Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Giải mã và phân tích hệ gen virus viêm gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận (NT) phân lập tại Việt Nam năm 2013

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------------- ĐỖ THỊ ROAN

GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH HỆ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT

CƢỜNG ĐỘC CHỦNG NT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2013

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 12/2014

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------------------- ĐỖ THỊ ROAN GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH HỆ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT

CƢỜNG ĐỘC CHỦNG NT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2013

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn: TS. ĐOÀN THỊ THANH HƢƠNG Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội – 12/2014

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦ U

Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Hepatitis Virus) được coi là một bệnh cổ

điển của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Bê ̣nh xảy ra ở

vịt con từ 1 đến 6 tuần tuổi, và đặc biệt mẫn cảm với vịt con dưới 1 tuần tuổi, tốc đô ̣

lây lan nhanh với tỷ lệ chết rất cao, có khi lên đến 95 – 100% toàn đàn. Bệnh gây thiệt

hại rất lớn về kinh tế, là mối lo ngại cho các nhà chăn nuôi.

Trên thế giới, mặc dù được phát hiện từ trước những năm 1950 nhưng chỉ trong

vòng 10 năm gần đây virus viêm gan vịt được nghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học

phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụng sinh học phân tử trong giám định, nghiên

cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan hệ sinh học trong họ Picornaviridae. Theo

quan điểm phân loại hiện nay, virus viêm gan vịt gồm ba genotype khác nhau:

genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3).

Tại Việt Nam, từ trước đến nay mới chỉ công bố sự phổ biến của virus viêm gan

vịt thuộc genotype I, bao gồm cả các chủng cường độc và vaccine. Tuy nhiên trong

những điều tra mới đây, virus viêm gan vịt thuộc genotype III đã phát hiện ở một số

địa phương của Việt Nam.

Để làm sáng rõ về đặc điểm phân tử của virus thuộc genotype 3 mới phát hiện

này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Giải mã và phân tích hệ gen virus viêm

gan vịt cường độc chủng Ninh Thuận (NT) phân lập tại Việt Nam năm 2013”. Đề

tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau:

1. Mục tiêu:

- Thu nhận được trình tự nucleotide của toàn bộ hệ gen của một chủng virus

viêm gan vịt cường độc mới phân lập tại Việt Nam năm 2013.

- Phân tích được trật tự sắp xếp của từng vùng gen và đặc điểm phân tử của các

phân đoạn gen trong hệ gen.

2. Nội dung:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Phân lập và thu thập một chủng virus cường độc viêm gan vịt mới phân lập tại tỉnh

Ninh Thuận (Việt Nam) năm 2013 (Kí hiệu chủng: NT).

- Giải mã toàn bộ hệ gen của virus viêm gan vịt chủng NT (có kích thước khoảng 7.8

kb).

- Phân tích trật tự sắp xếp của các gen theo từng vùng gen.

- So sánh trình tự nucleotide của chủng NT với các chủng virus viêm gan vịt khác của

Việt Nam và thế giới.

- Xây dựng cây phả hệ và vị trí phân loại.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chƣơng 1

TỔ NG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT

1.1.1. Cấ u ta ̣o chung

Virus viêm gan vịt (duck hepatitis virus) thuộc họ Picornaviridae, có kích

thước nhỏ, khoảng 20-30 nm, không có vỏ bọc ngoài cùng. Hệ gen của virus viêm gan

vịt chứa acid ribonucleic (RNA) sợi đơn dương có độ dài khoảng 7600 đến 7700

nucleotide và đuôi poly A ở đầu 3’, chứa duy nhất một khung đọc mở (open reading

frame) mã hoá cho một protein chung (polyprotein). Protein này, sau khi tổng hợp phải

trải qua nhiều lần phân cắt để tạo nên các sản phẩm protein độc lập. Hệ gen RNA của

virus rất đặc biệt, có chứa một protein ở đầu 5’ có tác dụng như một primer của quá trình

sao chép RNA nhờ RNA polymerase

(www.britannica.com/EBchecked/topic/459528/Picornavirus). Các virus thuộc họ

Picornaviridae rất đa dạng (có tới trên 200 genotype) và là loại virus được biết đến từ

sớm nhất. Bệnh do chúng gây ra rất đa dạng, có thể là bệnh cấp tính hay nhiễm

trùng mãn tính, bao gồm cả nhiều bệnh nguy hiểm trên người và động vật.

Picornavirus rất nhỏ bé, có thể xuyên qua được màng lọc thông thường (Levine,

Fabricant, 1950). Qua kính hiển vi điện tử, virus là những hạt tròn, bề mặt xù xì, không có

vỏ bọc ngoài cùng (hình 1.1).

Hình 1.1. . Mô hình cấu trúc của một chủng virus thuộc họ Picornavirus (Hepatitis A virus ). (Nguồn: www.technologyreview.com)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.1.2. Đặc điểm cấu trúc hệ gen của virus viêm gan vịt

Trong họ Picornaviridae, tất cả virus đều bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’

mà thay vào đó là một protein (khoảng 23 amino acid) gọi là VPg (v irion protein

genome-link). VPg này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ thông qua một gốc

tyrosine (Cheney et al., 2003) (hình 1.2). Ở cả hai đầu của hệ gen Picornavirus

đều có vùng không dịch mã (UTR). Vùng 5’UTR dài hơn, có độ dài khoảng từ

600 đến 1200 bp, trong khi vùng 3’UTR thường có độ dài chỉ từ 50 đến 100 bp.

Vùng 5’UTR có vai trò quan trọng đối với quá trình sao mã và vùng 3’UTR có

vai trò trong quá trình tổng hợp sợi âm. Tuy nhiên đầu 5’ cũng có thể có vai trò

trong việc làm tăng cường độc lực của virus. Trong hệ gen của Picornavirus có

một vùng nucleotide làm điểm khởi đầu để ribosome dịch mã, gọi là IRES –

Internal Ribosome Entry Site, đó là một cấu trúc di truyền hoạt động phức tạp

dạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi động cho quá trình dịch mã không

phụ thuộc điểm mũ của hệ gen virus (Chard et al., 2006). Nằm giữa hai vùng 5’

và 3’ là một khung đọc mở (open frame reading) lớn, mã hóa khoảng từ 2100

đến 2400 amino acid cho cả các protein cấu trúc và không cấu trúc. Đầu cuối 3’

của hệ gen virus có gắn thêm đuôi poly A, dài khoảng từ 16 đến18 nucleotide.

Trong chuỗi polypeptide, phần protein đầu tiên là protein dẫn, ký hiệu là L

(Leader protein), tiếp theo là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4 (1A), VP2 (1B),

VP3 (1C) và VP1 (1D), đoạn cuối cùng gồm 7 protein không cấu trúc là protein 2A,

2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D. Tuy nhiên, ở các chi virus khác nhau thì trật tự này có sự

thay đổi nhỏ. Chuỗi polypeptide chung của Picornavirus thường bị phân giải bởi một, hai hoặc cả ba enzyme protease là 3Cpro, 2Apro và Lpro thành 10, 11 hoặc 12 chuỗi

(Krumbholz et al., 2002). Toàn bộ chuỗi các protein liên tục này gồm 2249 amino

acid, đươ ̣c mã hóa bở i 6747 nucleotide (Ding, Zhang, 2007).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Picornavirus. Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm trên bề mặt vỏ kháng nguyên; protein VP4 lặn sâu vào bên trong (Nguồn: Swiss Institute of Bioinformatics, 2008). 1.1.3. Vai trò, chƣ́ c năng của các gen và các protein của virus viêm gan vịt

Trong hệ gen virus, VPg – tuy là một protein nhỏ, chỉ khoảng 23 amino acid,

nhưng có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình sao mã. VPg là mồi cho quá trình

tổng hợp sợi âm, trong khi VPgpUpUOH (một dạng chuyển hoá của VPg) là mồi cho

quá trình tổng hợp sợi dương.

Hình 1.3. Cấu trúc hệ gen của một loại virus họ Picornavirus (Kok, McMinn, 2009). Hệ gen chia làm ba phần chính : P1, P2, P3 mã hóa cho chuỗi polyprotein chung, sau đó tự phân cắt thành các protein thành phần.

Các protein VP1, VP2, VP3 và VP4 trong tổ hợp protein P1 có vai trò trong quá

trình tạo vỏ capsid của virus. Ba loại protein đầu tiên nằm ở mặt ngoài của virus,

protein VP4 ngắn hơn, nằm hoàn toàn ở bên trong vỏ capsid (Hình 1.2). Trong 4 loại

protein này, VP1 có vai trò đặc biệt quan trọng, quyết định tính kháng nguyên và độc

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lực của virus.

Bảy loại protein còn lại 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D là các protein không cấu

trúc, tham gia vào các quá trình nhân lên của virus. Protein dẫn (L), protein 2A và 3C (Lpro, 2Apro và 3Cpro) là các enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình phân cắt protein của virus (Strebel, Beck, 1986). Trong đó, Lpro chỉ xuất hiện trong các tế bào

nhiễm Aphtovirus và Cardiovirus. Các enzyme này không chỉ phân cắt các chuỗi

peptide của virus mà còn ức chế hoạt động tế bào của nhiều loại tế bào vật chủ khác nhau và gây ảnh hưởng đến chức năng nội bào. 3Cpro của Picornavirus có thể xâm

nhập vào nhân thông qua tiền tố có mang trình tự định vị nhân (NLS) của chúng là 3CD’ hay 3CD (Amineva et al., 2004; Sharma et al., 2004). 3Cpro đồng thời có thể

in-vitro

phân cắt phần lớn các yếu tố hoặc các nhân tố điều hoà liên quan đến RNA polymerase I, II, III của tế bào. Ngoài ra, 3Cpro còn liên quan đến quá trình ức chế phiên mã của tế bào vật chủ. 2Apro có khả năng phân cắt protein gắn có cấu trú c hô ̣p TATA nhưng lại không có khả năng ức chế quá trình phiên mã của tế bào vật chủ

(Yalamachili et al., 1997).

Các protein khác của Picornavirus bao gồm 2B, 2BC, 3A và 3D liên quan đến

quá trình sao chép RNA. Cụ thể :

Protein 2B/2BC

Các protein 2B hay protein 2BC được giả thiết là có khả năng biến đổi màng

của các tế bào bị nhiễm . Protein 2B và tiền thân của chúng là 2BC có vai trò quan

trọng trong quá trình nhân lên và gắn dính vào màng của hệ thống Golgi và phức hợp

mạng lưới nội chât (endoplasmic reticulum-ER) của tế bào vật chủ, từ đó hình thành

nên các cấu trúc túi hạt trên màng tế bào vật chủ bị viêm nhiễm và hình thành phức

hợp viroporin (Jong et al., 2004). Sự tích luỹ các protein 2B và 2BC trong mạng lưới

Golgi dẫn đến thay đổi tính thấm của màng sinh chất (Jong et al., 2008) và làm cho

cấu trúc thể Golgi trở nên lỏng lẻo, từ đó có thể gây chết tế bào (Kuppeveld et al.,

1997). Bên cạnh đó, khi protein 2B và 2BC gắn vào màng tế bào vật chủ còn gây giảm nồng độ Ca2+ trong phức hợp ER và Golgi, từ đó gây ức chế quá trình vận chuyển

protein từ mạng lưới nội chất ER tới phức hệ Golgi (Jong et al., 2006).

Protein 3A

Protein 3A là một loại protein gắn màng, chúng giữ vai trò trong quá trình ức

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chế tiết protein nội bào và giữ vai trò trung gian trong quá trình trình diện protein

màng khi bị nhiễm virus. Khi có mặt protein A trong tế bào sẽ làm gián đoạn quá trình

lưu thông từ mạng lưới nội chất tới mạng lưới Golgi, hiện tượng này cũng xuất hiện

trong trường hợp tế bào bị nhiễm có protein 2B (Doedens et al., 1995 ; Doedens et al.,

1997).

Protein 3AB

Theo các kết quả nghiên cứu về mặt hoá sinh, protein 3AB là một protein đa

chức năng. Vùng kỵ nước trong tiểu phần 3A của protein liên kết với cấu trúc dạng túi

hạt trên màng. Protein 3AB tương tác với 3D và 3CD của Poliovirus ở quy mô in-vitro

(Towner et al., 1996; Fujita et al., 2007). Protein 3AB màng gắn trực tiếp với tiền thân

3CD polymerase trên cấu trúc vòng lúp của RNA poliovirus, từ đó kích thích hoạt tính

protease của 3CD. Thêm vào đó, protein 3AB lại kích thích 3D polymerase của

Poliovirus (Hope et al., 1997) và có chức năng như là một cơ chất cho 3D polymerase

trong quá trình uridyl hoá VPg. Bên cạnh đó, protein 3AB của Poliovirus còn giữ một

số vai trò khác, ví dụ như phá vỡ tính bền vững của chuỗi xoắn kép, phá vỡ tính ổn

định trong cấu trúc bậc 2 của RNA và nâng cao khả năng bắt cặp của các cặp nucleotit

bổ sung trong quá trình sao chép của virus (Xiang et al., 1995; Richard et al., 2006).

Protein 3B

Các protein 3B (VPg) là những peptide nhỏ có chứa từ 21 đến 23 amino acid

liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của hệ gen Picornavirus thông qua liên kết 5’

tyrosyluridine trong các gốc tyrosine của VPg. VPg cũng có khả năng tương tác với

3D polymerase của Poliovirus và UMP để tạo thành các tổ hợp VpgpU và VpgpUpU

(Paul et al., 1998). VPg đã uridyl hóa được sử dụng như một primer cho cả quá trình

tổng hợp RNA sợi đơn âm và RNA sợi đơn dương (Pettersson et al., 1978).

Protein 3CD

Protein 3CD, tiền thân của protease 3C trưởng thành và polymerase 3D, có hoạt

tính protease, không có hoạt tính polymerase (Harris et al., 1992). Protein 3CD của

Poliovirus góp phần tích cực vào quá trình sao chép RNA của virus bằng cách tương

tác với cả hai đầu 5’ và 3’ của RNA virus, làm cuộn vòng genome của virus (Parsley et

al., 1997; Gamarnik and Andino,1997). Ngoài ra, 3CD cũng có khả năng tương tác với

ribonucleoprotein C (hnRNP C) (Brunner et al., 2005). hnRNP C tham gia trong quá

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình tổng hợp tiền RNA thông tin ở các tế bào bình thường. hnRNP C tham gia vào

quá trình sao chép RNA của virus và dạng đột biến của hnRNP C không có khả năng

tương tác protein-protein sẽ ức chế quá trình tổng hợp RNA sợi đơn dương của virus

(Walter et al., 2002 ; Brunner et al., 2005).

Protein 3D

RNA polymease 3D là một trong những thành phần cơ bản tham gia vào phức

hợp sao chép RNA virus. 3D polymease có thể uridilyl hóa VPg và sử dụng VPg-

pUpU như là một primer trong quá trình sao chép RNA.

1.1.4. Quá trình nhân lên của virus

Virus nhân lên trong tế bào chất. Đầu tiên, virus gắn vào thụ thể nằm trên màng

sinh chất của tế bào chủ, sau đó theo cơ chế nhập bào và tiến hành quá trình “cởi áo”

virus trong endosome hoặc lysosome.

Sau khi được giải phóng khỏi capsid, RNA hệ gen của virus được dịch mã, sản

xuất các protein của virus; tiếp theo đó, các phức hợp sao chép của virus được tập hợp;

RNA virus được nhân lên và hệ gen RNA mới sau tổng hợp sẽ được bao gói tạo thành

các thế hệ virus con cháu (Barton, Flanegan, 1995; Molla et al., 1991) (Hình 1.4).

Trước tiên, RNA ngay lập tức khởi động quá trình dịch mã ở vị trí gần đầu 5’

để tạo thành một polyprotein – tiền thân của các protein chức năng của virus.

Polyprotein này ban đầu được phân cắt thành 3 protein tiền chất là P1, P2 và P3.

Tiếp theo đó, mỗi protein lại tiếp tục tiến hành phân cắt để tạo ra các sản phẩm protein đặc

hiệu có chức năng cụ thể:

- P1 được cắt ra tạo thành VP0, VP1 và VP3. Đó là các protein capsid.

- P2 được cắt ra tạo thành các kháng nguyên 2A, 2B của vật chủ và 2C tham gia

vào quá trình tổng hợp RNA.

- P3 tiến hành tự cắt thành 3A, 3B (VPg), 3C (một enzyme dùng để phân cắt

hầu hết các protein) và 3D (RNA polymerase làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi RNA mới

tổng hợp trên khuôn RNA).

