

bào gan JHH5 với trình tự đã được công bố trên GenBank (NM_000903.2) chúng

tôi nhận thấy ở dòng pcDNA3.1B-NQO1-10 có sai khác ở 3 vị trí nucleotide dẫn

đến sai khác ở 2 vị trí A481G ->I161V, insert754A->F252I và làm lệch khung đọc;

dòng pcDNA3.1B-NQO1-15 có độ tương đồng 100% cả trình tự nucleotide và

49

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

amino acid, dòng pcDNA3.1B-NQO1-19 có sai khác ở 5 vị trí nucleotide dẫn đến

sai khác ở 4 amino acid: T88C-> không thay đổi aminoacid, A481G->I161V,

C560T->P187L, T605C->I202T, A803del->N268T và làm lệch khung đọc. Như

vậy, sai khác A481G xuất hiện ở cả hai dòng plasmid 10 và 19.

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

10 20 30 40 50

NM_000903.2 1 ATGGTCGGCA GAAGAGCACT GATCGTACTG GCTCACTCAG AGAGGACGTC

NQO1 10 1 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 1 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 1 .......... .......... .......... .......... ..........

60 70 80 90 100

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 51 CTTCAACTAT GCCATGAAGG AGGCTGCTGC AGCGGCTTTG AAGAAGAAAG

NQO1 10 51 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 51 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 51 .......... .......... .......... .......C.. ..........

110 120 130 140 150

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 101 GATGGGAGGT GGTGGAGTCG GACCTCTATG CCATGAACTT CAATCCCATC

NQO1 10 101 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 101 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 101 .......... .......... .......... .......... ..........

160 170 180 190 200

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 151 ATTTCCAGAA AGGACATCAC AGGTAAACTG AAGGACCCTG CGAACTTTCA

NQO1 10 151 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 151 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 151 .......... .......... .......... .......... ..........

210 220 230 240 250

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 201 GTATCCTGCC GAGTCTGTTC TGGCTTATAA AGAAGGCCAT CTGAGCCCAG

NQO1 10 201 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 201 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 201 .......... .......... .......... .......... ..........

50

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

260 270 280 290 300

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 251 ATATTGTGGC TGAACAAAAG AAGCTGGAAG CCGCAGACCT TGTGATATTC

NQO1 10 251 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 251 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 251 .......... .......... .......... .......... ..........

310 320 330 340 350

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 301 CAGTTCCCCC TGCAGTGGTT TGGAGTCCCT GCCATTCTGA AAGGCTGGTT

NQO1 10 301 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 301 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 301 .......... .......... .......... .......... ..........

360 370 380 390 400

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 351 TGAGCGAGTG TTCATAGGAG AGTTTGCTTA CACTTACGCT GCCATGTATG

NQO1 10 351 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 351 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 351 .......... .......... .......... .......... ..........

410 420 430 440 450

....|....| ....| ....|....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 401 ACAAAGGACC CTTCCGGAGT AAGAAGGCAG TGCTTTCCAT CACCACTGGT

NQO1 10 401 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 401 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 401 .......... .......... .......... .......... ..........

460 470 480 490 500

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 451 GGCAGTGGCT CCATGTACTC TCTGCAAGGG ATCCACGGGG ACATGAATGT

NQO1 10 451 .......... .......... .......... G......... ..........

NQO1 15 451 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 451 .......... .......... .......... G......... ..........

510 520 530 540 550

....|....| ....|....| ....|.... |....|....| ....|....|

NM_000903.2 501 CATTCTCTGG CCAATTCAGA GTGGCATTCT GCATTTCTGT GGCTTCCAAG

NQO1 10 501 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 501 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 501 .......... .......... .......... .......... ..........

51

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

560 570 580 590 600

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 551 TCTTAGAACC TCAACTGACA TATAGCATTG GGCACACTCC AGCAGACGCC

NQO1 10 551 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 551 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 551 .........T .......... .......... .......... ..........

610 620 630 640 650

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 601 CGAATTCAAA TCCTGGAAGG ATGGAAGAAA CGCCTGGAGA ATATTTGGGA

NQO1 10 601 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 601 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 601 ....C..... .......... .......... .......... ..........

660 670 680 690 700

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 651 TGAGACACCA CTGTATTTTG CTCCAAGCAG CCTCTTTGAC CTAAACTTCC

NQO1 10 651 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 651 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 651 .......... .......... .......... .......... ..........

710 720 730 740 750

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 701 AGGCAGGATT CTTAATGAAA AAAGAGGTAC AGGATGAGGA GAAAAACAAG

NQO1 10 701 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 701 .......... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 701 .......... .......... .......... .......... ..........

