Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại một số quận nội thành Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־

Tạ Thị Yến ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội – 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־

Hướng dẫn 1: PGS.TS. Chu Hoàng Hà

Hướng dẫn 2: PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo

Tạ Thị Yến ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội - 2019

Lời cam đoan

Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Chu Hoàng Hà và PGS.TS. Lê Thị

Hồng Hảo. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.

Học viên

Tạ Thị Yến

Lời cảm ơn

Luận văn thạc sĩ được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm quốc gia dưới sự dẫn dắt của:

PGS.TS. Chu Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Học

viện Khoa học và Công nghệ

PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ

sinh thực phẩm quốc gia.

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ.

Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các đồng nghiệp trong khoa Vi sinh vật – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong khoảng thời gian thực hiện luận văn.

Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên của Học Viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập tại

học viện.

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình thân yêu của tôi, cảm ơn bạn bè những người đã luôn sát cánh bên tôi, chia sẻ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết Tạ Thị Yến

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Tiếng Anh đầy đủ Tiếng Việt đầy đủ Chữ viết tắt

ADN Deoxyribonucleic acid axit Deoxyribonucleic

Plasmid-mediated AmpC β- AmpC Enzym β-lactamase AmpC lactamases

CXM cefuroxime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 2, cefuroxime

CTX cefotaxime Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, cefotaxime

Kháng sinh cephalosporin thế CAZ ceftazidime hệ 3, ceftazidime

CRO ceftriaxone Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, ceftriaxzone

CAL ceftazidime + clavulanic acid ceftazidime kết hợp axit clavulanic

CTL cefotaxime + clavulanic acid cefotaxime kết hợp axit clavulanic

CAC ceftazidime + cloxacillin ceftazidime kết hợp cloxacillin

CTC cefotaxime + cloxacillin cefotaxime kết hợp cloxacillin

CLSI Viện Tiêu chuẩn thử nghiệm lâm sàng Hoa Kỳ Clinical Laboratory Standard Institute

Ethylenediaminetetraacetic Axit EDTA acid Ethylenediaminetetraacetic

ESBL β-lactamase phổ rộng Extended spectrum beta- lactamase

Extended spectrum ESC cephalosporin phổ rộng Cephalosporin

EUCAST Ủy ban châu Âu về thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

FOX Cefoxitin Kháng sinh Cephalosporin thế hệ 2, cefoxitin

FSIS

Tổ chức an toàn và kiểm tra thực phẩm của bộ Nông nghiệp Mỹ United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service

ISO Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế International Standard Organisation

KZ Cefazolin Kháng sinh Cephalosprorin thế hệ 1, cefazoline

Omp Outer membrane porin Porin màng ngoài

OmpA Outer membrane protein A protein A màng ngoài vi khuẩn

PAI Pathogenicity island Vùng gây bệnh

UTI Urinary tract infection Vi khuẩn lây nhiễm đường tiết niệu

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

Danh mục các bảng

Bảng biểu Nội dung Trang

Bảng 1.1 9 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae

Bảng 1.2 Các thế hệ cephalosporin 14

Bảng 2.1 Kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ 40

Bảng 2.2 Vi khuẩn sinh enzym ESBL 41

Bảng 2.3 Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase 42

Bảng 2.4 Xác định vi khuẩn sinh enzym Carbapenemase 42

Bảng 2.5 Trình tự mồi của gen mã hóa enzym β-lactamase 44

Bảng 3.1 51 Mật độ vi sinh vật log CFU/g theo loại hình kinh doanh

Bảng 3.2 Tỉ lệ kháng kháng sinh Cephalosporin 56

Bảng 3.3 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL và 62 AmpC β-lactamase

Bảng 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 66

Bảng 3.5 73 Vi khuẩn Enterobacteriaceae mang gen kháng kháng sinh

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Nội dung Trang Hình

Hình 1.1. 8

10 Hình 1.2. Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người

Hình 1.3 Lịch sử ra đời các loại kháng sinh 12

15 Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật 16

Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn 17

Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh 18

19 Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng đồng

Hình 1.9 Các nhóm enzym β-lactamase 24

Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người 29

Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội 36

Hình 2.2 Rau ăn sống được bày bán tại các chợ và siêu thị 36

Hình 2.3 43

Hình 3.1 51 Nguyên lý cơ bản định danh vi khuẩn bằng hệ thống VITEK MS Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trung bình trong rau ăn sống

Hình 3.2 Kháng sinh đồ trên chủng vi khuẩn đối chiếu 53

53-54 Hình 3.3

54 Hình 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng với cephalosporin thế hệ 1, 2 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng Cephalosporin thế hệ 1, 2 và 3

Hình 3.5 Khuẩn lạc phân lập trên môi trường Macconkey 57

58 Hình 3.6 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactam phổ rộng

59 Hình 3.7

60 Hình 3.8 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym AmpC β- lactamase Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL và AmpC β-lactamase

Hình 3.9 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 65

65 Hình 3.10

68 Hình 3.11

69 Hình 3.12

69 Hình 3.13

69 Hình 3.14

70 Hình 3.15

70 Hình 3.16 Định danh Leclercia adecaboxylata bằng kỹ thuật MALDI TOF Sản phẩm khuếch đại gen được sử dụng để giải trình tự Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla TEM với dữ liệu ngân hàng gen Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla OXA với dữ liệu ngân hàng gen Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CTX-M với dữ liệu ngân hàng gen Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla DHA với dữ liệu ngân hàng gen Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CMY với dữ liệu ngân hàng gen

Hình 3.17 Đoạn khuếch đại gen bla TEM 71

Hình 3.18 Đoạn khuếch đại gen bla OXA 71

Hình 3.19 Đoạn khuếch đại gen bla CTX-M 72

Hình 3.20 Đoạn khuếch đại gen bla DHA 72

Hình 3.21 Đoạn khuếch đại gen bla CMY 72

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 7

1.1. HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE .............. 7

1.1.1. Enterobacteriaceae ........................................................................... 7

1.1.2. Sự phân bố của Enterobacteriaceae ................................................. 8

1.1.3. Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae .................................... 9

1.1.3.1. Viêm màng não và viêm nhiễm hệ Thần kinh .......................... 10

1.1.3.2. Nhiễm trùng đường tiết niệu ..................................................... 10

1.1.3.4. Gây bệnh đường ruột ................................................................ 11

1.2. KHÁNG SINH ...................................................................................... 12

1.2.1. Lịch sử ra đời kháng sinh ................................................................ 12

1.2.1.1. Cephalosporin ........................................................................... 13

1.2.1.2. Các kháng sinh β-lactam khác .................................................. 14

1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ................................................................ 14

1.2.2.1. Kháng kháng sinh ..................................................................... 14

1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn .................................... 18

1.2.3. Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm ................. 22

1.2.4. Enzym β-lactamase ......................................................................... 23

1.2.4.1. Enzym β-lactamase phổ rộng ................................................... 25

1.2.4.2. β-lactamase AmpC ................................................................... 27

1.2.4.3. Carbapenemase ......................................................................... 28

1.3. THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE ........... 29

1.3.1. Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae ........................... 30

1.3.2. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau trên thế giới ......... 32

1.3.3. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau tại Việt Nam ........ 34

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 36

2.1. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............ 36

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU .......................................................................... 37

2.2.1. Dụng cụ ........................................................................................... 37

2.2.2. Thiết bị ............................................................................................ 37

2.2.3. Hóa chất .......................................................................................... 38

2.2.4. Chủng chuẩn ................................................................................... 38

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 38

2.3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu .................................................................... 38

2.3.2. Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae ................................ 39

2.3.3. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh ............................................ 39

2.3.3.1. Thử tính kháng kháng sinh β-lactam ........................................ 39

2.3.3.2. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase ................................................................................................................ 40

2.3.4. Kỹ thuật MALDI – TOF định danh vi sinh vật .............................. 43

2.3.5. Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh ................................ 44

2.4. CHỦNG ĐỐI CHỨNG ......................................................................... 45

2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ ................................................................................ 46

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 47

3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU SỐNG ................................................................................... 47

3.1.1. Đánh giá tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống 47

3.1.2. Đánh giá mật độ nhiễm Enterobacteriaceae theo loại hình kinh doanh ......................................................................................................... 49

3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CEPHALOSPORIN VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYM β-LACTAMASE CỦA VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE .......................................................................... 52

3.2.1. Đánh giá khả năng kháng kháng sinh cephalosporin ..................... 52

3.2.2. Đánh giá sự lưu hành vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β- lactamase ................................................................................................... 57

3.3. ĐỊNH DANH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE SINH ENZYM β-LACTAMASE VÀ XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG KHÁNG SINH ............ 64

3.3.1. Định danh vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 64

3.3.2 Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase ....................................... 67

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 75

4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 75

4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 76

MỞ ĐẦU

Enterobacteriaceae là vi khuẩn gây bệnh đường ruột phổ biến trên toàn thế giới. Bệnh lây truyền qua thực phẩm gây ra bởi Enterobacteriaceae đang là

mối quan tâm của cộng đồng toàn cầu. Hầu hết các vụ bùng phát dịch Enterobacteriaceae trên người có liên quan đến việc tiêu thụ sản phẩm thực phẩm mang nguồn bệnh [1]. Hai vấn đề chính trong dịch tễ về vi khuẩn

Enterobacteriaceae tại các nước phát triển và đang phát triển trong nửa sau của thế kỷ 20 là sự bùng phát của các ca bệnh do Enterobacteriaceae lây truyền

qua thực phẩm lên người và các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng nhiều kháng sinh. Trong thế kỷ 21, tình trạng kháng kháng sinh đã trở nên được quan tâm trên toàn cầu với sự kháng carbapenem và cephalosporin

thế hệ 3 của các vi khuẩn Enterobacteriaceae [2].

Sự gia tăng về mức độ kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae là một vấn đề quan ngại trên toàn cầu trong những thập kỷ gần đây bởi sự lạm dụng

kháng sinh trong điều trị trên người và trong chăn nuôi. Sự cùng tồn tại của nhiều loài vi khuẩn trong đường ruột của động vật và con người đã tạo điều

kiện cho việc truyền gen kháng kháng sinh giữa các loài vi khuẩn với nhau. Bên cạnh đó con đường đi của chuỗi thức ăn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh lên người [3].

Cũng như một số nước trên toàn thế giới, Việt Nam đang phải đối mặt với khó khăn trong quá trình điều trị do sự gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh. Thực tế cho thấy hiện tượng dễ dàng mua bán kháng sinh

cho điều trị bệnh ở người và sử dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam mà không cần đơn của thầy thuốc là một trong những nguyên nhân chính thúc đẩy tình

trạng kháng kháng sinh [4].

Rau là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người Việt Nam. Theo báo cáo của Ngân hàng thế giới vào năm 2017, tỉ lệ tiêu thụ

rau tại Việt Nam là 0,4 kg rau mỗi ngày trên người và tỉ lệ tiêu thụ rau tại Hà Nội là 2,800 tấn mỗi ngày. Năng suất sản xuất rau tại Hà Nội là 600,000 tấn mỗi năm và trung bình là 1,644 tấn mỗi ngày. Với sức tiêu thụ khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, Hà Nội phải sử dụng nguồn cung từ các tỉnh thành thuộc đồng

bằng sông Hồng như Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hòa Bình [5]. Từ đó cho thấy rau là nguồn tiêu thụ chính cho nhu cầu ăn uống hằng ngày của người dân Hà Nội. Cũng như các loại thực phẩm khác, rau ăn sống là nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và khả năng lây truyền vi khuẩn kháng lên người.

Tuy nhiên cho đến nay có rất ít báo cáo đã công bố về tình trạng vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống chứa các gen mã hóa enzym β-lactamase có khả năng kháng kháng sinh β-lactam. Đặc biệt hơn, tại Việt Nam chưa có

trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn tình

công bố nào về Enterobacteriaceae trong rau ăn sống được bán tại các quán ăn.

Để có những bằng chứng cụ thể về thực trạng ô nhiễm và kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae trong rau ăn sống, chúng tôi quyết định tiến hành thực hiện luận văn “Đánh giá sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi

khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại một số quận nội thành Hà Nội”

Mục đích 1. Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống (Nhóm Enterobacteriaceae lên men glucose, nhóm

Enterobacteriaceae lên men lactose – Coliform- và Escherichia coli), và xác định tính kháng kháng sinh cephalosporin của các chủng vi khuẩn đã thu thập;

2. Xác định loài vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sinh enzym β- lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase và carbapenemase và gen mã hóa enzym β-lactamase trong các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh

enzym β-lactamase đã thu thập. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trên sản phẩm thực phẩm là rau ăn sống thu thập tại các loại hình kinh doanh là chợ, siêu thị và các quán ăn có phục vụ rau ăn sống.

Ý nghĩa khoa học Luận văn đã cung cấp thêm số liệu về sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại ba loại hình kinh doanh là chợ, siêu thị và quán ăn có phục vụ rau sống.

Luận văn là bước khởi đầu cho các nghiên cứu về thực trạng kháng kháng

sinh của vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm.

Ý nghĩa thực tiễn Luận văn cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea trong rau ăn sống, qua đó cho thấy

thực tiễn hiện diện của các vi khuẩn kháng kháng sinh trong thực phẩm đang được tiêu thụ tại chợ, siêu thị và quán ăn.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE

1.1.1. Enterobacteriaceae

Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae bao gồm một nhóm lớn các vi khuẩn gram âm không tạo bào tử, thường có độ dài 1-5 μm, sinh trưởng trong

điều kiện kị khí và hiếm khí tùy ý (ngoại trừ Saccharobacter fermentans và một số loài thuộc chi Yersinia và Erwinia) và có khả năng di chuyển bằng long, trừ chi Shigella và Tatumella. Một đặc điểm chung của ngoại

Enterobacteriaceae, giúp phân biệt với các vi khuẩn khác là thiếu cytochrome C oxidase dẫn đến tạo phản ứng âm tính với oxidase, trừ Plesiomonas spp. Enterobacteriaceae lên men nhiều loại carbohydrate, trong đó khả năng sản

xuất axit và sinh khí từ quá trình lên men glucose D là một đặc tính chẩn đoán quan trọng và thường được sử dụng là cơ sở để phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae. Một số thành viên của Enterobacteriaceae (ví dụ Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter spp.và Klebsiella spp.) có thể được phát hiện và định lượng dựa trên khả năng lên men lactose nhanh chóng

(thường trong vòng 24-48 giờ) tạo ra axít và sinh khí. Nhóm vi khuẩn này được gọi chung là vi khuẩn Coliform và thường được sử dụng như là các vi sinh vật chỉ điểm nhiễm phân bởi ngành công nghiệp thực phẩm và nước bởi vì môi trường sống bình thường của Coliform là đường tiêu hóa của động vật có vú [6].

Tên gọi họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae lần đầu tiên được

đề xuất bởi Rahn vào năm 1937, với chi Escherichia. Sơ đồ phân loại của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae phức tạp và nhanh chóng thay đổi khi áp dụng các kỹ thuật tiên tiến xác định loài vi khuẩn dựa trên trình tự axit nucleic. Số lượng chi và loài Enterobacteriaceae đã tăng từ 12 chi và 36 loài năm 1974 lên ít nhất 34 chi, 149 loài và 21 phân loài trong năm 2006 [7]. Năm

2011, họ vi khuẩn đường ruột đã tăng lên ít nhất 48 chi, 219 loài và 41 loài phụ. Theo cơ sở dữ liệu phân loại của Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ vào năm 2015 thì có 63 chi đã được xác định với hơn 210 loài [1], tuy nhiên họ vi khuẩn

đường ruột Enterobacteriaceae có ý nghĩa lâm sàng chỉ bao gồm 20-25 loài, và

các loài khác thì không thường gặp. Số lượng các chi và loài có thể được tăng lên theo thời gian dựa trên các số liệu chưa được công bố [7].

Enterobacteriaceae được xem là các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh cung cấp các bằng chứng về vệ sinh an toàn thực phẩm trong chuỗi thức ăn cũng như

trong ngành công nghiệp thực phẩm. Vi khuẩn thuộc họ đường ruột Enterobacteriaceae được chia thành 3 nhóm, trong đó chủ yếu là nhóm vi khuẩn không lên men đường lactose bao gồm một số chi như Proteus,

Cronobacter, Shigella; nhóm lên men lactose chậm hoặc do đột biến; nhóm còn lại thường được phát hiện bởi khả năng lên men lactose nhanh chóng và gọi là

Lên men lactose

h h hó

Lên men lactose chậm hoặc do biến đổi

Không lên menlactose

nhóm Coliform bao gồm các chi: Escherichia, Enterobacter, Klebsia, Serratia, Citrobacter (xem Hình 1.1) [6].

Hình 1.1. Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [6]

1.1.2. Sự phân bố của Enterobacteriaceae Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và môi trường. Một số loài là mầm bệnh ở người

và động vật, trong khi một số loài khác gây bệnh cho cây cối và côn trùng. Môi

trường sống tự nhiên của một số chi thuộc họ Enterobacteriaceae và có nguồn gốc phân lập từ môi trường tự nhiên, thực phẩm và con người được đưa ra trong Bảng 1.1. Do sự phân bố rộng rãi của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae do đó không thể tránh khỏi một số thành viên của họ Enterobacteriaceae sẽ xâm

nhập vào chuỗi thức ăn, gây ra sự hư hỏng thực phẩm và mang mầm bệnh [8].

Bảng 1.1 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [8]

Chi

Citrobacter Sự phân bố và vị trí phân lập Phân người, mẫu bệnh phẩm, nước thải, đất, nước, thực phẩm

Enterobacter Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đất, nước ngọt (sông, suối), rau, nước thải, phân người, mẫu bệnh phẩm và đường hô hấp

Escherichia Đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng nước, thực phẩm và đất thông qua sự nhiễm phân)

Klebsiella

Đường tiêu hóa và đường hô hấp ở người và các động vật khác, phân, đất, nước, hoa quả và rau, ngũ cốc và các mẫu bệnh phẩm ở người

Proteus Đường tiêu hóa ở người và động vật, đất, nguồn nước ô nhiễm

Salmonella Người và động vật, thực phẩm, nước, môi trường

Serratia Mẫu bệnh phẩm, khu vực sản xuất, đất, nước, môi trường, đường tiêu hóa của động vật có móng

Shigella Đường tiêu hóa của người và linh trưởng

Yersinia Phân bố rộng rãi ở người và động vật, thực phẩm, đất và nước

Thực phẩm, nước, máu Leclercia

1.1.3. Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae gây ra các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa và nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết,viêm phổi, nhiễm trùng vùng bụng hoặc vùng chậu, nhiễm trùng nơi phẫu thuật, viêm màng não và các áp xe

khác nhau bao gồm nhiễm khuẩn vết thương (xem Hình 1.2) [1].

Hình 1.2. Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người [1]

1.1.3.1. Viêm màng não và viêm nhiễm hệ Thần kinh

Một số loài E. coli có thể gây viêm màng não liên quan đến gram âm (viêm màng não sơ sinh E. coli) ở trẻ sơ sinh với tỷ lệ tử vong có thể lên đến 40%, và những người sống sót thường bị di chứng thần kinh. Sự sống sót của

vi khuẩn trong máu được tạo điều kiện bởi một màng bao axit polysialic antiphagocytic và protein A màng ngoài vi khuẩn (OmpA). Trong hệ thống thần

kinh trung ương, vi khuẩn có thể gây ra phù nề, viêm và tổn thương thần kinh [1].

1.1.3.2. Nhiễm trùng đường tiết niệu

Nhóm vi khuẩn gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI) là một trong

những loài vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng ở người, gây các triệu chứng bệnh nghiêm trọng và tốn kém về kinh tế cho việc chữa trị. Escherichia coli gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UPEC) chiếm khoảng 80% các ca UTIs, gây

viêm bàng quang ở bàng quang và viêm thận thận cấp tính ở thận [1].

Loài Enterobacteriaceae phổ biến khác có liên quan đến UTIs là Klebsiella pneumoniae. Loài này gây nhiễm trên các nhóm bệnh nhân đặc trưng, như bệnh nhân đái tháo đường hoặc bàng quang rối loạn chức năng và ống thông tiểu. K. pneumoniae, một tác nhân gây bệnh phổ biến trên các bệnh

nhân do nhiễm trùng bệnh viện, có một số yếu tố quyết định độc lực, bao gồm khả năng bám dính, hoạt tính phân giải ure và các hệ thống bất hoạt sắt [1].

1.1.3.3. Nhiễm khuẩn huyết

là một biến chứng chính của nhiễm

Nhiễm khuẩn huyết trùng Enterobacteriaceae vì nó có thể dẫn đến nhiễm trùng huyết nặng với suy nội

tạng cấp tính và sốc nhiễm trùng. Trong những năm gần đây, bệnh nhiễm khuẩn E. coli đã tăng lên và ở Anh, loài này hiện chiếm hơn 30% bệnh nhiễm khuẩn huyết ở những người trên 75 tuổi [1]. Cũng có sự gia tăng đáng kể về nhiễm

khuẩn huyết do các mầm bệnh gram âm khác gây ra như Leclercia adecarboxylata. L. adecarboxylata ngoài gây nhiễm khuẩn huyết có thể gây nhiễm trùng vết thương, đặc biệt trên các bệnh nhân mắc các bệnh nguyên phát

như ung thư, bệnh bạch cầu, suy thận và xơ gan [9]. Nguồn chủ yếu của nhiễm khuẩn huyết là các vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu. Các nguồn lây nhiễm

máu cổ điển khác bao gồm đường tiêu hóa, liên quan đến cả mầm bệnh đường ruột cụ thể và vi khuẩn đường ruột cơ hội, có thể chuyển từ lòng ruột sang máu trong vật chủ với các tình trạng tiềm ẩn (ví dụ như khối u rắn tiêu hóa, viêm túi

mật hoặc điều trị ức chế miễn dịch) [1].