Để lắp ráp, trước hết virus phân cắt P1 tạo thành một đơn phân gốc (protome)

5S chưa hoàn thiện chứa VP0, VP1 và VP3. Các protome này sẽ liên kết với genome

RNA để tạo thành tiền virion (provirion). Trong quá trình hoàn thiện, phần lớn hoặc tất

cả các phân tử VP0 đều bị phân cắt tạo thành VP2 và VP4. Sau lắp ráp, virion trưởng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành thoát ra khỏi tế bào nhờ sự tan bào (cell lysis). Một số Picornavirus, ví dụ virus

viêm gan A (Hepatitis A Virus, HAV) có thể gây nhiễm nhưng không gây ra sự tan

bào.

Đồng thời với quá trình dịch mã để tổng hợp các protein, RNA của hệ gen virus

cũng được nhân lên để tạo thành vật liệu di truyền cho các hạt virus mới.

Hệ gen RNA của Picornavirus là các RNA thông tin, chúng có chức năng như

là các khuôn mẫu cho quá trình sao chép RNA của virus (Gesteland et al., 1999). Các

RNA sợi dương của Picornavirus nhân lên thông qua các RNA sợi âm trung gian được

tổng hợp ngay bên trong các phức hợp sao chép gắn trên màng lipid trong bào tương

của các tế bào nhân thật của vật chủ (Ahlquist, 2006; Kopek et al., 2007). Điều đặc

biệt là trong quá trình nhân lên của các Picornavirus, có sự bất đối xứng giữa số lượng

RNA sợi âm trung gian và RNA sợi dương được tổng hợp trong các phức hợp sao

chép của virus. Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy, có rất nhiều yếu tố liên quan

đến quá trình sao chép RNA, trong đó, đặc biệt đã phát hiện các phân đoạn RNA hoạt

hóa có cấu trúc không gian dạng cis, gọi tắt là cis-RNA hoạt hóa (CREs – cis active

RNA elements), nằm trong hệ gen của các Picornavirus (Steil, Barton, 2009). Sự góp

mặt của các tiểu phần cis-RNA hoạt hóa tham gia vào sự ổn định của các RNA thông

tin của virus (Kempf, Barton, 2008), quá trình dịch mã RNA thông tin của virus. Các

trình tự cis-RNA (CREs) này tương tác mạnh mẽ với các protein sao chép của virus,

gián tiếp tác động lên sự sao chép RNA của virus (Steil, Barton, 2009). Mỗi RNA sợi

dương của virus đều được sao chép thành một RNA sợi âm bổ sung và sau đó RNA

sợi âm được sao chép thành 40 đến 70 phân tử RNA sợi dương thế hệ con cháu. Cuối

cùng, các RNA sợi dương – hệ gen virus được kết hợp với các protein và bao gói

thành các hạt virus mới, phá vỡ tế bào (tan bào), thoát ra ngoài tiếp tục xâm nhiễm trên

các tế bào thích ứng của vật chủ, khởi động một chu trình mới, giúp cho virus tồn tại

và gây ra bệnh lý trên vật chủ của chúng.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.4. Quá trình nhân lên của một virus họ Picornaviridae (poliovirus) (Philip, Minor,

2004)

1.1.5. Vị trí xếp loại trong họ Picornaviridae

Theo hệ thống phân loại thế giới ICTV (International Committee on Taxonomy

of viruses ) năm 2009, họ Picornaviridae bao gồm 24 loài và được nhóm vào 12 chi là

Enterovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus,

Kobuvirus, Teschovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus và một chi mới là

Avihepatovirus (Nicole et al., 2009 ;

nguồn : http://www.Picornaviridae.com/avihepatovirus/dhav.com; OIE 2010) (bảng

1.1). Trong đó virus viêm gan vịt thuộc chi Avihepatovirus.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tên chi

Bảng 1.1 : Danh sách các chi và loài thuộc họ Picornaviridae

Tên loài

Type huyết thanh

Bovine enterovirus

2 type bao gồm BEV-1 và BEV-2

Human enterovirus A

21 type bao gồm một số Coxsackie A virus và Enterovirus

bao

type

Human enterovirus B

57 gồm Enterovirus, Coxsackie B viruses, Echoviruses và Swine vesicular disease virus

Enterovirus

Human enterovirus C

14 type bao gồm một số Coxsackie A virus và enterovirus

Human enterovirus D

3 type bao gồm EV-68, EV-70, EV-94

Poliovirus

3 type bao gồm PV- 1, PV-2 và PV-3

Porcine enterovirus A

1 type là PEV- 8

Porcine enterovirus B

2 type bao gồm PEV-9 và PEV-10

Simian enterovirus A

1 type làSEVA1

Human rhinovirus A

74 serotype

Human rhinovirus B

25 serotype

Hepatitis A virus

1 serotype HAV

Hepatovirus

Avian

encephalomyelitis-

1 type AEV

like viruses

Encephalomyocarditis virus 1 serotype EMCV

virus

Cardiovirus

Theilovirus

type bao gồm Theiler murine 5 encephalomyellitis (TMEV), Vilyuisk human encephalomyelitis virus (VHEV), Theiler-like virus (TLV) của chuột, Saffold virus (SAFV) 1 và SAFV-2

Foot-and-mouth disease virus

7 serotype bao gồm O, A, C, Southern African Territories (SAT) SAT 1, SAT 2, SAT 3 và Asia 1

Aphthovirus

Equine rhinitis A virus

1 serotype: Equine rhinitis A virus (ERAV)

Human parechovirus

6 type bao gồm HpeV-1, HpeV-2, HpeV-3, HpeV-4, HpeV-5, HpeV-6

Parechovirus

Ljungan virus

Có 3 type huyết thanh LV-1, LV-2, LV- 3

Erbovirus

Equine rhinitis B virus

3 typ bao gồm ERBV-1, ERBV-2, ERBV-3

Kobuvirus

Aichi virus

1 serotype: Aichi virus (AiV)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bovine kobuvirus

1 serotype: Bovine kobuvirus (BKV)

Teschovirus

Porcine teschovirus

11 serotype bao gồm các serotype từ PTV-1 đến PTV-11

Sapelovirus

Duck Picornavirus Porcine enterovirus Simian Picornavirus 1

Duck Picornavirus (DPV) Porcine enterovirus 8 (PEV 8) Simian Picornavirus 1 (SV 1)

Senecavirus

Seneca Valley virus

Seneca valley virus (SVV)

Tremovirus

Avian encephalomyelitis Avian encephalomyelitis virus (AEV)

Avihepatovirus Duck Hepatitis A Virus

3 type bao gồm DHAV-1, DHAV-2, DHAV-3

1.1.6. Vị trí xếp loại của virus viêm gan vịt

Trước đây, dựa vào một số đặc tính của chúng mà virus viêm gan vịt được xếp

vào chi Enterovirus trong họ Picornaviridae (Woolcock, 2003). Tuy nhiên, nghiên cứu

trong những năm gần đây về sinh học phân tử đã chỉ ra rằng sự xếp loại đó là chưa phù

hợp. Ngày nay, với các phương pháp nghiên cứu về sinh học phân tử, toàn bộ hệ gen

của một số chủng virus viêm gan vịt trên thế giới đã được xác định. Tất cả các nghiên

cứu đều thống nhất rằng virus viêm gan vịt thuộc họ Picornaviridae. Theo công bố của

tổ chức Quốc tế về phân loại virus năm 2009 (International Committee of Taxonomy

of Virus, ICTV), virus viêm gan vịt DHV-I được xếp vào nhóm Picornavirus và được

đặt lại tên thành virus viêm gan vịt type A (DHAV) trong khi DHV-II và DHV-III lại

được xếp vào nhóm Astrovirus, với tên gọi duck astrovirus type 1 (DAstV-1) và duck

astrovirus type 2 (DAstV-2). Trong số đó, DHAV là nhóm virus độc lực cao nhất và

nguy hiểm nhất. Cụ thể, khi đàn vịt dưới ba tuần tuổi nhiễm virus thì tỷ lệ vịt chết có

thể lên đến 80% (Nguyễn Phục Hưng, 2004). Virus này phân bố khá rộng và là mối

nguy hại cho ngành chăn nuôi vịt. Theo quan điểm phân loại mới này, DHAV là thành

viên duy nhất trong chi mới của họ Picornaviridae (chi Avihepatovirus). Bằng các

phân tích về cơ chế phát sinh loài và các thử nghiệm trung hòa, DHAV được phân làm

3 genotype. Genotype I (DHAV-1) bao gồm các chủng cổ điển có mặt ở nhiều nơi trên

thế giới (Kim et al., 2006; Ding, Zhang, 2007; Tseng et al., 2007). Genotype II

(DHAV-2) bao gồm 2 chủng phân lập được ở Đài Loan (Tseng, Tsai, 2007a).

Genotype III (DHAV-3) bao gồm các chủng mới được phân lập ở Hàn Quốc, Trung

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Quốc và Việt Nam từ năm 2006 trở lại đây (Kim et al., 2007b ;

(http://www.Picornaviridae.com/avihepatovirus/dhav.com,

http://www.picornastudygroup.com) (Kim et al., 2009; OIE, 2010, Đoàn Thị Thanh

Hương et al., 2010), với cùng một cấu trúc hệ gen đặc trưng, như sau: 5’UTR-VP0-

VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR. Không có sự trung hòa chéo

giữa DHAV-1 và DHAV-2 (Tseng, Tsai, 2007) và ít có hiện tượng trung hòa chéo

giữa DHAV-1 và DHAV-3 (Kim et al., 2007b).

Các tác giả đã thống nhất cây phả hệ của họ Picornaviridae có thêm một nhánh

mới. Nhánh mới được tạo ra này đã chia Picornavirus thành 12 chi. Trong đó, virus

viêm gan vit tạo thành một nhánh riêng độc lập, khác biệt với tất cả các chi

Picornavirus khác, nằm ở giữa Parechovirus và Hepatovirus trong cây phả hệ (Tseng,

Tsai, 2007b) (Hình 1.5).

Để tìm hiểu mối liên quan giữa genotype và serotype, các tác giả đã tiến hành thí

nghiệm bằng cách thực hiện phản ứng trung hoà chéo. Kết quả cho thấy, kháng thể của

genotype nào thì có khả năng trung hoà kháng nguyên của genotype đó mà thôi. Chính

kết quả này đã chứng minh rằng giữa ba genotype cũng có thể có liên quan cả về

serotype huyết thanh (Kim et al., 2007). Sự tương đồng về nucleotide và amino acid

trong cùng một genotype đạt thấp nhất là 90 - 92%; trong khi giữa genotype khác nhau

thì tỷ lệ này không vượt quá 72 - 78%.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.5. Cây phả hệ thể hiện liên quan của virus viêm gan vịt với các chi thuộc họ Picornaviridae. Mối quan hệ được xây dựng dựa trên khoảng cách của cây phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về amino acid của phức hệ protein (Tseng et al., 2007).

Kết quả phân tích phả hệ dựa trên gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt

công bố trên Ngân hàng gen một lần nữa đã khẳng định chắc chắn các chủng virus này

thuộc về các genotype khác biệt. Kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu đã

công bố của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự năm 2011 (Đoàn Thị Thanh Hương,

2011)

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH VIÊM GAN VỊT

1.2.1 Tình hình nghiên cứu bê ̣nh viêm gan vi ̣t trên thế giớ i

Bệnh viêm gan do virus (Duck Virus Hepatitis) được phát hiện lần đầu tiên vào

năm 1945 tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine, Hofstad, 1945). Đến năm 1950,

bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà, Levine và Fabricant đã phân lập được virus

viêm gan vịt serotype 1 (Levine, Fabricant, 1950). Dịch bệnh sau đó lan rộng ra cả

nước Mỹ.

Năm 1965, ở Anh phát hiện bệnh viêm gan vịt xảy ra trên đàn vịt đã được tiêm

phòng bằng vaccine nhược độc viêm gan vịt serotype 1. Từ đây đã phân lập ra virus

viêm gan vịt serotype 2. Một hiện tượng tương tự cũng xảy ra trên đàn vịt ở Mỹ đã

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

được tiêm vaccine nhược độc viêm gan vịt serotype 1. Sau đó người ta phân lập được

một chủng viêm gan vịt khác hẳn, đặt tên là virus viêm gan vịt serotype 3. Có nhiều

phương pháp định type virus viêm gan vịt, ngoài các phương pháp huyết thanh học

như HA, ELISA, hay khuếch tán đĩa thạch thì ngày nay việc định type còn dựa trên

nhiều phương pháp sinh học phân tử hiện đại như RT-PCR và RT-LAMP với độ chính

xác cao và thời gian thực hiện được rút ngắn. Cụ thể, phương pháp RT-PCR đa mồi đã

được sử dụng để phân biệt hiện tượng đồng nhiễm DHAV-1 và DHAV-3 (Chen et al,

2013) trong khi phương pháp RT-LAMP với bộ mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên

trình tự gen 2C để nhận biết các chủng virus thuộc DHAV-1. Bằng phản ứng RT-

LAMP người ta đã phát hiện ra sự có mặt của virus viêm gan vịt DHAV-1 chỉ trong

khoảng một giờ thực hiện phản ứng với độ nhạy cao hơn cả phương pháp RT-PCR

(Yang et al., 2012).

Đến nay, bệnh viêm gan vịt do virus thuộc genotype I và genotype III đã phân

bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam. Virus viêm gan vịt không những

gây bệnh trên vịt con mà còn trên cả các loài khác như : gà tây, ngỗng, chim cút, trĩ,

vịt trời…

Phổ biến nhất hiê ̣n nay là virus viêm gan vịt genotype I bao gồm khoảng 60 – 70

chủng đã được phân lập từ năm 1950 đến nay. Virus viêm gan vịt genotype II chỉ gồm

có 2 chủng mới phân lập ở Đài Loan và virus viêm gan vịt genotype III gồm các chủng

mới phân lập ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam (Stanway et al., 2005; Tseng et

al., 2007a; 2007b; Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2010 ; 2011). Trong đó, hiện tượng

đồng nhiễm giữa DHAV-1 và DHAV-2 khá phổ biến tại Đài Loan (Tseng, Tsai,

2007). Trong khi tại Trung Quốc, hiện tượng đồng nhiễm lại được công bố là phổ biến

giữa DHAV-1 và DHAV-3 (Wei et al., 2012). Đặc trưng của bệnh là vịt chết nhanh

với tỷ lệ chết rất cao. Mổ khám bệnh tích thấy gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên bề

mặt gan (Woolcock, 2003b).

1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh viêm gan vịt lần đầu tiên được phát hiện năm 1978, nhưng tại

thời điểm này vẫn chưa phân lập được mầm bệnh. Từ năm 1979 đến năm 1984, bệnh

đã xảy ra ở nhiều địa phương làm chết nhiều vịt con (Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng,

1985). Bằng phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và phân

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lập virus, các tác giả đã khẳng định vịt chết do nhiễm virus viêm gan vịt (Lê Thanh

Hòa et al., 1984). Từ năm 1984 - 1987, bệnh viêm gan vịt đã lan tràn ở nhiều địa

phương như Hà Tây, Hòa Bình gây nhiều thiệt hại về kinh tế (Lê Minh Chí et al.,

1999; Nguyễn Văn Cảm et al., 2001; Nguyễn Hữu Vũ et al., 2001; Nguyễn Đức Lưu

et al., 2002). Tuy nhiên việc nghiên cứu sâu về bệnh viêm gan vịt chưa có nhiều. Năm

1983, từ chủng virus cường độc viêm gan vịt phân lập được tại Phú Xuyên - Hà Sơn

Bình (kí hiệu là TT), các tác giả đã cấy truyền 39 đời trên phôi gà và tạo được chủng

virus nhược độc VN (Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng, 1985). Năm 1985, quy trình sản

xuất vaccine từ 3 chủng virus nhược độc viêm gan vịt: chủng TN của Asplin, E32 của

Pháp và VN của Việt Nam đã được xây dựng (Lê Thanh Hòa et al., 1984). Tuy nhiên,

hiện nay không thấy sự có mặt của các loại vaccine trên trên thị trường. Theo một số

nghiên cứu đã công bố, bệnh viêm gan vịt cho đến nay vẫn xảy ra ở nước ta, gây thiệt

hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Văn Cảm et al., 2001). Đặc biệt, gần đây

nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta chưa thích ứng được với điều kiện môi

trường nên bệnh viêm gan vịt càng xảy ra nhiều hơn, nhất là ở các địa phương là Hà

Tây, Hà Nam, Thái Bình và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long gây tổn thất rất lớn

cho ngành chăn nuôi (Nguyễn Hữu Vũ et al., 2001; Nguyễn Đức Lưu et al., 2002). Từ

cuối năm 2003, đầu năm 2004, bệnh cúm gia cầm bùng phát, gây thiệt hại nghiêm

trọng đến ngành chăn nuôi gia cầm cũng như ảnh hưởng đến sức khỏe con người khiến

bệnh viêm gan vịt cũng như một số bệnh khác của gia cầm ít được quan tâm chú ý

nhiều như trước. Tuy nhiên, trên thực tế bệnh viêm gan vịt vẫn tồn tại và có nhiều biến

đổi phức tạp. Trong những năm gần đây, đặc biệt là từ năm 2006 - 2007 đến nay, các

nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu về sinh học phân tử virus viêm gan vịt và

đã đồng loạt đưa ra nhiều công bố khẳng định sự biến đổi mạnh mẽ và khác nhau trong

quần thể và hệ gen của virus, đến mức tạo ra một chi mới và các genotype mới trong

họ Picornaviridae (Yun et al., 2010). Tuy nhiên, các loại vaccine phòng bệnh viêm

gan vịt cho đến nay đều thuộc một loại genotype (DHAV-1). Do đó, việc sản xuất

vaccine từ chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype mới là rất cần thiết (Kim et al.,

2009).