760 770 780 790 800

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NM_000903.2 751 AAA-TTTGGC CTTTCTGTGG GCCATCACTT GGGCAAGTCC ATCCCAACTG

NQO1 10 751 ...A...... .......... .......... .......... ..........

NQO1 15 751 ...-...... .......... .......... .......... ..........

NQO1 19 751 ...-...... .......... .......... .......... ..........

810 820

....|....| ....|....| ....|..

NM_000903.2 800 ACAACCAGAT CAAAGCTAGA AAATGA-

NQO1 10 801 .......... .......... ..C.CGA

NQO1 15 800 .......... .......... ....CGA

NQO1 19 800 ...-...... .......... ..C.CGA

Hình 15. So sánh trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của các dòng plasmid

mang cDNA mã hóa protein NQO1 ở người và trình tự đã công bố

52

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Từ các kết quả thu được (Hình 15), chúng tôi có thể khẳng định rằng đoạn

cDNA mã hóa enzyme NQO1 được tạo dòng đúng trong vector biểu hiện

pcDNA3.1B. Như vậy có thể kết luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ

hợp pcDNA3.1B-NQO1 mang cDNA mã hóa cho NQO1 và cấu trúc này đã được

chọn dòng trong vi khuẩn E. coli DH 10β.

Để chắc chắn cấu trúc vector tái tổ hợp có khả năng biểu hiện được protein

NQO1, chúng tôi kiểm tra việc lắp ghép này có làm thay đổi khung đọc hay không

bằng phân tích trình tự suy diễn, đoạn cDNA có chiều dài 825bp dựa trên khung

đọc mã hóa enzyme NQO1 gồm 274 amino acid kể cả mã kết thúc của dòng

plasmid pcDNA3.1B-NQO1-15 kết quả cho thấy ngoài trình tự amino acid của

protein NQO1 đã được công bố còn có cả trình tự của epitop c-myc cùng đuôi 6x

10 20 30 40

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

His của vector biểu hiện đúng như tính toán lý thuyết.

P15.NQO1 1 MVGRRALIVL AHSERTSFNY AMKEAAAAAL KKKGWEVVES

NM_000903.2 1 .......... .......... .......... ..........

50 60 70 80

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

P15.NQO1 41 DLYAMNFNPI ISRKDITGKL KDPANFQYPA ESVLAYKEGH

NM_000903.2 41 ................... .......... ..........

90 100 110 120

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

P15.NQO1 81 LSPDIVAEQK KLEAADLVIF QFPLQWFGVP AILKGWFERV

NM_000903.2 81 .......... .......... .......... ..........

130 140 150 160

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

P15.NQO1 121 FIGEFAYTYA AMYDKGPFRS KKAVLSITTG GSGSMYSLQG

NM_000903.2 121 .......... .......... .......... ..........

170 180 190 200

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

P15.NQO1 161 IHGDMNVILW PIQSGILHFC GFQVLEPQLT YSIGHTPADA

NM_000903.2 161 .......... .......... .......... ..........

53

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

210 220 230 240

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

P15.NQO1 201 RIQILEGWKK RLENIWDETP LYFAPSSLFD LNFQAGFLMK

NM_000903.2 201 .......... .......... .......... ..........

250 260 270 280

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

P15.NQO1 241 KEVQDEEKNK KFGLSVGHHL GKSIPTDNQI KARNSSLEGP

NM_000903.2 241 .......... .......... .......... ...K*

290 300

....|....| ....|....| ....

P15.NQO1 281 RFEQKLISEE DLNMHTGHHH HHH*

NM_000903.2 275

c-myc 6x His

Hình 16. Trình tự amino acid suy diễn của các plasmid pcDNA3.1-NQO1-15 mang

đoạn cDNA mã hóa NQO1 và trình tự đã công bố NM_000903.2

Như vậy chúng tôi đã thành công trong việc tách dòng và thiết kế vector

biểu hiện mã hóa cho enzyme NQO1, dòng plasmid pcDNA3.1-NQO1-15 được

chọn là cấu trúc biểu hiện cần được nhân lượng lớn trong E. coli 10β. Cấu trúc biểu

hiện này sẽ được tách chiết và tinh sạch trước khi được sử dụng làm nguyên liệu

cho việc biểu hiện trong tế bào động vật.