1.1.3.4. Gây bệnh đường ruột

Các mầm bệnh gây bệnh đường ruột quan trọng nhất là Salmonella enterica, một số phân typ thuộc loài E. coli, Shigella và Yersinia. Mặc dù các

Enterobacteriaceae khác đôi khi có liên quan đến nhiễm trùng đường tiêu hóa, nhưng ý nghĩa lâm sàng đôi khi gây tranh cãi (ví dụ đối với Plesiomonas shigelloides hoặc Klebsiella pneumoniae liên quan đến tiêu chảy) [1].

1.2. KHÁNG SINH

1.2.1. Lịch sử ra đời kháng sinh

Kháng sinh được phát hiện vào năm 1928. Fleming ghi nhận một khuẩn lạc khác thường của nấm mốc trong một số đĩa petri có chứa vi khuẩn

Staphylococcus. Các khuẩn lạc mốc đã khuếch tán các hợp chất xung quanh nó dẫn tới không có khuẩn lạc Staphylococcus mọc xung quanh khuẩn lạc mốc. Fleming đã viết bài báo đầu tiên của ông về penicillin trong năm 1929, đề cập

đến việc sử dụng các chất bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để chọn lọc và phân lập vi khuẩn Haemophilus influenzae, được cho là nguyên nhân gây ra bệnh cúm. Theo thời gian, Fleming đã chứng minh rằng penicillin

có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn và thậm chí là diệt khuẩn. Tuy nhiên trong giai đoạn này penicillin đã không được sử dụng rộng rãi. Tiếp đó, sulfonamidochrysoidine (KI-730, prontosil), được tổng hợp bởi các nhà hóa học Josef Klarer và Fritz Mietzsch và đã được thử nghiệm bởi nhà vi khuẩn học người Đức Gerhard Domagk về hoạt tính kháng khuẩn trên các loại bệnh khác

nhau [10]. Trong các khoảng thời gian tiếp theo, rất nhiều họ kháng sinh và thế hệ kháng sinh mới ra đời, nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh trên người và động vật (xem Hình 1.3) [11].

Hình 1.3 Lịch sử ra đời các loại kháng sinh [11]

1.2.1.1. Cephalosporin

Họ kháng sinh cephalosporin được phát hiện đầu tiên vào năm 1945, tuy nhiên phải mất gần 2 thập kỷ để đưa các kháng sinh này vào điều trị. Một thập

kỷ sau phát hiện ban đầu, các chất cephalosporin đã được phân lập và xác định là sản phẩm lên men của nấm mốc. Các nhà khoa học tại Oxford, bao gồm Florey và Abraham, với các thiết bị đầy đủ đã nghiên cứu ra đặc điểm cấu trúc

của các cephalosporin, như họ đã làm đối với penicillin một thập kỷ trước đó. Ba chất cephalosporin P, N, và C đã được xác định. Mỗi sản phẩm đều hoạt

động kháng khuẩn nhưng chỉ cephalosporin C kháng cả vi khuẩn gram âm và gram dương. cephalosporin C đã trở thành nền tảng để phát triển các dòng cephalosporin tiếp theo. Dược phẩm cephalosporin đầu tiên là cephalothin, đã

được giới thiệu để sử dụng lâm sàng vào năm 1964. Và đến nay đã có hơn 20 thuốc kháng sinh cephalosporin được sử dụng trong điều trị. Cephalosporin là một trong những họ kháng sinh được các nhà điều trị kê toa rộng rãi nhất vì độc

tính thấp và khả năng hoạt động phổ rộng của chính kháng sinh này [12].

Về phân loại, cephalosporin gồm 5 thế hệ, dựa vào phổ hoạt động của

kháng sinh (xem Bảng 1.2). Thế hệ đầu hoạt động cephalosporin tập trung chủ yếu vào các vi khuẩn gram dương. Các thế hệ thứ hai thuốc đã tăng cường hoạt động chống trực khuẩn gram âm nhưng duy trì mức độ khác nhau của hoạt động

đối với cầu khuẩn gram dương. Các cephalosporin thế hệ thứ ba đã tăng lên rõ rệt tiềm năng chống lại vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên, đối với một số hợp chất trong nhóm 3, hoạt động chống lại cầu khuẩn gram dương lại giảm. Trong nhóm

thế hệ thứ ba, một vài hợp chất, chẳng hạn như ceftazidime và ceftolozane, được xem xét riêng biệt cho hoạt động chống lại P. aeruginosa. Thế hệ thứ tư có phổ hoạt động rộng nhất trong năm nhóm. Các loại thuốc thứ ba và thứ tư kết hợp cũng được gọi là Cephalosporin rộng phổ. Nhóm thứ năm được gọi là cephalosporin kháng tụ cầu kháng methicillin bao gồm ceftaroline và

ceftobiprole [12].

Bảng 1.2 Các thế hệ kháng sinh cephalosporin

Thế hệ 1 Thế hệ 2 Thế hệ 3 Thế hệ 4 Thế hệ 5

cephazolin cefamandole cefoperazone cefepime ceftaroline

cephalothin cefonicid cefotaxime cefpirome ceftobiprole

cephapirin cefuroxime ceftazidime

cephradin ceftizoxime

ceftraexone

moxalactam

1.2.1.2. Các kháng sinh β-lactam khác

Ngoài họ cephalosporin, penincillin, bốn loại kháng sinh carbapenems -

imipenem, meropenem, ertapenem, và doripenem hiện đang được đưa vào trong điều trị tại một số nước phát triển như Mỹ. Carbapenem hoạt động kháng nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm kị khí và hiếu khí bởi sự thâm nhập hiệu quả của carbapenem thông qua màng ngoài tế bào, có ái lực cao với các protein liên kết penicillin, và sự ổn định của chúng chống lại hầu hết các enzym β-

lactamase phổ rộng (ESBLs) lớp A và enzym β-lactamase lớp C (AmpCs) [13].

1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh

1.2.2.1. Kháng kháng sinh

Kháng sinh đã được con người phát hiện và đưa vào quá trình trị liệu từ giai đoạn bắt đầu của loài người. Thuốc kháng sinh cơ bản đã được xác nhận bởi cơ quan quản lý của Mỹ như là loại thuốc được sản xuất bởi một loài sinh

vật để ức chế sự tăng trưởng hoặc để giết chết một loài vi sinh vật khác. Dưới tác dụng của kháng sinh, một số chủng vi khuẩn đã dần thích nghi và kháng lại các kháng sinh. Sự xuất hiện của các mầm bệnh kháng nhiều loại thuốc khác nhau đã làm gia tăng lo ngại về những hậu quả và tác động của hiện tượng này lên sức khỏe con người và quá trình điều trị bệnh trên người.

Sự kháng thuốc được định nghĩa là sức đề kháng của vi khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn mà trước đây chúng chỉ biểu hiện sự nhạy cảm. Đầu tiên hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn là quá trình tiến hóa tự nhiên, sau đó hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong các loài vi sinh vật gây

bệnh bởi sử dụng sai thuốc kháng sinh và sự lây lan toàn cầu của vi khuẩn kháng thuốc, chủ yếu ảnh hưởng đến bệnh nhân có hệ miễn dịch kém hoặc sức khỏe yếu. Sự kháng thuốc đã tiêu tốn nhiều chi phí hơn trong quá trình chữa trị

và trong hoạt động nghiên cứu về ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh. Một loạt các loại thuốc kháng sinh đã bị kháng bởi các vi sinh vật gây bệnh trong những thập kỷ gần đây, nhân tố kháng thuốc có thể được tạo ra và lan truyền từ

vi sinh vật này sang vi sinh vật khác, từ loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác theo nhiều cách khác nhau [10].

Thông qua hoạt động chuyển gen, ví dụ, integron, nhân tố axit nucleic (ADN) di động có thể bắt giữ và mang các gen, được vận chuyển bởi các gen nhảy (transposon), cho phép các vi sinh vật gây bệnh trao đổi cơ chế kháng

kháng sinh (xem Hình 1.4). Một trường hợp đề kháng tự nhiên được thấy thường xuyên bởi các tỷ lệ đột biến tự nhiên trong gen nằm trên nhiễm sắc thể mà sau đó nhân tố đột biến được lan truyền bởi sự nhân lên của vi khuẩn. Một

trong những cơ chế kháng là sự tích hợp của ADN trên hệ gen từ vi khuẩn chết và plasmid của các tế bào sống, mà cũng có thể xảy ra với integrons đến từ

phẩy khuẩn. Đột biến xảy ra tất cả các thời điểm, thay đổi nucleotid duy nhất có thể làm thay đổi gen và chuyển gen kháng lên vi sinh vật. Các plasmid từ một loại vi khuẩn, với bất kỳ integron, có thể dễ dàng chuyển sang vi khuẩn

khác thông qua chuyển gen ngang bởi sự tiếp hợp [10].

Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

[10]

Vật liệu di truyền được trao đổi giữa các vi sinh vật qua ba con đường chính: (i) Tải nạp ADN, ví dụ: từ Streptococcus mitisto sang Streptococcus pneumoniae, (ii) biến nạp, ví dụ kháng Methycillin trong Staphylococcus

aureus đã được phân lập trong các mẫu phân ở các trang trại và cơ sở giết mổ; và (iii) sự tiếp hợp, ví dụ là các plamid chịu trách nhiệm cho sự phổ biến toàn cầu của các gen mã hóa enzym carbapenemase hoặc β-lactamase, đặc biệt phổ biến trong các vi khuẩn gram âm và tụ cầu (xem Hình 1.5) [14].

Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật [14]

Sự hình thành tính kháng của vi khuẩn lên kháng sinh đã được ghi nhận

sớm nhất vào giai đoạn đầu của kỷ nguyên kháng sinh. Trong vòng 20 năm qua, sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và khả năng kháng của chúng đã liên tiếp phát triển. Nguyên nhân chính là sự thiếu hiểu biết của người

sử dụng về kháng sinh, dẫn đến lạm dụng kháng sinh trong điều trị. Rõ ràng, tự dùng thuốc ảnh hưởng đến hiệu quả của liệu pháp điều trị và gây nguy hiểm cho sức khỏe người bệnh cũng như nguy hại đến cộng đồng. Sự lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc tự nhiên cho vi khuẩn và thúc đẩy quá trình tiến hóa nhanh của vi khuẩn. Hơn nữa, các hợp chất trong hệ sinh thái và điều kiện môi trường sống cũng góp phần tạo áp lực chọn lọc bổ sung lên vi sinh vật. Bên

cạnh đó, nguyên nhân khác thúc đẩy hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn là việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích trị bệnh và kích thích tăng trưởng. Hiện nay, kháng kháng sinh đã là vấn đề toàn cầu, và các nước phát triển hiện đã xây dựng các chương trình để hạn chế tình trạng kháng kháng sinh. Ví dụ, ở các nước Bắc Âu, đã nghiên cứu việc sử dụng hợp lý thuốc kháng

sinh, cùng với loại bỏ các chất kích thích tăng trưởng cho động vật nuôi. Từ năm 2006, các nước Liên minh châu Âu khác đã và đang áp dụng các biện pháp tương tự để hạn chế sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp [10].

1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

Có rất nhiều cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn, trong số đó năm cơ

chế thường thấy nhất là: enzym ức chế hoạt động của kháng sinh, biến đổi trong protein liên kết penicillin (PBP), đột biến Porin, bơm đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào và thay đổi mục tiêu của kháng sinh (thay đổi thành tế bào) (xem Hình 1.6) [10].

Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn [10]

Để ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, kháng sinh có xu hướng tác động lên mục tiêu cụ thể như ức chế tổng hợp protein cụ thể, tổng hợp ADN và ARN, can thiệp vào sự tổng hợp thành tế bào, phá vỡ các cấu trúc màng thấm, và ức

chế sự tổng hợp chất chuyển hóa thiết yếu (xem Hình 1.7) [15]. Do cấu trúc sinh học khác nhau của kháng sinh, các mục tiêu tấn công của kháng sinh có

thể khác nhau tùy thuộc vào từng đối tượng vi khuẩn đang tiếp xúc với chính

kháng sinh. Ví dụ, penicillin và cephalosporin ức chế vi khuẩn tổng hợp vách tế bào bằng cách can thiệp tới các enzym liên quan đến tổng hợp lớp peptidoglycan; trong khi tetracycline và streptogramin ức chế vi khuẩn bằng cách phá vỡ sự tổng hợp protein. Một vi khuẩn được xem là kháng với một

kháng sinh đặc biệt khi các kháng sinh không còn hiệu quả để điều trị một căn bệnh gây ra bởi một tác nhân gây bệnh của vi khuẩn đặc biệt [16].

Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh [15]

Enzym ức chế hoạt động của kháng sinh

Cơ chế kháng phổ biến nhất của vi khuẩn là enzym ức chế. Cơ chế này được dựa trên một số chiến lược để thay đổi cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn: thủy phân, một loại phản ứng xảy ra chủ yếu với các kháng sinh β-

lactam; thay đổi các nhóm chức năng (acyl, phosphoryl, thiol, nucleotidil, ADP-ribosyl, glycosyl), xảy ra với rất nhiều chất kháng khuẩn, chẳng hạn như mminoglycoside, chloramphenicol, rifamycin, và lincosamide; và oxi hóa khử

, xảy ra với tetracycline, rifamycin, và streptogramin. Hơn nữa enzym có thể sửa đổi các hợp chất kháng khuẩn, β-lactamase là một vấn đề lớn trong việc

điều trị các vi khuẩn gram âm. Enzym β-lactamase bao gồm enzym penicillinases, chống lại các kháng sinh penicillin, hoặc enzym AmpC cephalosporinases (ví dụ, MOXs, MIR, FOX). Có nhiều enzym β-lactamase phổ rộng (ví dụ, SHV-1, TEM-1, TEM-2, CTX), có khả năng thủy phân các

penicillin và các cephalosporin và kháng lại các chất ức chế lactamase (ví dụ, axit clavulanic, sulbactam và tazobactam). Nhóm enzym kháng penicillin và cephalosporin, bao gồm cefotaxime và ceftazidime; Hơn nữa, nhiều vi khuẩn

sản sinh enzym TEM và SHV còn đồng kháng với tetracycline, sulfonamides, và aminoglycosid. Phần lớn các vi khuẩn sinh enzym CTX-M kháng với fluoroquinolones. Cuối cùng, enzym carbapenemases (ví dụ, IMP, VIM, KPCs,

OXAs), là các enzym có khả năng bất hoạt tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [10].

Biến đổi các protein liên kết penicillin (PBP)

PBPs là protein quan trọng có liên quan trong việc xây dựng các peptidoglycan, là thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn. Các enzym này

xúc tác các sợi glycan và liên kết ngang giữa các chuỗi glycan. Các vị trí hoạt động của sợi glycan là mục tiêu của kháng sinh β-lactam. Các hợp chất này bắt

chước sợi peptit đôi D-Ala-D-Ala trong peptidoglycan và tạo thành một phức acyl-enzym rất ổn định, dẫn đến enzym bị bất hoạt. Khi các PBP thay đổi vị trí hoạt động, thì các kháng sinh β-lactam sẽ để mất hoặc làm giảm ái lực của

chúng với các protein mục tiêu, dẫn đến sự kháng thuốc [10].

Biến đổi Porin

Vi khuẩn gram âm có một lớp màng bên ngoài vách tế bào, màng ngoài, trong đó bao gồm một lớp lipid kép. Các thành phần chính của lớp đôi này là lipopolysaccharide, là hợp chất kị nước, nên các hợp chất ưa nước rất khó khăn

để đi qua. Do đó, porins hoặc porins màng ngoài (OMP), là các protein hỗ trợ trong việc thông qua các chất hòa tan thấm qua màng lipid kép. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng của thuốc để vượt qua porins, chẳng hạn như hình

dạng, kích thước. Có một số porins điển hình, chẳng hạn như OmpF, OmpC, và OmpE. Mỗi loài vi khuẩn sản xuất các porins cụ thể và sự mất mát hoặc giảm hoạt động của một hoặc nhiều OMP là một yếu tố góp phần phổ biến

trong việc xây dựng sức đề kháng (ví dụ, mất OprD) của P. aeruginosa đối với Imipenem và Meropenem. Ở các loài khác, mất OmpF có thể dẫn đến các sinh vật kháng với nhiều loại kháng sinh (đa kháng). Trong một số chủng vi khuẩn, sự giảm hoặc mất ái lực của thuốc với các protein (porin), dẫn đến mất khả

năng để vượt qua các màng ngoài và không thể xâm nhập vào tế bào. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng áp lực chọn lọc tác dụng bởi việc sử dụng kéo dài thuốc kháng sinh là một yếu tố quan trọng trong sự xuất hiện của vi khuẩn

đa kháng và việc sửa đổi các porins là một yếu tố quan trọng sự hình thành đa kháng thuốc [10].

Protein bơm

Một cơ chế hiệu quả cao của kháng kháng sinh là sự sản sinh hệ thống protein bơm kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn. Tất cả các thành viên của họ

protein này bao gồm 3 dạng không thay đổi sau: Dạng A, đóng vai trò như cửa vào và ra của tế bào chất, kiểm soát sự di chuyển của các chất nền đến và đi từ các tế bào chất; dạng B, đó là tham gia vào các khớp nối năng lượng; và dạng

C, định hướng vị trí và đề xuất hướng vận chuyển. Các protein đặc trưng nhất trong họ này là protein vận chuyển tetracycline (TetB), đã được tìm thấy trong

E. coli [10].

Sửa đổi phân tử mục tiêu của các kháng sinh

Hầu hết các kháng sinh ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein đều

nhằm vào các ribosome mục tiêu và sự khác biệt giữa cấu trúc của ribosome này cho các hành động chọn lọc của thuốc kháng sinh trong vi khuẩn, vi khuẩn

cổ và các tế bào nhân chuẩn. Ngay cả giữa các loài, sự thay đổi nhỏ trong cấu trúc ribosome có thể dẫn đến sự tương tác đặc hiệu mang tính chất của loài lên kháng sinh. Do đó các kháng sinh nhắm vào ribosome là chất diệt khuẩn rất

mạnh. Tuy nhiên, qua nhiều thập kỷ sử dụng, các tác nhân gây bệnh đã trở nên đề kháng với thuốc kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein. Một cơ chế đáng chú ý của sự kháng là việc sửa đổi các mục tiêu của kháng sinh. Ví dụ, những

thay đổi nhỏ trong một chuỗi axit amin, dẫn đến thay đổi cấu trúc protein đủ để cản trở kháng sinh. Các báo cáo đầu tiên của sự thay đổi cấu trúc ribosome

trong đột biến erythromycin kháng E. coli mô tả sự thay đổi protein ribosome, đáng chú ý là các protein L4 và L22 [10].

1.2.3. Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm

Escherichia coli và Acinetobacter spp. là tác nhân gây bệnh quan trọng ở người. Các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do các vi sinh vật nói trên thường

được điều trị bằng cephalosporin phổ rộng (ESC). Tuy nhiên, trong hai thập kỷ qua, hoạt động điều trị đã phải đối mặt với sự gia tăng nhanh chóng các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi sự kháng cephalosporin phổ rộng của các chủng vi khuẩn gây bệnh do sự hình thành enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), plamid trung gian AmpCs và các enzym carbapenemase. Tình trạng này làm hạn chế đáng kể quá trình điều trị và gây nguy hiểm đến sức khỏe con người. Gia cầm

được xem như là nguồn chứa các vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc. Chính việc sử dụng tự do các kháng sinh trong chăn nuôi đã góp phần vào sự thích nghi và tính chọn lọc của vi khuẩn trong quá trình kháng lại kháng sinh cephalosporin phổ rộng của vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Ngày nay, sự phổ biến của thức ăn có nguồn gốc từ động vật có chứa các vi khuẩn

Enterobacteriaceae và E. coli mang gen kháng kháng sinh cephalosporin phổ rộng (đặc biệt là các chủng vi khuẩn có chứa gen CTX-M và CMY-2 AmpC mã hóa enzym β-lactamase) đã gây ra lo ngại cho việc điều trị bệnh. Hơn nữa,

gần đây với sự xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng carbapenem (vi khuẩn đường ruột sản sinh VIM-1, NDM-1 hay OXA-23) đang là mối quan tâm lớn của cả cộng đồng [17].

Việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y đã góp phần vào việc lựa chọn và lây lan của các vi khuẩn gram âm đa kháng kháng sinh, đặc biệt là

E. coli và Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin phổ rộng đã được phân lập trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và từ môi trường nước. Nguy cơ trước mắt của tình trạng này là sự lây truyền các chủng vi khuẩn kháng

cephalosporin phổ rộng hay ESBL từ thực phẩm lên người do tiêu thụ thực phẩm có mang mầm bệnh, hơn nữa sự lây lan từ người sang người qua chất thải (phân) thông qua môi trường và bệnh viện cũng được xem là môi trường lý

tưởng cho sự phát tán các mầm bệnh kháng kháng sinh ra cộng đồng thông qua hệ thống nước thải (xem Hình 1.8) [16, 17, 18]

Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng đồng [19]

1.2.4. Enzym β-lactamase

Sự kháng kháng sinh β-lactam trong các vi khuẩn gây bệnh gram âm có xu hướng liên quan đến sự sinh enzym β-lactamase. Báo cáo tổng hợp gần đây về β-lactamase theo cấu trúc và chức năng cho thấy có hơn 950 enzym với cấu

trúc tự nhiên được mô tả. Các enzym này tồn tại dưới dạng β-lactamases đặc trưng cho cá thể, ví dụ là loài Klebsiella oxytoca, enzym có thể được tạo ra bởi các thành phần ngoài nhiễm sắc thể với tám enzym β-lactamase khác nhau xuất hiện trong một cá thể. Mối quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu là khả năng thay đổi ngày càng tăng của vi khuẩn để sản sinh các enzym β-lactamase phân

giải tất cả các kháng sinh β-lactam [2].

