ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Vân Anh
THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN E. coli
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Vân Anh
THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN E. coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS Nguyễn Quang Huy
2. TS. Lã Thị Huyền
Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN
Không có sự thành công của một học viên nào mà không có sự hỗ trợ, giúp đỡ và đóng góp của các Thầy cô. Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn và giúp đỡ của các Thầy cô trong Trƣờng và đặc biệt là các Thầy cô trong Khoa Sau đại học.
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS Nguyễn Quang Huy – Trƣởng khoa Hoá sinh Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội, TS. Lã Thị Huyền – Phòng công nghệ động vật viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và dìu dắt em trong suốt thời gian em học tập và hoàn thành luận văn.
Tiếp theo, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành luận văn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các GS, TS, cán bộ nghiên cứu của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, luôn tận tình sát sao chỉ bảo, chia sẻ những kinh nghiệm và cho em những lời khuyên quý báu trong công việc cung nhƣ cuộc sống.
Và cuối cùng, bằng tình cảm chân thành và yêu mến em xin đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và ngƣời thân, những ngƣời luôn ủng hộ, động viên và tạo cho em những điều kiện tốt nhất về tinh thần cũng nhƣ vật chất trong suốt thời gian học tập và thực tập.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên
Nguyễn Thị Vân Anh
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 1
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. Tổng quan về bệnh ung thƣ ....................................................................................... 3
1.1.1. Ung thư ........................................................................................................... 3
1.1.2. Ảnh hưởng của bệnh ung thư ......................................................................... 5
1.1.3. Nguyên nhân gây ung thư .............................................................................. 5
1.2. Protein kháng nguyên CD47 và kháng thể kháng CD47 ...................................... 7
1.2.1. Protein kháng nguyên CD47- đích trong điều trị ung thư ........................... 7
1.3.3. Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư .................. 9
1.3. Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ..... 10
1.4. Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) .................................................................. 11
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 13
2.1. Vật liệu ........................................................................................................................ 13
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm ................................................................................ 13
2.2. Thiết bị ........................................................................................................................ 13
2.3.1. Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 bằng phản ứng PCR ....................... 14
2.3.2. Điện di trên gel agarose............................................................................... 14
2.3.5. Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+ ............................................ 16
2.3.6. Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phương pháp sốc nhiệt ........................................................................................... 16
2.3.7. Tách plasmid từ vi khuẩn E.coli theo phương pháp mini-prep của
Sambrook ................................................................................................................. 17
2.3.8. Chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen antiHer2 bằng phương
pháp PCR ................................................................................................................ 17
2.3.9. Quy trình biểu hiện kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện
E.coli ........................................................................................................................ 18
2.3.10. Quy trình điện di protein SDS-PAGE ....................................................... 18
2.3.11. Tinh sạch kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký
ái lực với Ni-NTA resin .......................................................................................... 19
2.3.12. Nuôi cấy dòng tế bào Jurkat ...................................................................... 19
2.3.13. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang ...................................................... 20
3.1. Kết quả nhân gen mã hóa kháng thể kháng CD47 .............................................. 22
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47... 22
3.2.1. Cắt vector pET22b+ và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn.......... 22
3.2.2. Kết quả gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47 ........ 23
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện
E. coli ................................................................................................................................... 28
3.4. Kết quả tinh sạch kháng thể anti-CD47 ................................................................ 29
3.5. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng
nguyên CD47 ..................................................................................................................... 30
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 34
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPα ............................................................ 9
Bảng 1.2. Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPα .......................................................... 10
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ ung thƣ thế giới .............................................................................. 3
Hình 1.2. Bản đồ ung thƣ tại Việt Nam ............................................................................. 4
Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ ............................................. 6
Hình 1.5: Mô hình cấu trúc thụ thể CD47 .......................................................................... 7
Hình 1.6. Các cơ chế nhắm trúng đích con đƣờng CD47- SIRPα trong ung thƣ . ........... 8
Hình 3.1. Kết quả nhân gen anti-CD47 bằng phản ứng PCR. .................................. 22
Hình 3.2. Cắt vector pET22b+ bằng enzyme cắt giới hạn. .............................................. 23
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gen giữa sản phẩm PCR (khuếch đại
gen antiCD47). ................................................................................................................... 24
Hình 3.4. Kiểm tra sơ bộ các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47 .............. 25
Hình 3.5. Kiểm tra các dòng plasmid mang gen anti-CD47. ........................................... 26
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của kháng thể kháng CD47 ở tế bào vi khuẩn E.coli 28
Hình 3.8. Kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể anti-CD47. ............................................. 30
Hình 3.9. Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên
CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat.. ....................................................................... 31
DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Amp Ampicillin
AML Tế bào ung thƣ máu
Bp Base pair (cặp bazơ)
CD47 Cluster of Differentiation 47
DNA Deoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylenediaminetraacetic acid
EtBr Ethidium bromide
HEK Tế bào thận phôi thai ở ngƣời
HSC Tế bào gốc tạo máu
IPTG Isopropyl-β-D-l-thiogalactopyranoside
MCS Mutiple cloning site
LB Luria-betani medium
LSC Tế bào gốc ung thƣ máu
NHL Non-Hodgkin’s lymphoma
OKT3 OrthocloneTM
PEG Polyethylen glycol
RNA Ribonucleic acid
V/p Vòng / phút
Fc Kháng thể đơn miền và mảnh kết tinh
SIRPα Signal regulatory protein alpha.