Trong các năm gần đây, các công trình nghiên cứu về virus viêm gan vịt ở Việt

Nam không có nhiều và các nghiên cứu này chỉ đi sâu vào nghiên cứu bệnh tích đại

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thể, vi thể của virus gây bệnh, các đặc tính sinh học của virus nhược độc (Bùi Thị Cúc,

2002; Trần Thị Lan Hương, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007) ; có rất ít các nghiên cứu về

sinh học phân tử, giải mã hệ gen (Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2011).

1.2.3. Đƣờng xâm nhập và cách lây lan

Virus viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ vịt bệnh sang vịt lành, tỷ lệ nhiễm bệnh

rất cao (100%). Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp hoặc qua vết

thương (Levine, Fabricant, 1950). Đường lây nhiễm qua không khí của bệnh viêm gan

vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà con. Có sự

xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp. Những vịt chưa bị nhiễm

virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít

ngày.

1.2.4. Cơ chế gây bệnh

Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hoá, hô hấp hoặc vết

thương rồi vào máu. Theo máu, virus đến các cơ quan phủ tạng đặc biệt là gan, đây là

cơ quan thích hợp nhất đối với virus. Ở giai đoạn đầu, do tác dụng của virus đã khiến

trao đổi chất ở gan bị rối loạn. Kiểm tra tổ chức học cho thấy lượng glycogen trong

gan giảm mạnh nhưng lượng lipid lại tăng cao do quá trình trao đổi lipid ở gan mà đặc

biệt là trao đổi cholesterol bị ức chế. Vì vậy, vịt con ở thời kỳ mới nở thiếu năng lượng

dẫn đến sức đề kháng của chúng bị giảm sút. Giai đoạn thứ hai, virus trực tiếp phá

hoại tế bào gan, tế bào nội mô huyết quản, gây xuất huyết đặc trưng. Sự có mặt của

virus DHAV còn ảnh hưởng tới cơ chế điều hòa phiên mã, cụ thể là quá trình methyl

hóa DNA. Quá trình này làm tăng sự có mặt của tế bào CD8A trong tuyến ức, phổi,

lách và gan nhưng giảm ở thận và các cơ (Xu et al., 2014). Virus nhân lên trong tế bào

gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kuffer (một loại đại thực bào

phân bố ở thành xoang mạch máu của gan). Khi kiểm tra cho thấy tổ chức gan bị phá

hoại, cơ thể không được giải độc làm con vật chết do ngộ độc (Phạm Văn Ty, 2007 ;

Bùi Thanh Khiết, 2007).

1.2.5. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau từ 1 đến 2 giờ mắc bệnh, vịt bị chứng xanh

tím niêm mạc, rối loạn vận động, co giật, vịt chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt, nghiêng sườn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang bên

sườn (hình 1.6). Mổ khám bệnh tích phát hiện gan vịt bệnh thường bị sưng, nhũn, dễ

bị nát khi ấn nhẹ. Trong một số trường hợp gan vịt bệnh bị nhũn có hình thái như

gelatin. Bề mặt gan loang lổ do có nhiều điểm xuất huyết, xuất huyết lan rộng không

có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ khác nhau . Tuy nhiên, hiê ̣n tươ ̣ng xuất

huyết trên bề mặt gan không phải có ở tất cả vịt chết do bệnh viêm gan virus (Nguyễn

Đức Lưu, Vũ Như Quán, 2002; Nguyễn Văn Cảm et al., 2001).

Hình 1.6. Tư thế chết điển hình của vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt và hình ảnh gan vịt nhiễm virus. A: Hình ảnh vịt chết khi nhiễm virus viêm gan vịt. B: Gan vịt xuất huyết khi mắc bệnh (Nguồn: www.as2.nchu.edu.tw).

1.2.6. Vaccine phòng bệnh

Biện pháp quan trọng nhất để khống chế dịch bệnh là dùng vaccine tạo miễn

dịch cho đàn vịt (Tripathy, Hanson, 1986; Davis et al., 1987). Vaccine phòng bệnh

viêm gan vịt có 2 loại gồm vaccine nhược độc và vaccine vô hoạt.

- Vaccine nhược độc: Vaccine viêm gan vịt nhược độc được sản xuất từ virus

cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh học. Virus cường độc được tiêm truyền

nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virus giảm đi. Virus vẫn có

khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm

vaccine. Virus viêm gan vịt độc lực thường được cấy truyền nhiều đời trên phôi gà để

giảm độc tính sau đó virus này được dùng làm vaccine.

- Vaccine vô hoạt: Vaccine viêm gan vịt vô hoạt được sản xuất từ virus viêm

gan vịt bằng cách nuôi cấy virus trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BEI (Binary Ethylenimine), dùng bổ trợ dạng nhũ dầu. Bảo quản vaccine ở 40C trong

thời gian 20 tháng vẫn giữ được hiệu lực.

Cho đến nay trên thị trường Việt Nam đang sử dụng rộng rãi một loại vaccine

nhược độc viêm gan vịt do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất. Qua khảo sát

sinh học phân tử hệ gen bước đầu cho thấy, chủng virus được sử dụng làm vaccine có

nguồn gốc từ Hàn Quốc. Ngoài ra, một chủng virus vaccine nhược độc khác của Học

viện Nông nghiệp Hà Nội cũng đã bước đầu được ứng dụng vào thực tế (Nguyễn Phục

Hưng, 2004). Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử của chúng tôi cho thấy các loại

vaccine sử dụng tại Việt Nam đều thuộc genotype I.

1.3. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS VIÊM GAN VỊT

Bệnh viêm gan vịt được coi là một bệnh cổ điển của ngành chăn nuôi gia cầm

trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế, là mối lo

ngại cho các nhà chăn nuôi (FAO, Food and Agriculture Oganization).

Từ khi phát hiện bệnh lần đầu tiên tại Mỹ năm 1945 đến nay, nhiều nghiên cứu

về bệnh viêm gan vịt cũng như virus gây bệnh đã được tiến hành và công bố; nhiều

loại vaccine nhược độc và vô hoạt đã được sản xuất (Golubnichi, Malinovskaya, 1984;

Gough, Spackman, 1981) nhưng bệnh vẫn xảy ra ở nhiều nơi trên toàn thế giới.

Nguyên nhân là do virus viêm gan vịt rất đa dạng và luôn biến đổi đã dẫn đến có sự sai

khác lớn trong hệ gen giữa các chủng virus. Do đó có sự chênh lệch về tính kháng

nguyên giữa chủng virus vaccine với các chủng virus gây bệnh.

Qua khảo sát sinh học phân tử hệ gen virus, các nhà khoa học đã phát hiện ra

virus viêm gan vịt gồm 3 genotype khác nhau được đặt tên là DHAV-1, DHAV-2 và

DHAV-3. Tuy nhiên, các loại vaccine sử dụng từ trước đến nay đều được sản xuất dựa

trên các chủng virus của DHAV-1. Đây chính là nguyên nhân mà mặc dù đã sử dụng

vaccine viêm gan vịt, nhưng dịch bệnh vẫn xảy ra.

Ở Việt Nam, virus viêm gan vịt cũng rất đa dạng và phức tạp do chúng ta nhập

khẩu con giống từ nhiều nước khác nhau trên thế giới, rất có thể chúng mang theo

mầm bệnh viêm gan vịt từ nhiều nước khác nhau khiến tình hình dịch bệnh viêm gan

vịt ở nước ta ngày càng phức tạp, gây khó khăn trong công tác sản xuất vaccine và

phòng chống bệnh.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Từ trước đến nay, chúng ta mới chỉ chẩn đoán bệnh dựa trên triệu chứng lâm

sàng, bệnh tích, các phản ứng huyết thanh học. Điều đó chỉ cho biết đàn vịt mắc bệnh

viêm gan vịt, nhưng không biết được virus gây bệnh thuộc chủng/type nào. Hiện nay ở

Việt Nam có một số loại vaccine nhược độc đang được sử dụng. Những chủng đó có

phù hợp với những chủng cường độc viêm gan vịt đương nhiễm hiện nay hay chưa,

điều này cần được giám định.

Các nghiên cứu mới đây trên thế giới với đầy đủ bằng chứng về sinh học phân

tử đã xác định virus viêm gan vịt thuộc một chi mới trong họ Picornaviridae, đồng

thời đã chứng minh sự tồn tại của 3 genotype khác nhau, trong đó DHAV-1 bao gồm

các chủng DHAV phổ biến từ trước đến nay; DHAV-2 và DHAV-3 là 2 genotype

hoàn toàn mới vừa được phát hiện. Các virus vaccine được sử dụng từ trước đến nay

thường chỉ thuộc DHAV-1, ít có vaccine thuộc DHAV-3 và không có vaccine thuộc

DHAV-2.

Liệu virus viêm gan vịt ở Việt Nam có cùng chung những biến đổi về hệ gen và

tồn tại genotype mới như của thế giới đã công bố? Và liệu chủng virus nhược độc

vaccine đang sử dụng tại Việt Nam có phù hợp với các chủng virus cường độc đang

lưu hành tại Việt Nam?

Nghiên cứu tìm hiểu các đặc tính sinh học nói chung và đặc tính sinh học phân

tử của tác nhân gây bệnh nói riêng là điều vô cùng cần thiết, nhất là đối với các loại

virus RNA, có mức độ đột biến nhanh. Việc tìm kiếm nguồn gen mới, phù hợp để sử

dụng làm vaccine phòng chống bệnh một cách hiệu quả, dù là vaccine thế hệ cũ hay

vaccine thế hệ mới đều đòi hỏi cần phải có một bộ sưu tập đầy đủ về gen và hệ gen.

Do đó, việc giải mã gen/hệ gen của đại diện các chủng virus cường độc viêm gan vịt

đang lưu hành và chủng virus vaccine viêm gan vịt đang sử dụng tại Việt Nam, cũng

như xác định vị trí phả hệ và nguồn gốc với các chủng của thế giới là rất cần thiết hiện

nay. Kết quả này sẽ là định hướng và là nguồn nguyên liệu để cung cấp nguồn gen/

nguồn virus cho công tác sản xuất vaccine trong tương lai.

Cho đến nay có rất ít công bố về giải mã và phân tích đặc điểm phân tử của hệ

gen virus cường độc viêm gan vịt phân lập tại Việt Nam. Do đó vấn đề giải mã toàn bộ

hệ gen của một chủng virus cường độc mới, phân lập tại Việt Nam là điều cần thiết

hiện nay.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Nguyên liê ̣u

Mẫu bệnh phẩm viêm gan vịt phân lập ở vịt con mắc bệnh tại tỉnh Ninh Thuận

năm 2013 (kí hiệu là NT) và được tiếp truyền qua phôi trứng vịt 11 ngày tuổi. Nước

trứng vịt chứa virus được sử dụng để tách chiết RNA tổng số và giải mã hệ gen.

2.1.2. Dụng cu ̣ và thiết bi ̣

- Các loại máy móc bao gồm: Tủ lạnh thường; tủ lạnh âm sâu -80oC (Sanyo, Nhật Bản); tủ ấm 37oC (Nhật Bản); máy ly tâm thường; máy ly tâm lạnh; máy PCR

(PTC-100 Thermal cycler) của MJ. Research Inc. (Mỹ); máy điện di kiểm tra sản

phẩm PCR của hãng Bio-Rad; máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ); máy vi tính,

máy ổn nhiệt; máy nuôi lắc tế bào; máy Vortex; tủ cấy vô trùng; bộ pipetman (10l,

20l, 100l, 200l, 1000l và 5000l); máy tính và các phần mềm sinh - tin học.

- Các dụng cụ thường qui trong phòng thí nghiệm: dao, kéo, panh, kẹp, phiến

kính, đĩa Petri, các loại ống Eppendorf, đầu côn, lọ đựng môi trường, ống nuôi vi

khuẩn...

2.1.3. Hóa chất

- Hoá chất: Yeast Extract và trypton (DIFCO-Mỹ), EDTA, SDS, Tris-HCl

(Sigma-Mỹ), Acid acetic (Merk-Đức), Ampicilin (Merk-Đức), Agar (Sigma, Mỹ);

Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo-Pháp).

- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc, USA)”

và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.

- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA do hãng Fermentas cung cấp

- Bộ kit “AccuPower®ProFi Taq PCR Premix” để thực hiê ̣n phản ứ ng PCR do

hãng BIONEER (Hàn Quốc) cung cấp.

- Các mồi dùng cho phản ứng PCR đặt của hãng Macrogen (Hàn Quốc).

- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR do hãng BIONEER (Hàn Quốc) cung

cấp.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Bô ̣ kit cloning đầu bằng “CloneJETTM PCR cloning kit” củ a BIONEER (Hàn

Quốc)

- Bộ kit tách plasmid tái tổ hợp, “AccuPrep® Plasmid Extraction Kit” của hãng

BIONEER (Hàn Quốc).

- Các enzyme giới hạn: EcoRI, BglII (Fermentas).

- Các dung dịch dùng để điện di trên thạch agarose.

2.2. PHƢƠNG PHÁ P

iến hành các thí nghiê ̣m theo sơ đồ hình 2.1 sau

Để thu nhâ ̣n hê ̣ gen virus chú ng tôi t đây

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiê ̣m thu hê ̣ gen virus viêm gan vi ̣t chủ ng NT và phân tích số liệu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.1. Phƣơng phá p tá ch chiết RNA tổ ng số

RNA hệ gen của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và bảo quản ở -200C

cho đến khi sử du ̣ng .

2.2.2. Phƣơng phá p chuyển đổ i cDNA sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́ u

(hexamer ) và mồi đặc hiệu DK 1Fb sử du ̣ng bô ̣ Sơ ̣i cDNA đươ ̣c tổng hơ ̣p theo phương pháp chuyển đổi từ RNA hê ̣ gen củ a virus bằng đồng thờ i mồi xác suất

riptase củ a hãng Fermentas . Phản ứng được kít và enzyme Maxima Reverse Transc 800C trong 5 phút. Sản thực hiê ̣n ở 500C trong 1 giờ , sau đó dừ ng phản ứ ng ở phẩm cDNA được bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng, để thực hiện một loạt các

phản ứng PCR thu nhận từng vùng gen tiếp nối vào nhau. Thành phần phản ứng

chuyển cDNA đươ ̣c trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số

Thành phần

Thể tích

RNA tổng số (100ng/µl)

2 µl

Primer hexamer (100picomol/µl)

1 µl

DK1Fb (10mM)

1 µl

dNTP mix (10mM)

1 µl

9,5 µl

H2O (nuclease-free)

4 µl

5X AMV buffer RiboLockTMRNase Inhibitor (20U/µl)

0,5 µl

Maxima Reverse Transcriptase (20U/µl)

1µl

20 µl

TỔNG:

2.2.3. Phƣơng phá p PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trên khuôn cDNA thu từng phân đoạn của hệ

gen. Trong nghiên cứ u này chú ng tôi dù ng bô ̣ kit AccuPower®ProFi Taq PCR Premix

do hãng BIONEER cung cấp và phản ứng thực hiện trên máy PCR (PTC-100). Thành

phần phản ứ ng và chu trình nhiê ̣t đươ ̣c trình bày trong bảng 2.2.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bảng 2.2: Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Số chu kỳ 1

Thành phần Khuôn cDNA Mồi xuôi (10picomol/µl) Mồi ngươ ̣c (10picomol/µl) DMSO Nướ c tinh khiết Tổng

Thể tích 2µl 2µl 2µl 2µl 42µl 50µl

Nhiê ̣t đô ̣ 940C - 5 phút 940C - 30 giây 520C - 30 giây 680C - 5 phút 680C - 10 phút 40C – 20 giờ

Sản phẩm PCR được bảo quản ở 40C hoă ̣c -200C. Kết quả phản ứ ng PCR đươ ̣c 1%. Nếu kết quả thu đươ ̣c

đánh giá bằng điê ̣n di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose băng sản phẩm có kích thướ c mong muốn thì sản phẩm sẽ đươ ̣c dù ng cho các thí nghiê ̣m tiếp theo.