(ESBLs) và carbapenemases rộng

β-lactamase gồm 4 nhóm chính có thể được xác định dựa trên các đặc tính của kháng sinh: penicillinase, cephalosporinase kiểu AmpC, β-lactamases (xem Hình 1.9), ESBLs, phổ cephalosporinase có thể thủy phân cephalosporin phổ rộng như cefotaxime

hoặc ceftazidime. Các vi khuẩn Enterobacteriacease sản sinh ra các enzym này với khả năng thuỷ phân hầu hết các kháng sinh penicillin và cephalosporin, dẫn đến việc sử dụng kháng sinh carbapenem thường xuyên hơn. Tuy nhiên, các

báo cáo cũng cho thấy các vi khuẩn gram âm sinh enzym carbapenemases cũng đạt được tỷ lệ cao. Enzym carbapenemase này có tỷ lệ bất hoạt cao đối với kháng sinh carbapenems, các kháng sinh lactam phổ rộng đang được sử dụng

để chống lại vi khuẩn gram sinh enzym β-lactamase [2].

Hình 1.9 Các nhóm enzym β-lactamase [2]

Dựa trên sự phân loại của Ambler, enzym β-lactamase có thể được phân

loại vào bốn lớp, lớp A đến D, dựa trên axit amin chuỗi giống nhau và cấu trúc phân tử. Lớp A, C, D gồm các cấu trúc giống penicillin và liên quan đến protein liên kết penicillin. Các lớp này khác nhau bởi trọng lượng của protein liên kết

penicillin. Lớp B β-lactamase, mặc dù cũng thủy phân vòng β-lactam, nhưng cấu trúc không liên quan đến các protein liên kết penicillin. Các enzym β-

lactamase thường thấy trong điều trị lâm sàng là lớp A hoặc lớp C. Loại A enzym thủy phân thường ưu tiên penicillin, nhưng cũng có thể phân giải

cephalosporin hoặc carbapenemase. Thông thường họ các enzym β-lactamase bị ức chế bởi axit clavulanic.Tuy nhiên điểm đột biến có thể khiến các enzym kháng với các chất ức chế hoặc mở rộng phổ hoạt động bao gồm các cephalosporin thế hệ thứ ba và aztreonam (gọi là β-lactam phổ rộng). Lớp

enzym β-lactamase C ưu tiên thủy phân cephalosporin và không bị ức chế bởi axit clavulanic. Các β-lactamase thường được mã hóa trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Enzym loại B là các enzym hoạt động phổ rộng, và có thể thủy phân

tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [20].

1.2.4.1. Enzym β-lactamase phổ rộng

Nhóm enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), là enzym có tác dụng kháng cephalosporin thế hệ ba và thế hệ 4, carbapenem và monobactam. Hiện tượng

kháng các kháng sinh trên đã được ghi nhận vào thập niên 1980, tại Đức, năm 1983, ca bệnh đầu tiên đã được mô tả là có sự xuất hiện vi sinh vật sản sinh enzym β-lactamase. Vi khuẩn sinh enzym ESBL thường đa kháng do các gen qui định tính kháng lên các loại kháng sinh khác nhau đều nằm trên cùng 1 plasmid. Một số vi khuẩn sinh enzym ESBL kháng với nhóm aminoglycosides,

4-quinolon. Bên cạnh đó nhiều vi khuẩn sinh enzym beta-lactamase phổ rộng đang hoạt động chống lại hầu hết các kháng sinh β-lactam, bao gồm oxyimino- betalactams, ceftazidime, ceftiofur, aztreonam, có thể bị bất hoạt bởi axit

clavulanic [21].

Nhóm enzym ESBL được phân loại dựa trên cấu tạo, kết cấu phân tử của enzym và nhóm kháng sinh mà các enzym này ức chế. Năm 2010, dựa trên cấu

trúc phân tử, các enzym β-lactamase được chia làm 4 nhóm: nhóm 1 (lớp C) bao gồm các enzym kháng cephalosporin; nhóm 2 (lớp A và D) bao gồm ESBL

và các enzym carbapenemase; nhóm 3 gồm metallo-β-lactamase; nhóm 4 là các enzym penicillinase kháng axit clavulanic [21].

ESBL còn được định nghĩa là các enzym β-lactamase có thể bị ức chế

bởi axit clavulanic, tazobactam hoặc sulbactam, và được mã hóa bởi các một số gen có thể được trao đổi giữa các vi khuẩn như sau:

Enzym SHV

Tập hợp các enzym SHV của nhóm β-lactamase dường như được bắt nguồn từ Klebsiella spp. Khởi nguồn của tập hợp enzym SHV, là SHV-1, tìm thấy đầu tiên trong chủng vi khuẩn gây bệnh K. pneumoniae. Trong nhiều

chủng K. pneumoniae, các gen mã hóa SHV 1, LEN-1, cư trú trên các nhiễm sắc thể của vi khuẩn, sau đó được kết hợp vào một plasmid và đã phát tán gen này đến các vi khuẩn đường ruột khác. SHV-1 kháng với penicillin phổ rộng

như ampicillin, tigecycline và piperacillin. Các enzym SHV-1 β-lactamase chịu trách nhiệm trong 20% trường hợp kháng ampicillin liên quan đến plasmid

trong K. pneumonia [22].

Enzym TEM

Enzym TEM-1, lần đầu tiên được báo cáo từ một chủng E. coli phân lập

vào năm 1965, có khả năng kháng kháng sinh tương tự như enzym SHV-1. TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và cephalosporin thế hệ đầu tiên

nhưng không thể tấn công các cephalosporin oxyimino. Tuy nhiên sau đó đã xuất hiện các biến thể TEM đầu tiên gia tăng hoạt động chống lại các cephalosporin phổ rộng là TEM-3. TEM-3, lần đầu được báo cáo vào năm

1989, là enzym TEM β-lactamase đầu tiên hiển thị các kiểu hình ESBL. Hiện nay các biến thể của TEM ngày càng mở rộng về số lượng và phổ biến trong các vi khuẩn đường ruột [22].

Enzym CTX

Một nhóm enzym β-lactamase mới là CTX, ưu tiên thủy phân cefotaxime.

Nhóm enzym này đã được tìm thấy trên một số chủng vi khuẩn như Salmonella Typhimurium, E. coli và một số loài Enterobacteriaceae khác. Đây là nhóm enzym không liên quan rất chặt chẽ với TEM hoặc SHV β-lactamase. CTX-M

β-lactamase được cho là bắt nguồn từ gen trên nhiễm sắc thể trong loài Kluyvera spp., một tác nhân gây bệnh cơ hội của thuộc vi khuẩn Enterobacteriaceae được tìm thấy trong môi trường. Protein CTX-M đã được phát hiện vào cuối những

năm 1980 và ngày nay hơn 100 biến thể đã được giải trình tự [21].

Enzym OXA

Các Enzym β-lactamase OXA được đặt tên dựa trên khả năng thủy phân Oxacillin. Các β-lactamase này được đặc trưng bởi tỷ lệ thủy phân cloxacillin và oxacillinlớn hơn 50% đối với penicillin G. Chúng chủ yếu xảy ra ở P.

aeruginosa nhưng đã được phát hiện trong nhiều vi khuẩn gram âm khác. Trong thực tế, phổ biến nhất trong các Enzym β-lactamase OXA, là OXA-1 đã được tìm thấy trong 1-10%. Các enzym OXA ESBL ban đầu được phát hiện trong

khuẩn lạc P. aeruginosa từ bệnh viện ở Ankara, Thổ Nhĩ Kỳ. Sự tiến hóa của enzym ESBL OXA có nhiều điểm tương đồng với sự tiến hóa của enzym ESBL

SHV- và TEM [22].

Các enzym ESBL khác

Một số enzym ESBL khác như PER, GES, BES, CME, SFO, GES, PSE

đã được tìm thấy và phân lập trên vi sinh vật gây bệnh ở khắp nơi trên thế giới [23].

1.2.4.2. β-lactamase AmpC

AmpC β-lactamase chủ yếu là các enzym được mã hóa bởi gen nằm trên nhiễm sắc thể tạo ra tính kháng với penicillin, cephalosporin phổ hẹp, oxymino- lactam, và cephamycin và không nhạy cảm với các chất ức chế-lactamase như

nhóm axit clavulanic. Sự sản sinh AmpC trong trực khuẩn gram âm thường bị ức chế. Tuy nhiên, sự gia tăng tạm thời trong sản xuất enzym AmpC (gấp 10 đến 100 lần) có thể xảy ra với sự hiện diện của kháng sinh β-lactam ở các loài

sau đây: Enterobacter, Citrobacter freundii, Serratia, M. morganii, Providencia và P. aeruginosa. Quá trình sản xuất β-lactamase của AmpC trở lại mức thấp sau khi ngừng tiếp xúc với kháng sinh, trừ khi đột biến tự phát xảy

ra ở locus ampD của gen, dẫn đến sự sản xuất vĩnh viễn enzym ở những loài này. Sử dụng Cephalosporin thế hệ thứ ba trong điều trị bệnh do Enterobacter

spp. là cơ hội cho vi khuẩn lựa chọn và sản sinh các đột biến, dẫn đến sự xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh trong quá trình điều trị [22].

Hơn 20 enzym AmpC qua trung gian plasmid, có nguồn gốc từ các gen được mã hóa bởi nhiễm sắc thể trong Enterobacteriaceae hoặc Aeromonas spp., đã được tìm thấy trong E. coli, K. pneumoniae, Salmonella enterica và Proteus mirabilis [22]. Thành viên thường gặp nhất của nhóm này là enzym beta-

lactamase CMY 2 trong vi khuẩn Salmonella phân lập từ động vật, gia cầm và trên vi khuẩn Shigella, E. coli O157 từ các vụ dịch [24].

1.2.4.3. Carbapenemase

Carbapenemase là tập hợp gồm các enzym có Serin trong vị trí hoạt động

và enzym Metallo β-lactamase (MBLs) mà sử dụng ít nhất 1 nguyên tố kẽm cho hoạt động phân giải kháng sinh.

Các enzym carbapenemases Serine lần đầu tiên được xác định vào giữa những năm 1980 với số lượng hạn chế trên vi khuẩn E. coli, nhưng bây giờ đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Điều quan trọng nhất là enzym Klebsiella

pneumoniae carbapenemase - KPCs, được các plasmid truyền phát tán khắp các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và các loài vi khuẩn không sản sinh enzym này. Hai enzym tương đương về sinh hóa KPC-2 và KPC-3 là phổ biến nhất, sự khác biệt giữa các isoenzym này là sự thay thế amino axit đơn (His272 đổi thành Tyr) [22].

Enzym Metallo-β-lactamases (MBLs) hiện nay được tìm thấy trên toàn cầu do sự lan truyền bởi plasmid ở nhiều loài vi khuẩn. Hơn 80 MBL khác nhau đã được xác định trên toàn thế giới, với hơn 75% số enzym này xuất hiện như

các enzym mã hoá từ plasmid. Các họ chính của các MBL đã bao gồm enzym IMP và VIM β-lactamase, ban đầu được tìm thấy trong P. aeruginosa, nhưng bây giờ chúng đã được tìm thấy trong Enterobacteriaceae. Việc sản xuất MBL trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được ghi nhận từ năm 1994 khi IMP-1 mã hoá từ plasmid được xác định trong loài Serratia marcescens tại Nhật Bản [22].

1.3. THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE

Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có thể lây nhiễm lên thực phẩm theo con đường trực tiếp hoặc gián tiếp từ nhiều nguồn

khác nhau hoặc tự chúng có thể đại diện cho hệ vi sinh vật tự nhiên của thực phẩm. Một số chi thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea thường xuất hiện rộng rãi và phổ biến trong thực phẩm bao gồm Citrobacter, Enterobacter,

Hafnia, Klebsiella, Serratia, Yersinia, Escherichia, Proteus và Salmonella, có thể xâm nhập vào chuỗi thức ăn hoặc có thể liên quan đến các loại thực phẩm

thông qua nhiễm phân (xem Hình 1.10) [1, 24].

Ô nhiễm thực phẩm bởi mầm bệnh đường ruột (Enterobacteriaceae) có thể xảy ra từ trang trại nếu nước thải của con người được sử dụng để bón cho

đất hoặc nếu nước thải được sử dụng để tưới cho cây trồng. Trái cây tươi và rau quả có thể trở nên bị ô nhiễm trước hoặc sau khi thu hoạch. Những rủi ro như vậy sẽ tăng thêm nếu thực phẩm bị xử lý sai trong quá trình chế biến và

chuẩn bị, trong chuỗi thức ăn các mầm bệnh có thể nhân lên theo cấp số nhân trong điều kiện thuận lợi [26].

Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người [25]

1.3.1. Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae

Trong các sản phẩm thực phẩm thì con người có xu hướng tiêu thụ các sản phẩm tươi, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể khỏe mạnh.

Trong các sản phẩm được tiêu thụ thì rau ăn sống là thực phẩm giàu dinh dưỡng cung cấp vitamin, khoáng và chất xơ, nên mức tiêu thụ các sản phẩm rau đã tăng lên trong thập kỷ gần đây. Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO)

việc tiêu thụ quá ít rau quả đã dẫn tới sự tử vong của 1,7 triệu người trên toàn thế giới. WHO và tổ chức Nông Lương (FAO) cũng khuyến cáo con người cần

bổ sung ít nhất 400 g trái cây và rau mỗi ngày (không bao gồm các loại cây trồng có nguồn gốc tinh bột) để phòng tránh các bệnh mãn tính như bệnh tim, tiểu đường, béo phì và ngăn ngừa các bệnh khác do thiếu vi chất [27].

Rau ăn sống thường chứa các vi sinh vật không gây bệnh, nhưng trong quá trình trồng trọt, thu hoạch, vận chuyển và xử lý, sản phẩm có thể bị nhiễm mầm bệnh từ nguồn nước, chất thải của động vật và con người. Hầu hết các sản

phẩm này có thể tiêu thụ trực tiếp mà không cần chế biến thêm hoặc không cần xử lý nhiệt, do đó các vi sinh vật gây bệnh có trong rau sống có thể là nguy cơ

tiềm ẩn đối với sức khỏe của người tiêu dùng và nảy sinh vấn đề an toàn thực phẩm cần kiểm soát. Sự nhiễm bẩn có thể là kết quả của việc xử lý đất với các chất hữu cơ phân bón, như bùn thải và phân chuồng, và từ nước tưới, cũng như

từ khả năng của mầm bệnh để tồn tại và phát triển trong rau. Dịch tễ học của bệnh lây truyền qua thực phẩm đã thay đổi nhanh chóng trong những thập kỷ gần đây, ngay sau khi một số mầm bệnh chủ yếu của con người được công nhận

là lây lan từ các trang trại nuôi động vật, thì rau ăn sống đã nổi lên như một nguồn chứa nguy cơ mới để truyền các mầm bệnh lên người. Bên cạnh đó mức tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên trong những năm gần đây, song song đó, kể từ đầu những năm 1990, các vụ ngộ độc liên quan đến việc tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên nhanh chóng. Hầu hết các báo cáo về triệu chứng dạ dày- ruột kết do ăn rau ăn sống đều có liên quan đến ô nhiễm vi khuẩn, đặc biệt là

với các thành viên họ Enterobacteriaceae [28].

Tiêu thụ rau ăn sống cũng là con đường mà qua đó con người tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh mang gen kháng kháng sinh. Ngoài ra, sự hiện diện của

vi khuẩn kháng kháng sinh trong rau ăn sống có thể góp phần làm lan rộng tính kháng kháng sinh giữa các quần thể vi khuẩn theo chiều ngang giữa các chủng, loài và chi khác nhau. Sự hiện diện của các gen kháng trên các yếu tố di truyền di động tạo điều kiện cho sự phân bố và lan truyền tính kháng kháng sinh và

việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh trong điều trị đã góp phần hình thành nhân tố kháng trong vi khuẩn. Việc sử dụng một lượng lớn thuốc kháng sinh trong nông nghiệp có thể dẫn đến việc thích nghi của các vi khuẩn kháng thuốc; bên

cạnh đó sử dụng phân từ chăn nuôi động vật sang nông nghiệp hoặc sử dụng nước bị ô nhiễm để tưới rau cũng có thể lây lan vi khuẩn kháng bệnh cho rau trồng. Từ đó lây lan sang người qua con đường tiêu thụ rau. Do đó, sự hiện diện

của vi khuẩn kháng thuốc trong rau ăn sống đã làm dậy lên mối nguy về an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng [28].

Một trong những mối quan tâm liên quan đến kháng kháng sinh trên toàn thế giới là việc phổ biến các vi khuẩn gram âm đặc biệt là Enterobacteriaceae có khả năng kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3 (3GCs). Khả năng kháng

đối với 3GCs thường do sự sản sinh enzym β-lactamases phổ rộng (ESBLs) hoặc AmpC β-lactamases và liên quan đến các vi khuẩn thường Enterobacteriaceae hiện diện trong phân như Citrobacter spp., Enterobacter

spp., Escherichia coli, và Klebsiella spp. Những vi khuẩn này có thể tồn tại trong đất nông nghiệp thông qua việc sử dụng phân chuồng gia súc hoặc nước mặt bị nhiễm bẩn do tưới tiêu. Vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae thuộc chi Kluyvera, Serratia và Rahnella có trong đất và nước, là dạng vi khuẩn tự nhiên chứa enzym ESBL, là yếu tố quyết định về khả năng kháng 3GC. Trong

quá trình canh tác trong đất (thay đổi phân chuồng) và / hoặc khi được tưới bằng nước bị ô nhiễm, rau có thể có thể bị nhiễm vi khuẩn sinh enzym ESBL. Đặc biệt, việc tiêu thụ rau ăn sống có thể dẫn đến việc nhiễm vi khuẩn kháng 3GC và trao đổi gen kháng kháng sinh với vi khuẩn đường ruột trong suốt quá trình tiêu hóa, do đó có thể ảnh hưởng tới sức khoẻ cộng đồng. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột trên rau sống và tính

kháng kháng sinh của các vi khuẩn này, tuy nhiên chỉ có một số ít vài nghiên cứu tiến hành khảo sát sự hiện diện của Enterobacteriaceae kháng 3GC trên rau [17, 28].

1.3.2. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau trên thế giới

Theo các báo cáo của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới thì Enterobacteriaceae thường được tìm thấy phổ biến trong các nguồn sống khác

nhau như đất, nước, thực vật và động vật và trong các chuỗi thức ăn. Và rau sống được xem là nguồn chứa các vi khuẩn Enterobacteriaceae. Nghiên cứu tại Hà Lan được thực hiện bởi Hoek và cộng sự, tổng số 1216 rau quả thu được

từ các cửa hàng tại Hà Lan trong năm 2012 và 2013 đã được phân tích để xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae, trong đó Rau diếp (n = 137), rau diếp xoăn

(n = 96), rau diếp băng (n = 193) đã cho thấy sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn đường ruột như Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter freundii [29]. Trong đó, Enterobacteriaceae kháng 3GC được phát hiện trên 5.2% mẫu

rau đã thu thập. Dựa trên môi trường sống và cơ chế kháng 3GC, những vi khuẩn này có thể được chia thành hai nhóm: sinh ra ESBL (Escherichia Coli, Enterobodie spp.), sản sinh AmpC (Citrobacter freundii, Enterobodie spp.). Sự

nhiễm bẩn vi khuẩn có khả năng kháng 3GC trong rau lá xanh là 0,6% [29].

Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, trái cây tươi và rau quả có liên quan đến nhiều bệnh do thực phẩm bùng phát ở các vùng khác nhau trên thế

giới, bao gồm cả ở Canada. Cơ quan Thanh tra Thực phẩm Canada tiến hành khảo sát một loạt các sản phẩm có sẵn trong thị trường Canada (rau địa phương

so với rau nhập khẩu, rau hữu cơ so với rau thông thường). 31.329 mẫu được thu thập trên khắp Canada trong bốn năm (2009-2013) bao gồm các loại rau lá (n = 12.073), các loại thảo mộc lá (n = 6.032), hành xanh (n = 3,381), dưa đỏ

(n = 3,230), cà chua (n = 4,837) và quả (n = 1,776). Nhìn chung, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriacea trong các loại sản phẩm được nghiên cứu là khoảng 0 - 1,01%, tỉ lệ bắt gặp cao nhất trong các loại thảo mộc lá (0,79-1,30%), tiếp theo là các loại rau lá (0,30 - 0,53%), dưa đỏ (0,07 - 0,36%), hành xanh (0,03 - 0,26%), quả (0 - 0.22%) và cà chua (0 - 0.08%) [30].

Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Phần Lan trên các loại rau được

bán lẻ tại các cửa hàng gồm các loại rau cho rễ như củ cải, rau mùi tây, cà rốt và rau xanh như xà lách, hẹ, rau diếp băng, rau cần tây, cải bắp cải cho thấy sự xuất hiện của 114 vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae. Sau khi nhận dạng, các vi khuẩn được phân loại như sau: Citrobacter freundii - 21

chủng, Enterobacter aerogenes - 41 chủng, Erwinia carotovora - 5 chủng, Escherichia coli - 5 chủng, Hafnia spp. - 30 chủng, Klebsiella spp. - 1 chủng, Proteus vulgaris - 9 chủng, Providencia spp. - 2 chủng, và Serratia marcescens - 1 chủng. Đặc biệt từ mẫu rau diếp là loại rau ăn sống, 22 vi khuẩn đã được

phân lập và phân loại vào các chi sau: Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Hafnia spp. và Escherichia coli [31].

Một nghiên cứu khác của Odigie và cộng sự thực hiện vào năm 2015 trên

100 mẫu rau được thu thập từ các thị trường ở Calabar, Nigeria đã phân lập được 105 vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Ba mươi vi khuẩn thuộc họ

Enterobacteriaceae được phân lập từ mẫu đã được rửa bằng nước và giấm, trong đó 75 chủng vi khuẩn đã được thu thập từ các mẫu rau chưa rửa. Các loài vi khuẩn chủ yếu thuộc chi Klebsiella, Proteus và Escherichia [18].

Trong một nghiên cứu của Kim và cộng sự nhằm xác định sự hiện diện của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym và β-lactamase trên rau ăn sống. Tổng cộng 189 mẫu rau (91 rau mầm và 98 mẫu salad trộn) được

thu thập tại thị trường bán lẻ ở Hàn Quốc từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 2 năm 2013. Sự phổ biến của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh

enzym ESBL là 10,1%, trong đó 94,7% là từ các mẫu rau mầm. Tất cả các chủng vi khuẩn đều kháng với cefotaxime, và nhiều vi khuẩn sinh ESBL cũng gentamicin, kháng kháng khác, gồm sinh bao các với

trimethoprim/sulfamethoxazole, và Ciprofloxacin (lần lượt là 73,7%, 63,2% và 26,3%). Enzym β-lactamase TEM-1, SHV-1, -2, -11, -12, -27, -28 và-61, và CTX-M-14, -15 và-55 được phát hiện dưới dạng đơn lẻ hoặc dạng kết hợp. Đây

là báo cáo đầu tiên về sự phổ biến về loài Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae sinh enzym ESBL trên rau tại Hàn Quốc. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng rau ăn sống, đặc biệt là rau mầm, có thể đóng vai trò trong việc phát tán các vi khuẩn sinh ESBL lên người [32].

Bên cạnh đó sự xuất hiện và lan rộng trên toàn thế giới của họ vi khuẩn

đường ruột Enterobacteriaceae sản xuất enzym carbapenemase là mối quan tâm lớn đối với sức khoẻ cộng đồng. Chuỗi cung ứng thực phẩm ngày càng được quan tâm vì đó có thể là nguồn chứa và phát tán gen kháng kháng sinh.

Tuy nhiên rất ít nghiên cứu tập trung vào họ vi khuẩn đường ruột sinh enzym carbapenemase, đặc biệt là trên rau. Từ tháng 1 đến tháng 4 năm 2016, tổng cộng có 87 mẫu rau tươi (rau diếp, cà chua, cà rốt, dưa chuột, bí xanh và rau mùi tây) được mua từ các chợ và cửa hàng ở thành phố Béjaia, Algeria. Trong

số 87 mặt hàng thực phẩm được phân tích, 3 (3.4%) chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem thu được từ ba loại rau được mua ở hai cửa hàng khác nhau ở Béjaia, Algeria [33].

Trong nghiên cứu thực hiện tại Thụy Sĩ trên các loại rau được nhập khẩu từ Việt Nam, Zurﬂuh và cộng sự khi thực hiện nghiên cứu vào năm 2015 đã

phát hiện ra các chủng Enterobacteriaceae sinh ESBL. 169 mẫu rau được thu thập để phân tích, trong đó có 20 mẫu rau nhập khẩu từ Việt Nam, bao gồm rau húng, rau canh giới, mồng tơi. Kết quả cho thấy sự hiện diện của 3 loài vi khuẩn

Escherichia coli, Klebsiella pneumonie và Enterobacter cloacae sinh ESBL [34]. Trong một nghiên cứu khác của Zurﬂuh và cộng sự trong năm 2015, trên mẫu rau trộn từ Việt Nam đã phát hiện loài vi khuẩn Klebsiella variicola sinh

enzym OXA-181carbapenemase. Tiếp tục nghiên cứu về Enterobacteriaceae trên rau sống được nhập từ châu Á, Năm 2016 Zurﬂuh đã phát hiện chủng Escherichia coli DH5-alph sinh enzym ESBL đồng thời chứa gen mcr-1 kháng

Colistin trên mẫu rau từ Việt Nam .

1.3.3. Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau tại Việt Nam

Sự lưu hành của Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại Việt Nam có sự thay đổi về tỉ lệ giữa các nghiên cứu giữa các vùng miền khác nhau thuộc

các tác giả khác nhau vào từng thời điểm khác nhau, tuy nhiên Enterobacteriaceae vẫn hiện diện với tỉ lệ cao trên các mẫu rau ăn sống đã thu

thập, thường lên tới 100%. Kết quả phân tích Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương năm 2011 cho thấy 96 mẫu rau được lấy tại chợ Hoàng Liệt và 118 mẫu lấy từ quận Long Biên (Hà Nội) đều nhiễm vi khuẩn Coliforms và các vi khuẩn gây

ra bệnh tiêu chảy (những loại vi khuẩn có trong phân người và gia súc) [35]. Kết quả xét nghiệm nước dùng để tưới rau cho thấy có quá nhiều mầm bệnh, đặc biệt là vi khuẩn Coliforms (nguồn nước tưới chủ yếu là ao chứa nước mưa

hoặc nước giếng ở hộ gia đình). Điều này chứng tỏ nguồn nước tưới tiêu đóng

vai trò quan trọng, có ảnh hưởng tới việc lan truyền các vi sinh vật gây bệnh. Trong nghiên cứu của Lương Đức Phẩm, trên hầu hết các loại rau cải chứa 106 - 107 tế bào Coliforms/g và phân hữu cơ không sạch mầm bệnh có thể gây ô nhiễm trên đất và cây trồng sau khi được sử dụng, nhất là đối với loại rau ăn

thân và ăn lá [36].

Trong khi đó Nghiên cứu thực hiện tại Thành Phố Hồ Chí Minh và khu vực đồng bằng sông Mê Công cũng cho tỉ lệ nhiễm Enterobacteriaceae trong

rau ăn sống là cao. Một nghiên cứu khác của đại học Cần Thơ thực hiện năm 2011-2012 (n=25) cho thấy Coliforms và E.coli hiện diện trong các mẫu rau

với hàm lượng cao [35]. Gần đây nhất nghiên cứu về Enterobacteriaceae của Ho Le Quynh Chau và cộng sự thực hiện 2013-2014 tại Huế cho thấy 100% (n=108) mẫu rau bán ở chợ nhiễm E. coli [37].

Từ các nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam trong những năm gần đây cho thấy rau ăn sống là một trong các nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và có khả năng lây truyền vi khuẩn kháng lên người. Cùng với sự hiện diện của

các loài vi khuẩn gây bệnh, thì con người đã sản xuất và áp dụng nhiều thế hệ kháng sinh vào quá trình chữa trị, tuy nhiên dần dần các vi khuẩn gây bệnh đã

thể hiện tính kháng kháng sinh. Bên cạnh đó việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi (gia cầm, thủy hải sản) và sự lây nhiễm vi khuẩn do tiêu thụ thực phẩm vô hình chung đã gây khó khăn cho quá trình điều trị.Theo báo cáo của

tổ chức y tế thế giới, kháng kháng sinh đang là thực trạng đáng báo động, đặc biệt là tại các nước đang phát triển, nơi mà quá trình sử dụng kháng sinh không được kiểm soát chặt chẽ. Tuy nhiên cho đến nay có rất ít công bố về sự lưu

hành vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống chứa các gen mã hóa enzym β-lactamase có khả năng kháng kháng sinh β-lactam. Đặc biệt hơn, tại Việt Nam chưa có công bố nào về tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống được bán tại các quán ăn.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Thời gian thu thập mẫu được tiến hành vào cuối tháng 8 đến tháng 10

năm 2018.

Chín mươi mẫu rau được thu thập tại các chợ, siêu thị và quán ăn phục

vụ đồ ăn kèm rau ăn sống trên địa bàn 5 quận nội thành: Cầu Giấy, Nam Từ Liêm, Hà Đông, Long Biên, Hoàng Mai.

Rau ăn sống (rau mùi ta, mùi tàu, bạc hà, húng quế, húng láng, ngổ, xà

lách, diếp) được thu thập tại các chợ và siêu thị và cửa hàng ăn (xem Hình 2.1 & Hình 2.2).

Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội

Hình 2.2 Rau ăn sống được bày bán tại các chợ và siêu thị

Mỗi mẫu rau ăn sống (khối lượng khoảng 0.5 kg) được thu thập, bảo

quản trong túi nilon vô trùng và được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm.

Các mẫu rau ăn sống sau đó được bảo quản mẫu tại phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 4oC – 80C và được phân tích trong ngày hoặc vào ngày hôm sau. Phương pháp lấy mẫu:

 Các mẫu rau ăn sống được thu thập ngẫu nhiên tại 5 Quận (theo phụ lục 1): Cầu Giấy, Nam Từ Liêm, Hà Đông, Hoàng Mai, Long Biên.

 Thời gian thu thập mẫu: Tháng 8-Tháng 10/2018.

 Tại mỗi sạp hàng mỗi loại rau ăn sống chỉ thu thập 1 mẫu.

Mẫu sau khi thu thập được tiến hành phân tích tại Khoa Vi sinh vật – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Số 65 Phạm Thận

Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội.

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.2.1. Dụng cụ

Túi vô trùng (Biomerieux, Pháp) Ống nghiệm thủy tinh vô trùng (Duran, Đức)

Que cấy nhựa (Biologix, Mỹ) Pipettman (Effendorf, Đức) Tăm Bông vô trùng (Việt Nam)

Đĩa petri (Gosselin, Pháp) Bàn dập kháng sinh (Oxoid, Mỹ) Giấy parafilm (Sigma, Đức)

Hộp để chủng (Việt Nam)

2.2.2. Thiết bị

Nồi hấp (Hymaraya, Nhật) Tủ sấy (Sanyo, Nhật)

Cân kỹ thuật D = 0,1 ML802 (Metter Toledor, Thụy Sĩ) Tủ ấm (Memert, Đức)

Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Bio II, Anh) Máy đồng nhất mẫu (Anh)

2.2.3. Hóa chất

Buffer Peptone water (Merck, Đức) TSA agar (Merck, Đức)

VRB (BD, Mỹ) VRBG agar (BD, Mỹ) TBX agar (Oxoid, Mỹ)

Mueller Hinton agar (Merck, Đức) Macconkey agar (Sigma, Đức)

cefotaxime/calvulanic ceftazidime,

Khoanh giấy kháng sinh: cefazolin, cefoxitin, cefuroxime, ceftriaxone, axit, cefotaxime, ceftazidime/clavulanic axit (Liofilchem, Ý)

McFaland (BaCl2 – Sigma, Mỹ ; H2SO4 – Merck, Đức)

2.2.4. Chủng chuẩn

Sử dụng chủng chuẩn:

Escheriachia coli ATCC 25922

Salmonella 572 đã được công bố trong bài báo quốc tế năm 2014 [38]

Escherichia coli ATCC 8739

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 5 chợ, mỗi chợ 6 mẫu tại các

sạp hàng khác nhau. Thời gian thu thập tháng 8-9/2018;

Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 30 quán bán đồ ăn sẵn có kèm rau ăn sống (quán vịt nướng, quán phở). Thời gian thu thập tháng 8- 9/2018;

Ba mươi mẫu rau ăn sống được thu thập tại 8 siêu thị và cửa hàng rau

sạch. Thời gian thu thập tháng 8-10/2018.

2.3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu

Cân mẫu: Cân 25 g (từ 0.5 kg rau đã được đồng nhất) cho vào túi vô trùng, bổ sung 225 mL đệm peptone.

2.3.2. Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae

ISO 21528-2:2017: Enterobacteriaceae: Định lượng các loài vi khuẩn Enterobacteriaceae lên men glucose. Các khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng đến

màu đỏ hoặc đỏ tía (có hoặc không có quầng tủa), lên men glucose và cho phản ứng oxidase âm tính được xác định là Enterobacteriaceae [39].

TCVN 7429-2:2008 (ISO 16649-2:2001): E. coli: các khuẩn lạc màu xanh lục đến xanh lam trên môi trường trypton-mật-glucuronid (TBX) được xem là E. coli [40].

TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2006): Coliform : Định lượng các loài vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea lên men lactose. Các

khuẩn lạc đặc trưng là các khuẩn lạc màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh) được xem là khuẩn lạc Coliform điển hình [41].

Cách thức tiến hành: Mẫu sau khi được đồng nhất trong đệm peptone thu được huyền phù 10-1, hút 1mL từ dịch huyền phù 10-1 cho vào 9mL nước peptone muối thu được dịch pha loãng mẫu 10-2. Tiến hành các nồng độ pha loãng tiếp theo. Hút 1 mL dịch huyền phù chứa mẫu từ các nồng độ pha loãng, cho vào đĩa petri vô trùng, đổ 15mL thạch VRBG/VRB/TBX. Để đông trong 15 phút. Lật ngược các đĩa, đem nuôi tại nhiệt độ phù hợp: 37oC/24h đối với phép thử định lượng coliform và Enterobacteriaceae; 44oC/24h đối với phép thử định lượng E. coli. Khuẩn lạc màu đỏ tía trên thạch VRB được xem là

coliform; Khuẩn lạc màu xanh lục - lam trên thạch TBX được xem là E. coli; Các khuẩn lạc màu hồng – đỏ tía trên thạch VRBG, âm tính oxidase và lên men đường glucose được đếm là Enterobacteriaceae.

2.3.3. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh

2.3.3.1. Thử tính kháng kháng sinh β-lactam

Tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae được thử nghiệm bằng các khoanh giấy kháng sinh theo qui trình hướng dẫn của tổ chức Y tế thế giới [42]:

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch McFaland và tạo dung dịch chủng

Enterobacteriaceae: 106 – 108

Bước 2: Sử dụng bông tăm vô trùng dàn dịch chủng

Enterobacteriaceae lên đĩa thạch Muller Hinton agar

Bước 3: Hong khô ở nhiệt độ phòng và đặt khoanh giấy kháng sinh có

chứa kháng sinh (nồng độ và các kháng sinh được thể hiện trong Bảng 2.1)

Bước 4: Đo kích thước vòng kháng, đối chiếu với kích thước của chủng

đối chiếu (E. coli ATCC 25922) theo hướng dẫn của tổ chức CLSI về chuẩn kháng sinh theo Bảng 2.1 [43].

Bước 5: Đọc kết quả: kháng, nhạy cảm, không kháng.

Bảng 2.1 Kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ [43]

Điểm đọc tiêu chuẩn

Kháng sinh Nồng độ kháng sinh Tên viết tắt S I R (µg)

Cephalosporin thế hệ 1 Cefazolin KZ ≥15 - ≤14 30

Cephalosporin thế hệ 2 cefuroxime cefoxitin CXM FOX 30 30 ≥18 ≥18 15-17 15-17 ≤14 ≤14

Cephalosporin thế hệ 3

ceftriaxone cefotaxime ceftazidime CRO CTX CAZ 30 30 30 ≥23 ≥26 ≥21 20-22 23-25 18-20 ≤19 ≤22 ≤17

Chú thích: S: nhạy cảm; I: Trung gian; R: kháng

2.3.3.2. Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase

Phân lập các chủng Enterobacteriacea có khả năng sinh enzym β-

lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase, carbapenemase [44]. Các mẫu rau được tăng sinh trong đệm peptone, ủ tại 37oC/24h Ria chuyển lên môi trường Macconkey/ chứa 100 µ/L cefotaxime

Các chủng Enterobacteriacea vi khuẩn mọc trên môi trường Macconkey chứa 100 µ/g cefotaxime, được tiến hành xác định trên môi trường đặc trưng cho vi khuẩn Enterobacteriaceae (nhóm lên men đường lactose và nhóm lên men đường glucose)

Chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae sẽ được tiến hành xác định sinh enzym β-lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase, carbapenemase trong các thử nghiệm kháng sinh tương ứng với từng loại enzym.

Tạo dịch vi khuẩn xác định tính kháng kháng sinh: thực hiện 4 bước tương tự như đã trình bày trong mục 2.4.3.1

Đo kích thước vòng kháng, đối chiếu với kích thước theo hướng dẫn

của tổ chức CLSI và EUCAST về chuẩn kháng sinh [43, 45].

Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase phổ

rộng

Khẳng định sự có mặt của enzym β-lactamase phổ rộng bằng thử nghiệm

kháng sinh đồ trên 4 khoanh giấy kháng sinh là cefotaxime (CTX), cefotaxime kết hợp clavulanic axit (CTL), ceftazidime (CAZ) và ceftazidime kết hợp axit clavulanic (CAL). Quá trình thử nghiệm được tiến hành song song cùng với

chủng Salmonella 572. Với kích thước vòng kháng CTL và CAL lớn hơn hoặc bằng 5mm so với vòng kháng CTX và/hoặc CAZ thì khẳng định chủng vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng theo hướng dẫn của tổ chức CLSI thể hiện trong

Bảng 2.2 [43].

Bảng 2.2 Vi khuẩn sinh enzym ESBL [43]

vi khuẩn sinh enzym ESBL

Khẳng định Kháng sinh

cefotaxime (CTX), CTX và clavulanic axit (CTL, 40µg)

vòng kháng CTL, CAL ≥5mm so với vòng kháng CTX, CAZ ceftazidime (CAZ), CAZ và clavulanic axit (CAL, 40µg)

Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym AmpC β-lactamase

Khẳng định sự có mặt của enzym AmpC β-lactamase bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 4 khoanh giấy kháng sinh là cefotaxime (CTX), cefotaxime kết hợp cloxacillin (CTC), ceftazidime (CAZ) và ceftazidime kết hợp

cloxacillin (CAC). Quá trình thử nghiệm được tiến hành song song cùng với chủng Salmonella 572. Với kích thước vòng kháng CTC và CAC lớn hơn hoặc bằng 5mm so với vòng kháng CTX và CAZ thì khẳng định chủng vi khuẩn sinh

AmpC β-lactamase theo hướng dẫn của CLSI thể hiện trong Bảng 2.3 [43].

Bảng 2.3 Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase [43]

Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase Kháng sinh cefotaxime (CTX), CTX và cloxacillin (CTC)

ceftazidime (CAZ), CAZ và cloxacillin (CAC)

Khẳng định vòng kháng CTL, CAL ≥5mm so với vòng kháng CTX, CAZ

Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym carbapenemase

(MR+BO), meropenem + cloxacillin

Khẳng định sự có mặt của enzym carbapenemase bằng thử nghiệm kháng sinh đồ trên 5 khoanh giấy kháng sinh là meropenem (MRP), meropenem + phenylboronic axit (MR+CL), meropenem + EDTA (MR+ED) và temocillin (TMO). Chủng sinh enzym carbapenemase được khẳng định theo hướng dẫn của EUCAST thể hiện trong

Bảng 2.4 [45].

Bảng 2.4 Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym carbapenemase [45]

Kích thước vòng kháng của Meropenem và các kháng sinh khác β- lactamases KPC MBL AmpC cloxacillin (MR+CL) < 5 mm < 5 mm ≥5 mm temocillin (TMO) --- --- --- EDTA (MR+ED) < 5 mm ≥5 mm < 5 mm

< 5 mm < 5 mm <11 OXA -48 phenylboronic axit (MR+BO) ≥4 mm < 4 mm ≥4 mm < 4 mm < 11 mm OXA

Đọc kết quả: vi khuẩn sinh hay không sinh enzym β-lactamase, AmpC

β-lactamase, carbapenemase.

2.3.4. Kỹ thuật MALDI – TOF định danh vi sinh vật

Thiết bị VITEK MS là máy đo khối phổ MALDI-TOF sử dụng kỹ thuật MALDI (Kỹ thuật ion hóa theo cơ chế giải hấp phụ sử dụng nguồn laser với sự

trợ giúp của chất nền), dựa trên sử dụng công nghệ khối phổ protein. VITEK® MS là hệ thống định danh vi khuẩn tự động, tiên tiến, sử dụng công nghệ MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of- Flight) định danh các loài vi khuẩn được thực hiện bằng ghi nhận các dải quang phổ và phân tích các dải quang phổ với cơ sở dữ liệu của VITEK® MS (xem Hình 2.3). So sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu

với cơ sở dữ liệu của gần 6000 loài vi sinh vật khác nhau. MALDI-TOF MS cho kết quả nhanh trong vài phút cho 1 mẫu, yêu cầu thể tích mẫu ít và chi phí hóa chất thấp và cho kết quả thu được là loài vi sinh vật được xác định.

Hình 2.3 Nguyên lý cơ bản định danh vi khuẩn dựa trên VITEK MS

Các bước tiến hành định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật MALDI TOF trên

thiết bị VITEK MS theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị [46].