3.4 Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào động vật

3.4.1 Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK 293

Với mục đích sưu tập và nuôi một dòng tế bào ổn định phục vụ cho các

nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp, chúng tôi đã sử dụng tế bào HEK293 của hãng

Invitrogen. Cũng giống như các dòng tế bào động vật nuôi cấy, tế bào HEK 293

cũng được chọn lọc thích nghi với các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Ở điều kiện

nuôi cấy tĩnh trong môi trường có bổ sung huyết thanh, tế bào HEK293 sống bám

thành lớp mỏng trên bề mặt đĩa hoặc bình nuôi còn trong điều kiện nuôi lắc ở môi

54

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

trường không bổ sung huyết thanh, tế bào sống dạng huyền phù. Đây là ưu thế quan

trọng trong nghiên cứu sản xuất các protein tái tổ hợp mang lại hiệu quả cao trong

biểu hiện và giảm được chi phí cho môi trường nuôi cấy. Bên cạnh đó dòng tế bào

HEK đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới như một công cụ trong biểu hiện

protein tái tổ hợp. Mặc dù có nguồn gốc biểu mô, bộ máy sinh hóa của nó lại có khả

năng thực hiện được hầu hết sự cuộn gấp sau dịch mã và biến đổi cần thiết để tạo ra

protein chức năng trưởng thành từ một dãy rộng nuclecid ở động vật có vú và không

có vú.

Trước khi tiến hành biến nạp, các tế bào biểu hiện từ trạng thái đông lạnh được nuôi

phục hồi bằng môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh, điều kiện nuôi là tủ ấm

37oC và 5% CO2, tạo ra các tế bào khỏe mạnh. Sau 14 ngày, các tế bào phát triển

đạt 70% bề mặt bình nuôi cấy và bắt đầu được chia ra các bình nuôi. Các tế bào

được duy trì ổn định bằng cách thay môi trường mới 3 ngày/lần. Sau 2-4 thế hệ một

nửa tế bào được giữ dòng và bảo quản -80oC, 7 ngày sau khi giữ dòng một ống tế

bào đã được nuôi phục hồi để kiểm tra khả năng sống sót. Kết quả là tế bào chỉ phát

triển trở lại sau 3 ngày phục hồi (hình 17). Như vậy việc nuôi ổn định và giữ dòng

tế bào đã được tiến hành tốt. Các tế bào này sẽ được sử dụng cho những nghiên cứu

chuyển gen vào tế bào và biểu hiện protein tái tổ hợp.

Hình 17. Tế bào HEK293 được nuôi trong môi trường DMEM

có bổ sung huyết thanh

55

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

3.4.2 Chuẩn bị vector pcDNA3.1-NQO1 cho chuyển gen

Trong nghiên cứu này, sau khi tìm được plasmid mang cDNA mã hóa cho

enzyme NQO1 chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp (pcDNA3.1B và

pcDNA3.1B-NQOQ-15 mang gen mã hóa cho enzyme NQO1) vào tế bào HEK

theo phương pháp lipofectamine. Biểu hiện tạm thờicủa cDNA của NQO1 được

điều khiển bởi promoter immediate early CMV có nguồn gốc từ cytomegalovirus.

Trên vector pcDNA3.1B còn có cấu trúc biểu hiện gen kháng neomycin/kanamycin

cho phép chọn dòng tế bào chuyển gen ổn định nhờ kháng sinh chọn lọc geneticine

(G418). Ngoài ra đoạn cDNA được ghép nối cùng với đuôi c-myc và 6xHis giúp

cho quá trình phát hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp trong tế bào vật chủ dễ dàng.

Để đạt hiệu quả cao trong biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thì plasmid

dùng cho biến nạp phải được tinh sạch với nồng độ cao. Chúng tôi đã tiến hành tách

chiết plasmid và tinh sạch bằng phương pháp chiết phenol. Vector tái tổ hợp sau đó

được kiểm tra chất lượng và nồng độ trên máy đo OD ở bước sóng 260 và 280nm.

Tỷ lệ giá trị OD260/280 >1,8 chứng tỏ plasmid tách được đủ tinh sạch cho bước

biến nạp vào tế bào động vật.

3.4.3 Biểu hiện nhanh NQO1 trong tế bào động vật

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng phương pháp lipofectamine TM2000 để biến nạp pc DNA3.1-NQO1 và pcDNA3.1B vào tế bào HEK293.