Danh sách các mồi đươ ̣c sử du ̣ng trong phản ứ ng PCR nhân gen mong muốn và

các mồi sử dụng trong giải trình tự được liệt kê ở bảng 2.3.

Bảng 2.3: Danh sách và trình tự các mồi sử du ̣ng trong phản ứ ng PCR

2.2.4. Phƣơng phá p điê ̣n di trên gel agarose Dựa trên nguyên lý của phương pháp là: các acid nucleic mang điện tích âm

trong môi trường pH trung tính do có gốc phosphat ở khung phosphatdieste trong cấu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trúc hoá học, dưới tác dụng của điện trường không đổi chúng di chuyển về cực dương

và dừng lại ở điểm đẳng điện (pI) đặc trưng của mỗi loại phân tử acid nucleic . Các

phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm hơn loại có trong lượng phân tử nhỏ. Sản

phẩm điện di được nhâ ̣n biết nhờ nhuộm gel trong Ethidium bromide và soi dưới tia cực tím.

Có 2 loại gel sử dụng trong kĩ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học

phân tử là: Gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử dụng

phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA.

Mô ̣t trong các c hỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của thực khuẩn

thể Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzym giới hạn HindIII thành 8 phân đoạn có độ

dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb. Nhờ chỉ thị phân tử

DNA có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.

2.2.5. Phƣơng phá p tinh sa ̣ch sả n phẩ m PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ PCR Purification Kit của hãng BIONEER

. Sản phẩm đã tinh sạch được dùng để giải trình tự

theo hướ ng dẫn củ a nhà sản xuất trực tiếp hoă ̣c dòng hóa trướ c khi giải trình tự. 2.2.6. Phƣơng phá p dòng hó a sả n phẩ m PCR 2.2.6.1. Nguyên lí chung của phương pháp dòng hóa

Nguyên lý củ a quá trình dòng hóa là gắn nối (ligation) một đoạn DNA ngoại lai (thường là sản phẩm PCR/RT-PCR) vào trong hệ gen của một vòng DNA đã được

thiết kế sẵn gọi là plasmid mang (hay vector dẫn truyền), tạo ra vector tái tổ hợp và

được chuyển nạp (transformation) vào tế bào khả biến phù hợp (thường là tế bào khả

biến E. coli) tạo dòng tái tổ hợp. Sau khi chuyển nạp, vi khuẩn đươ ̣c nuôi cấy để nhân

lên và chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp nhằm thu được số lượng lớn các bản sao DNA

ngoại lai (vector tái tổ hợp). Tách chiết các khuẩn lạc đơn dòng để thu lượng DNA

plasmid chứ a đoa ̣n DNA cần chèn , sau đó plasmid dương tính đươ ̣c kiểm tra la ̣i bằng cách dùng enzyme giới hạn (restriction enzyme) phù hợp để cắt sản phẩm ra khỏi

vector.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.6.2. Dòng hóa vào vector pJET 1.2 (lai đầu bằng)

Sản phẩm PCR thu được có đầu 3’ chứ a các Adenin , vì vậy khi dòng hóa vào vector pJET 1.2 đầu bằng (có trong bộ kit CloneJET TM PCR cloning kit ) ( do hãng Fermentas cung cấp ) sản phẩm PCR phải trải qua bước xử lý thành dạng đầu bằng

bằng enzyme DNA Blunting enzyme (do hãng cung cấp) trướ c khi thực hiê ̣n phản ứ ng

gắn nố i (ligation). Sản phẩm PCR sau khi được bằng hóa sẽ được gắn vào vector

pJET1.2 (Fermentas, hình 2.2) bằng enzyme T4 DNA ligase.

Hình 2.2. Cấu trú c các vector sử dụng trong nghiên cứu. A. Vector pJET1.2 đầu bằng (Fermentas); B. Vector pCR®2.1TOPO đầu lồi T (Invitrogen).

Đoa ̣n DNA ngoa ̣i lai đươ ̣c chèn vào giữa vị trí của gen sinh enzyme gây chết tế

bào nằm trên vector pJET 1.2. Khi đoa ̣n DNA đươ ̣c chèn vào giữa gen này , nó sẽ làm

. Các vector bất hoa ̣t gen , vì vậy các khuẩn lạc dương sẽ mọc dạng màu trắng đục

không chứ a đoa ̣n DNA ngoa ̣i lai gen gây chết đươ ̣c nối la ̣i , do đó khuẩn la ̣c không thể mọc được khi nuôi cấy . Trên vector cũng có chứ a vù ng mã hóa gen kháng ampicillin , đây cũng là tín hiê ̣u giú p nhâ ̣n biết và cho ̣n lo ̣c khuẩn la ̣c dương hiê ̣u quả .

Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pJET 1.2 đươ ̣c trình bày ở bảng 2.4a và 2.4b. Sau khi bổ sung đủ các thành phần như trong bảng 2.4a tiến hành

thực hiện phản ứng bằng hóa sản phầm PCR như sau : Vortex rồi li tâm nhẹ ống chứa mẫu trong khoảng 5 giây, ủ mẫu ở 700C trong 5 phút, sau đó lấy ra ủ lại vào đá để làm lạnh.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ản phẩm PCR trước khi gắn nối vào Bảng 2.4a: Thành phần phản ứng bằng hóa s vector

Thành phần 2X Reaction Buffer Sản phẩm PCR* Nướ c (nuclease-free) DNA Blunting Enzyme pJET1.2/blunt cloning vector (50ng/µl) Tổng

Thể tích 10µl 2µl (nồng đô ̣ cuối 0.5pmol) 5µl 1µl 1µl (nồng đô ̣ cuố i 0.05 pmol/µl) 18µl

Đặt nguyên ống phản ứng trên đá, tiếp tu ̣c bổ sung:

Bảng 2.4b: Thành phần phản ứng gắn nối sản phẩm PCR đã bằng hóa vào vector pJET1.2

Thành phần pJET1.2/blunt cloning vector (50ng/µl) T4 DNA ligase Tổng

Thể tích 1 µl (nồng đô ̣ cuối 0.05 pmol/µl) 1 µl 20 µl

- Vortex rồi ly tâm ống phản ứ ng trong khoảng 5 giây - Tiếp tu ̣c ủ ở 220C trong 30 phút - Sản phẩm sau ligate được đem chuyển nạp vào tế bào khả biến E.coli để chọn

lọc và nhân lên các plasmid chứ a đoa ̣n DNA ngoa ̣i lai mong muốn . Sản phẩm chuyển

nạp được đưa vào tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt . Tế bào đươ ̣c trải nuôi trên đĩa môi trườ ng LB (Luria – Bertani) agar (môi trườ ng đă ̣c ) ở 370C qua đêm. Dựa vào đặc tính gen gây chết và đặc tính kháng kháng sinh ampicillin của vector chúng tôi

chọn lấy những khuẩn lạc trắng đục có dạng tròn , bề mă ̣t nhẵn để chuyển sang nuôi cấy trên môi trườ ng LB lỏng . Các ống tế bào được nuôi qua đêm ở 370C, lắc 200 vòng/phút. Khi đã đa ̣t đô ̣ đu ̣c theo yêu cầu (OD600 ~ 0.4) thì đem đi tách thu plasmid bằng kit tách plasmid củ a hãng BIONEER . Plasmid thu đươ ̣c đươ ̣c đem cắt kiểm tra bằng enzyme BglII (Fermentas). Thành phần phản ứng cắt kiểm tra theo thành phần

đươ ̣c trình bày ở bảng 2.5. Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng BglII

Thể tích

Thành phần 10X buffer Tango (Fermentas) 2 µl 1 µl Enzyme BglII (Fermentas) 1 µl DNA plasmid (10U/µl) 16 µl Nướ c tinh khiết Tổng 20 µl

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Sau khi ủ 2 giờ ở 370C sản phẩm cắt đươ ̣c điê ̣n di kiểm tra trên gel agarose 1%. Plasmid dương tính sẽ là các plasmid khi cắt kiểm tra bằng BglII điê ̣n di thu đươ ̣c hai băng: băng thứ nhất có kích thướ c xấp xỉ 3 kb tương ứ ng vớ i đô ̣ dài vector pJET 1.2, băng thứ 2 có độ dài bằng độ dài sản phẩm PCR ngoại lai đưa vào. 2.2.6.3. Dòng hóa vào vector pCR®2.1TOPO (lai đầu dính)

Do sản phẩm PCR (sử dụng enzyme Taq DNA polymerase xúc tác tổng hợp)

thường được gắn thêm Adenine (A) ở đầu 3’, nên khi nối với vector có đầu lồi là

Thymine (T) đã được các hãng sinh phẩm thiết kế từ trước, thì hai nucleotide này sẽ

gắn nối bổ sung cho nhau nhờ enzyme nối T4-DNA ligase hoặc enzyme topoisomerase. Cấu trúc vector pCR®2.1TOPO được trình bày trong hình 2.2.

Vị trí để nối sản phẩm PCR vào được bố trí ở trong chuỗi gen lacZ, gen mã hóa

và sản xuất enzyme β-galactosidase, có tác dụng xúc tác thủy phân một loại hóa chất

có tên gọi là X-gal để tạo nên các dẫn chất có màu xanh. Vi khuẩn không mang

plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh. Khi sản phẩm được nối vào vị trí

nối thành công, thì đoạn DNA ngoại lai làm bất hoạt gen lacZ không cho nó sản xuất

ra enzyme β-galactosidase, và do vậy, vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ không có

enzyme phân hủy cơ chất X-gal và khuẩn lạc sẽ mang màu trắng khi nuôi trên môi

trường có chứa X-gal.

Thành phần phản ứng: Vector pCR2.1TOPO: 1 µl

Nước tinh khiết: 1 µl

Sản phẩm PCR: 3 µl

Dung dịch muối: 1 µl

6 µl Tổng số:

- Giữ 10 phút. Chuyển nạp và nuôi cấy trên đĩa Petri chứa môi trường thạch LB

có chứa kháng sinh và X-gal.

- Tế bào sử dụng để chuyển nạp là tế bào khả biến (competent cells) E. coli chủng

DH5αT1 hoặc Top10 (Invitrogen). Khi được nuôi trong môi trường dinh dưỡng, plasmid

trong tế bào chủ sẽ cùng nhân lên với hệ gen tế bào chủ và phân chia cùng tế bào chủ khi

tế bào phân chia.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Sau khi nuôi cấy tiền hành chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường

lỏng. Khuẩn lạc màu trắng trên môi trường LB agar được lựa chọn để nuôi cấy trong

các ống chứa môi trường LB lỏng. Chọn khuẩn lạc màu trắng ngà là tốt nhất.

- Bổ sung 10 µl kanamycin (50mg/ml) để chọn lọc dòng có mang gen kháng

kháng sinh.

- Có thể bổ sung thêm 7 µl X-gal (40mg/ml) vào môi trường để kiểm tra thêm

một lần nữa, ống môi trường có vi khuẩn tái tổ hợp phát triển sẽ không có màu xanh

còn ống có vi khuẩn không tái tổ hợp sẽ có màu xanh.

- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trường được lắc ở 220 vòng/phút trong vòng

từ 16 đến 20 giờ ở 370C.

(Môi trường LB lỏng tương tự như môi trường LB agar đặc nhưng không bổ sung

agar).

- Plasmid tái tổ hơ ̣p sau khi đươ ̣c tách chiết thu DNA plasmid tái tổ hơ ̣p sẽ

i ha ̣n EcoRI. Thành phần phản ứng cắt enzyme

đươ ̣c cắt kiểm tra la ̣i bằng enzyme giớ đươ ̣c trình bày trong bảng 2.6 dướ i đây Bảng 2.6: Thành phần phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI

Thành phần 10X buffer for EcoRI (Fermentas) EcoRI (Fermentas) DNA plasmid (10U/µl) Nướ c tinh khiết Tổng Thể tích 2µl 1µl 1µl 16µl 20µl

Các plasmid tái tổ hợp dương tính sẽ được gửi sang công ty Macrogen (Hàn

Quố c) để giải trình tự . Pasmid tái tổ hơ ̣p thu đươ ̣c khi lai đoa ̣n DNA vào vector pJET1.2 sẽ được giải trình tự bằng hai mồi trên vector là:

- Mồi xuôi: pJET1.2F: 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’

- Mồi ngươ ̣c: pJET1.2R: 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’

Plasmid tái tổ hơ ̣p thu đươ ̣c khi lai đoa ̣n DNA vào vector pCR2.1TOPO sẽ được

giải trình tự bằng hai mồi trên vector là:

- Mồi xuôi (M13F): 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’

- Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.7. Phƣơng phá p giả i trình tƣ ̣

Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme DNA-

polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA-polymerase xúc tác gắn các

nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có chứa nhóm -OH tự do, khi

gặp nucleotide không chứa nhóm 3’-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc

trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3

và 4) để dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn

dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide.

Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo chiều

5’→3’. Mỗi một lần giải trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA ban đầu chưa

được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide; thông thường là 500-

1000 nucleotide nếu được giải trình trên máy giải trình tự tự động.

2.2.8. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu

Trình tự DNA thu nhận được từ máy giải trình tự, được cung cấp ở hai dạng:

chuỗi nucleotide thô ở dạng chữ (.txt) và chuỗi nucleotide thô ở dạng giản đồ

chromatogram (.ab1). Chuỗi đã được biên tập (edited) được sử dụng ở dạng .txt, vì ở

dạng này, tất cả các chương trình phân tích gen (ví dụ: MEGA, GENEDOC,

MacVector) đều có thể nhận biết.

Chương trình so sánh và phân tích chuỗi gen - GENEDOC:

GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình cho máy

tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở dạng .msf

(multiple sequence file) (Nicholas KB, Nicholas HB, 1999), GeneDoc cho phép xác

định trình tự amino acid của gen nhân và gen ty thể, đưa ra cấu hình của các chuỗi đã

được so sánh để chuyển nạp vào MEGA cho phân tích phả hệ.

Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA):

MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) là một hệ chương trình nổi

giao diện (interface application) được lập trình dễ sử dụng cho các nhà nghiên cứu di

truyền học phân tử với mục đích so sánh đối chiếu các chuỗi gen đồng chức năng từ

các chủng cùng loài, từ các chủng khác loài trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ từ

đó suy ra mối quan hệ nguồn gốc và phả hệ ở góc độ tiến hóa phân tử (Tamura et al.,

2013).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chúng tôi đã tiến hành lựa chọn các chuỗi nucleotide vùng ORF của 40 chủng

virus DHAV đã được đăng ký trên Ngân hàng gen để phân tích độ tương đồng về

nucleotide và phân tích phả hệ nguồn gốc dựa trên các số liệu này. Danh sách 40

chủng virus được lựa chọn được liệt kê trong bảng 2.7.

Bảng 2.7: Các chủng virus viêm gan vịt trên thể giới dùng trong so sánh với chủng viêm gan vịt cường độc NT ở Viê ̣t Nam.