Bước 1: vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA ở 37oC/24h

Bước 2: Vi khuẩn được phết lên từng giếng của khay Bước 3: Nhỏ 0.1 µL dung dịch CHCA Bước 4: Quét mã khay, nhập mã mẫu vào phần mềm Malditof preparation

Bước 5: Chạy máy Bước 6: Đăng nhập phần mềm Myla, đọc kết quả

2.3.5. Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase bằng kỹ thuật PCR dựa trên

độ dài đoạn gen khuếch đại.

Thu ADN mẫu bằng xử lý nhiệt 100oC/15’. Ly tâm 13000v/4’. Thu

dịch nổi.

Sử dụng các cặp mồi đã được công bố bởi tác giả Li và cộng sự vào

năm 2013 [47].

Tiến hành phản ứng PCR với các trình tự mồi theo Bảng 2.5

Bảng 2.5 Trình tự mồi của gen mã hóa enzym β-lactamase [47]

Gen kháng Trình tự mồi (5’-3’) TT Đoạn khuếch đại (bp)

661 1. blaTEM

856 2. blaCMY-2

807 3. blaSHV

4. blaOXA 590

5. blaPSE 575

6. BlaDHA 926

7. 585 CAGCGGTAAGATCCTTGAGA TTCATCCATAGTTGCCTGACT ACAGAACAACAGATTGCCGATA TGTCGCTGCCGTTGATGA TTCGCCTGTGTATTATCTCC TTTGCTGATTTCGCTCGG ACCAGATTCAACTTTCAA TCTTGGCTTTTATGCTTG GCTCGTATAGGTGTTTCCGTTT CGATCCGCAATGTTCCATCC GCCGTCTCCGTAAAGGGTAAGC GCCAGAATCACAATCGCCACCT CGATGTGCAGTACCAGTAA AGTGACCAGAATCAGCGG Bla CTX- M

Chu trình phản ứng PCR: Biến tính DNA: 94°C/5 phút; 30 chu kỳ:

Biến tính DNA 94°C/30s, gắn mồi 55°C/30s; kéo dài chuỗi 72°C/50s; và giai đoạn ổn định 72 °C/7 phút.

Chạy điện di với gel 1.5%, chụp gel

Sản phẩm PCR đại diện cho mỗi gen được tiến hành tinh sạch và giải trình tự để xác định sự chính xác của sản phẩm. Trình tự ADN của mỗi gen được

so sánh với dữ liệu

tiến hành của ngân hàng gen Mỹ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Các chủng Enterobacteriaceae mang gen đặc trưng sau đó được sử dụng làm đối chứng dương cho phản ứng PCR xác định

gen đích.

2.4. CHỦNG ĐỐI CHỨNG

Phát hiện Enterobacteriaceae trên rau, sử dụng chủng E. coli ATCC

25922.

Định danh vi khuẩn, sử dụng chủng E. coli ATCC 8739

Phân tích kháng sinh: sử dụng chủng Salmonella 572, được phân lập từ

năm 2012 và công bố trên tạp chí Journal of Food Protection [38].

2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ

Số liệu được nhập vào bảng Excel và được phân tích bằng sử dụng phần

mềm STATA 11.0 (StataCorp, College, TX, USA) với các biến là địa điểm thu thập mẫu và các thời điểm thu thập mẫu. Giá trị P<0.05 được sử dụng để đánh giá sự khác biệt về mặt thống kê giữa các biến. Các phép tính thống kê về sự ô nhiễm Enterobacteriaceae trên rau ăn sống theo các loại hình kinh doanh được tiến hành theo phương pháp phân tích bảng với mỗi biến nghiên cứu được kiểm

tra bằng 2xn chi square trong Stata.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU SỐNG

3.1.1. Đánh giá tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau

sống

Chín mươi mẫu rau sống được thu thập tại 03 loại hình kinh doanh là các chợ, quán bán đồ ăn có kèm rau ăn sống, và siêu thị thuộc 5 Quận nội thành Hà Nội (Phụ lục 1) (n=30 đối với mỗi loại hình kinh doanh) và tiến hành phân tích phát hiện và định lượng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột

Enterobacteriaceae gồm Coliform (nhóm vi khuẩn Enterobacteriacea lên men lactose), Enterobacteriaceae (nhóm vi khuẩn Enterobacteriacea lên men glucose) và Escherichia coli với tỉ lệ dương tính tương ứng là 100% (90 mẫu,

n=90), 100% (90 mẫu, n=90), 86% (77 mẫu, n=90). Kết quả phân tích của nghiên cứu này tương đồng với các kết quả được thực hiện tại Long Biên và

Hoàng Mai năm 2011 của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương với 100% mẫu rau nhiễm Coliform (n=204) [35]. Kết quả này cũng tương đương với phát hiện Coliform trên rau trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự

thực hiện tại Cần Thơ năm 2011-2012 (n=25) và nghiên cứu của Ho Le Quynh Chau và cộng sự thực hiện tại Huế năm 2013-2014 (n=108) [35], [37]. Mức nhiễm E. coli là 100% trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà và Ho

Le Quynh Chau, cao hơn kết quả nghiên cứu của chúng tôi do có sự khác biệt trong thiết kế thí nghiệm từ địa điểm lấy mẫu đến số lượng mẫu.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự tương đồng về sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae với các nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới, tuy khác nhau về tỉ lệ nhiễm. Nghiên cứu của Ljevaković-

Musladin và cộng sự thực hiện thu thập 243 mẫu rau ăn sống tại khách sạn, nhà hàng và các cửa hàng bán lẻ từ năm 2011-2018 tại Croatia cho thấy có 39,5% mẫu nhiễm Enterobacteriaceae [48]. Một nghiên cứu khác được thực hiện tại

Ấn Độ bởi Al-Kharousi và cộng sự trong năm 2014 cho thấy tỉ lệ nhiễm Enterobacteriaceae trong rau là 91% và E. coli là 22% [49].

Sự nhiễm các vi khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae có tỉ lệ cao trên rau ăn sống được xác định có thể do lây nhiễm trong quá trình trồng trọt bắt nguồn từ nguồn nước tưới và đất và 1 nguyên nhân thường thấy tại các nước đang phát triển là rau có thể được rửa tại nguồn nước ô nhiễm trước khi phân

phối ra thị trường. Trong sản xuất nông nghiệp, rau nhiễm các vi sinh vật gây bệnh có thể liên quan tới bao gồm sử dụng nước ao và nước sông để rửa rau, cách thức xử lý rau của người trồng rau và lưu trữ rau ở những nơi bị ô nhiễm.

Thông tin có sẵn về hàm lượng vi khuẩn trong nước rửa cũng như rau và sự ô nhiễm sản phẩm thực vật bởi mầm bệnh của con người là một thực tế đã biết. Ở Ấn Độ, rau được rửa hầu hết trong các vùng nước có sẵn, như sông hoặc ao

có sẵn ở khu vực lân cận nơi sản xuất. Sau nông dân, những người bán rau những nhân tố quan trọng góp phần vào sự phát tán các mầm bệnh từ nguồn

nước lên rau, các loại rau khác nhau được bày bán trên sạp hàng, tất cả rau trong sạp thường xuyên được tưới nước (để giữ cho chúng tươi trong mùa hè nóng và khô) với nguồn nước từ cùng một xô trong nhiều ngày mà không khử

trùng xô. Điều này có thể dẫn đến một lượng đáng kể vi sinh vật chỉ điểm như Coliform, Escherichia coli nhiễm lên rau tại các sạp hàng bán lẻ [50]. Từ các sạp hàng bán lẻ, rau được phân phối tới các cửa hàng bán đồ ăn sẵn có phục vụ

rau ăn sống đã làm tăng nguy cơ phát tán mầm bệnh Enterobacteriaceae lây truyền qua thực phẩm lên người. Không chỉ tại các nước đang phát triển mà tại đất nước phát triển như Hoa Kỳ, Gelting và Baloch đã báo cáo 2 vụ dịch bệnh tại Hoa Kỳ có liên quan trực tiếp đến việc tiêu thụ rau bị nhiễm mầm bệnh từ nước tưới. Trong lần đầu tiên, rau cải bó xôi đóng gói tươi từ một trang trại duy

nhất ở California được coi là nguồn gốc của vụ dịch E. coli O157: H7 năm 2006 gây ra hơn 200 ca bệnh và 5 người chết. Nước ngầm được sử dụng làm nước tưới và gây ô nhiễm tầng nước mặt được xác định là các yếu tố đóng góp liên quan đến vụ dịch này. Trong lần thứ hai, rau xà lách mỡ phục vụ trong các chuỗi nhà hàng được xác định là phương tiện truyền bệnh cho một đợt bùng phát E. coli O157: H7 khác vào năm 2006. Các mẫu từ điều tra môi trường

cũng cho thấy sự trùng khớp di truyền giữa chủng vi khuẩn là nguyên nhân bùng phát dịch và chủng vi khuẩn thu được từ hệ thống nước tưới [51]. Từ các nghiên cứu tại các nước đang phát triển và phát triển nói trên cho thấy sự lây

truyền vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae từ nguồn nước lên rau sống như là một hiện tượng tất yếu và điều đó cũng lý giải cho sự nhiễm khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống thu thập trên địa bàn Hà Nội với tỉ lệ cao chiếm 100%, khi tại Việt Nam vẫn còn các vùng thâm canh, sử dụng nguồn

nước tưới chưa qua kiểm soát chất lượng để trồng rau, và dễ dàng bắt gặp hình ảnh những người nông dân, người bán hàng rửa rau tại các ao hồ, kênh mương trước khi đưa đi tiêu thụ.

3.1.2. Đánh giá mật độ nhiễm Enterobacteriaceae theo loại hình

kinh doanh

Đánh giá tỉ lệ rau ăn sống nhiễm Enterobacteriaceae theo loại hình kinh

doanh (các chợ, siêu thị và quán ăn) cho thấy tỉ lệ nhiễm của nhóm Enterobacteriaceae lên men glucose và nhóm Enterobacteriaeae lên men lactose (oliform) là tương tự nhau với 100%, tỉ lệ nhiễm E. coli ở nhóm mẫu thu thập tại siêu thị thấp hơn với 57%. Các tính toán thống kê cho thấy mật độ hiện diên họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trung bình cao nhất tại

các mẫu thu thập ở chợ và thấp nhất là trên mẫu thu thập tại siêu thị (xem Hình 3.1). Thuật toán thống kê cho giá trị P> 0.05, nên sự khác biệt về tỉ lệ ô nhiễm Coliform và Enterobacteriaceae trên mẫu rau ăn sống đã thu thập tại 3 loại hình

kinh doanh nói trên là không có ý nghĩa thống kê. Sự không khác biệt về tỉ lệ nhiễm tại 3 loại hình kinh doanh có thể xuất phát từ nguồn cung cấp rau ăn sống. Tại Việt Nam hiện nay để truy xuất nguồn cung thực phẩm, đặc biệt là

rau ăn sống vẫn chưa có các biện pháp hiệu quả. Tuy nhiên tỉ lệ ô nhiễm E. coli có sự khác nhau mang ý nghĩa thống kê giữa các mẫu thu thập tại chợ, siêu thị

và quán với giá trị P<0.05. Trong đó phép thử định lượng cho thấy số lượng vi khuẩn Coliform, E. coli và Enterobacteriaceae tương ứng tính theo giá trị log dao động từ 3,95 đến 7,46 CFU/g, từ <1 đến 4,46 CFU/g, và từ 3,47 đến 7,47

CFU/g theo Bảng 3.1.

So sánh số lượng E. coli nhiễm trong rau ăn sống thu được trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi với các nghiên cứu trong nước cho thấy mật độ vi

khuẩn thấp hơn nghiên cứu của tác giả Ho Le Quynh Chau thực hiện tại Huế năm 2013-2014 với hàm lượng trung bình từ 5,47 đến 6,71 (log CFU/g) [37].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của tác giả Najafi cùng cộng sự thực hiện tại Iran từ năm 2010 đến 2011 (n=174), với mật độ Enterobacteriaceae trong mẫu salad trộn dao động từ 3 đến 8,3 (log CFU/g) và từ 3,1 đến 7 (log CFU/g) đối với rau lá trộn. Cũng trong nghiên cứu

của Najafi mật độ Coliform tổng số trong mẫu salad trộn dao động từ 3,9 đến 7,48 (log CFU/g) và từ 3,2 đến 7 (log CFU/g) đối với rau lá trộn [52]. Một nghiên cứu khác của Klapec và cộng sự thực hiện ở Phần Lan từ tháng 5 đến

tháng 9 năm 2015 cho thấy mật độ trung bình của Enterobacteriaceae (n=35) trên mẫu rau mua tại chợ dao động từ 2,33 đến 4,16 (log CFU/g), thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi [53]. Weldezgina và cộng sự với nghiên cứu thực

hiện tại Ethiopia vào năm 2016 trên các mẫu rau (n=120) ghi nhận Enterobacteriaceae hiện diện trong rau diếp với mật độ cao nhất là 6,54 (log

CFU/g) [54]. Các nghiên cứu khác nhau được thực hiện tại các nước khác nhau đều cho thấy sự khác nhau về mật độ vi nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau và khác với các kết quả của các tác giả khác được thực hiện trên địa

bàn Hà Nội dù được tiến hành cùng phương pháp được công bố bởi tổ chức tiêu chuẩn quốc tế (ISO). Sự khác biệt về kết quả của các nghiên cứu có thể bắt nguồn từ đối tượng, cỡ mẫu, đặc điểm địa lý, phương thức sản xuất và thời

điểm thu thập mẫu.

Tỉ lệ nhiễm Enterobacteriaceae

120%

100%

80%

Cửa hàng ăn

57%

60%

Chợ

Siêu thị

40%

20%

coliform

E. coli

Enterobacteriaceae

Hình 3.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau ăn sống

Bảng 3.1 Mật độ vi sinh vật log CFU/g theo loại hình kinh doanh

Mật độ vi sinh vật log CFU/g

Coliform Escherichia coli Enterobacteriaceae

Địa điểm thu thập Nhỏ nhất Lớn nhất Trung Bình Nhỏ nhất Lớn nhất Trung Bình Nhỏ nhất Lớn nhất Trung Bình mẫu

5 7,46 6,45 1,95 4,08 3,31 5 7,47 6,59

Quán ăn

Chợ 5,70 7,26 6,47 2,30 4,46 3,61 5,70 6,98 6,60

Siêu thị 3,95 7,18 6,15 <1 3,62 2,62 3,48 6,66 5,91

Theo qui định của bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thì số lượng vi khuẩn Coliform và Escherichia coli được phép có trong mẫu lần lượt là 100 CFU/g và 10 CFU/g [55]. Từ đó cho thấy, 100% mẫu đã thu thập tại Quán ăn,

chợ và Siêu thị không đạt yêu cầu về chỉ tiêu Coliform. 100% mẫu tại Quán ăn và chợ không đạt chỉ tiêu Escherichia coli, 57% mẫu tại Siêu thị không đạt yêu cầu cho chỉ tiêu này.

3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CEPHALOSPORIN VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYM β-LACTAMASE CỦA VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE

3.2.1. Đánh giá khả năng kháng kháng sinh cephalosporin

Chín mươi khuẩn lạc từ 90 mẫu được tiến hành tính kháng kháng sinh β- lactam trên các kháng sinh thuộc dòng cephalosporin. Kết quả vòng kháng của

chủng đối chứng E. coli ATCC để kiểm chứng chất lượng môi trường, nồng độ vi sinh đều cho kích thước vòng kháng phù hợp theo hướng dẫn của tổ chức

CLSI (xem Hình 3.2) [39]. Kết quả kiểm tra khoanh giấy kháng sinh cho thấy 49 chủng vi khuẩn kháng với cephalosporin thế hệ 1, 46 chủng kháng với cephalosprorin thế hệ 2 (trong đó 21 chủng kháng với cefuroxime và; 32 chủng kháng với cefoxitin, 7 chủng kháng đồng thời cefuroxime và cefoxitin); 24 chủng kháng với cephalosporin thế hệ 3, trong đó có 13 chủng kháng với 3 kháng sinh thuộc dòng cephalosporin thế hệ 3 (xem hình Hình 3.3, Hình 3.4).

A

4

2

5

1

6

3

Hình 3.2 Kháng sinh đồ trên chủng đối chiếu

(1) KZ, kích thước vòng kháng 23 mm (yêu cầu 21-27 mm) (2) FOX, kích thước vòng kháng 28 mm (yêu cầu 23-29 mm) (3) CXM, kích thước vòng kháng 25 mm (yêu cầu 20-26 mm) (4) CAZ, kích thước vòng kháng 26 mm (yêu cầu 25-32 mm) (5) CTX, kích thước vòng kháng 32 mm (yêu cầu 29-35 mm) (6) CRO, kích thước vòng kháng 34 mm (yêu cầu 29-35 mm)

(A) chủng E. coli ATCC 25922

B

4

2

5

3

1

6

Hình 3.2 Kháng sinh đồ trên chủng đối chiếu

(1) KZ, kích thước vòng kháng 6 mm, kháng (≤14 mm, kháng)

(B) Chủng Salmonella 572

(2) FOX, kích thước vòng kháng 25 mm, nhạy cảm (≥23 mm, nhạy cảm) (3) CXM, kích thước vòng kháng 9 mm, kháng (≤14 mm, kháng) (4) CAZ, kích thước vòng kháng 12 mm, kháng (≤17 mm, kháng) (5) CTX, kích thước vòng kháng 8 mm, kháng (≤22 mm, kháng) (6) CRO, kích thước vòng kháng 8 mm, kháng (≤19 mm, kháng)

A

B

3

2

1

3

1

Hình 3.3 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng với cephalosporin thế hệ 1, 2 (A) Chủng Enterobacteriaceae SR16 kháng với kháng sinh KZ, CXM (1) KZ, kích thước vòng kháng 6 mm, kháng (≤14 mm, kháng) (2) FOX, kích thước vòng kháng 25 mm, nhạy cảm (≥23 mm, nhạy cảm) (3) CXM, kích thước vòng kháng 9 mm, kháng (≤14 mm, kháng)

(1) KZ, kích thước vòng kháng 6 mm, kháng (≤14 mm, kháng) (2) FOX, kích thước vòng kháng 8 mm, kháng (≤14 mm, kháng (3) CXM, kích thước vòng kháng 20 mm, nhạy cảm (≥18 mm, nhạy cảm)

(B) Chủng Enterobacteriaceae 70/19 kháng với kháng sinh KZ, FOX.

2

1

3

2

1 B

A

(1) CAZ, kích thước vòng kháng 13 mm, kháng (≤17 mm, kháng) (2) CTX, kích thước vòng kháng 9 mm (≤22 mm, kháng) (3) CRO, kích thước vòng kháng 10 mm (≤19 mm, kháng)

Hình 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng Cephalosporin thế hệ 1, 2 và 3 (A) Chủng Enterobacteriaceae SR27 kháng với kháng sinh CTX, CRO (1) CAZ, kích thước vòng kháng 25 mm, nhạy cảm (≥21 mm, nhạy cảm) (2) CTX, kích thước vòng kháng 15 mm (≤22 mm, kháng) (3) CRO, kích thước vòng kháng 13 mm (≤19 mm, kháng) (B) Chủng Enterobacteriaceae 85/3 kháng với kháng sinh CTX, CRO và CAZ

Các chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae được phát hiện kháng nhiều nhất với cefazolin với 54%; tiếp đến là cefoxitin với 36%; cefuroxime, cefotaxime, và ceftriaxone với 23%, 26% và 27%; cuối cùng là ceftazidime với 14% theo Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Tỉ lệ kháng kháng sinh Cephalosporin của Enterobacteriaceae

Tên viết Số chủng Tỉ lệ Kháng sinh Nồng độ kháng kháng (%) tắt

Cephalosporin thế hệ 1

Cefazoline KZ 30 49 54%

Cephalosporin thế hệ 2

cefuroxime CXM 30 21 23%

cefoxitin FOX 30 32 36%

Cephalosporin thế hệ 3

ceftriaxone CRO 30 24 27%

cefotaxime CTX 30 23 26%

ceftazidime CAZ 30 13 14%

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự tương đồng với các nghiên cứu khác trên thế giới về sự xuất hiện của vi khuẩn Enterobacteriacea kháng kháng sinh cephalosporin. Nghiên cứu của Zeka và cộng sự thực hiện từ năm 2013 đến năm 2014 (n=310), các chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae thu được đều kháng với các kháng sinh cephalosporin thế hệ 2 (cefuroxime), cephalosporin

thế hệ 3 (cefotaxime, ceftazidime, ceftraexone) [56]. Hơn nữa, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về sự hiện diện của vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 đã cho thấy sự trùng hợp với nghiên cứu của Weldman và cộng sự thực hiện vào năm 2011 với 50 mẫu rau từ Thái Lan, Malaysia và Việt Nam nhập khẩu vào Hà Lan, các chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae từ mẫu rau thơm đều kháng với kháng sinh cefotaxime và

ceftazidime [57]. Điều này cho thấy sự xuất hiện của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae kháng kháng sinh cephalosporin trong các loại rau ăn sống ở Việt Nam đã được lưu hành từ nhiều năm trước đây nhưng chưa được nghiên cứu đánh giá bởi các tổ chức trong nước.