Khoảng 24 giờ sau biến nạp thay môi trường có bổ sung kháng sinh geneticin. Môi

trường mới có bổ sung kháng sinh geneticin được thay hàng ngày và liên tục trong 7

ngày. Đây là thời gian cần thiết để geneticin tác động lên các tế bào không được

nhận DNA plasmid, làm cho chúng bong ra khỏi bề mặt đĩa nuôi và bị loại bỏ trong

mỗi lần thay môi trường. Khi tất cả các tế bào trên đĩa nuôi đối chứng đã hoàn toàn

bị chết, tiến hành chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp. Khi một khuẩn lạc chiếm

khoảng 1/6 bề mặt giếng nuôi, chuyển tế bào sang đĩa (35x10 mm). Tế bào sau khi

phát triển tốt ở đĩa nuôi này sẽ chuyển sang đĩa (60x15 mm), và (100x20 mm), có

thể giữ chủng giống và thu tế bào để phân tích sự biểu hiện protein. Kết thúc thí

nghiệm, chúng tôi thu được dịch tế bào có chứa protein tổng số. Để kiểm tra kết quả

biểu hiện chúng tôi đã tiến hành điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide

56

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

12,6% có SDS. Kết quả điện di protein tổng số của mẫu được trình bày ở hình 18.

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy, trong dịch chiết protein tổng số của mẫu tế

bào mang plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1B-NQO1 (ở đường chạy số 2), có xuất hiện

một băng protein mới có khối lượng phân tử khoảng 33 kDa so với mẫu tế bào

mang plasmid pcDNA3.1B (ở đường chạy số 1). Theo phần thiết kế vector biểu

hiện thì protein tái tổ hợp bao gồm đoạn protein NQO1 (274 aa tương ứng với

30kDa) và phần đuôi myc-his có trọng lượng phân tử khoảng 3 kDa, tương đương

với băng có kích thước khoảng 33 kDa. Như vậy, protein mới này có trọng lượng

phân tử hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Có thể tạm thời khẳng định hệ

biểu hiện của vector pcDNA3.1B có mang trình tự đoạn gen mã hóa cho protein

NQO1 đã hoạt động dẫn đến sự biểu hiện một protein mới và đó là protein tái tổ

hợp mà chúng tôi mong muốn.

Hình 18. Điện di biểu hiện tạm thời protein trên gel polyacrylamide 12,6%

M: Marker protein (Fermentas)

1: Protein tổng số của mẫu tế bào đối chứng mang plasmid pcDNA3.1B

2: Protein tổng số của mẫu tế bào HEK mang plasmid tái tổ hợp

pcDNA3.1B-NQO1.

57

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

Protein tái tổ hợp NQO1 có gắn đuôi 6x-histidine nên protein tái tổ hợp

này có thể được tinh sạch bằng hệ thống cột resin có gắn nickel chuyên dùng cho

các protein tái tổ hợp chứa đuôi histidine. Resin là chất mang dạng agarose liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với Ni2+. Cột resin-

nickel có ái lực cao với các protein có chứa 6 gốc histidine. Việc gắn kết hình thành thông qua liên kết giữa ion Ni2+ và His trong phân tử protein. Protein được tinh sạch

trong điều kiện không biến tính và protein được thôi ra bằng muối imidazol

Các tế bào chuyển gen và biểu hiện ổn định NQO1 được chọn lọc và giữ

dòng. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy tiềm năng ứng dụng các kỹ thuật như

nuôi cấy tế bào động vật có vú, chuyển gen, biểu hiện nhanh protein và chọn dòng

tế bào chuyển gen trong nghiên cứu chuyển gen tại Việt Nam. Đây là cơ sở cho các

nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tạo protein tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong hệ

biểu hiện tế bào động vật có vú.

58

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ

Kết luận

Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi có một số kết luận sau:

 Từ tế bào nuôi cấy JHH5, chúng tôi đã tách được RNA tổng số có chất lượng

đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho enzyme NQO1.

 Đã nhân được đoạn cDNA mã hóa cho enzyme NQO1. Đoạn cDNA mã hóa

NQO1 có độ dài tương ứng 822bp mã hóa 274 amino acid đã được tách dòng

và giải trình tự đúng so với Genbank.

 Đã thiết kế được vector biểu hiện pcDNA3.1 B mang đoạn cDNA mã hóa

NQO1 và biểu hiện tạm thời được gen mã hóa cho enzyme NQO1 ở tế bào

HEK293.

Kiến ngh

 Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa NQO1 trong vector pcDNA3.1B

ở tế bào HEK293.

 Nghiên cứu phương pháp thu hồi tinh sạch protein NQO1.

59

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

TÀI LI U THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải

(2005), "Biểu hiện gen interleukin-2 của người rh-IL2MM bị đột biến tại

các điểm glycosyl hóa và gốc cysteine 125 trong Escherichia coli", Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 3(2),tr. 149-154.

2. Lã Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Đặng Thị Thu, Lê Quang Huấn

(2009), "Biểu hiện kháng nguyên CD25 tái tổ hợp trong vi khuẩn E.

coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(3), tr. 319-324.