Stt Ký hiệu chủng

Năm phân lâ ̣p

Phân nhó m Nƣớ c phân lâ ̣p

1201 AP03337 AP04009 AP04114 AP04203 B-N C-BLZ SD1201 C-YCW C-YCZ C-YDF D11-JW-018 1v (serotype1) DN2 FS GD C-GY JS2010 JT SD01 SD1101 B-63 04G 90D FC64-CHN-2009 CL DRL62 HP1 HSS S SG H X C80 A66 03D Du-CH-LGD-100913 Du-CH-LGD-100915 Du-CH-LGD-100916 Du-CH-LGD-100928

Số đăng ký NHG KC893553 DQ256132 DQ256133 DQ812093 DQ256134 JX235698 GU066822 KC993890 GU066824 GU066823 GU066821 JX312194 GU250782 JF914944 EU877916 GQ122332 EU352805 HQ654774 JF835025 GQ485310 JQ409566 EU747874 EF067923 EF067924 HQ232302 EF 427899 DQ 219396 EF151312 DQ812092 EF417871 FJ971623 DQ249300 FJ496343 DQ864514 DQ886445 DQ 249299 JF 828984 JF 828985 JF 828986 JF 828988

DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-3 DHAV-2 DHAV-2 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1 DHAV-1

Trung Quốc Hàn Quốc Hàn Quốc Hàn Quốc Hàn Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Hàn Quốc Trung Quốc Viê ̣t Nam Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Đài Loan Đài Loan Trung Quốc Trung Quốc Hàn Quốc Trung Quốc Hàn Quốc Trung Quốc Trung Quốc Anh Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Đài Loan Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc

2012 2004 2004 2003 2004 2011 2009 2011 2009 2009 2009 2011 2008 2009 2008 1999 2007 2010 2010 2008 2010 2008 2006 2006 2009 2011 2005 2006 2006 2007 2009 2007 2008 2006 2006 2005 2010 2010 2010 2010

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chƣơng III

KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬN

3.1. Kết quả thu nhâ ̣n gen VP1 và xác định genotype virus cƣờng độc chủng NT

Chuỗi RNA tổng số thu đươ ̣c từ quá trình tách chiết RNA tổng số của mẫu nướ c trứ ng có chứa virus chủng NT được sử dụng cho phản ứng chuyển đổi từ RNA sang

cDNA bằng mồi xác suất hexamer và mồi đă ̣c hiê ̣u DK 1F. Sản phẩm cDNA sau đó đươ ̣c dù ng làm khuôn để thực hiê ̣n phản ứ ng PCR thu gen VP 1 nhằm hai mu ̣c đích : 1) xác định mẫu nước trứng nghiên cứu chứa virus viêm gan vi ̣t ; 2) thu nhận đoa ̣n gen

VP1 để giải trình tự, xác định genotype của chủng virus cường độc nghiên cứu.

Từ khuôn cDNA của chủng NT , chúng tôi tiến hành phản ứ ng PCR vớ i cả ba

cặp mồi thu nhận gen VP1 của cả ba genotype (DH3F-DH4R thu gen VP1 của DHAV-

1, DHAV2F-DHAV2R thu gen VP 1 của DHAV-2, DHAV3F-DHAV3R thu gen VP 1

3F- của DHAV-3). Kết quả đã cho chúng tôi thu được sản phẩm vớ i că ̣p mồi DHAV

DHAV3R của DHAV-3. Kích thước sản phẩm PCR thu được xấp xỉ 0.8kb, chất lươ ̣ng sản phẩm tốt. Sản phẩm này được dòng hóa vào vector pCR®2.1-TOPO. Plasmid tái tổ hơ ̣p thu đươ ̣c đươ ̣c gử i sang Hàn Quốc để giải trình tự.

Hình 3.1. Kết quả PCR nhân gen VP 1 bằng că ̣p mồi DHAV3F-DHAV3R (A) và kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI (B). Ghi chú: A: Giếng M thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được cắt bằng enzyme HindIII); giếng 1: sản phẩm PCR của mẫu NT cha ̣y bằng că ̣p mồi DHAV3F-DHAV3R, giếng 2: sản phẩm PCR của mẫu NT chạy bằng cặp mồi DHAV 2F-DHAV2R, giếng 3: sản phẩm PCR củ a mẫu NT cha ̣y bằng că ̣p mồi DH3F-DH4R. B: Giếng M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzyme HindIII; 1, 2: DNA plasmid tái tổ hợp của các khuẩn lạc mẫu NT sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Hàn Quốc ) để Plasmid chứ a đoa ̣n gen VP 1 đươ ̣c gử i đến công ty Macrogen

giải trình tự . Phản ứng giải trình tự được thực hiện với cặp mồi M 13F-M13R đươ ̣c thiết kế ngay trên vector pCR®2.1-TOPO.

Kết quả trình tự gen VP 1 chủng NT bao gồm 720 nucleotide, bằng vớ i kích

thướ c gen VP1 của các chủng DHAV-3 trên thế giớ i.

Sau khi thu nhận trình tự nucleotide gen VP1 của chủng NT , chúng tôi tiế n

hành BLAST trình tự này lên website của NCBI . Kết quả cho thấy chủ ng virus nghiên

cứu thuô ̣c genotype III với độ đồng nhất từ 93 đến 100%. Từ đây chú ng tôi tiến hành thiết kế mồi để thực hiê ̣n các phản ứ ng PCR thu nhận toàn bô ̣ hê ̣ gen virus.

3.2. Kết quả thu nhâ ̣n chuỗi nucleotide củ a toàn bô ̣ hê ̣ gen chủ ng NT

đươ ̣c

RNA tổng số thu đươ ̣c từ quá trình tách chiết mẫu nướ c trứ ng chủ ng NT dùng làm khuôn để chuyển đổi cDNA . Các mồi dùng để thu nhận từng phân đoạ n gen

của virus viêm gan vịt chủng NT được thiết kế dựa trên trình tự các hệ gen của DHAV -

3 đã được công bố trên Ngân hàng Gen (bảng 2.3). Sơ đồ bố trí các mồi để thu nhận hệ

gen virus được trình bày ở hình 3.2.

Hình 3.2. Sơ đồ thí nghiê ̣m thu toàn bô ̣ hê ̣ gen chủ ng NT Ghi chú: Mũi tên dài trên cùng là ORF chung kích thước 6756 bp (ATG: mã khởi đầu; TAA: mã kết thúc; vị trí 653-7408 trong chuỗi nucleotide của hệ gen); mũi tên ngắn biểu thị mồi và chiều 5’->3’ của mồi; các vạch giới hạn giữa 2 mồi là sản phẩm PCR ước tính; VP1 được xác định vị trí trong hệ gen; polyA là chuỗi adenine thêm vào cuối hệ gen khi sao chép.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bằng 7 phản ứng PCR (2 phản ứng long PCR, 5 phản ứng PCR thường ), mỗi

100bp đến 200bp, chúng tôi đã thu đoa ̣n PCR thu đươ ̣c có đô ̣ dài lồng vào nhau từ

nhận được toàn bộ hệ gen của virus viêm gan vịt chủng NT (hình 3.3 và hình 3.4).

Hình 3.3. Kết quả điê ̣n di sản phẩm PCR thu toàn bô ̣ hê ̣ gen virus viêm gan vi ̣t cườ ng đô ̣c chủng NT. A: Giếng M: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được cắt bằng enzyme HindIII); giếng 1: sản phẩm PCR chạy bằ ng că ̣p mồi DK 1F-DK1Rb (phân đoạn 1). B: giếng M: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được cắt bằng enzyme HindIII), giếng 1: sản phẩm PCR cha ̣y bằng c ặp mồi DK2F-DK3R. C: giếng M: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được cắt bằng enzyme HindIII), giếng 1: sản phẩm PCR chạy bằng cặp mồi DK 4F- DK5R.

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR thu các phân đoa ̣n 2, 3, 4, 5 của virus DHAV chủng NT Giếng M: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được cắt bằng enzyme HindIII); giếng 1: sản phẩm PCR thu phân đoạn 2 bằng că ̣p mồi DK 2F-DK2R trên khuôn là sản phẩm PCR đã cha ̣y bằng că ̣p mồi DK 2F-DK3R; giếng 2: sản phẩm PCR thu ph ân đoa ̣n 3 bằng că ̣p mồi DK3F-DK3R trên khuôn là sản phẩm PCR đã cha ̣y bằng că ̣p mồi DK 2F-DK3R; giếng 3: sản phẩm PCR thu phân đoạn 4 bằng că ̣p mồi DK 4F-DK4R trên khuôn là sản phẩm PCR đã chạy bằng cặp mồi DK 4F-DK5R; giếng 4: sản ph ẩm PCR thu phân đoạn 5 bằng că ̣p mồi DK5F-DK5R trên khuôn là sản phẩm PCR đã cha ̣y bằng că ̣p mồi DK4F-DK5R.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chúng tôi tiến hành dòng hóa phân đoạn 1 và phân đoạn 5 trướ c khi đem giải

trình tự , với mục đích để thu được toàn bộ hai đầu 5’và 3’ của hệ gen. Với các sản

phẩm PCR khác đươ ̣c chú ng tôi tinh sa ̣ch và gử i giải trình tự trực tiếp bằng các mồ i đă ̣c hiê ̣u. Kết quả dòng hóa phân đoa ̣n 1 và phân đoạn 5 đươ ̣c trình bày trong hình 3.5 và hình 3.6.

Như vâ ̣y, dựa trên kết quả giải trình tự gen VP 1, đối chiếu so sánh vớ i trình tự gen VP1 của các chủng hiện nay đã công bố trên ngân hàng gen chúng tôi đã xác định

đươ ̣c chủ ng virus cườ ng đô ̣c NT thuô ̣c genotype III (DHAV-3). Gen này có đô ̣ dài

720bp, bằng vớ i đô ̣ dài gen VP 1 của các chủng virus thuộc genotype III , dài hơn 6 bp

so với gen VP 1 của chủng virus thuộc genotype I và II . Gen VP1 của chủng NT đã

đươ ̣c dòng hóa và lưu giữ trong plasmid da ̣ng vòng bền vững.

Toàn bô ̣ hê ̣ gen virus viêm gan vi ̣t cườ ng đô ̣c chủng NT phân lập tại tỉnh Ninh

Thuận năm 2013 gồm 7790 bp (bao gồm cả phần đuôi polyA (16 bp) ở đầu 3’) đã

được thu nhận.

Hình 3.5. Kết quả dòng hó a phân đoa ̣n 5 của chủng NT vào vector pJET1.2 A: Hình ảnh đĩa khuẩn lạc dương tính chứa plasmid tái tổ hợp đoạn gen 1.2 kb sản phẩm PCR cha ̣y bằng că ̣p mồ i DK 5F-DK5R dù ng vector pJET 1.2. B: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn Bgl II. Ghi chú: M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzyme HindIII; 1, 2,3: DNA plasmid tái tổ hợp đoạn gen 1.2 kbcủa củ a sản phẩm PCR cha ̣y bằng că ̣p mồ i DK5F-DK5R cắt bằng enzyme BglII.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp chứa phân đoạn 1 của hệ gen virus DHAV chủng NT A: Hình ảnh đĩa khuẩn lạc dương tính chứa plasmid tá i tổ hơ ̣p đoa ̣n gen 1.8 kb sản phẩ m PCR cha ̣y bằng că ̣p mồ i DK 1F-DK1Rb dù ng vector pCR 2.1. B: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI. Ghi chú: M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzyme HindIII; 1, 2: DNA plasmid tái tổ hợp đoạn gen 1.8 kbcủa củ a sản phẩm PCR cha ̣y bằng că ̣p mồ i DK1F-DK1Rb cắt bằng enzyme EcoRI. 3.3. Phân tích đă ̣c điểm hê ̣ gen virus cƣờ ng đô ̣c viêm gan vi ̣t chủ ng NT 3.3.1. Đặc điểm hệ gen

Từ kết quả giải trình trình tự , toàn bộ hệ gen của virus viêm gan vịt chủng NT của Việt Nam bao gồm 7790 nucleotide đã được truy cập vào Ngân hàng gen sử dụng

chương trình BLAST . Chủng NT của Việt Nam có đô ̣ tương đồng cao (93-99%) (phụ

lục 2) về nucleotide so vớ i các chủ ng DHAV -3 đã đươ ̣c công bố trên ngân hàng gen.

Từ đó, chúng tôi đi đến kết luận chủng NT mà chúng tôi đang n ghiên cứ u chính xác

thuô ̣c DHAV-3. Bằng chương trình GeneDoc2.7, phân tích so sánh với các chủng của

thế giới cho thấy:

- Trật tự sắp xếp các gen củ a virus viêm gan vi ̣t cườ ng đô ̣c chủ ng NT cũng

giống như các virus viê m gan vịt khác đã được công bố. Chủng virus này có các đặc

trưng của họ Picornaviridae, bao gồm các vùng gen kết nối kế tiếp nhau: Vùng

5’UTR-vùng gen dẫn L-tổ hơ ̣p P1(VP0, VP3, VP1)- tổ hợp P2(2A1, 2A2, 2B và 2C)- tổ hơ ̣p P 3(3A, 3B, 3C và 3D)–vùng 3’UTR-chuỗi polyA . Vùng mã hóa cho chuỗi polyprotein có chiều dài 7656 bp (từ vi ̣ trí 653 đến vị trí 7408), mã hóa cho 2251 amino acid cấu ta ̣o nên 12 protein thành phần , gồm cả protein cấu trú c và protein không cấu trú c. Vùng 5’UTR dài 652 bp, vùng 3’UTR dài 366 bp, chuỗi poly A gồm

16 phân tử Adenine liền kề nhau . Toàn bộ hệ gen có chiều dài 7790 nucleotide, cấu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trúc hệ gen chủng NT đượ c trình bày trong Phu ̣ lu ̣c 2, trật tự sắp xếp các gene được trình bày trong bảng 3.1.

Kích thước

Tổ hợp gen

Gen

Start codon

Stop codon

Bảng 3.1: Trâ ̣t tự sắp xếp các gen trong hê ̣ gen virus viêm gan vi ̣t cườ ng đô ̣c DHAV -3 chủng NT

P1

P2

P3

5’UTR L VPO VP3 VP1 2A1 2A2 2B 2C 3A 3B 3C 3D 3’UTR ORF

bp 652 90 678 711 720 60 855 357 999 279 84 561 1362 366 6756 7774

Aa - 30 226 237 240 20 285 119 333 93 34 181 453 - 2251

Vị trí trong hệ gen 1 - 652 653 - 742 743 - 1420 1421 - 2131 2132 - 2851 2852 - 2911 2912 - 3766 3767 - 4123 4124 - 5121 5122 - 5401 5402 - 5485 5486 - 6046 6047 - 7408 7409 - 7774 653 - 7408

- ATG - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - TAA -

Vị trí phân cắt giữa các phân đoa ̣n - L/G Q/G Q/G E/L NPG/P Q/S Q/S Q/G Q/S E/S Q/G - -

Tổng:

NT (không kể đuôi polyA ), số purine A là 2135 Trong toàn bô ̣ hệ gen củ a chủ ng

nucleotide (chiếm 27,5%) và purine G l à 1745 nucleotide (chiếm 22,4%); số

pyrimidine T là 2301 nucleotide (chiếm 29,6%) và pyrimidine C là 1592 nucleotide

(chiếm 20,5%). Tỷ lệ G+C (42,9%) thấp hơn tỷ lê ̣ A+T (57,1%).

Dựa vào phần mềm GeneDoc 2.7, thành phần nucleotide của hệ gen chủng NT được

thống kê và trình bày tại bảng 3.2. Thành phần các nucleotide này được so sánh với thành

phần nucleotide trong hệ gen của chủng virus nhược độc vaccine VXXT đang sử dụng tại

Việt Nam, thuộc DHAV-1. Kết quả so sánh được trình bày ở bảng 3.2 cho thấy có sự khác

biệt khá lớn giữa 2 chủng virus này.

Bảng 3.2: Thành phần nucleotide của hệ gen và tỷ lệ (%) mỗi loại nucleotide ở virus viêm gan vịt chủng NT và VXXT

Chủng NT (DHAV-3)

Chủng VXXT (DHAV-1)

Base

Số lượng 2188 2179 1752 1572

Tỷ lệ (%) 28,4 28,3 22,8 20,4

A T G C Tổng số

Số lượng 2135 2302 1745 1592 7774

Tỷ lệ (%) 27,5 29,6 22,4 20,5 100

7691

100

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả so sánh cho thấy, chủng NT có tỷ lệ nucleotide da ̣ng A và T lần lượt là

27,5% và 29,6%, sai khác nhiều so với chủng DHAV-1-VXXT là 29,1% và 28,8%

(Đoàn Thi ̣ Thanh Hương et al., 2011). Sự sai khác này làm cho thành phần amino acid

của hai genotype tại Việt Nam có sự khác nhau, và có ảnh hưởng như thế nào đến hiệu

quả dùng vaccine đối với những đàn vịt thuộc DHAV-3 tại Việt Nam là điều cần được

xem xét. Sự khác biê ̣t này có liên quan đến hiê ̣u quả dù ng vaccine đối vớ i đàn vi ̣t con

đang đươ ̣c nuôi hiê ̣n nay vì hầu hết các chủng virus viêm gan vi ̣t đươ ̣c phát hiê ̣n ở Viê ̣t

Nam những năm gần đây đều thuộc genotype III.