3.2.2. Đánh giá sự lưu hành vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh

enzym β-lactamase

Các vi khuẩn Enterobacteriaceae được phân lập trên môi trường Macconkey/Violet red Bile Glucose đã bổ sung kháng sinh cefotaxime nồng độ

100 µg/L (xem Hình 3.5) và tiến hành thử nghiệm khả năng sinh enzym β- lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase và carbapenemase song song cùng với chủng Salmonella 572 (Xem Hình 3.6). Kết quả cho thấy có 21 chủng vi khuẩn

Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL với kích thước vòng kháng CTL và CAL lớn hơn 5 mm so với vòng kháng CTX và CAZ, 7 chủng Enterobacteriaceae sinh enzym AmpC β-lactamase với kích thước vòng kháng CTC và CAC lớn

hơn 5 mm so với vòng kháng CTX và CAZ và 7 Enterobacteriaceae chủng sinh cả 2 enzym ESBL và β-lactamase AmpC (xem Hình 3.6, Hình 3.7 và Hình 3.8). 13/21 chủng Enterobacteriaceae này kháng với cả 3 kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 là ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime. Không có chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym carbapenemase được phát hiện trong nghiên cứu này.

A

B

Hình 3.5 Khuẩn lạc phân lập trên môi trường Macconkey

(A) Khuẩn lạc hồng có màng nhầy; (B) Khuẩn lạc hồng lõm

2

3

4

1

2

1

3

4 A

B

kích thước vòng kháng CTL lớn hơn 5 mm so với vòng kháng CTX

kích thước vòng kháng CAL lớn hơn 5 mm so với vòng kháng CAZ

(1) CTX, kích thước vòng k háng 11 mm (2) CTL, kích thước vòng kháng 31 mm (3) CAZ, kích thước vòng kháng 15 mm (4) CAL, kích thước vòng kháng 28 mm

Hình 3.6 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL (A) Chủng Enterobacteriaceae SR29 thu thập năm 2018

kích thước vòng kháng CTL lớn hơn 5 mm so với vòng kháng CTX

kích thước vòng kháng CAL lớn hơn 5 mm so với vòng kháng CAZ

(1) CTX, kích thước vòng kháng 8 mm (2) CTL, kích thước vòng kháng 31 mm (3) CAZ, kích thước vòng kháng 12 mm (4) CAL, kích thước vòng kháng 27 mm

(B) Chủng Salmonella 572

2

1

4

3

2

3

4

1 B

A

Hình 3.7 Chủng Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase AmpC

kích thước vòng kháng CTC lớn hơn 5mm so với vòng kháng CTX

kích thước vòng kháng CAC lớn hơn 3 mm so với vòng kháng CAZ

(1) CTX, kích thước vòng kháng 9 mm (2) CTC, kích thước vòng kháng 15 mm (3) CAZ, kích thước vòng kháng 13 mm (4) CAC, kích thước vòng kháng 16 mm

(A) Chủng Enterobacteriaceae 85/3 thu thập năm 2018

kích thước vòng kháng CTC lớn hơn 5 mm so với vòng kháng CTX

kích thước vòng kháng CAL lớn hơn 4 mm so với vòng kháng CAZ

(1) CTX, kích thước vòng kháng 9 mm (2) CTC, kích thước vòng kháng 14 mm (3) CAZ, kích thước vòng kháng 12 mm (4) CAC, kích thước vòng kháng 16 mm

(B) Chủng Salmonella 572

8

2

7

3

6

1

5

4

kích thước vòng kháng CTL lớn hơn 5mm so với vòng kháng CTX kích thước vòng kháng CAL lớn hơn 5 mm so với vòng kháng CAZ

kích thước vòng kháng CTC lớn hơn 5mm so với vòng kháng CTX

kích thước vòng kháng CAC lớn hơn 3 mm so với vòng kháng CAZ

(1) CTX, kích thước vòng kháng 9 mm (2) CTL, kích thước vòng kháng 27 mm (3) CAZ, kích thước vòng kháng 15 mm (4) CAL, kích thước vòng kháng 25 mm (5) CTX, kích thước vòng kháng 9 mm (6) CTC, kích thước vòng kháng 18 mm (7) CAZ, kích thước vòng kháng 15 mm (8) CAC, kích thước vòng kháng 18 mm

Hình 3.8 Chủng Enterobacteriaceae 109/4 sinh enzym ESBL và β-lactamase AmpC

Kết quả nghiên cứu cho thấy 21 chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh

enzym β-lactamase (ESBL& AmpC) đều được phân lập tại quán phục vụ đồ ăn có kèm rau ăn sống, chợ và siêu thị. Trong đó 14 chủng vi khuẩn sinh đồng thời 2 enzym ESBL & β-lactamase AmpC. 6 chủng Enterobacteriaceae thu thập tại

các quán ăn sinh đồng thời 2 enzym β-lactamase là enzym ESBL và enzym β- lactamase AmpC. 5 trong 11 chủng Enterobacteriaceae thu thập được tại chợ

trong 4 chủng sinh cả 2 enzym ESBL và β-lactamase AmpC. 3 Enterobacteriaceae thu thập được tại siêu sinh enzym ESBL và AmpC. Các chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL, AmpC β-lactamase

được phân lập từ các chợ và siêu thị trong các loại rau Mùi ta, Mùi tàu, Bạc Hà, thấy chủng Húng quế, Húng láng, và Ngổ, và không phát hiện

Enterobacteriaceae sinh β-lactamase trên rau diếp và xà lách. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mẫu rau trộn (hỗn hợp rau ăn sống) thu thập tại các quán ăn ở cả 5 quận đều có chứa vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase (ESBL và AmpC). Số lượng chủng vi khuẩn Enterobacteriacea sinh enzym β-

lactamase xuất hiện nhiều nhất trong các mẫu rau thu thập tại quận Nam Từ Liêm và không phát hiện chủng sinh enzym β-lactamase tại các mẫu rau thu thập tại siêu thị trên địa bàn quận Long Biên và Cầu Giấy thể hiện trong Bảng

3.3.

Bảng 3.3 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL và AmpC β-lactamase

STT

Loại rau ăn sống

Địa điểm thu thập

Vi khuẩn sinh enzym β-lactamase

Loại Hình Kinh Doanh

Vi khuẩn sinh enzym AmpC

Vi khuẩn sinh enzym ESBL

Vi khuẩn sinh enzym ESBL & AmpC

Quán ăn

Mùi tàu + mùi ta + húng quế Mùi ta

Siêu thị

Hoàng Mai

Mùi ta

Chợ

Húng láng

Mùi tàu + mùi ta + diếp cá

Quán ăn

Hà Đông

Chợ

Mùi tàu + mùi ta + húng quế Bạc hà

Siêu thị

Mùi tàu

Quán ăn

Long Biên

Chợ

Bạc hà + mùi ta + húng quế Mùi ta

Quán ăn

01 01 01

Mùi tàu + mùi ta + húng quế Húng quế

Rau ngổ

Cầu Giấy

Chợ

Mùi tàu

Mùi ta

Quán ăn

Mùi tàu + mùi ta + húng quế Bạc hà

Mùi tàu

Chợ

Nam Từ Liêm

Húng láng

Mùi ta

- 01

- - - 01

Siêu thị

Mùi tàu

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Zurflu thực hiện tại Thụy sĩ vào năm 2015 trên mẫu rau ăn sống nhập khẩu từ Việt Nam phát hiện ra các loài vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym ESBL (n=20) [58]. Không chỉ riêng ở Việt Nam, hiện nay các nghiên

cứu trên thế giới đều cho thấy sự lưu hành của vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase. Nghiên cứu của Hoek và cộng sự thực hiện năm 2015 tại Hà Lan cho thấy 63 mẫu rau (n=1216) nhiễm vi khuẩn

Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase [29]. Một nghiên cứu khác thực hiện tại Hàn Quốc bởi Kim và cộng sự cho thấy 10,1% các chủng Enterobacteriaceae thu thập sinh ESBL (n=189) [32]. Nghiên cứu của Said và

cộng sự thực hiện tại Tusinia năm 2015 cho thấy 8,9% mẫu rau thu thập tại Siêu thị nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase [59].

Một nghiên cứu được thực hiện bởi Miranda và cộng sự trên 211 bệnh nhân gặp vấn đề về đường tiêu hóa sau khi trở về Đức từ Ấn Độ và khu vực Đông Nam Á từ tháng 2 năm 2013 đến tháng 4 năm 2014 cho thấy sự xuất hiện

của vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase phổ rộng trong phân người bệnh. Tiêu chảy, đau bụng và buồn nôn là những triệu chứng chính của các bệnh nhân. Vi khuẩn sinh enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL) đã có mặt

ở 50,7% (107/211) trong số những khách du lịch quay về nhà tất cả các chủng vi khuẩn là E. coli ngoại trừ ba chủng vi khuẩn K. pneumoniae. Tỷ lệ bắt gặp

cao nhất đối với người trở về từ Ấn Độ là 72% và Đông Nam Á là 59%. Khách du lịch, đặc biệt là những người trở về từ Ấn Độ và Đông Nam Á, được xem là nhân tố tạo thành một nguồn lây lan tiềm năng của vi khuẩn Enterobacteriaceae

sinh enzym β-lactamase phổ rộng [60]. Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy có thể có sự hiện diện của vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase phổ rộng trong thực phẩm hoặc trong nguồn nước tại các nước Đông Nam Á nói chung và Việt Nam nói riêng.

Các nghiên cứu tại Việt Nam trên các bệnh nhân và người khỏe mạnh

cho thấy sự hiện diện về vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase trên cả 2 đối tượng này. Nghiên cứu của Cao và cộng sự thực hiện năm 2001 đã phát hiện 55/1309 chủng vi khuẩn thu thập từ bệnh nhân tại bệnh viện sinh

enzym β-lactamase [61]. Kết quả nghiên cứu của Bui và cộng sự vào năm 2015 và kết quả nghiên cứu của Hoang và cộng sự năm 2017 đều ghi nhận sự xuất hiện của các loài vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên người khỏe mạnh [62], [63]. Hơn nữa, nghiên cứu của Bui và cộng sự thực hiện từ năm 2014-2016 thực hiện

bằng phương pháp quét bề mặt cho thấy sự xuất hiện với tỉ lệ của Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase trên tay người và dụng cụ bếp là 2%, tại các bồn rửa là 14.9% và tại nhà vệ sinh là 34% [64]. Điều này cho thấy

Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase hiện diện khắp mọi nơi tại Việt Nam: từ người khỏe mạnh đến bệnh nhân, dụng cụ và nơi chế biến thực phẩm, và từ các nguồn thực phẩm mà con người tiêu thụ.

Hiện nay tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu xác định Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase trong môi trường và trong thực

phẩm, tuy nhiên trong thực phẩm lại chỉ tập trung ở các sản phẩm thịt và thủy sản mà chưa quan tâm đến sản phẩm tiêu thụ trực tiếp không qua chế biến như rau ăn sống – một nguồn nguy cơ mang mầm bệnh và có thể truyền các chủng

vi khuẩn mang gen kháng kháng sinh lên người. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỉ lệ Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase trong các mẫu rau ăn sống đã thu thập chiếm 23% là điều đáng lo ngại về nguy cơ có thể lan

truyền và phát tán mầm bệnh mang gen kháng kháng sinh lên người cũng như cộng đồng và môi trường do cơ chế trao đổi và các vật liệu chuyển gen của vi

khuẩn như. Do đó cần đưa ra các cảnh báo cho người tiêu dùng và nhà quản lý, để có các biện pháp kiểm soát phù hợp nguồn thực phẩm nói chung và rau ăn sống nói riêng từ nông trại tới bàn ăn.

3.3. ĐỊNH DANH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE SINH ENZYM β- LACTAMASE VÀ XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG KHÁNG SINH

3.3.1. Định danh vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-

lactamase

Hai mươi mốt chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-

lactamase được tiến hành định danh. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng đa kháng sinh và sinh enzym β-lactamase được xác định là vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter

hormaechei và Leclercia adecaboxylata với độ tương đồng 99.9% (xem Hình 3.9, Hình 3.10).

Hình 3.9 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase

Hình 3.10 Định danh Leclercia adecaboxylata bằng kỹ thuật MALDI-TOF

Kết quả nghiên cứu đã ghi nhận sự hiện diện của các loài vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng đa kháng sinh và sinh enzym β-lactamase, trong đó

chủng Escherichia coli (E. coli) chiếm ưu thế với 13 chủng, 6 chủng Klebsiella

pneumoniae (K. pneumoniae), 1 chủng Enterobacter hormaechei (E. hormaechei) và 1 chủng Leclercia adecarboxylata (L. adecarboxylata) được thể hiện trong Bảng 3.4.

Bảng 3.4 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase

ESBL

STT Loài Vi khuẩn ESBL AmpC Mã mẫu Địa điểm thu thập & AmpC

+ + E. coli +

E. coli +

E. coli + Nam Từ Liêm E. coli +

E. coli +

K. pneumoniae + + +

+ E. coli + +

E. coli +

Cầu Giấy E. coli +

K. pneumoniae + + +

E. coli + + +

E. coli + + + Hà Đông K. pneumoniae +

K. pneumoniae + + +

E. coli + + +

Hoàng Mai 1. R19 2. R20 3. R17 4. R18 5. SR27 6. 70/12 7. R24 8. R22 9. R27 10. R25 11. 109/4 12. SR29 13. 70/19 14. R14 15. 109/3 16. SR13 17. 85/3 18. SR16 + + +

+ + + 19. R5

K. pneumoniae L. adecaboxylata E. coli + + + Long biên 20. R8 21. 85/5 E. hormaechei + + +

Kết quả của nghiên cứu có sự tương đồng với các nghiên cứu khác trên

thế giới với sự hiện diện phổ biến của 2 loài vi khuẩn E. coli và K. pneumoniae

sinh enzym β-lactamase trong rau ăn sống [56]. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với nghiên cứu của Zurflu thực hiện tại Thụy sĩ vào năm 2015 trên mẫu rau ăn sống nhập khẩu từ Việt Nam phát hiện ra vi khuẩn E. coli sinh enzym ESBL (n=20) [58]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi đã phát hiện ra 2

loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceaea sinh enzym ESBL β- lactamase so với các nghiên cứu khác đã công bố trong đối tượng rau ăn sống là L. adecaboxylata và E. hormaechei. L. adecaboxylata và E. hormaechei đã

được mô tả như một mầm bệnh mới nổi ở người với khả năng gây nhiễm trùng nặng ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Spiegellhauer và cộng sự (2019) đã báo cáo về sự hiện diện của L. adecarboxylata trên một bệnh nhân nhập viện để

được ghép phổi bị tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu và viêm phổi do L. adecarboxylata [65]. Enterobacter hormaechei là một mầm bệnh mới nổi quan

trọng và là thành viên chủ chốt của phức hợp Enterobacter cloacae rất đa dạng. Các chủng E. hormaechei có thể tồn tại và lây lan trong môi trường bệnh viện, và thường biểu hiện kháng với nhiều loại kháng sinh quan trọng quá trình điều

trị. Nghiên cứu của Monahan (2019) đã ghi nhận các chủng vi khuẩn E. hormaechei kháng đa kháng sinh và kháng các kháng sinh mạnh trong môi trường bệnh viện bằng kỹ thuật giải trình tự gen [66].

3.3.2 Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase

Các chủng vi khuẩn gồm E. coli, K. pneumoniae, E. hormaechei và L. adecaboxylata đã phân lập được tiến hành phản ứng khuếch đại gen, khuếch đại đoạn gen đích. 7 cặp mồi được sử dụng để phát hiện các gen mã hóa enzym

β-lactamase: bla TEM, bla PSE, bla DHA, bla OXA, bla CMY, bla SHV, bla CTX-M. Kết quả khuếch đại gen cho thấy sự xuất hiện của 3 gen đại diện cho

nhóm gen mã hóa enzym ESBL (bla TEM, bla OXA, bla CTX-M) và 02 gen đại diện cho nhóm β-lactamase AmpC (bla DHA, bla CMY) với kích thước của đoạn gen phù hợp được quan sát trên ảnh chạy gel điện di (xem Hình 3.11).

Các sản phẩm khuếch đại gen đại diện cho 1 gen (gen bla TEM và bla CMY, chủng Escherichia coli SR13; gen bla OXA, chủng E. hormaechei 85/5; gen bla CTX-M, chủng K. pneumoniae SR16; gen bla DHA, chủng L.

adecaboxylata R5) được tiến hành giải trình tự và so sánh với dữ liệu của ngân

TEM OXA CTX-M M DHA CMY B

926 bp 856 bp

661 bp 590 bp

500 bp

hàng gen (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để xác định sự chính xác của sản phẩm khuếch đại gen.

TEM: bla TEM (661 bp), Chủng Enterobacteriacea SR13 OXA: bla OXA (590 bp), Chủng Enterobacteriacea 85/5 CTX-M: bla CTX-M (585 bp), Chủng Enterobacteriacea SR16 M: Thang ADN 100 bp DHA: bla DHA (926 bp), Chủng Enterobacteriacea R5 CMY: bla CMY (856 bp), Chủng Enterobacteriacea SR13 B: Thành phần phản ứng PCR không bao gồm ADN vi khuẩn

Hình 3.11 Sản phẩm khuếch đại gen được sử dụng để giải trình tự

Trình tự của các đoạn gen (được thể hiện trong phụ lục 2) được so sánh với dữ liệu ngân hàng gen, cho thấy mức độ tương đồng từ 99.55% tới 100%; bla TEM mức độ tương đồng đạt 99.55%, bla CTX mức độ tương đồng đạt

99.83%, bla OXA, bla DHA và bla CMY mức độ tương đồng 100% (xem Hình 3.12, hình 3.13, hình 3.14, hình 3.15, hình 3.16)

Hình 3.12 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla TEM với dữ liệu ngân hàng gen

Hình 3.13 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla OXA với dữ liệu

ngân hàng gen

Hình 3.14 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CTX với dữ liệu

ngân hàng gen

Hình 3.15 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla DHA với dữ liệu

ngân hàng gen

Hình 3.16 Kết quả so sánh sản phẩm khuếch đại gen bla CMY với dữ liệu ngân hàng gen

Các chủng Enterobacteriacea sau khi giải trình tự, xác định sản phẩm khuếch đại gen đúng chính xác là gen mục tiêu cần tìm sẽ được sử dụng làm đối chứng dương cho quá trình chạy khuếch đại gen trên 21 chủng. Chủng SR13

được sử dụng làm đối chứng dương cho quá trình khuếch đại gen bla TEM và CMY, chủng SR16 được sử dụng làm đối chứng dương cho quá trình khuếch đại gen bla CTX-M, chủng 85/5 được sử dụng làm đối chứng dương cho quá trình khuếch đại gen bla OXA, chủng R5 được sử dụng làm đối chứng dương cho quá trình khuếch đại gen DHA. Quá trình khuếch đại gen cho thấy 15/21

chủng mang các gen thuộc 5 gen bla TEM, bla OXA, bla CTX-M, bla DHA và bla CMY.

Kết quả cho thấy 15/21 chủng Enterobacteriacea biểu hiện kiểu hình sinh enzym ESBL mang gen CTX-M và TEM. 5/14 chủng biểu hiện kiểu hình sinh enzym β-lactamase AmpC mang gen bla DHA và bla CMY, là 2 gen phổ biến trong các gen mã hóa enzym β-lactamase AmpC. Mười chủng Enterobacteriacea

mang gen bla TEM, 3 chủng Enterobacteriacea mang gen bla DHA, 2 chủng Enterobacteriacea mang gen bla CMY-2, 1 chủng Enterobacteriacea mang gen bla OXA, 13 chủng Enterobacteriacea mang gen bla CTX-M, không có chủng Enterobacteriacea nào mang gen bla SHV và bla PSE (xem Hình 3.17, Hình 3.18,

SR13 SR16 SR27 SR29 R5 R8 R19 R24 R25 M 70/12 70/19 85/3 85/5 109/3 109/4 B

Hình 3.19, Hình 3.20, Hình 3.21).

661 bp 500 bp

Hình 3.17 Đoạn khuếch đại gen bla TEM (661 bp), M: (Thang ADN) 100 bp

B: Thành phần phản ứng PCR không bao gồm ADN vi khuẩn

M 70/19 85/3 85/5 B

590 bp 500 bp

Hình 3.18 Đoạn khuếch đại gen bla OXA (590 bp), M: (Thang ADN) 100 bp B: Thành phần phản ứng PCR không bao gồm ADN vi khuẩn

SR16 SR13 SR27 SR29 R5 R8 R19 R24 R25 M 70/12 70/19 85/3 85/5 109/3 109/4 B

585 bp 500 bp

R5 R8 R19 R24 R25 M 70/12 70/19 85/3 85/5 109/3 B

Hình 3.19 Đoạn khuếch đại gen bla CTX-M (585 bp), M: (Thang ADN) 100 bp B: Thành phần phản ứng PCR không bao gồm ADN vi khuẩn

926 bp 500 bp

Hình 3.20 Đoạn khuếch đại gen bla DHA (926 bp), M: (Thang ADN) 100 bp B: Thành phần phản ứng PCR không bao gồm ADN vi khuẩn SR13 SR16 SR27SR29 R5 R8 R19 R24 R25M 70/12 70/1985/3 B

856 bp

500 bp

Hình 3.21 Đoạn khuếch đại gen bla CMY (856 bp), M: (Thang ADN) 100 bp B: Thành phần phản ứng PCR không bao gồm ADN vi khuẩn

Kết quả nghiên cứu ghi nhận được 6 chủng vi khuẩn Escherichia coli, 2 chủng Klebsiella pneumoniae, 1 chủng Enterobacter hormaechei, 01 chủng L. adecaboxylata mang gen bla TEM; 01 chủng E. hormaechei mang gen bla OXA; 6 chủng vi khuẩn Escherichia coli, 5 chủng Klebsiella pneumoniae, 1

chủng Enterobacter hormaechei, 01 chủng L. adecaboxylata mang gen bla CTX-M; 2 chủng K. pneumoniae và 1 chủng L. adecaboxylata mang gen bla DHA; 2 chủng vi khuẩn E. coli mang gen bla CMY thể hiện trên Bảng 3.5. Với

15 chủng Enterobacteriaceae đã phát hiện các kiểu gen mã hóa enzym β- lactamase cho thấy kết quả so sánh giữa kiểu gen mã hóa enzym và kiểu hình kháng kháng sinh cho thấy bla CTX-M và TEM hiện diện phổ biến trên các

chủng sinh enzym β-lactamase đã phân lập.