3. Lê Trầm Nghĩa, Thư Trần Phong, Hoàng Thanh Tuấn, Quan Quốc Đăng, Đỗ

Minh Sĩ, Đàm Sao Mai (2010), "Sản xuất protein Erthroprotein thông

qua quá trình chuyển gen trên tế bào CHO-K1(Chinese Hamster ovary)",

Tạp chí Khoa học và Phát triển, 8(3), tr. 498-504.

4. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), "Nghiên cứu và phát triển sản xuất

vaccine ăn được trong thực vật", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr.

133-142.

5. Nguyễn Bích Nhi, Masashi Suzuki (2003), "Chuyển và biểu hiện gien yếu tố

sinh trưởng nguyên bào sợi 10 người (HFGF-10) ở tế bào động vật bậc

cao", Tạp chí Sinh học, 25(4), tr. 37-41.

6. Nguyễn Đình Cường, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Đặng Thành Nam,

Phan Văn Chi (2004), "Tinh chế và phân tích khối phổ protein bất hoạt

ribosome tái tổ hợp từ cây mướp đắng (Momordica charantia L.) ", Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 2(2), tr. 217-226.

7. Nguyễn Hải Hà, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải (2009), "Biểu hiện protein

huỳnh quang xanh (GFP) trong tế bào động vật có vú nuôi cấy", Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 7(3), tr. 313-318.

8. Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Văn Phòng, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Huy Hoàng,

Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2010), "Biểu hiện yếu tố hoạt hóa

60

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

plasminogen mô (h-tPA) người ở tế bào", Kỷ yếu hội nghị sinh học phân

và hóa sinh y học, tr. 185-191.

9. Nguyễn Hoàng Lộc (2006), "Giáo trình Công nghệ tế bào", NXB Đại học Huế,

tr. 203.

10. Nguyễn Huy Hoàng, Rita Bernhardt (2012), "Đánh giá sự biểu hiện của

Cyp11Bs trong dòng tế bào HCT116", Tạp chí Công nghệ Sinh học,

34(3), tr. 326-330.

11. Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Văn Phòng, Nông Văn Hải (2010), "Tách dòng

và phân tích trình tự cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX (h-F9) ở người",

Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(4), tr. 1785-1792.

12. Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003),

"Khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của

Trichobakin tái tổ hợp", Y học Việt Nam, 284, tr. 26-30.

13. Vũ Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh, Bùi Khánh Chi, Trương Nam

Hải (2009), "Biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người trong tế bào

Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(1), tr. 35-39.

Tài liệu tiếng Anh

14. Alard A, Fabre B, Anesia R, Marboeuf C, Pierre P, Susini C, Bousquet C,

Pyronnet S. (2010), "NAD(P)H quinone-oxydoreductase 1 protects

eukaryotic translation initiation factor 4GI from degradation by the

proteasome.", Mol Cell Biol, 30(4), pp. 1097-1105.

15. Albena T, Dinkova-Kostova and Talalay Paul (2010), "NAD(P)H:quinone

acceptor oxidoreductase 1 (NQO1), a multifunctional antioxidant

enzyme and exceptionally versatile cytoprotector", Arch Biochem

Biophys, 501(1), pp. 116-118.

16. Anwar A, Dehn D, Siegel D, Kepa JK, Tang LJ, Pietenpol JA, Ross D (2003),

"Interaction of human NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1) with

the tumor suppressor protein p53 in cells and cell-free systems.", J Biol

Chem, 278(12), pp. 10368-10373.

61

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

17. Asher G, Bercovich Z, Tsvetkov P, Shaul Y, Kahana C. (2005), "20S

proteasomal degradation of ornithine decarboxylase is regulated by

NQO1.", Mol Cell Biol, 17(5), pp. 645-655.

18. Asher G, Dym O, Tsvetkov P, Adler J, Shaul Y. (2006), "The crystal structure

of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 in complex with its potent

inhibitor dicoumarol.", Biochemistry, 45(20), pp. 6372-6378.

19. Asher G, Lotem J, Cohen B, Sachs L, Shaul Y. (2001), "Regulation of p53

stability and p53-dependent apoptosis by NADH quinone oxidoreductase

1.", Proc Natl Acad Sci U S A, 98(3), pp. 1188-1193.

20. Asher G, Lotem J, Kama R, Sachs L, Shaul Y (2002), "NQO1 stabilizes p53

through a distinct pathway.", Proc Natl Acad Sci USA, 99(5), pp. 3099-

3104.