So sánh về kích thước hệ gen , nhìn chung có khác nhau giữa các chủng và giữa

các genotype. Trong cù ng mô ̣t genotype , kích thước hai vùng không mã hóa 5’UTR và

3’UTR không có sự thay đổi đáng kể. Tuy nhiên giữa các genotype khác nhau thì sự

sai khác này là khá lớn . Do vù ng 5’UTR là nơi hình thành nên vòm (loop) bám và tạo ởng nhất vị trí bám của RNA polymerase khởi đầu sao chép nên nó có những ảnh hư

. Đặc biệt , vùng không mã hóa đi ̣nh đến virus. Sự thay đổi về kích thướ c ở các vù ng không mã hóa 5’UTR và 3’UTR trong hê ̣ gen có thể không làm thay đổi các đă ̣c tính sinh ho ̣c cũng như không ảnh hưở ng đến khả năng gây bê ̣nh củ a virus , nhưng quan tro ̣n g trong viê ̣c giú p virus bảo tồ n hê ̣ gen củ a chú ng qua các lần lây nhiễm tự nhiên

còn là một trong các cơ sở dữ liệu trong phân tích nguồn gốc phả hệ các chủng virus

viêm gan vi ̣t.

Sự sai khác về nucleotide củ a các gen và cả vù ng không mã hóa 5’UTR, 3’UTR

của hệ gen DHAV đều là những cơ sở dữ liệu góp phần vào việc phân biệt và xếp loại

các chủng virus viêm gan vịt . Gần đây, gen VP1 được nghiên cứu nhiều nhất vì gen

này vừ a mang tính kháng nguyên , vừ a quyết đi ̣nh đô ̣c lực gây bê ̣nh củ a DHAV , có ý . Do đó , nghĩa quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ và phòng chống bệnh viêm gan vịt sự khác biệt trên trình tự gen VP 1 giữa các genotype đươ ̣c coi như chỉ thi ̣ phân tử để phân biê ̣t DHAV-3 vớ i DHAV-1 và DHAV-2.

Vớ i chủ ng NT mà chú ng tôi nghiên cứ u có cùng kích thước với khung đo ̣c mở

của các chủng thuộc DHAV -3 (6756 nucleotide), và sai khác 6 nucleotide vớ i các

(có c ùng số nucleotide là 6750 nucleotide). Sáu chủng thuô ̣c genotype I và II

nucleotide sai khác này tương ứ ng vớ i hai amino acid nằm ở gen kháng nguyên VP 1.

Điều này có thể dẫn đến sự khác biệt về độc lực và tính kháng nguyên của vuris thuộc

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

genotype III so vớ i ha i genotype còn la ̣i . Vùng ORF của virus viêm gan vịt nói chung

đều mã hóa cho 10 đến 12 protein chứ c năng. Tuy nhiên ở mô ̣t số chủ ng cũng có

trườ ng hơ ̣p VP0 không phân cắt thành VP2 và VP4.

olyprotein chủ ng NT cho thấy : Phân tích thành phần aminoacid củ a chuỗi p

trong số 20 amino acid cấ u ta ̣o nên chuỗi popyprotein , Leucine chiếm tỷ lê ̣ cao nhất

(chiếm 8,84%), Tryptophan chiếm tỷ lê ̣ thấp nhất (1.64%). Các amino acid khác chiếm

tỷ lệ trung bình từ 7.55% đến 4.53%.

Về vi ̣ trí cắt giữa các phân đoạn polypeptide , so sánh giữa 3 chủng NT , DN2

(chủng virus cường độc thuộc genotype III phân lập ở Việt Nam năm 2009) và chủng

VXXT (chủng virus nhược độc vaccine đang sử dụng tại Việt Nam ), chủng NT có vị

trí cắt gần giống với chủng DN 2 (JF914944) và chủng VXXT (JF914945) ngoại trừ

2 vị trí cắt này điểm cắt giữa protein 3B và 3C có khác biê ̣t . Cụ thể : chủng NT v ị trí cắt này E /S lại là Q/S (Glutamic acid/Serine) trong khi ở chủ ng DN

(Glutamine/Serine). Ở chủng vaccin e VXXT (thuô ̣c genotype I ) vị trí cắt này lại là

E/N (Glutamic acid/Asparagine) (Đoàn Thi ̣ Thanh Hương, 2011). Sự khác biê ̣t về vi ̣ trí cắt có ảnh hưở ng trực tiếp đến khả năng nhâ ̣n biết củ a enzy me, quyết đi ̣nh sự thành

công của quá trình cắt phân đoạn các protein.

Để phân tích và so sánh sự biến đổi củ a chủ ng NT so vớ i các chủ ng virus viêm

gan vi ̣t thuô ̣c cả ba genotype đã và đang lưu hành trên thế giớ i , chúng tôi chọn so sánh

trình tự vùng ORF của chủng này với vùng ORF của 40 chủng DHAV đã được công

bố trên Ngân hàng gen (bảng 2.7). Đây là các chủng đại diện cho các genotype khác nhau, phân lâ ̣p ở các ổ di ̣ch trên khắp thế giớ i ở các th ời điểm khác nhau , bao gồm 22 chủng thuộc DHAV-3, 2 chủng thuộc DHAV-2 và 16 chủng thuộc DHAV-1.

Kết quả so sánh thành phần chuỗi polypeptide của chủng NT nghiên cứu được

thống kê như sau:

- Phần đầu củ a vù ng ORF là protein dẫn (L), vùng này có ít biến đ ổi giữa các chủng và giữa các genoype . Ở chủng NT , vùng L khác với các chủng virus thuộc hai

genotype I và II ở vi ̣ trí 11 và 14 và 23 trên chuỗi polyprotein. Ở vị trí 11, chủng NT hoàn toàn giống với các chủn g thuô ̣c DHAV-3, cùng là Glutamic acid (E), trong khi

hai chủ ng thuô ̣c DHAV-2 lại là Serine (S), các chủng thuộc DHAV-1 là Alanine (A).

Ở vị trí 14, chủng NT có sự sai khác so với cả genotype I và II , amino acid ở vi ̣ trí này

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của chủng NT là Alanine (A), giống vớ i các chủ ng khác thuô ̣c DHAV-3, trong khi ở cả

hai genotype còn la ̣i đều là Valine (V).

- Gen mã hóa cho protein VP 0 của chủng NT (thuô ̣c DHAV-3) đô ̣ dài 678 bp,

cùng độ dài với gen mã hóa cho VP 0 của hai genotype còn la ̣i . Sau khi đươ ̣c di ̣ch mã protein này tự phân cắt thành VP 4 và VP 2 (tùy từng chủng ). Protein VP 4 có kích

thướ c rất nhỏ nằm sâu trong vỏ capsid . VP2 lớ n hơ n nằm ngay trên bề mă ̣t kháng . Do trình tự nguyên, cùng với VP 3 và VP 1 quyết đi ̣nh tính kháng nguyên củ a virus nucleotide ở vùng này cũng ít biến đổi giữa 3 genotype nên sự biến đổi về amino acid

. Dựa vào kết quả so sánh giữa

cũng ít xảy ra . Chứ c năng củ a protein này ít thay đổi các chủ ng trên phần mềm GeneDoc2.7 chúng tôi nhận thấy chỉ có sai khác điểm giữa

các chủng.

- Vùng gen mã hóa cho protein VP 3 ở chủng NT có nhiều biến đổi so với các

chủng khác trong cùng genotype III. Ở các vị trí 1428, 1750, 1779, 2042, 2052, 2093

chủng NT sai khác nhiều về nucleotide so với các chủng còn lại thuộc cả ba genotype

nhưng các sai khác này cũng không làm biến đổi về amino acid . Tuy nhiên, sự sai khác ở vị trí 1454, trên trình tự ORF củ a chủ n g NT đã dẫn đến sai khác về amino acid ở vi ̣ trí 485 so vớ i mô ̣t số chủ ng khác trong cùng DHAV-3 và hoàn toàn sai khác với các

chủng thuộc hai genotype còn lại . Đặc biệt, nucleotide ở vị trí 2125 của chủng NT là

Thymin (T) khác hoàn toàn so với tất cả các chủng còn lại (C đối với genotype I và III; A đối với genotype II). Tuy nhiên, sự sai khác này dẫn đến sự sai khác về amino acid ở

các chủng thuộc DHAV-2 và DHAV-3, nhưng la ̣i không ta ̣o nên sự khác biê ̣t vớ i

DHAV-1.

- Protein VP 1 có vai trò quan trọng đối với các chủng DHAV . Cũng như các

chủng DHAV khác , gen này không mang mã khở i đầu cũng không có mã kết thú c do

nằm ở vù ng giữa củ a khung đo ̣c mở . So sánh gen VP1 của chủng NT nghiên cứu vớ i

gen VP1 của 40 chủng virus DHAV đã được công bố toàn bộ hệ gen trên ngân hàng

gen chú ng tôi nhâ ̣n thấy gen VP 1 của chủng NT có kích thước bằng với các chủng

khác thuộc DHAV-3, và lớ n hơn kích thước gen VP1 của các chủng thuộc DHAV-1,

DHAV-2 là 6 nucleotide. So sánh trình tự gen VP 1 của chủng NT với 21 chủng

DHAV-3 chúng tôi nhận thấy có 164 vị trí sai khác về nucleotide dẫn đến 38 vị trí sai

khác về amino acid . Các sai khác chủ yếu nằm ở phần cuối của gen tứ c đầu 3’ củ a

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chuỗi gen . Sự sai khác này càng lớn khi so sánh giữa chủng NT với chủng vaccine

VXXT và các chủng thuộc genotype I và II. Đầu 3’ là vùng chứa nhiều biến đổi nhất

trong gen VP1 dẫn đến sự khác biê ̣t về tính kháng nguyên và độc lực của virus. Sự khác biệt này có thể ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên-kháng

thể của virus với tế bào chủ. Từ đó cho thấy, vaccine có bản chất là DHAV-1 sẽ không hoă ̣c ít có tính bảo hô ̣ đối vớ i các chủ ng virus cường độc thuộc DHAV-3.

n sự thay đổi về

- Cũng giống như các Picornavirus khác, nằm ở vi ̣ trí trung tâm củ a hê ̣ gen củ a chủng NT là tổ hợp gen P 2. Tổ hơ ̣p này có chiều dài lớ n nhất trong toàn bô ̣ hê ̣ gen vớ i kích thước 2270 bp. Toàn bộ tổ hợp gen này nằm từ vi ̣ trí 2852 đến vị trí 5121 của của hê ̣ gen virus . Vùng gen này mã hóa cho 4 protein thành phần 2A1, 2A2, 2B và 2C. Đây đều là các protein không cấu trú c , tuy không tham gia vào quá trình hình thành hạt virus nhưng có mă ̣t trong các tế bào nhiễm . Mỗi protein thành phần có mô ̣t vai trò nhất đi ̣nh trong quá trình nhân lên , xâm nhiễm củ a virus vào tế bào chủ . Từ ng biến đổi trong trình tự nucleotide củ a phân đoa ̣n này có thể ảnh hưở ng đế amino acid làm ảnh hưở ng cả đến bản thân virus lẫn tế bào chủ .

Nằm ở đầu tổ hợp gen P 2 là protein 2A1 và 2A2. Độ dài vùng gen mã hóa cho

tác

protein 2A1 và 2A2 chênh lê ̣ch nhau khá lớ n . Đây là hai protein có chứ c năng đô ̣ng vào tế bào chủ ở mứ c đô ̣ khác nhau . Protein 2A1 thuô ̣c chuỗi polyprotein chính gồ m 20 amino acid, là protein có kích thước khá nhỏ trong chuỗi polyprotein . Protein

2A2 có vai trò ức chế sự phát triển của tế bào nhiễm . Khi so sánh vớ i các chủ ng khác thuô ̣c DHAV -3 chúng tôi chỉ thấy có 8 sai khác về nucleotide dẫn đến 2 sai khác về

amino acid . Các đột biến này đều ở dạng đột biến điểm , không quá sai khác vớ i các

chủng còn lại thuộc cùng genotype III . Vì vậy , có thể thấy protein này khá bảo tồn

trong cù ng một genotype . Tại vị trí 3300 của hệ gen chủng NT (gen 2A2), có một đột biến điểm (G→A) khác hẳn với tất cả các chủng khác ở cả ba genotype

. Sự sai khác này dẫn đến sự biến đổi về amino acid ta ̣i vi ̣ trí 1100 trên chuỗi polypeptide , ở chủ ng NT vi ̣ trí này là T (Thymine) trong khi ở genotype II là A (Alanine), genotype I là D (Aspartic acid). Đây cũng là một trong những sai khác phân biệt giữa các chủng thuộc

ba genotype . So vớ i các chủ ng khác cù ng thuô ̣c DHAV -3 thì chủng NT có 103 sai

khác về nucleotide dẫn đến 18 sai khác về amino acid ở gen 2A2.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Protein 2B và 2C cù ng vớ i protein 3A và 3D tham gia vào quá trình sao chép RNA củ a virus. 2B và 2C đươ ̣c phân cắt từ protein tiền thân 2BC. Ở chủng NT nghiên cứ u, hai gen này cũng nằm kề nhau . Gen 2B có kích thướ c ngắn hơn (357 bp) trong khi gen 2C có kích thước dài hơn (999bp). Điểm khở i đầu củ a gen 2B là vi ̣ trí 3767 và điểm kết thú c gen 2C là 5121 trên hê ̣ gen . Điểm phân cắt giữa hai protein này giống vớ i chủ ng DN 2, tứ c là cũng cắt ở vi ̣ trí Q /S (Glutamine/Serine). Phân tích lần lươ ̣t từ ng gen chú ng tôi nhâ ̣n thấy:

+ Gen 2B mã hóa cho protein 2B của chủng NT có kích thước bằng với các

chủng virus DHAV đương nhiễm hiện nay đã công bố. So vớ i các chủ ng DHAV-3

đươ ̣c công bố trên ngân hàng gen , vùng gen này của chủng NT hoàn toàn tương đồng

với chủng DN2 phân lập tại Việt Nam năm 2009, nhưng có 45 vị trí sai khác về

nucleotide dẫn đến sai khác 3 sai khác về amino acid với các chủng DHAV-3 của thế

giới.

+ So sánh gen 2C giữa chủng NT và các chủng DHAV-3 cho thấy có 162 điểm

sai khác về nucleotide dẫ n đến 33 vị trí sai khác về amico acid . Trong đó , trình tự nucleotide ta ̣i vi ̣ trí 4162 (C) và 5009 (A), khác hoàn toàn vớ i các chủ ng DHAV khác. Tổ hơ ̣p gen P 3 của chủng NT mã hóa cho chuỗi polypeptide cấu thành nên 4

protein 3A, 3B, 3C và 3D. Phân đoa ̣n đầu tiên củ a tổ hơ ̣p gen này là trình tự nucleotide mã hóa cho protein 3A. Trình tự này gồm 279 nucleotide (từ vi ̣ trí 5122 đến vị trí 5401) mã hóa cho 93 amino acid . So sánh trình tự nucleotide củ a gen 3A chủng NT vớ i 21 chủng DHAV-3 phân lâ ̣p gần đây trên thế giớ i chúng tôi nhâ ̣n thấy có 51 vị trí sai khác dẫn đến 8 vị trí sai khác về amino acid trong chuỗi polypeptide . Trong đó, có

2 vị trí nucleotide (vị trí 5243 và 5390) sai khác với tất cả các chủng DHAV . Tuy

3A, vì không

nhiên, những sai khác này không ảnh hưở ng đến hoa ̣t tính củ a protein dẫn đến làm thay đổi amino acid.

Gen 3B và 3C mã hóa cho protein 3B và 3C. Hai protein này cù ng nằm trong tổ

hơ ̣p gen P 3. Vì nằm ở giữa khung đo ̣c mở nên hai gen liền kề này không có mã khởi

đầu và mã kết thú c . Chúng được phiên mà và dịch mã dưới sự điều khiển của mã khởi

đầu và mã kết thú c chung củ a khung đo ̣c mở . Gen 3B có chiều dài 102 bp tương ứ ng vớ i 34 amino acid, bắt đầu từ vi ̣ trí 5370 đến 5453 trên hê ̣ gen . Liền kề vớ i gen 3B là gen 3C. Gen 3C dài hơn , nằm từ vi ̣ trí 5454 đến 6014 trên hê ̣ gen virus , mã hóa cho

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

181 amino acid. Protein 3C có bản chất là mô ̣t enzyme tham g ia vào quá trình phân cắt hầu hết các protein . Đây cũng là điểm khác biê ̣t đáng kể củ a chủ ng NT nói riêng và DHAV-3 nói chung so với DHAV -1 và DHAV-2. Ở hai genotype I và II , vùng gen 3B

và 3C vớ i đô ̣ dài tương ứ ng là 84 bp và 561 bp.