Bảng 3.5 Vi khuẩn Enterobacteriaceae mang gen kháng kháng sinh

Biểu hiện

Mã Biểu hiện kiểu hình ESBL STT Loài Vi khuẩn kiểu hình AmpC Mẫu

TEM OXA CTX-M DHA CMY

1 + + R19 E. coli

2 + + SR27 E. coli

3 + + 70/12 K. pneumoniae

4 + + R24 E. coli

5 + + R25 K. pneumoniae

6 + + 109/4 K. pneumoniae

7 + SR29 E. coli

8 + + 70/19 E. coli

9 + + 109/3 K. pneumoniae

10 + + SR13 E. coli

11 + 85/3 E. coli

12 + SR16 K. pneumoniae

13 + + + R5 L. adecaboxylata

14 + + R8 E. coli

15 + + + 85/5 E. hormaechei

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã ghi nhận sự xuất hiện của các

chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae mang gen bla TEM mã hóa enzym β-

lactamase, tương đồng với công bố của Kim và cộng sự trong nghiên cứu thực

hiện năm 2015 trên rau [32]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự phổ

biến của gen bla CTX-M trong các chủng đã nghiên cứu qua đó cho thấy sự

không có sự khác biệt về kết quả nghiên cứu với tác giả Zurfluh và cộng sự

thực hiện trên mẫu rau Việt Nam nhập khẩu vào Thụy Sĩ. Zurfluh đã ghi nhận

sự xuất hiện của các chủng Enterobacteriaceae trong rau ăn sống mang các gen

CTXM-15, CTXM-55, CTXM-14, CTXM-65 và SHV-2 [58]. Điều đặc biệt

của nghiên cứu của chúng tôi và nghiên cứu của Hoang và cộng sự trên người

khỏe mạnh tại Thành phố Hồ Chí Minh, cũng như nghiên cứu của Bui trên

người khỏe mạnh tại Hà Nội, đều cho thấy sự xuất hiện của chủng vi khuẩn E.

coli mang gen bla TEM mã hóa enzym β-lactamase trong cả rau ăn sống và trên

người lớn khỏe mạnh [61, 62]. Từ đây một giả thiết về sự lan truyền vi khuẩn

Enterobaceriaceae sinh enzym β-lactamase từ rau ăn sống lên người ở Việt

Nam và là tiền đề cho một nghiên cứu sâu hơn về nguy cơ nhiễm các vi khuẩn

Enterobacteriacea mang gen kháng kháng sinh khi tiêu thụ các thực phẩm

mang mầm bệnh chứa gen kháng kháng sinh, giải đáp cho sự phát tán và sự gia

tăng tính kháng kháng sinh trong người lành cũng như người mang bệnh tại

Việt Nam.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Tỉ lệ Enterobacteriaceae lưu hành trong rau ăn sống tại một số quận nội thành Hà Nội là 100% (n=90). Trong đó 100% mẫu rau nhiễm Coliform và

Enterobacteriaceae, 86% nhiễm E. coli.

Tỉ lệ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae kháng lại các kháng sinh cephalosporin thế hệ 1, 2, 3 với tỉ lệ lần lượt: cefazolin là 54%, tiếp đến là

cefoxitin với 36%, ceftriaxone và cefotaxime với 26 và 27%, cefuroxime với 23%, cuối cùng là ceftazidime với 14%.

Xác định 21 chủng (23%) sinh eznyme β-lactamase, trong đó 21 chủng sinh enzym β-lactamase phổ rộng, 14 chủng sinh enzym β-lactamase AmpC.

Định danh được 4 loài vi khuẩn sinh enzym β-lactamase trong rau sống là Escherichia coli (13 chủng), Klebsiella pneumoniae (6 chủng), Enterobacter hormaechei (1 chủng) và Leclercia adecaboxylata (1 chủng).

Phát hiện gen mã hóa enzym β-lactamase

trong các chủng Enterobacteriaceae là bla TEM (10 chủng), bla OXA (1 chủng), bla CTX-M (13 chủng), bla DHA (3 chủng), bla CMY (2 chủng).

4.2. KIẾN NGHỊ

Cần có các biện pháp kiểm soát an toàn thực phẩm từ quá trình trồng trọt tới thị trường tiêu thụ và tới người tiêu dùng. Kiểm soát chất lượng nguồn nước tưới cho tới qui trình chế biến thực phẩm tại các quán ăn.

Tiến hành mở rộng phạm vi nghiên cứu tại các quận ngoại thành là vùng tập trung trồng rau ăn sống để ghi nhận thực trạng nhiễm Enterobacteriaceae

sinh enzym β-lactamase trong rau ăn sống.

Mở rộng nghiên cứu về vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng kháng sinh và sinh enzym β-lactamase trong nguồn nước được sử dụng tưới rau trong quá

trình trồng trọt, rau ăn sống, người khỏe mạnh tiêu thụ rau ăn sống, người bệnh để xác minh mối liên hệ về di truyền và mối liên hệ giữa môi trường, chuỗi cung cấp thực phẩm và con người.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Jenkins Claire S. B., Rob J. Rentenaar, Luce Landraud, 2017, Enterobacteriaceae in Infectious Diseases, Edited by J. Cohen, Elsevier

Limited, pp. 1556–1578.

2. Bush K., 2010, Alarming β-lactamase-mediated resistance in multidrug-

resistant Enterobacteriaceae, Current Opinion in Microbiology, 13(5), pp. 558–564.

3. Ventola C. L. , 2015, The antibiotic resistance crisis: causes and threats,

Pharmacy & Therapeutics Journal, 40(4), pp. 277–83.

4. GARP Vietnam Nation Working Group, 2010, Situation Analysis

Use Resistance and in

Antibiotic Vietnam. https://cddep.org/publications/situation_analysis_antibiotic_use_and_res istance_vietnam/.

5. World Bank, 2017, Vietnam food safety risks management : challenges and opportunities : Quản lý nguy cơ an toàn thực phẩm ở Việt Nam : (Vietnamese). những thách thức hội cơ và

http://documents.worldbank.org/curated/en/777651490723110666/Qu% E1%BA%A3n-l%C3%BD-nguy-c%C6%A1-an-to%C3%A0n-

th%E1%BB%B1c-ph%E1%BA%A9m-%E1%BB%9F- Vi%E1%BB%87t-Nam-nh%E1%BB%AFng-th%C3%A1ch- th%E1%BB%A9c-v%C3%A0-c%C6%A1-h%E1%BB%99i

6. Baylis C., M. Uyttendaele, H. Joosten, A. Davies, and H. J. Heinz, 2011, The Enterobacteriaceae and their significance to the food industry. https://ilsi.eu/wp-content/uploads/sites/3/2016/06/EP-

Enterobacteriaceae.pdf

7. Karen Carroll C. J. A. S., Jeffery A. Hobden, Steve Miller, Stephen A.

Morse, Timothy A. Mietzner, Barbara Detrick, Thomas G. Mitchel, James H. McKerrow, 2016, Enteric Gram-Negative Rods in Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical (Enterobacteriaceae)

Microbiology, 27th ed., Edited by Carroll Karen C. J. A. S, Jeffery A.

Hobden, Steve Miller, Stephen A. Morse, Timothy A. Mietzner, Barbara Detrick, Thomas G. Mitchel, James H. McKerrow, McGraw-Hill Education, pp. 221–244.

8. Baylis C. L., 2006, Enterobacteriaceae in Food spoilage microorganisms

Edited by C. de W. Blackburn, pp 624-667.

9. Matsuura H. and S. Sugiyama, 2018, Sepsis and Leclercia adecarboxylata, An International Journal of Medicine, 111(10), pp. 733- 734.

10. Oliveira K. de Sousa, L.A. de Lima, N.B. Cobacho, 2016, Mechanism of

Antibacterial Resistance: Shedding Some Light on These obscure Processes in Antibiotic Resistance: Mechanisms and New Antimicrobial Approaches, 1st ed. editted by K. and M. R. Kateryna, Elsevier Inc., pp.

19–35.

11. World Health Organization, 2014, Resistance to Antibacterial drugs in

Antimicrobial Resistance: Global Report on Surveillance, pp. 1-257. https://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/

12. Craig W. A. and D. R. A., 2015, Cephalosporins in Mandell, Douglas,

and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases 8th ed. edited by John E. Bennett, Raphael Dolin and Martin J. Blaser, Elsevier Inc., pp. 278–292.

13. Doi Y. and H. F. Chambers, 2015, Other β-Lactam Antibiotics in Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious

Diseases 8th ed. edited by John E. Bennett, Raphael Dolin and Martin J. Blaser, Elsevier Inc., pp. 293–297.

14. Holmes A. H., Luke S. P. Moore, Arnfinn Sundsfjord, Martin Steinbakk,

Sadie Regmi, Abhilasha Karkey, Philippe J Guerin, Laura J. V. Piddock, 2016, Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial

resistance, Lancet, 387(10014), pp. 176–187.

15.

Etebu E. and I. Arikekpar, 2016, Antibiotics: Classification and mechanisms of action with emphasis on molecular perspectives,

International Journal of Applied Microbiology Biotechnology Research, 96(2), pp. 90–101.

16. Ricke Steven C. and Juliany Rivera Calo, 2015, Antibiotic Resistance in Pathogenic Salmonella in Antimicrobial Resistance and Food Safety

edited by Chin-Yi Chen , Xianghe Yan, C. R. Jackson, Elsevier Inc, 2015, pp. 37–53.

17. Seiffert S. N., M. Hilty, V. Perreten, and A. Endimiani, 2013, Extended- spectrum cephalosporin-resistant gram-negative organisms in livestock: An emerging problem for human health?, Drug Resistance Updates,

16(1–2), pp. 22–45.

18. Odigie Iyonawan Elvis, Bolaji David Akinbo, Adedeji David Atere, Nosakhare Lawrence Idemudia, A. Asuquo, 2013, Antimicrobial

Susceptibility Of Some Members Of Enterobacteriaceae Isolated From Salad Vegetables In Calabar, Journal of Chemical Information and

Modeling, 53(9), pp. 1689–1699.

19. Kawamura K., N. Nagano, M. Suzuki, J. Wachino, K. Kimura, and Y. Arakawa, 2017, ESBL-producing Escherichia coli and Its Rapid Rise

among Healthy People, Food Safety, 5(4), pp. 122–150.

20. Doi Y. and H. F. Chambers, 2015, Penicillins and β-Lactamase Inhibitors in Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious

Diseases 8th ed. edited by John E. Bennett, Raphael Dolin and Martin J. Blaser, Elsevier Inc., pp. 263–277.

21. Urumova V., 2015, Extended spectrum beta lactamase producing animal Enterobacteriaceae isolates as potential risk to public health - Review, Revue de Médecine Vétérinaire, 166 (7–8), pp. 192–207.

22. Opal S. M. and A. Pop-Vicas, 2015, Molecular Mechanisms of Antibiotic Resistance in Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice

of Infectious Diseases 8th ed. edited by John E. Bennett, Raphael Dolin and Martin J. Blaser, Elsevier Inc. pp. 235–251.

23. Shaikh S. , J. Fatima, S. Shakil, S. M. D. Rizvi, and M. A. Kamal, 2015,

Antibiotic resistance and extended spectrum beta-lactamases: Types, epidemiology and treatment, Saudi Journal of Biological Sciences, 22(1), pp. 90–101.

24. Jacoby G. A., 2009, AmpC Β-Lactamases, Clinical Microbiology

Reviews, 22(1), pp. 161–182.

25. Ryan K. J., 2018, Enterobacteriaceae in Sherris Medical Microbiology

7th ed., McGraw-Hill Education, pp. 613–644.

26. Nyenje M. E. , C. E. Odjadjare, N. F. Tanih, E. Green, and R. N. Ndip, 2012, Foodborne pathogens recovered from ready-to-eat foods from

International implications,

roadside cafeterias and retail outlets in alice, eastern cape province, South Africa: Public health Journal of Environmental Research and Public Health, 9 (8), pp. 2608–2619.

27. Food and Agriculture Organization of United Nation, 2013, Part 3: Feeding the world in FAO Statistical Year Book 2013 World Food and

Agriculture, pp. 138.

28. Falomir M., D. Gozalbo, and H. Rico, 2010, Coliform bacteria in fresh vegetables: from cultivated lands to consumers, Current Research

Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, pp. 1175–1181.

29. Hoek van A. H. A. M. , C. Veenman, W. M. van Overbeek, G. Lynch, A. M. de Roda Husman, and H. Blaak, 2015, Prevalence and characterization of ESBL- and AmpC-producing Enterobacteriaceae on

retail vegetables,” International Journal of Food Microbiology, 204, pp. 1–8.

30. Denis N., H. Zhang, A. Leroux, R. Trudel, and H. Bietlot, 2016,

Prevalence and trends of bacterial contamination in fresh fruits and vegetables sold at retail in Canada, Elsevier Ltd, pp. 67.

31. Łaniewska-Trokenheim Łucja, Marcin Sobota, Iwona Warmińska- the family Radyko, 2006, Antibiotic Resistance of bacteria of Enterobacteriaceae isolated from vegetables - short report, Polish

Journal of Food Nutrition Sciences, 4, pp. 427–431.

32. Kim H. S., J. W. Chon, Y. J. Kim, D. H. Kim, M. sang Kim, and K. H. Seo, 2015, Prevalence and characterization of extended-spectrum-β- lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in

ready-to-eat vegetables, International Journal of Food Microbiology, 207, pp. 83–86.

33. Rolain Jean-Marc, 2017, First detection of Klebsiella pneumoniae producing OXA-48 in fresh vegetables from Béjaiia city, Algeria (2010), Resistance, Journal Antimicrobial Global of

http://dx.doi.org/10.1016/j.jgar.2017.02.006.

34. Zurfluh K., L. Poirel, P. Nordmann, J. Klumpp, and R. Stephan, 2015, variicola producing OXA-181 First detection of Klebsiella

carbapenemase in fresh vegetable imported from Asia to Switzerland, Antimicrobial Resistance & Infection Control, 4(1), pp. 1–3.

35. Nguyễn Thị Thu Hà, Dương Minh Viễn, Nguyễn Hoàng Anh, 2013, Khảo sát nguy cơ nhiễm coliforms, Salmonella, Shigella và E. coli trên rau ở vùng trồng rau chuyên canh và biện pháp cải thiện, Tạp chí Khoa học

Trường Đại học Cần Thơ, 25, tr. 98–108.

36. Lương Đức Phẩm, 2001, Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm,

Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.

37. Chau Ho Le Quynh, Ho Trung Thong, Nguyen Van Chao, Pham Hoang Son Hung, Vu Van Hai, Le Van An, Ayako Fujieda, Tanaka Ueru, Miki

Akamatsu, 2014, Microbial and Parasitic Contamination on Fresh Vegetables Sold in Traditional Markets in Hue City, Vietnam, Journal of Food and Nutrition Research, 2(12), pp. 959–964.

38. Ta Y. T., T. T. Nguyen, P. B. To, D. X. Pham, Hao T. H. Le, G. N. Thi, W. Q. Alali, I. Walls, M. Doyle, 2014, Quantification, serovars, and

antibiotic resistance of Salmonella isolated from retail raw chicken meat in Vietnam,” Journal of Food Protection, 77(1), pp. 57–66.

39. International Standard Organisation, 2017, ISO 21528-2:2017

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique.

40. Bộ Khoa học và Công nghệ, 2008, TCVN 7429-2:2008. Vi sinh vật trong

thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza – Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44oC sử dụng 5-Bromo-4-clo-3-indoly β-glucuronid.

41. Bộ Khoa Học và Công nghệ, 2007, TCVN 6848:2007. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp định lượng coliform – Kỹ

thuật đếm khuẩn lạc.

42. World Health Organization, 2010, Susceptibility testing of

Enterobacteriaceae using disk diffusion.

43. Clinical and Laboratory Standard Institute, 2018, Performance Standards

for Antimicrobial Susceptibility Testing.

44. University of Denmark. Technical, 2018, Isolation of ESBL-, AmpC- and carbapenemase-producing E. coli from fresh meat, https://www.eurl- ar.eu/CustomerData/Files/Folders/21-protocols/397_esbl-ampc-

cpeprotocol-version-meat-v6-16-02-18.pdf

45. Skov R., G. Skov, 2012, European Committee on Antimicrobial

Susceptibility Testing guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and / or epidemiological importance.

46. Biomerieux, Workflow User Manual.

47. Li R., J. Lai, Y. Wang, S. Liu, Y. Li, K. Liu, J. Shen, C. Wu, 2013, Prevalence and characterization of Salmonella species isolated from pigs,

ducks and chickens in Sichuan Province, China, International Journal of Food Microbiology, 163(1), pp. 14–18.

48. Ljevaković-Musladin I., M. Lakić, and L. Kozačinski, 2019,

Microbiological Quality Assessment of Ready-to-eat Vegetables in Dubrovnik-Neretva County, Croatia, Universal Journal of Agricultural

Research, 7(1). pp. 1–6.

49. Al-Kharousi Zahra, N. Guizani, A. M. Al-Sadi, I. M. Al-Bulushi, and B. Shaharoona, 2016, Hiding in Fresh Fruits and Vegetables: Opportunistic Pathogens May Cross Geographical Barriers, International Journal of

Microbiology, pp.1-14.

50. Mritunjay S. K. and V. Kumar., 2015, Fresh Farm Produce as a Source of Pathogens: a Review, Research Journal of Environmental Toxicology, 9(2), pp. 59–70.

51. Akinde Sunday B., A. A. Sunday, Folasade M. Adeyemi, Iyabobola B.

Fakayode, Odunola O. Oluwajide, Adetoun A. Adebunmi, Julius K. Oloke, Clement O. Adebooye, 2016, Microbes in irrigation water and fresh vegetables: Potential pathogenic bacteria assessment and

implications for food safety, Applied Biosafety, 21(2), pp. 89–97.

52. Najafi M. B., M. Bahreini, 2012, Microbiological Quality of Mixed

Fresh-Cut Vegetable Salads and Mixed Ready - to -Eat Fresh Herbs in Mashhad , Iran, International Conference on Nutrition and Food Science, 39, pp. 62–66.

53. Kłapeć T., A. Cholewa, G. Cholewa, J. Dutkiewicz, and A. Wójcik-Fatla, their 2016, Microbiological characterization of vegetables and rhizosphere soil in Eastern Poland, Annuals of Agricultural and

Environmental Medicine, 23(4), pp. 559–565.

54. Weldezgina D., D. Muleta, 2016, Bacteriological Contaminants of Some

Fresh Vegetables Irrigated with Awetu River in Jimma Town, Southwestern Ethiopia, Hindawi Publishing Corporation Advances in Biology, pp. 1–11.

55. Bộ Nông nghiệp và Phát triển NôngThôn, 2007, Phụ lục 1-9: Quyết định số 106 /2007/QĐ-BNN ngày 28 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

56. Zekar F. M. Sophie A. Granier, Muriel Marault , Lydia Yaici, Benoit Gassilloud, Charles Manceau, Abdelaziz Touati, Yves Milleman, 2017,

From farms to markets: Gram-negative bacteria resistant to third- generation cephalosporins in fruits and vegetables in a region of North Africa, Frontiers in Microbiology, 8, pp. 1–11.

57. Veldman K. , A. Kant, C. Dierikx, A. van Essen-Zandbergen, B. Wit, D.

resistant to

third-generation Mevius, 2014, Enterobacteriaceae cephalosporins and quinolones in fresh culinary herbs imported from Southeast Asia, International Journal of Food Microbiology, 177, pp.

72–77.

58. Zurfluh K. , M. Nüesch-Inderbinen, M. Morach, A. Z. Berner, H. Hächler,

2015,

imported from

Extended-spectrum-β-lactamase-producing Stephan, R. Enterobacteriaceae the isolated from vegetables Dominican Republic, India, Thailand, and Vietnam, Applied and

Environmental Microbiology, 81(9), pp. 3115–3120.

59. Said L. Ben, AhlemJouini, NaouelKlibi, Raoudha Dziri, Carla Andrea

Alonso, Abdellatif Boudabous, Karim Ben Slama, Carmen Torres, 2015, Detection of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae in vegetables, soil and water of the farm environment

in Tunisia, International Journal of Food Microbiology, 203, pp. 86–92.

60. Miranda I. Barreto, Ralf Ignatius, Roland Pfu¨ller, Barbara Friedrich- Ja¨nicke, Florian Steiner, Matthias Paland, Sebastian Dieckmann,

Katharina Schaufle, Lothar H. Wieler, Sebastian Guenther, Frank P. rate of ESBL-producing Mockenhaupt, 2016, High carriage

Enterobacteriaceae at presentation and follow-up among travellers with gastrointestinal complaints returning from India and Southeast Asia, Journal of Travel Medicine, 23(2), p.1-7.