21. Asma Chinigarzadeh, Razauden Zulkifli, Iman Yaze and Reyhaneh rahnamai

tajadod (2012), "Isolation and cloning of human NQO1 promoter in Pgl3

basic vector", International journal of scientific & technology research,

1(7), pp. 2277-8616.

22. Bauer AK, Faiola B, Abernethy DJ, Marchan R, Pluta LJ, Wong VA, Roberts

K, Jaiswal AK, Gonzalez FJ, Butterworth BE, Borghoff S, Parkinson H,

Everitt J, Recio L. ( 2003 ), "Genetic susceptibility to benzene-induced

toxicity: role of NADPH: quinone oxidoreductase-1.", Cancer Res, 63,

pp. 929-935.

23. Beyer RE, Segura-Aguilar J, di Bernardo S, Cavazzoni M, Fato R, Fiorentini

D, Galli MC, Setti M, Landi L, Lenaz G. (1997), "The two-electron

quinone reductase DT-diaphorase generates and maintains the

antioxidant (reduced) form of coenzyme Q in membranes.", Mol Aspects

Med, 18, pp. 15-23.

24. Bianchet MA, Faig M, Amzel LM. (2004), "Structure and mechanism of

NAD[P]H:quinone acceptor oxidoreductases (NQO)", Methods

Enzymol., 382, pp. 144-174.

62

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

25. Bui CB, Shin J ((2011), "Persistent expression of Nqo1 by p62-mediated Nrf2

activation facilitates p53-dependent mitotic catastrophe", Biochem

Biophys 412, pp. 347-352.

26. Chandrasena RE, Edirisinghe PD, Bolton JL, Thatcher GR. (2008),

"Problematic detoxification of estrogen quinones by NAD(P)H-

dependent quinone oxidoreductase and glutathione-S-transferase.", Chem

Res Toxicol, 21(7), pp. 1324-1329.

27. Deller S, Macheroux P, Sollner S (2008), "Flavin-dependent quinone

reductases", Cell Mol Life Sci, 65(1), pp. 141-160.

28. Dinkova-Kostova AT, Cheah J, Samouilov A, Zweier JL, Bozak RE, Hicks

RJ, Talalay P. (2007), "Phenolic Michael reaction acceptors: combined

direct and indirect antioxidant defenses against electrophiles and

oxidants.", Med Chem, 3, pp. 261-268.

29. Dinkova-Kostova AT, Fahey JW, Talalay P (2004), "Chemical structures of

inducers of nicotinamide quinone oxidoreductase 1 (NQO1).", Methods

Enzymol., 382, pp. 423-448.

30. Dinkova-Kostova AT, Talalay P (2008 ), "Direct and indirect antioxidant

properties of inducers of cytoprotective proteins", Mol Nutr Food Res,

52, pp. 128-138.

31. Fagerholm Retal (2008), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 NQO1*2

genotype (P187S) is a strong prognostic and predictive factor in breast

cancer.", Nat Genet, 40(7), pp. 844-853.

32. Fahey JW, Dinkova-Kostova AT, Stephenson KK, Talalay P. (2004), "The

"Prochaska" microtiter plate bioassay for inducers of NQO1", Methods

Enzymol., 382, pp. 243-258.

33. Faig M, Bianchet MA, Talalay P, Chen S, Winski S, Ross D, Amzel LM

(2000), "Structures of recombinant human and mouse NAD(P)H:quinone

oxidoreductases: species comparison and structural changes with

63

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

substrate binding and release.", Proc Natl Acad Sci USA, 97(7), pp.

3177-3182.

34. Fridovich I (1995), "Superoxide radical and superoxide dismutases", Annu

Rev Biochem, 64, pp. 97-106.

35. Gaikwad A, Long DJ 2nd, Stringer JL, Jaiswal AK. (2001), "In vivo role of

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1) in the regulation of

intracellular redox state and accumulation of abdominal adipose tissue.",

J Biol Chem, 276(25), pp. 22559-22564.

36. Gaikwad NW, Rogan EG, Cavalieri EL. (2007), "Evidence from ESI-MS for

NQO1-catalyzed reduction of estrogen ortho-quinones.", Free Radic Biol

Med, 43(9), pp. 1289-1299.

37. Garate M, Wong RP, Campos EI, Wang Y, Li G. (2008), "NAD(P)H quinone

oxidoreductase 1 inhibits the proteasomal degradation of the tumour

suppressor p33(ING1b).", EMBO Rep, 9(6), pp. 576-581.