Ở vị trí cắt giữa protein 3B và 3C, do có sự sai khác hai bô ̣ ba GAA so vớ i bô ̣

ba CAG ở chủ ng DN 2 đã dẫn đến có sai khác hai amino acid ta ̣i vi ̣ trí cắt giữa protein này, ở chủng NT vị trí cắt là E/S (Glutamic acid/Serine) còn ở chủng DN2 là

Q/S (Glutamine/Serine). Vị trí cắt này cũng khác hẳn với vị trí cắt của chủng VXXT,

là chủng vaccine đang được sử dụng phổ biến hiện nay ở Việt Nam, ở chủng VXXT vị

trí cắt này lại là E/N (Glutamic acid/Asparagine) (Đoàn Thị Thanh Hương., 2010). Sự

. Các

thay đổi này ảnh hưở ng đến việc nhâ ̣n biết vị trí cắt và hiê ̣u suất cắt củ a enzyme protease cần bám đặc hiệu với sợi polypeptide để phát huy tính phù hợp về vị trí bám

và hoạt lực enzyme. Chính cấu tạo phân tử và điện tích của các amino acid đứng cạnh

nhau sẽ quyết định tính đặc hiệu của protease.

Vùng gen 3D có kích thướ c tương đối lớ n (1362 bp), nằm ở vi ̣ trí cuối cù ng củ a

. Gen 3D mã hóa cho

22 khung đo ̣c mở . Đây là protein cuối cù ng trong chuỗi polyprotein có đươ ̣c từ trình tự ORF nên có mã kết thú c TAA nhưng không có mã khở i đầu protein 3D, mô ̣t loa ̣i RNA polymerase có vai trò quan tro ̣ng trong quá trình sao chép RNA củ a hê ̣ gen virus . Khi so sánh thành phần nucleotide và amino acid giữa

chủng DHAV-3 cho thấy trên vù ng gen 3D (6047-7408) chỉ có 18 vị trí sai khác về

amino acid trong số 115 vị trí sai khác về nucleotide. Vì vậy, gen 3D đươ ̣c coi là tương

đố i bảo tồn trong genotype III.

Nhìn chung giữa các genotype ít có biế n đổi ở vù ng nucleotide từ vi ̣ trí 1 đến vị trí 1869 trên vù ng ORF (tương ứ ng vớ i amino acid từ vi ̣ trí 1 đến vị trí 623 trong chuỗi 1872 đến hết vùng polypeptide). Có sự sai khác khá lớn giữa các genotype từ vị trí

khung đo ̣c mở , các sai khác này không còn ở dạng điểm mà thành từng cụm dạng

oligo nucleotide hoă ̣c oligo peptide.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.3.2. Kết quả phân tích đồng nhấ t (về nucleotide) và tƣơng đồng (về amino acid) trên toàn vù ng ORF củ a chủ ng NT (Viê ̣t Nam) vớ i 40 chủng DHAV trên thế giới Từ kết quả giải trình tự toàn bô ̣ hê ̣ gen củ a chủ ng NT , chúng tôi tiến hành so

sánh vùng ORF của chủng nghiên cứu với vùng ORF của các chủng viêm gan vịt

thuô ̣c cả 3 genotype đã đươ ̣c công b ố trên Ngân hàng gen . Trong nghiên cứ u này

chúng tôi sử dụng phần mềm GeneDoc 2.7 (Nicholas et al, 1999) và Mega 6.0

(Tamura et al, 2013) trên cơ sở bô ̣ mã di truyền củ a vi khuẩn để so sánh sự đồng nhất (identity) về nucleotide và tươ ng đồng (homology) về amino acid . Dựa trên cơ sở dữ liê ̣u này chú ng tôi xây dựng cây phân loa ̣i để xác đi ̣nh nguồn gốc phả hê ̣ củ a chủ ng NT vớ i 40 chủng DHAV đã công bố trên Ngân hàng gen . Kết quả so sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide đươ ̣c trình bày trong bảng 3.3.

Từ Bảng 3.6 cho thấy, chủng NT của Việt Nam có sai khác từ 1-7% so với các

chủng thuộc DHAV-3, trong khi với hai genotype còn lại, sự sai khác này 27% đối với

genotype I và 28% đối với genotype II. So sánh giữa các chủng thuộc genotype III,

chủng NT của Viê ̣t Nam có đô ̣ tương đồng cao vớ i hầu hết các chủ ng phân lâ ̣p từ

Trung Quốc, trong đó có tỷ lệ tương đồng cao nhất (98%) vớ i 2 chủng 1201 (phân lâ ̣p

năm 2012) và chủng chủng B-N (phân lâ ̣p năm 2011). So sánh với chủng DN 2, phân

lập tại Đồng Nai – Việt Nam năm 2009, chủng NT có tỷ lệ đồng nhất về nucleotide là

93%.

Như vâ ̣y ở Viê ̣t Nam , ngoài các chủng thuộc DHAV -1 tồn ta ̣i từ khá lâu cho

đến nay, gần đây đã phát hiê ̣n nhiều chủ ng virus viê m gan vi ̣t thuô ̣c DHAV -3 tại nhiều

địa phương trên cả nước (Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2010; 2011). Tuy nhiên, tại

Viê ̣t Nam vẫn dù ng duy nhất vaccine nhươ ̣c đô ̣c thuô ̣c DHAV -1. Chủng virus vaccine

này thuộc cù ng mô ̣t nhánh vớ i các chủ ng củ a Hà n Quốc và Mỹ và có tỷ lệ tương đồng

thấp với các chủng DHAV -3 đương nhiễm (Đoàn Thi ̣ Thanh Hương et al., 2011). Tại

Hàn Quốc, các chủng virus viêm gan vịt DHAV-3 được báo cáo là tương đối phổ biến

và đã có vaccine phòng bệnh viêm gan vịt thuộc genotype này. Đây là loại vaccine có

nguồn gốc từ chủ ng cườ ng đô ̣c DHAV -3 chủng AP-04203 đã đươ ̣c cấy truyền nhiều

đờ i qua phôi gà.

Vẫn chưa tìm thấy sự xuất hiê ̣n củ a chủ ng thuô ̣c DHAV -2 trên lãnh thổ Viê ̣t

Nam hay bất cứ nước nào khác ngoài Đài Loan.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

28 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 72 72 100 94

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

2 98

3 95 96

4 94 95 99

5 95 96 99 99

6 95 95 98 98 98

7 98 99 96 95 96 96

8 96 97 95 95 95 95 97

9 96 97 95 95 95 95 97 96

10 96 97 94 94 94 94 97 96 97

11 96 97 95 95 95 95 97 96 97 98

12 96 97 95 95 95 95 97 97 98 97 98

13 94 95 96 96 96 96 95 95 94 94 94 94

14 96 97 96 95 96 95 97 97 97 96 97 97 95

17 98 99 96 96 96 96 99 98 98 97 97 98 95 98 93 99

18 97 98 96 96 96 96 98 97 97 97 97 98 95 98 93 99 99

19 95 96 94 94 94 94 96 96 97 99 98 97 94 96 92 97 97 97

20 97 98 95 95 95 95 98 97 97 96 97 97 95 98 93 98 98 99 96

21 97 95 95 95 95 97 97 96 96 96 96 94 97 93 97 97 97 95 97 97

22 96 97 95 95 95 95 97 97 97 96 96 96 94 97 93 97 97 97 95 97 97

23 94 94 95 95 96 95 94 94 94 94 94 94 94 94 95 95 95 95 93 94 94 94

24 77 78 78 78 78 78 78 78 78 77 77 77 78 78 77 78 78 78 77 78 78 77 78

25 77 78 78 78 78 78 78 78 78 77 78 78 78 78 77 78 78 78 77 78 78 78 78 99

26 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 72 72

27 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 72 72 94

29 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 72 72 99 94 99

30 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 73 72 72 95 94 95 95

15 93 93 94 94 94 94 93 93 93 93 93 93 93 93

16 97 98 96 96 96 96 96 98 97 98 97 97 98 95 98

Bảng 3.3: Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide vù ng ORF củ a chủ ng NT vớ i 29 chủng DHAV trên thế giới

Chú thích: 1. NT (VN),2.1210 (CN),3. AP03337 (KR),4. AP04009 (KR),5. AP04114 (KR),6. AP04203 (KR), 7.B-N (CN), 8.C-BLZ (CN), 9.SD1210 (CN), 10.C-YCW (CN), 11.C-YCZ (CN), 12.C-YDF (CN), 13.D11-JW-018 (KR), 14.1v (TQ), 15.DN2 (VN), 16.FS (CN), 17.GD (CN), 18.C-GY (CN), 19.JS2010 (CN), 20.JT (CN), 21.SD01 (CN), 22.SD1101 (CN), 23.B-63 (CN), 24.04G (TW), 25.90D (TW), 26.HP1 (CN), 267HSS (KR), 28.S (CN), 29.SG (CN), 30.H (UK), Trong đó: CN-Trung Quốc, KR-Hàn Quốc, UK-Anh, TW-Đài Loan,VN-Viê ̣t Nam

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.3.3. Xác định mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus viêm gan vịt Việt Nam

sử dụng toàn bộ chuỗi gen khung đọc mở (ORF)

Toàn bộ dữ liệu chuỗi gen khung đọc mở của 41 chủng virus đã nêu trong

(Hình

bảng 3.5 đươ ̣c đưa vào phần mềm Mega 6.0 để phân tích phả hệ nguồn gốc 3.7). Kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ hoàn toàn phù hơ ̣p vớ i kết quả so sánh tỷ

lệ tương đồng bằng phần mềm GeneDoc 2.7.

ợc chia Kết quả phân tích phả hê ̣ cho thấy các chủng virus viêm gan vịt đư

làm ba nhóm riêng biệt đại diện cho 3 genotype I, II và III:

i) Nhóm genotype I bao gồm các chủng phân lập tại Hàn Quốc, Trung Quốc

và Đài Loan;

ii) Nhóm genotype II chỉ bao gồm hai chủng duy nhất phân lập tại Đài Loan;

iii) Nhóm genotype III bao gồm các chủng phân lập tại Trung quốc, Hàn

Quốc và Việt Nam.

Trong nhóm genotype III được phân làm ba nhánh chính: Nhánh thứ nhất

bao gồm 14 chủng của Trung Quốc, 1 chủng JT của Hàn Quốc và chủng NT của

Việt Nam. Trong đó chủng NT phân lập năm 2013 của Việt Nam có quan hệ gần

gũi nhất với chủng B-N và 1201 của Trung Quốc. Đây là hai chủng mới được phân

lập năm 2011 và 2012. Điều này cho thấy rất có khả năng chủng NT của Việt Nam

có nguồn gốc từ các chủng mới phân lập của Trung Quốc, được du nhập vào qua

con đường vận chuyển, buôn bán qua biên giới. Nhánh thứ hai bao gồm 05 chủng

của Hàn Quốc. Nhánh thứ ba bao gồm chủng DN2 của Việt Nam và chủng B63 của

Trung Quốc.

Cũng qua phân tí ch phả hê ̣ cho thấy sự phứ c ta ̣p trong quần thể virus viêm gan vi ̣t trên thế giớ i . Quần thể virus viêm gan vi ̣t bi ̣ ảnh hưở ng bở i các vù ng đi ̣a lý khác nhau. Phân tích phả hê ̣ cho thấy virus viêm gan vi ̣t có nguồn gốc từ hai nhóm : mô ̣t là Trung Quốc và mô ̣t nhóm khác có nguồn gốc ngoài Trung Quốc bao gồm : Anh, Hàn Quốc, Đài Loan và Viê ̣t Nam . Cây phả hê ̣ cũng đươ ̣c chia thành các phân

nhóm, có nhiều phân nhóm gồm các chủng virus có năm phân lập gần nhau , cụ thể

như nhóm DN 2 (Viê ̣t Nam 2009) và B -63 (Trung Quốc 2008) và nhóm gồm các

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chủng B-N (Trung Quốc 2011), chủng 1210 (Trung Quốc 2012) và chủng NT (Viê ̣t

Nam 2013).

Hình 3.7. Mối quan hê ̣ nguồn gốc phả hê ̣ giữa các chủ ng DHAV của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự nucleotide vù ng ORF bằng chương trình M EGA6.0 (sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ (Neighbour-Joining) với đô ̣ tin câ ̣y 1000 bootstraps).

Cũng qua phân tích phả hệ cho thấy sự phức t ạp trong quần thể virus viêm

gan vi ̣t trên thế giớ i . Quần thể virus viêm gan vi ̣t bi ̣ ảnh hưở ng bở i các vù ng đi ̣a lý khác nhau. Phân tích phả hê ̣ cho thấy virus viêm gan vi ̣t có nguồn gốc từ hai nhóm :

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mô ̣t là Trung Quốc và mô ̣t nhó m khác có nguồn gốc ngoài Trung Quốc bao gồm :

Anh, Hàn Quốc, Đài Loan và Viê ̣t Nam.

Trong số các chủng virus viêm gan vịt được công bố trên Ngân hàng gen, các

chủng của Trung Quốc được phân lập và công bố nhiều nhất . Nguyên nhân có thể

do Trung Quốc là mô ̣t nướ c rô ̣ng lớ n , dân cư đông , nền chăn nuôi la ̣i phát triển

mạnh về qui mô cho nên các chủng virus viêm gan vịt từ xa xưa đã đã có cơ hội

phát sinh và tiến hóa tạo nên sự đa dạng sinh học . Viê ̣c xuất, nhâ ̣p khẩu và buôn bán . Trong khi đó vịt từ Trung Quốc ra nhiều nước trên thế giới diễn ra thường xuyên Viê ̣t Nam la ̣i là nướ c rất gần vớ i Trung Quốc nên viê ̣c vâ ̣n chuyển gia cầm qua biên giớ i rất thuâ ̣n tiê ̣n. Vì thế, về nguyên tắ c các chủ ng virus từ Trung Quốc có thể phát . Đó có thể là tán đi nhiều nước và có những biến đổi phù hợp với điều kiện địa lý

nguyên nhân dẫn đến sự đa da ̣ng củ a các chủ ng virus viêm gan vi ̣t như ngày nay .

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

KẾ T LUẬN VÀ KIẾ N NGHI ̣

KẾ T LUẬN

1. Toàn bộ hệ gen virus viêm gan vịt chủng NT phân lập tại tỉnh Ninh Thuận (Viê ̣t

7790 bp,

Nam) năm 2013 đã đươ ̣c giải trình tự . Độ dài chính xác của hệ gen là trong đó vùng 5’UTR là 652 bp ; ORF là 7656 bp ; vùng 3’UTR là 366bp; và đuôi

polyA gồm 16 Adenine. Lưu giữ đươ ̣c ba phân đoa ̣n gen VP 1, phân đoa ̣n 1 và phân

đoa ̣n 5 của hệ gen trong plasmid tái tổ hợp.

2. Chủng NT của Việt Nam thuộc genotype III (DHAV-3) có trật tự sắp xếp các gen

giống như trâ ̣t tự sắp xếp các gen củ a các chủ ng thuô ̣c ho ̣ Picornaviridae trên thế

Các gen được sắp xếp liên tục theo thứ tự : giớ i.

5’UTR/L/VP0/VP3/VP1/2A1/2A2/2B/2C/3A/3B/3C/3D/3’UTR.

3. Vị trí phân loại của virus viêm gan vịt cường độc ch ủng NT (Viê ̣t Nam): Group

IV: ssRNA positive-strand viruses; Order: Nidovirales; Family: Picornaviridae;

Genus: Avihepatovirus; Genotype: DAHV3; Strain: NT

93- 4. Virus cườ ng đô ̣c viêm gan vi ̣t chủng NT củ a Viê ̣t Nam có tỷ lê ̣ tương đồng

98% với các chủng thuộc DHAV-3; 72% với các chủng thuộc DHAV-2 và 73% với

các chủng thuộc DHAV -1. Trong đó có tỷ lệ tương đồng cao nhất (98%) vớ i hai

chủng 1210 và B-N củ a Trung Quốc.

KIẾ N NGHI ̣

1. Cần thu thâ ̣p , sàng lọc thêm số mẫu để kiểm tra xem ngoài hai genotype I và III

đang tồn ta ̣i ở Viê ̣t Nam còn có virus thuô ̣c genotype II hay không .