ScFv Mảnh kháng thể đơn chuỗi
Fab Fragment of antigen binding
MỞ ĐẦU
CD47 là glycoprotein chuyển màng thuộc siêu họ globulin miễn dịch. CD47 có khối
lƣợng phân tử 50 kDa bao gồm vùng IgV ngoại bào chứa đầu N, 5 vùng chuyển màng và
đuôi nội bào ngắn chứa đầu C. CD47 liên kết đặc hiệu với một số protein bao gồm
integrins, thrombospondin-1, và liên quan đến các quá trình sinh lý tế bào nhƣ di chú tế
bào, hoạt hóa tế bào T và tế bào tua, và sự phát triển của sợi trục thần kinh [16]. Ngoài ra,
CD47 còn là phối tử đặc hiệu của SIRPα . Protein này biểu hiện trên bề mặt của các tế
bào đại thực bào. Tƣơng tác CD47-SIRPα ức chế quá trình thực bào bởi đại thực bào và
tế bào tua [44].
CD47 đƣợc xác định là kháng nguyên ung thƣ buồng trứng ngƣời lần đầu tiên
vào những năm 1980 [17]. Sau đó, CD47 đƣợc xác định biểu hiện ở nhiều loại khối u
ngƣời bao gồm AML, CML [11], ALL [7], bạch cầu không liêu quan đến lympho bào
NHL [8], đa uy tủy [21], ung thƣ bàng quang [32] và các khối u rắn khác [11]. Điều
đặc biệt là, CD47 biểu hiện yếu ở các tế bào bình thƣờng và biểu hiện mạnh ở các tế
bào khối u. Xác định mức độ biểu hiện CD47 ở hai mẫu tế bào HSC và tế bào LSC
bằng phƣơng pháp flow cytometry cho thấy mật độ kháng nguyên CD47 ở tế bào LSC
cao hơn ở tế bào HSC [10; 7]. Định lƣợng CD47 mRNA trong mẫu máu ngoại vi của
một nhóm gồm 132 bệnh nhân AML bằng phƣơng pháp real-time PCR cho thấy hàm
lƣợng CD47 mRNA của bệnh nhân AML cao hơn so với nhóm chứng [40]. Các kết
quả đã công bố cho thấy CD47 không những là marker hữu dụng để nhận dạng LSC,
AML và một số tế bào khối u khác mà còn là đích để phát triển các loại thuốc đặc hiệu
và liệu pháp miễn dịch tiêu diệt tế bào ung thƣ biểu hiện kháng nguyên CD47.
Ung thƣ máu cấp tính có tốc độ phát triển rất nhanh ở tủy xƣơng cùng với sự
biểu hiện của một số kháng nguyên bề mặt bao gồm CD19, CD22, CD33, CD123,
và CD47. Trong đó, CD47 biểu hiện mạnh ở cả tế bào ung thƣ máu và tế bào gốc
ung thƣ máu. Tế bào gốc ung thƣ máu là một trong những nhân tố tiềm tàng khiến
1
cho bệnh ung thƣ máu dai dẳng, khó điều trị dứt điểm và dễ tái phát. Do đó, CD47
là một trong các đích để tấn công nhằm tiêu diệt tận gốc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp
tính.
Mảnh kháng thể scFv là một trong những định dạng phổ biến nhất của mảnh
kháng thể tái tổ hợp. Mặc dù chúng là những đại diện khá nhỏ của dạng kháng thể
tái tổ hợp (26-28 kDa) nhƣng chúng cung cấp đầy đủ các đặc tính của kháng thể và
vị trí gắn kết kháng nguyên không bị thay đổi. So với các kháng thể đầy đủ chúng ít
phức tạp hơn, bao gồm chỉ các miền biến đổi của chuỗi nặng kháng thể (VH) và
vùng biến đổi của chuỗi nhẹ kháng thể (VL), các VH và VL đƣợc liên kết bởi một
polypeptide linh hoạt.
Với sự ra đời của công nghệ DNA tái tổ hợp từ những năm 1970, protein bắt
đầu đƣợc biểu hiện nhiều ở dạng tái tổ hợp trong các tế bào vi sinh vật một cách
nhanh hơn và thuận tiện hơn so với nguồn tự nhiên. Trong những năm gần đây, kỹ
thuật sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ thống sinh học ngày càng đƣợc ứng
dụng rộng rãi. Trong đó, các ―nhà máy‖ vi khuẩn đƣợc lựa chọn sử dụng nhiều do
các ƣu điểm nhƣ chi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh. Chủng biểu
hiện Escherichia coli là chủng đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu cũng
nhƣ trong sản xuất protein tái tổ hợp.