38. Gong X, Kole L, Iskander K, Jaiswal AK (2007), "NRH:quinone

oxidoreductase 2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 protect tumor

suppressor p53 against 20s proteasomal degradation leading to

stabilization and activation of p53.", Cancer Res, 67(11), pp. 5380-5388.

39. Hayes JD, McMahon M. (2009), "NRF2 and KEAP1 mutations: permanent

activation of an adaptive response in cancer", Trends Biochem Sci, 34(4),

pp. 176-188.

40. Holtzclaw WD, Dinkova-Kostova AT, Talalay P. (2004), "Protection against

electrophile and oxidative stress by induction of phase 2 genes: the quest

for the elusive sensor that responds to inducers.", Adv Enzyme Regul., 44,

pp. 335-367.

41. Iskander K, Gaikwad A, Paquet M, Long DJ 2nd, Brayton C, Barrios R,

Jaiswal AK. (2005), "Lower induction of p53 and decreased apoptosis in

NQO1-null mice lead to increased sensitivity to chemical-induced skin

carcinogenesis.", Cancer Res, 65(6), pp. 2054-2058.

64

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

42. Itoh K, Wakabayashi N, Katoh Y, Ishii T, O'Connor T, Yamamoto M (2003),

"Keap1 regulates both cytoplasmic-nuclear shuttling and degradation of

Nrf2 in response to electrophiles.", Genes Cells, 8(4), pp. 379-391.

43. Jia Z, Zhu H, Misra BR, Li Y, Misra HP. (2008), "Dopamine as a potent

inducer of cellular glutathione and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1

in PC12 neuronal cells: a potential adaptive mechanism for dopaminergic

neuroprotection.", Neurochem Res, 33(11), pp. 205.

44. Kensler TW, Wakabayashi N, Biswal S (2007), "Cell survival responses to

environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway", Annu Rev

Pharmacol Toxicol, 47, pp. 89-127.

45. Lim JH, Kim KM, Kim SW, Hwang O, Choi HJ. (2008 ), "Bromocriptine

activates NQO1 via Nrf2-PI3K/Akt signaling: novel cytoprotective

mechanism against oxidative damage.", Pharmacol Res, 57(5), pp. 325-

331.

46. Liu F, Luo L, Wei Y, Wang W, Li B, Yan L, Wen T (2013), "A functional

NQO1 609C:T polymorphism and risk of hepatocellular carcinoma in a

Chinese population.", Tumour Biol, 34(1), pp. 47-53.

47. Long DJ 2nd, Gaikwad A, Multani A, Pathak S, Montgomery CA, Gonzalez

FJ, Jaiswal AK. (2002), "Disruption of the NAD(P)H:quinone

oxidoreductase 1 (NQO1) gene in mice causes myelogenous

hyperplasia.", Cancer Res, 62(11), pp. 3030-3036.

48. Lu F, Zahid M, Wang C, Saeed M, Cavalieri EL, Rogan EG (2008),

"Resveratrol prevents estrogen-DNA adduct formation and neoplastic

transformation in MCF-10F cells", Cancer Prev Res (Phila), 1(2), pp.

135-145.

49. Montano MM, Chaplin LJ, Deng H, Mesia-Vela S, Gaikwad N, Zahid M,

Rogan E. (2007), "Protective roles of quinone reductase and tamoxifen

against estrogen-induced mammary tumorigenesis.", Oncogene, 26(24),

pp. 3587-3590.

65

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

50. Motohashi H, Yamamoto M. (2004), "Nrf2-Keap1 defines a physiologically

important stress response mechanism.", Trends Mol Med, 10(11), pp.

549-557.

51. Nguyen T, Nioi P, Pickett CB (2009), "The Nrf2-antioxidant response element

signaling pathway and its activation by oxidative stress.", J Biol Chem,

284(20), pp. 13291-13295.

52. Nioi P, McMahon M, Itoh K, Yamamoto M, Hayes JD. (2003), "Identification

of a novel Nrf2-regulated antioxidant response element (ARE) in the

mouse NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 gene: reassessment of the

ARE consensus sequence", Biochem J, 374, pp. 337-348.

53. Oshrat Hershkovitz, Rokah Ofer Shpilberg, Galit Granot (2010), "NAD(P)H

quinone oxidoreductase protects TAp63γ from proteasomal degradation

and regulates TAp63γ-dependent growth arrest", PLoS One, 5(6), pp.

e11401.

54. Patrick BA, Gong X, Jaiswal AK (2011), "isruption of NAD(P)H:quinone

oxidoreductase 1 gene in mice leads to 20S proteasomal degradation of

p63 resulting in thinning of epithelium and chemical-induced skin

cancer", Oncogene, 30, pp. 1098-1107.