2. Phát hiện và lưu giữ thêm các chủng thuộc genotype III nhằm bổ sung thêm

nguồn dữ liê ̣u để sản xuất vaccine phòng chống các chủ ng thuô ̣c DHAV-3 hiê ̣u quả.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:

1. Đoàn Thị Thanh Hương, Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạnh, Lê Thanh Hòa

(2010) Phát hiện lần đầu tiên genotype III (DHAV-3) virus gây bệnh viêm gan

vịt tại Việt Nam bằng phương pháp giám định phân tử. Tạp chí Công nghệ

Sinh học 8(2): 145-153.

2. Đoàn Thị Thanh Hương (2011) Nghiên cứu giải mã hệ gen virus viêm gan vịt

(Duck hepatitis A virus) phân lập tại Việt Nam và xác định vị trí phân loại.

Luận án Tiến sỹ Sinhh học, Viện Công nghệ Sinh học

3. Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly (2001) Nghiên cứu

biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan virus vịt. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật Thú y

4: 48-51.

4. Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng (1985) Thăm dò tạo chủng vaccine nhược độc

viêm gan vịt bằng chủng phân lập tại địa phương. Tạp chí Khoa học và kỹ

thuật Thú y 4: 3-8.

5. Lê Minh Chí, Hồ Đình Chúc, Bùi Quý Huy (1999) Kết quả điều tra dịch bệnh

gia súc, gia cầm 5 tỉnh phía Bắc (1995 - 1997). Tạp chí Khoa học và kỹ thuật

Thú y 6(3): 75-78.

6. Bùi Thị Cúc (2002) Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể và siêu vi thể

bệnh viêm gan siêu vi trùng vịt. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp,

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

7. Lê Thanh Hòa, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên (1984) Đặc tính sinh học

của giống virus vaccine viêm gan vịt chủng TN của Asplin và vaccine phòng

bệnh ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Kỹ thuật Thú y 2: 21-25.

8. Nguyễn Bá Hiên (2007) Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virut

nhược độc viêm gan vịt DH-EG-2000 và bước đầu nghiên cứu chế tạo vacxin

phòng bệnh. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật Thú y 2: 11-15.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

9. Nguyễn Phục Hưng (2004) Tình hình mắc bệnh viêm gan vịt do virus ở một số

tỉnh đồng bằng Bắc bộ, phân lập virus gây bệnh, Nghiên cứu đặc tính sinh học

của chủng virus nhược độc viêm gan vịt DH-EG-2000 và qui trình sản xuất

vaccine. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

10. Trần Thị Lan Hương (2007) Phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên đàn vịt

con nuôi tại một số vùng phụ cận Hà Nội. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật Thú y

5: 13-16.

11. Bùi Thanh Khiết (2007) Nghiên cứu quy trình sản xuất vaccine viêm gan vịt từ

chủng virus vaccine nhược độc DH-EG-2000 và ứng dụng phòng, can thiệp

dịch vào thực tế sản xuất. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông

nghiệp Hà Nội.

12. Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán (2002) Bệnh viêm gan virus vịt. Tạp chí

Khoa học và kỹ thuật Thú y 9(1): 87-90.

13. Phạm Văn Ty (2007) Virus học. Nhà xuất bản giáo dục.

14. Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn Đức Lưu, Trần Thu Hiền, Nguyễn Khánh Ly (2001)

Kết quả sử dụng kháng thể viêm gan virus vịt phòng trị bệnh cho vịt, ngan.

Tạp chí Khoa học và kỹ thuật Thú y 4: 52-58.

Tiếng Anh

15. Ahlquist P (2006) Parallels among positive-strand RNA viruses, reverse-

transcribing viruses and double stranded RNA viruses. Nat Rev Microbiol

4(5): 371-382.

16. Amineva SP, Aminev AG, Palmenberg AC, Gern JE (2004) Rhinovirus 3C

protease precursors 3CD and 3CD' localize to the nuclei of infected cells. J

Gen Virol 85: 2969-2979.

17. Barton DJ, Black EP, Flanegan JB (1995) Complete replication of poliovirus

in vitro: preinitiation RNA replication complexes require soluble cellular

factors for the synthesis of VPg-linked RNA. J Virol 69: 5516-5527.

18. Blyn LB, Swiderek KM, Richards O, Stahl DC, Semler BL, Ehrenfeld E,

(1996) Poly(rC) binding protein 2 binds to stem-loop IV of the poliovirus Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

RNA 5' noncoding region: identification by automated liquid chromatography-

tandem mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci USA 93: 11115-11120.

19. Brunner JE, Nguyen JH, Roehl HH, Ho TV, Swiderek KM, Semler BL (2005)

Functional interaction of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C with

poliovirus RNA synthesis initiation complexes. J Virol 79: 3254-3266.

20. Chard LS, Bordelea ME, Pelletier J, Tanaka J, Belsham GJ (2006) Hepatitis C

virus related internal ribosome entry sites are found in multiple genera of the

family Picornaviridae. Virology 87: 927-936.

21. Cheney IW, Naim S, Shim JH, Reinhardt M, Pai B, Wu JZ, Hong Z, Zhong W

(2003) Viability of poliovirus/rhinovirus VPg chimeric viruses and

identification of an amino acid residue in the VPg gene critical for viral RNA

replication. Virology 77: 7434-7443.

22. Chen LL, Xu Q, Zhang RH, Yang L, Li JX, Xie ZJ, Zhu YL, Jiang SJ, Si XK

(2013) Improved duplex RT-PCR assay for differential diagnosis of mixed

infection of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 in ducklings. J Virol

methods 192: 12-17.

23. Davis D, Hannant D (1987) Fractionation of neutralizing antibodies in serum

of ducklings vaccinated with live duck hepatitis virus vaccine. Res Vet Sci 43:

276-277.

24. Ding C, Zhang D (2007) Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1.

Virology 361: 9-17.

25. Doedens JR, Giddings THJ, Kirkegaard K (1997) Inhibition of endoplasmic

reticulum-to-Golgi traffic by poliovirus protein 3A: genetic and ultrastructural

analysis. J Virol 71: 9054-9064.

26. Doedens JR, Kirkegaard K (1995) Inhibition of cellular protein secretion by

poliovirus proteins 2B and 3A. EMBO J 14: 894-907.

27. Fujita K, Krishnakumar SS, Franco D, Paul AV, London E, Wimmer E (2007)

Membrane topography of the hydrophobic anchor sequence of poliovirus 3A

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

and 3AB proteins and the functional effect of 3A/3AB membrane association

upon RNA replication. Bio-chemistry 46: 5185-5199.

28. Gamarnik AV, Andino R (1997) Two functional complexes formed by KH

domain containing proteins with the 5' noncoding region of poliovirus RNA.

RNA 3: 882-892

29. Golubnichi VP, Malinovskaya GV (1984) Dynamics of postvaccinal

antibodies in blood serum against duck hepatitis virus. Vet Nauk Proiz (Minsk)

22: 72- 75.

30. Gough RE, Spackman D (1981) Studies with inactivated duck virus hepatitis

vaccines in breeder ducks. Avian Pathol 10: 471-479.

31. Harris KS, Reddigari SR, Nicklin MJ, Hammerle T, Wimmer E (1992)

Purification and characterization of poliovirus polypeptide 3CD, a proteinase

and a precursor for RNA polymerase. J Virol 66: 7481-7489.

32. Hope DA, Diamond SE, Kirkegaard K (1997) Genetic dissection of interaction

between poliovirus 3D polymerase and viral protein 3AB. J Virol 71: 9490-

9498.

33. Jin X, Zhang W, Zhang W, Gu C, Cheng G, Hu X (2008) Identification and

molecular analysis of the highly pathogenic duck hepatitis virus type 1 in

Hubei province of China. Res Vet Sci 85(3): 595-598.

34. Jong AS, Mattia F, Van Dommelen MM, Lanke K, Melchers WJ, Willems PH,

Kuppeveld FJ (2008) Functional analysis of Picornavirus 2B proteins: effects

on calcium homeostasis and intracellular protein trafficking. J Virol 82: 3782-

3790.

35. Jong AS, Melchers WJ, Glaudemans DH, Willems PH, Kuppe-veld FJ (2004)

Mutational analysis of different regions in the coxsackievirus 2B protein:

requirements for homo-multimerization, membrane permeabilization,

subcellular localization, and virus replication. J Biol Chem 279: 19924-19935.

36. Jong AS, Visch HJ, Mattia F, Dommelen MM, Swarts HG, Luyten T,

Callewaert G, Melchers WJ, Willems PH, Kuppeveld FJ (2006) The

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

coxsackievirus 2B protein increases efflux of ions from the endoplasmic

reticulum and Golgi, thereby inhibiting protein trafficking through the Golgi. J

Biol Chem 281: 14144-14150.

37. Kempf BJ, Barton DJ (2008) Poly (rC) binding proteins and the 5′ cloverleaf

of uncapped poliovirus mRNA function during de novo assembly of

polysomes. J Virol 82(12): 5835-5846.

38. Kim MC, Kim MJ, Kwon YK, Lindberg AM, Joh SJ, Kwon HM, Lee YJ,

Kwon JH (2009) Development of duck hepatitis A virus type 3 vaccine and its

use to protect ducklings against infections. Vaccine 27: 6688-6694.

39. Kim MC, Kwon YK, Joh SJ, Kwon JH, Kim JH, Kim SJ (2007b)

Development of one-step reverse transcriptase-polymerase chain reaction to

detect duck hepatitis virus type 1. Avian Dis 51: 540-545

40. Kim MC, Kwon YK, Joh SJ, Kim SJ, Tolf C, Kim JH, Sung HW, Lindberg

AM, Kwon JH (2007) Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the

presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus

type 1 type strains. Arch Virol 152:2059-2072.

41. Kim MC, Kwon YK, Joh SJ, Lindberg AM, Kwon JH, Kim JH (2006)

Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a novel lineage close

to the genus Parechovirus in the family Picornaviridae. J Gen Virol 87: 3307-

3316.

42. Kok CC, McMinn PC (2009) Picornavirus RNA-dependent RNA polymerase.

Int J Biochem Cell Biol 41: 498-502.

43. Kopek BG, Perkins G, Miller DJ, Ellisman MH, Ahlquist P (2007) Three-

Dimensional Analysis of a Viral RNA Replication Complex Reveals a Virus-

Induced Mini-Organelle. PLoS Biol 5(9): 2022-2034.

44. Kuppeveld FJ, Galama JM, Zoll J, Hurk PJ, Melchers WJ (1996) Coxsackie

B3 virus protein 2B contains cationic amphipathic helix that is required for

viral RNA replication. J Virol 70: 3876-3886.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

45. Kuppeveld FJ, Hoenderop JG, Smeets RL, Willems PH, Dijkman HB, Galama

JM, Melchers WJ (1997) Coxsackievirus protein 2B modi-fies endoplasmic

reticulum membrane and plasma membrane permeability and facilitates virus

release. EMBO J 16: 3519-3532.

46. Nicholas KB and HB Nicholas (1999) GeneDoc: a tool for editing and

annotating multiple sequence alignments. Distributed by authors.

47. Levine P, Fabricant J (1950) A hitherto-undescribed virus disease of ducks in

North America. Cornell Vet 40: 71-86.

48. Levine P, Hofstad MS (1945) Duck disease investigation. Annu Rep New York

State Vet Coll, Ithaca Vet 40: 71-86.

49. Molla A, Paul A. V, Wimmer and E (1991) Cell-free, de novo synthesis of

poliovirus. Science 254: 1647-1651.

50. Nicole LR, Keith AC (2009) Evolution of Picornaviridae: An examination of

phylogenetic relationships and cophylogeny. Mol Phylogenet Evol 54: 995-

1005.

51. Parsley TB, Towner JS, Blyn LB, Ehrenfeld E, Semler BL (1997) Poly (rC)

binding protein 2 forms a ternary complex with the 5'-terminal sequences of

poliovirus RNA and the viral 3CD proteinase. Rna 3: 1124-1134.

52. Paul AV, Boom JH, Filippov D, Wimmer E (1998) Protein-primed RNA

synthesis by purified poliovirus RNA polymerase. Nature 393: 280-284.

53. Pettersson RF, Ambros V, Baltimore D (1978) Identification of a protein

linked to nascent poliovirus RNA and to the polyuridylic acid of negative-

strand RNA. J Virol 27 (2): 357-65.

54. Philip D. Minor (2004) Polio eradication, cessation of vaccination and re-

emergence of disease. Nat rev microbiol 2 (6): 473-482.

55. Qi Xu, Yang Chen, Wen Ming Zhao, Zheng Yang Huang, Yang Zhang, Xiu

Li, Yi Yu Tong, Guo Bing Chang, Xiu Jun Duan, Guo Hong Chen (2014)

DNA methylation and regualation of the CD8A after duck hepatitis virus type

1 infection. PloS ONE 9(2): 1-7. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

56. Richards OC, Spagnolo JF, Lyle JM, Vleck SE, Kuchta RD, Kirkegaard K

(2006) Intramolecular and intermolecular uridylylation by poliovirus RNA-

dependent RNA polymerase. J Virol 80: 7405-7415.

57. Sharma R, Raychaudhuri S, Dasgupta A (2004) Nuclear entry of poliovirus

protease-polymerase precursor 3CD: implications for host cell transcription

shut-off. Virology 320: 195-205.

58. Stanway G, Brown F, Christian P, Hovi T, Hyypiä T, King AMQ, Knowles

NJ, Lemon SM, Minor PD, Pallansch MA, Palmenberg AC, Skern T (2005)

Family Picornaviridae, In: Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J.,

Desselberger U., Ball L.A (Eds), Virus Taxonomy. Eighth Report of the

International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier/Academic Press,

London: 757-778.

59. Steil BP, Barton DJ (2009) Cis-Active RNA Elements (CREs) and

Picornavirus RNA Replication. Virus Res 139(2): 240–252.

60. Strebel K, Beck E (1986) A second protease of foot-and-mouth disease virus.

J Virol 58: 893-899.

61. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S (2013) MEGA6:

Molecular evolutionary genetics anaylysis version 6.0. Mol Biol Evol 30(12):

2725-2729

62. Towner JS, Ho TV, Semler BL (1996) Determinants of membrane association

for poliovirus protein 3AB. J Biol Chem 271: 26810-26818.

63. Tripathy DN, Hanson LE (1986) Impact of oral immunization against duck

viral hepatitis in passively immune ducklings. Prevent Vet Med 4: 355-360.

64. Tseng CH, Knowles NJ, Tsai HJ (2007) Molecular analysis of duck hepatitis

virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus. Virus Res 123:

190-203.

65. Tseng CH, Tsai HJ (2007a) Molecular characterization of a new serotype of

duck hepatitis virus. Virus Res 126: 19-31.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

66. Tseng CH, Tsai HJ (2007b) Sequence analysis of a duck Picornavirus isolate

indicates that it together with porcine enterovirus type 8 and simian

Picornavirus type 2 should be assigned to a new Picornavirus genus. Virus

Res 129(2): 104-114.

67. Walter BL, Parsley TB, Ehrenfeld E, Semler BL (2002) Distinct poly(rC)

binding protein KH domain determinants for poliovirus translation initiation

and viral RNA replication. J Virol 76: 12008-12022.

68. Wei CY, Su S, Huang Z, Zhu WJ, Chen JD, Zhao FR, Wang YJ, Xie JX,

Wang H, Zhang G (2012) Complete genome sequence of a novel duck

hepatitis A virus discovered in southern China. J Virol 86(18): 10247.

69. Woolcock PR (2003) Duck hepatitis, Diseases of Poultry, 11th Ed, Iowa State

Press, Ames IA: 343-354.

70. Xiang W, Harris KS, Alexander L, Wimmer E (1995) Interaction between the

5'-terminal cloverleaf and 3AB/3CDpro of poliovirus is essential for RNA

replication. J Virol 69: 3658-3667.

71. Yalamanchili P, Banerjee R, Dasgupta A (1997) Poliovirus-encoded protease

2APro cleaves the TATA-binding protein but does not inhibit host cell RNA

polymerase II transcription in vitro. J Virol 71: 6881-6886.

72. Yang, Jing Li, Yuhai Bi, Lei Xu (2012) Development and application of a

reverse transcription loop–mediated isothermal amplification method for rapid

detection of duck hepatitis A virus type 1. Virus genes 45: 585-589.

73. Yun T, Ni Z, Liu GQ, Yu B, Huang JG, Zhang YM, Chen JP (2010)

Generation of infectious and pathogenic duck hepatitis virus type 1 from

cloned full-length cDNA. Virus Res 147: 159-165.