61. Cao V., Lambert T, Nhu DQ, Loan HK, Hoang NK, Arlet G, Courvalin P., 2002, Distribution of extended-spectrum β-lactamases in clinical isolates of Enterobacteriaceae in Vietnam, Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 46(12), pp. 3739–3743.

62. Bui T. M. H., Itaru Hirai, Shuhei Ueda, Thi Kim Ngan Bui, Kouta

Hamamoto, Takehiko Toyosato, Danh Tuyen Le, Yoshimasa Yamamoto, 2015, Carriage of Escherichia coli producing CTX-M-type extended- spectrum β-lactamase in healthy Vietnamese individuals, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 59(10), pp. 6611–6614.

63. Hoang P. H., Sharda Prasad Awasthi, Phuc Do Nguyen, Ngan Ly Hoang Nguyen, Dao Thi Anh Nguyen, Ninh Hoang Le, Chinh Van Dang, Atsushi Hinenoya, and Shinji Yamasaki, 2017, Antimicrobial resistance

profiles and molecular characterization of Escherichia coli strains isolated from healthy adults in Ho Chi Minh City, Vietnam, The Journal of

Veterinary Medical Science, 79(3), pp. 479–485.

64. National Institute of Nutrition, 2016, AMR in community in Viet Nam: Situation and Pilot solutions Project for “Determining the Outbreak

Mechanisms and Development of a Surveillance Model for Multi-Drug Resistant Bacteria".

65. Spiegelhauer M. R., P. F. Andersen, T. H. Frandsen, R. L. M. Nordestgaard, and L. P. Andersen, 2019, Leclercia adecarboxylata: a case report and literature review of 74 cases demonstrating its pathogenicity

in immunocompromised patients, Infectious Diseases, 51(3), pp. 179- 188.

66. Monahan L. G. , M. Z. Demaere, M. L. Cummins, S. P. Djordjevic, P.

Roy Chowdhury, A. E. Darling, 2019, High contiguity genome sequence of a multidrug-resistant hospital isolate of Enterobacter hormaechei, Gut

Pathogens, 11(3), pp. 1–6.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

Danh sách các mẫu rau ăn sống và địa điểm thu thập mẫu

STT Rau ăn sống ĐỊA ĐIỂM QUẬN NỘI THÀNH

THỜI GIAN THU THẬP

Hoàng Mai 5/8 1 mùi tàu + mùi ta + húng quế Quán Vịt 22 Định Công - Hoàng Mai - Hà Nội

Hoàng Mai 5/8 2 mùi tàu + mùi ta + húng quế Quán Vịt 234 Định Công - Hoàng Mai - Hà Nội

Hoàng Mai 5/8 3 mùi tàu + mùi ta + húng quế Quán Vịt 38 Định Công - Hoàng Mai - Hà Nội

4 Long Biên 19/8 mùi tàu + mùi ta + húng quế

CH Vịt quay Lạng Sơn - Hoàng Tiến,211 Ngọc Lâm, Long Biên, Hà Nội

Long Biên 19/8 5 mùi tàu + mùi ta + húng quế Vịt quay Ngan Chặt - Đường Ngọc Lâm, Long Biên - Hà Nội

6 Long Biên 19/8 mùi tàu + mùi ta + húng quế CH Vịt cỏ Thành Luân - Ngõ 2 - Phú Viên, Long Biên - Hà Nội

7 Cầu Giấy 16/9 mùi tàu + mùi ta + húng quế

Quán Vịt 29, 104 C9 Tô Hiệu, Khu tập thể Nghĩa Tân, Nghĩa Tân, Cầu Giấy, Hà Nội

8 mùi tàu + mùi ta Hà Đông 9/9

CH Xuyên - Phở Bò Gà - 193 Quang Trung - Hà Đông - Hà Nội

Hà Đông 9/9 9 rau ngổ

CH Thu Quý - Thịt Gà - Số 1 Quang Trung - Hà Đông - Hà Nội

10 Cầu Giấy 16/9 canh giới + húng quế + mùi tàu

Đồ ăn chín Thanh Long - U5A15 Nghĩa Tân - Cầu Giấy - Hà Nội

Cầu Giấy 16/9 11 húng quế

CH Minh Chiến - Cạnh Kiot 3 Chợ Nghĩa Tân - Cầu Giấy - Hà Nội

Cầu Giấy 16/9 12 húng quế + ngổ + diếp cá Quán Ngan Vũ Vinh - 101 Mai Dịch - Cầu Giấy - Hà Nội

Long Biên 19/8 13 mùi tàu + mùi ta + húng quế Quán Nam Vịt - 113 Ngọc Lâm - Long Biên - Hà Nội

14 Long Biên 19/8 mùi tàu + mùi ta + húng chó CH Mạnh Tuấn - 81 Ngọc Lâm - Long Biên - Hà Nội

15 Hoàng Mai 5/8 mùi tàu + mùi ta + húng quế CH Phở 150 Đại Từ - Hoàng Mai - Hà Nội

Hoàng Mai 5/8 16 mùi tàu + mùi ta CH Phở 160 Đại Từ - Hoàng Mai - Hà Nội

17 Hà Đông 9/9 mùi tàu + húng quế + diếp cá Quán vịt 221 La Khê - Hà Đông - Hà Nội

18 Hà Đông 9/9 mùi tàu + húng quế + diếp cá

Quán Ký vịt - chung cư Comma 18 - La Khê - Hà Đông - Hà Nội

19 Hà Đông 9/9 mùi tàu + húng quế + diếp cá + tía tô Quán Toàn Thủy - kiot 1 - Chợ Bông Đỏ - La

Khê - Hà Đông - Hà Nội

20 mùi tàu + húng quế Cầu Giấy 16/9

Quán Vịt - Trần Bình (đối diện số 9 ngõ 58 Trần Bình) - Cầu Giấy - Hà Nội

21 Cầu Giấy 16/9 mùi tàu + húng quế + diếp cá Quán Vịt - Chợ Nghĩa Tân - Cầu Giấy - Hà Nội

22 16/9 mùi tàu + mùi ta + húng quế Nam Từ Liêm

Quán Gà Ngan Vịt ngon - Kiot 4+5 - CT5 - ĐN3 - Mỹ Đình 2 - Nam Từ Liêm Hà Nội

23 16/9 mùi tàu + mùi ta + húng quế Nam Từ Liêm Quán Vịt quay 396 đường Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

24 16/9 mùi tàu + mùi ta + húng quế Nam Từ Liêm

Vịt cỏ Sơn Tuyền - Cạnh N4Đ7 - Đường Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

16/9 25 Nam Từ Liêm mùi tàu + mùi ta + húng quế Vịt quay Thúy Nga - đường Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

26 Hoàng Mai 5/8 mùi tàu + mùi ta + húng quế

Quán Bia hơi Ngân Vịt - Kiot 42 tòa HH4B Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

27 Hà Đông 16/9 mùi tàu + mùi ta + húng quế Quán Vịt Nhật Minh - 60 Thanh Bình - Hà Đông - Hà Nội

28 Hà Đông 9/9 mùi tàu + mùi ta + húng quế Quán Vịt Thương (cạnh số nhà 175) Khu đô thị đấu giá - Ngô

Thì Nhậm- Hà Đông - Hà Nội

29 Long Biên 19/8 mùi tàu + mùi ta + húng quế

Vịt quay Tùng Vịt - 29B, Đường Bồ Đề, Phường Bồ Đề, Quận Long Biên, Hà Nội

30 Hoàng Mai 16/9 mùi tàu + mùi ta + húng quế

Quán Bia hơi Ngân Vịt - Kiot 42 tòa HH4B Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

31 Rau mùi tàu Hoàng Mai 5/8

NguyễnThị Loan - Chợ HH- Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

32 Húng bạc hà Hoàng Mai 5/8

Nguyễn Thị Loan - Chợ HH- Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

33 diếp cá Hoàng Mai 5/8

Nguyễn Thị Loan - Chợ HH- Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

34 Rau Mùi Hoàng Mai 5/8

Nguyễn Thị Loan - Chợ HH - Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

35 rau quế (lá nhỏ) Hoàng Mai 5/8

ngô Thị Nga - Chợ Đại Từ - Hoàng Mai - Hà Nội

Hoàng Mai 5/8 36 húng chó

ngô Thị Nga - Chợ Đại Từ - Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

37 mùi tàu Long Biên 19/8

Hoàng Thị Hoa - Chợ Ngọc Thụy, Long Biên, Hà Nội

Long Biên 19/8 38 rau mùi

Hoàng Thị Hoa - Chợ Ngọc Thụy, Long Biên, Hà Nội

39 rau quế Long Biên 19/8

Hoàng Thị Hoa - Chợ Ngọc Thụy, Long Biên, Hà Nội

40 xà lách xoăn Hà Đông 9/9

Trịnh Thị Hằng - Chợ La Khê - Hà Đông - Hà Nội

Hà Đông 9/9 41 xà lách mỡ

Trịnh Thị Hằng - Chợ La Khê - Hà Đông - Hà Nội

42 mùi ta Hà Đông 9/9

Trịnh Thị Hằng - Chợ La Khê - Hà Đông - Hà Nội

43 mùi tàu Hà Đông 9/9

Nguyễn Thị Lan - Chợ La Khê - Hà Đông - Hà Nội

Hà Đông 9/9 44 húng bạc hà

Nguyễn Thị Lan - Chợ La Khê - Hà Đông - Hà Nội

45 húng quế Hà Đông 9/9

Nguyễn Thị Lan - Chợ La Khê - Hà Đông - Hà Nội

46 húng chó Cầu Giấy 16/9

Nguyễn Thị Hoa - Chợ Đồng Xa- Cầu Giấy - Hà Nội

47 húng quế (lá nhỏ) Cầu Giấy 16/9

Nguyễn Thị Hoa - Chợ Đồng Xa- Cầu Giấy - Hà Nội

48 bạc hà Cầu Giấy 16/9

Nguyễn Thị Hoa - Chợ Đồng Xa- Cầu Giấy - Hà Nội

49 mùi ta Cầu Giấy 16/9 Lê Thị Hà - Chợ Đồng Xa- Cầu Giấy - Hà Nội

50 mùi tàu Cầu Giấy 16/9 Lê Thị Hà - Chợ Đồng Xa- Cầu Giấy - Hà Nội

51 ngổ Cầu Giấy 16/9 Lê Thị Hà - Chợ Đồng Xa- Cầu Giấy - Hà Nội

52 húng chó 16/9 Nam Từ Liêm Bùi Thị Nguyệt - Chợ Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

16/9 53 bạc hà Nam Từ Liêm Bùi Thị Nguyệt - Chợ Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

16/9 54 mùi ta Nam Từ Liêm Bùi Thị Nguyệt - Chợ Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

16/9 55 húng quế (lá nhỏ) Nam Từ Liêm Cao Thị Mỹ- Chợ Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

16/9 56 mùi tàu Nam Từ Liêm Cao Thị Mỹ- Chợ Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

16/9 57 xà lách Nam Từ Liêm Cao Thị Mỹ- Chợ Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

Long Biên 9/10 58 xà lách xoăn

Trịnh Thị Mai - Chợ Thạch Bàn - Long Biên - Hà Nội

Long Biên 9/10 59 xà lách mỡ

Trịnh Thị Mai - Chợ Thạch Bàn - Long Biên - Hà Nội

Long Biên 9/10 60 bạc hà

Trịnh Thị Mai - Chợ Thạch Bàn - Long Biên - Hà Nội

Xà Lách Lo lo tím Fivimart- Hà Đông Hà Đông 61 8/10

Xà Lách Romaine Hà Đông 62 8/10

Xà Lách Lo lo xanh AEON mall Long Biên 63 9/10

64 Mùi ta (ngò ri) 9/10 Long Biên

65 Xà lách Mỡ 9/10 Long Biên

66 Húng quế 9/10 Long Biên

67 Mùi tàu (ngò gai) 9/10 Long Biên

Xà Lách Romaine Mega Market HN Hà Đông 68 8/10

69 Rau húng quế 8/10 Hà Đông

70 Xà lách Frise 8/10 Hà Đông

71 Húng quế Hoàng Mai 15/10 Bác Tôm - Linh Đàm - Hoàng Mai

72 Xà Lách Hoàng Mai 15/10

73 Mùi Ta Hoàng Mai 15/10

Hoàng Mai 15/10 74 Xà Lách

MT Mart - hh1A - Linh Đàm - Hoàng Mai - Hà Nội

75 Ngổ Hoàng Mai 15/10

76 Mùi Ta Hoàng Mai 15/10

Cầu Giấy 18/10 77 Xà lách Lo lo Tím

Fivimart- 94 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội

78 Cầu Giấy 18/10 Xà lách mỡ Thủy canh CNC

79 Cầu Giấy 18/10 Xà lách DakleaF xanh

80 Cầu Giấy 18/10 Xaà lách Lo lo xanh Thủy canh

81 Mùi tàu Cầu Giấy 18/10

82 Húng bạc hà Cầu Giấy 18/10

83 19/10 Xà lách Frise thủy canh Nam Từ Liêm BigC garden - Mỹ Đình - Nam Từ Liêm - Hà Nội

84 Húng quế 19/10 Nam Từ Liêm

85 Mùi tàu 19/10 Nam Từ Liêm

86 Rau ngổ 19/10 Nam Từ Liêm

87 Mùi tàu Hà Đông 15/10 Auchan Mart - Hà Đông - Hà Nội

Cầu Giấy 18/10 88 Xà lách Frise rau thủy canh Vinmart - 72 Trần Đăng Ninh

89 diếp cá Cầu Giấy 18/10 Vinmart - 72 Trần Đăng Ninh

90 xa lách mỡ Cầu Giấy 18/10 Vinmart - 72 Trần Đăng Ninh

1 CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT 41 TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGTG 81 CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG 121 TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC 161 TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 201 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA 241 CACTGCTGCC AACTTACTTC TGACAACGAT CGGAGGACCG 281 AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT GCACAACATG GGGGATCATG 321 TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC TGAATGAAGC 361 CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGCAGCA 401 ATGGCAACAA CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC 441 TTACTCTAGC TTCCCGGCAA CAATTAATAG ACTGGATGGA 481 GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG CTCGGCCCTT 521 CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGARSSGGTG 561 AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA 601 TGGTAAGCCC TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG 641 AGTCAGGCAA CTATGGATGA A Trình tự đoan gen bla OXA 1 ACCAGATTCA ACTTTCAAGA TCGCATTATC ACTTATGGCA 41 TTTGATGCGG AAATAATAGA TCAGAAAACC ATATTCAAAT 81 GGGATAAAAC CCCCAAAGGA ATGGAGATCT GGAACAGCAA 121 TCATACACCA AAGACGTGGA TGCAATTTTC TGTTGTTTGG 161 GTTTCGCAAG AAATAACCCA AAAAATTGGA TTAAATAAAA 201 TCAAGAATTA TCTCAAAGAT TTTGATTATG GAAATCAAGA 241 CTTCTCTGGA GATAAAGAAA GAAACAACGG ATTAACAGAA 281 GCATGGCTCG AAAGTAGCTT AAAAATTTCA CCAGAAGAAC 321 AAATTCAATT CCTGCGTAAA ATTATTAATC ACAATCTCCC 361 AGTTAAAAAC TCAGCCATAG AAAACACCAT AGAGAACATG 401 TATCTACAAG ATCTGGATAA TAGTACAAAA CTGTATGGGA 441 AAACTGGTGC AGGATTCACA GCAAATAGAA CCTTACAAAA 481 CGGATGGTTT GAAGGGTTTA TTATAAGCAA ATCAGGACAT 521 AAATATGTTT TTGTGTCCGC ACTTACAGGA AACTTGGGGT 561 CGAATTTAAC ATCAAGCATA AAAGCCAAGA

PHỤ LỤC 2 Trình tự đoạn gen bla TEM

1 TCGATGTGCA GTACCAGTAA AGTTATGGCG GCCGCGGCGG 41 TGCTTAAGCA GAGTGAAACG CAAAAGCAGC TGCTTAATCA 81 GCCTGTCGAG ATCAAGCCTG CCGATCTGGT TAACTACAAT 121 CCGATTGCCG AAAAACACGT CAACGGCACA ATGACGCTGG 161 CAGAACTGAG CGCGGCCGCG TTGCAGTACA GCGACAATAC 201 CGCCATGAAC AAATTGATTG CCCAGCTCGG TGGCCCGGGA 241 GGCGTGACGG CTTTTGCCCG CGCGATCGGC GATGAGACGT 281 TTCGTCTGGA TCGCACTGAA CCTACGCTGA ATACCGCCAT 321 TCCCGGCGAC CCGAGAGACA CCACCACGCC GCGGGCGATG 361 GCGCAGACGT TGCGTCAGCT TACGCTGGGT CATGCGCTGG 401 GCGAAACCCA GCGGGCGCAG TTGGTGACGT GGCTCAAAGG 441 CAATACGACC GGCGCAGCCA GCATTCGGGC CGGCTTACCG 481 ACGTCGTGGA CTGTGGGTGA TAAGACCGGC AGCGGCGACT 521 ACGGCACCAC CAATGATATT GCGGTGATCT GGCCGCAGGG 561 TCGTGCGCCG CTGATTCTGG TCACT Trình tự đoạn gen bla DHA 1 GCCGTCTCCG TAAAGGGTAA GCCCTATTAT TTCAATTATG 41 GTTTTGCCGA TATTCAGGCA AAACAGCCGG TCACTGAAAA 81 TACACTATTT GAGCTCGGAT CTGTAAGTAA AACTTTCACA 121 GGTGTGCTGG GTGCGGTTTC TGTGGCGAAA AAAGAGATGG 161 CGCTGAATGA TCCGGCGGCA AAATACCAGC CGGAGCTGGC 201 TCTGCCGCAG TGGAAGGGGA TCACATTGCT GGATCTGGCT 241 ACCTATACCG CAGGCGGACT GCCGTTACAG GTGCCGGATG 281 CGGTAAAAAG CCGTGCGGAT CTGCTGAATT TCTATCAGCA 321 GTGGCAGCCG TCCCGGAAAC CGGGCGATAT GCGTCTGTAT 361 GCAAACAGCA GTATCGGCCT GTTTGGTGCT CTGACCGCAA 401 ACGCGGCGGG GATGCCGTAT GAGCAGTTGC TGACTGCACG 441 GATCCTGGCA CCGCTGGGGT TATCTCACAC CTTTATTACT 481 GTGCCGGAAA GTGCGCAAAG CCAGTATGCG TACGGTTATA 521 AAAACAAAAA ACCGGTCCGC GTGTCGCCGG GACAGCTTGA 561 TGCGGAATCT TACGGCGTGA AATCCGCCTC AAAAGATATG 601 CTGCGCTGGG CGGAAATGAA TATGGAGCCG TCACGGGCCG 641 GTAATGCGGA TCTGGAAATG GCAATGTATC TCGCCCAGAC 681 CCGCTACTAT AAAACCGCCG CGATTAACCA GGGGCTGGGC 721 TGGGAAATGT ATGACTGGCC GCAGCAGAAA GATATGATCA 761 TTAACGGTGT GACCAACGAG GTCGCATTGC AGCCGCATCC 801 GGTAACAGAC AACCAGGTTC AGCCGTATAA CCGTGCTTCC 841 TGGGTGCATA AAACGGGCGC AACAACTGGT TTCGGCGCCT 881 ATGTCGCCTT TATTCCGGAA AAACAGGTGG CGATTGTGAT 921 TCTGGC

Trình tự đoạn gen bla CTX-M

Trình tự đoạn gen bla CMY 1 ACAGAACAAC AGATTGCCGA TATCGTTAAT CGCACCATCA 41 CCCCGTTGAT GCAGGAGCAG GCTATTCCGG GTATGGCCGT 81 TGCCGTTATC TACCAGGGAA AACCCTATTA TTTCACCTGG 121 GGTAAAGCCG ATATCGCCAA TAACCACCCA GTCACGCAGC 161 AAACGCTGTT TGAGCTAGGA TCGGTTAGTA AGACGTTTAA 201 CGGCGTGTTG GGCGGCGATG CTATCGCCCG CGGCGAAATT 241 AAGCTCAGCG ATCCGGTCAC GAAATACTGG CCAGAACTGA 281 CAGGCAAACA GTGGCAGGGT ATCCGCCTGC TGCACTTAGC 321 CACCTATACG GCAGGCGGCC TACCGCTGCA GATCCCCGAT 361 GACGTTAGGG ATAAAGCCGC ATTACTGCAT TTTTATCAAA 401 ACTGGCAGCC GCAATGGACT CCGGGCGCTA AGCGACTTTA 441 CGCTAACTCC AGCATTGGTC TGTTTGGCGC GCTGGCGGTG 481 AAACCCTCAG GAATGAGTTA CGAAGAGGCA ATGACCAGAC 521 GCGTCCTGCA ACCATTAAAA CTGGCGCATA CCTGGATTAC 561 GGTTCCGCAG AACGAACAAA AAGATTATGC CTGGGGCTAT 601 CGCGAAGGGA AGCCCGTACA CGTTTCTCCG GGACAACTTG 641 ACGCCGAAGC CTATGGCGTG AAATCCAGCG TTATTGATAT 681 GGCCCGCTGG GTTCAGGCCA ACATGGATGC CAGCCACGTT 721 CAGGAGAAAA CGCTCCAGCA GGGCATTGCG CTTGCGCAGT 761 CTCGCTACTG GCGTATTGGC GATATGTACC AGGGATTAGG 801 CTGGGAGATG CTGAACTGGC CGCTGAAAGC TGATTCGATC 841 ATCAACGGCA GCGACA

Chú thích: Phần bôi đậm là trình tự mồi