55. Prochaska HJ, Santamaria AB, Talalay P. (1992), "Rapid detection of

inducers of enzymes that protect against carcinogens", Proc Natl Acad

Sci USA, 89(6), pp. 2394-2398.

56. Ross D (2004), "Quinone reductases multitasking in the metabolic world",

Drug Metab Rev, 36, pp. 639-654.

57. Ross D, Siegel D (2004), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1, DT-

diaphorase), functions and pharmacogenetics", Methods Enzymol., 382,

pp. 115-144.

58. SantaCruz KS, Yazlovitskaya E, Collins J, Johnson J, DeCarli C (2004),

"Regional NAD(P)H:quinone oxidoreductase activity in Alzheimer's

disease.", Neurobiol Aging, 25(1), pp. 63-69.

66

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

59. Siegel D, Bolton EM, Burr JA, Liebler DC, Ross D (1997), "The reduction of

alpha-tocopherolquinone by human NAD(P)H: quinone oxidoreductase:

the role of alpha-tocopherolhydroquinone as a cellular antioxidant.", Mol

Pharmacol. , 52(2), pp. 300-305.

60. Siegel D, Gustafson DL, Dehn DL, Han JY, Boonchoong P, Berliner LJ, Ross

D (2004), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1: role as a superoxide

scavenger", Mol Pharmacol, 65(5), pp. 1238-1247.

61. Siegel D, Kepa JK, Ross D (2012), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1

(NQO1) localizes to the mitotic spindle in human cells", PLoS ONE,

7(9), pp. e44861.

62. Singh S, Chakravarti D, Edney JA, Hollins RR, Johnson PJ, West WW,

Higginbotham SM, Cavalieri EL, Rogan EG. (2005), "Relative

imbalances in the expression of estrogen-metabolizing enzymes in the

breast tissue of women with breast carcinoma.", Oncol Rep, 14(4), pp.

1091-1096.

63. Singh S, Zahid M, Saeed M, Gaikwad NW, Meza JL, Cavalieri EL, Rogan

EG, Chakravarti D. (2009), "NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1

Arg139Trp and Pro187Ser polymorphisms imbalance estrogen

metabolism towards DNA adduct formation in human mammary

epithelial cells.", J Steroid Biochem Mol Biol, 117(1-3), pp. 56-66.

64. Su XL, Yan MR, Yang L; Qimuge-Suyila. (2012), "NQO1 C609T

polymorphism correlated to colon cancer risk in farmers from western

region of Inner Mongolia", Chin J Cancer Res, 24(4), pp. 317-322.

65. Thomas P, Smart TG. (2005), "HEK293 cell line: a vehicle for the expression

of recombinant proteins.", J Pharmacol Toxicol Methods, 51(3), pp. 187-

200.

66. van Muiswinkel FL, de Vos RA, Bol JG, Andringa G, Jansen Steur EN, Ross

D, Siegel D, Drukarch B (2004), "Expression of NAD(P)H:quinone

67

Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm

oxidoreductase in the normal and Parkinsonian substantia nigra.",

Neurobiol Aging, 25(9), pp. 1253-1262.

67. Wang B, Jin F, Xie Y, Tang Y, Kan R, Zheng C, Yang Z, Wang L. (2006),

"Association analysis of NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene 609

C/T polymorphism with Alzheimer's disease.", Neurosci Lett, 409(3), pp.

179-181.

68. Williams-Ashman HG, Higgins C. (1961), "Oxydation of reduced pyridine

nucleotides in mammary gland and adipose tissue following treatment

with polynuclear hydrocarbons", Med Exp Int J Exp Med., 4, pp. 223-

226.

69. Zafar KS, Inayat-Hussain SH, Siegel D, Bao A, Shieh B, Ross D. (2006),

"Overexpression of NQO1 protects human SK-N-MC neuroblastoma

cells against dopamine-induced cell death.", Toxicol Lett, 166(3), pp.

261-267.

70. Zhang DD, Lo SC, Cross JV, Templeton DJ, Hannink M. (2004), "Keap1 is a

redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3-dependent ubiquitin

ligase complex.", Mol Cell Biol, 24(24), pp. 10941-10953.

71. Zhu H, Jia Z, Mahaney JE, Ross D, Misra HP, Trush MA, Li Y. (2007), "The

highly expressed and inducible endogenous NAD(P)H:quinone

oxidoreductase 1 in cardiovascular cells acts as a potential superoxide

scavenger", Cardiovasc Toxicol, 7(3), pp. 202-211.

Trang web tham khảo:

72. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

73. http://www.lifetechnologies.com

68