Do đó, tác giả lựa chọn đề tài: ―Thiết kế vector biểu hiện mang gen scFv
kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn E.coli‖ với mục tiêu: Thiết kế
thành công vector biểu hiện mang gen scFv đặc hiệu CD47 và biểu hiện đƣợc
2
protein trong vi khuẩn E.coli.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh ung thƣ
1.1.1. Ung thƣ
Ung thƣ là một thuật ngữ trong y học để chỉ khối u ác tính. Đây là một loại bệnh
mà một nhóm tế bào biểu thị sự tăng sinh không kiểm soát (các tế bào có sự phân chia
vƣợt quá giới hạn bình thƣờng), sau đó xâm nhập và tiêu diệt các mô liền kề nó, đôi khi
tế bào di căn (xâm nhập vào các vùng khác trên cơ thể theo đƣờng bạch huyết hoặc
máu) [1; 2]. Có khoảng 200 loại bệnh ung thƣ đã đƣợc khoa học tìm ra.
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2018 công bố tình hình ung thƣ hiệu
chỉnh theo độ tuổi tại 185 quốc gia và vùng lãnh thổ.
Hình 1.1. Bản đồ ung thƣ thế giới [18]
Trong đó, 10 quốc gia có tỉ lệ ung thƣ cao nhất đều là những nƣớc phát triển:
Úc đứng số 1 với tỉ lệ mắc ung thƣ cả 2 giới ở mức 468/100.000 dân; New Zealand
(438); Ireland (373); Hungary (368); Mỹ đứng thứ 5 với tỉ lệ 352, kế đó là Bỉ, Pháp,
Đan Mạch, Na Uy, Hà Lan...
Trong khu vực Đông Nam Á, Singapore có tỉ lệ mắc ung thƣ cao nhất, kế đó
là Philippines (163, vị trí 89 thế giới); Thái Lan vị trí 92 thế giới (152); thứ 4 khu
vực là Lào (154, vị trí 97 thế giới).
Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thƣ
151,4/100.000 dân, xếp 19 châu Á và thứ 5 tại khu vực Đông Nam Á. Vào năm
3
2015, Việt Nam xếp vị trí 107 và thời điểm 2013 xếp ở vị trí 108.
Theo thống kê của WHO, số ca mắc mới ung thƣ tại Việt Nam không ngừng
tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010. Năm 2018, số ca mắc mới tăng
lên gần 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đó gần 70% trƣờng hợp tử vong, tƣơng
đƣơng 115.000 ca.
Nhìn tổng quan trên bản đồ ung thƣ thế giới, tỉ lệ mắc của Việt Nam không
cao, tuy nhiên tỉ lệ tử vong tƣơng đối lớn, xếp vị 56/185 quốc gia và vùng lãnh thổ
với tỉ lệ 104,4/100.000 dân. Vào năm 2016, tỉ lệ tử vong của Việt Nam ở mức
110/100.000 dân.
Hình 1.2. Bản đồ ung thƣ tại Việt Nam [18]
Tính chung cả 2 giới, 5 loại ung thƣ có tỉ lệ mắc nhiều nhất tại Việt Nam
gồm: Ung thƣ gan, hơn 25.000 ca (15,4%), kế đó là ung thƣ phổi (14,4%), ung thƣ
dạ dày (10,6%), ung thƣ vú, ung thƣ đại tràng.
5 loại ung thƣ phổ biến nhất ở nam giới Việt gồm: Ung thƣ phổi (21,5%),
ung thƣ gan (18,4%), ung thƣ dạ dày, ung thƣ đại tràng; ung thƣ hầu họng. Ở nữ
giới, hàng đầu vẫn là ung thƣ vú, ung thƣ đại tràng, ung thƣ phổi, ung thƣ gan.
Tổ chức sáng kiến toàn cầu về ung thƣ (GICR, thuộc WHO) cho biết, các số
4
liệu có đƣợc dựa trên những nguồn tốt nhất đƣợc cung cấp tại mỗi nƣớc.
WHO cho biết, ung thƣ đang là một trong những thách thức sức khoẻ cộng
đồng quan trọng nhất của thế kỷ 21. Khoảng 40% trƣờng hợp ung thƣ có thể đƣợc
ngăn ngừa bằng cách giảm tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ bao gồm chế độ ăn uống,
dinh dƣỡng, hoạt động thể chất.
1.1.2. Ảnh hƣởng của bệnh ung thƣ
Bệnh ung thƣ gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đời sống và kinh tế ở mỗi
quốc gia. Không những dẫn đầu về nguyên nhân gây tử vong trên thế giới, bệnh ung
thƣ vẫn là một căn bệnh mà cho đến nay vẫn chƣa có biện pháp điều trị triệt để. Đối
với một nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, mỗi năm có khoảng 0,5% dân số đƣợc chẩn đoán
ung thƣ. Hiện nay, vẫn đang còn rất nhiều ngƣời phải sống và chống chọi với căn
bệnh này với chi phí điều trị rất lớn. Các nhà khoa học, bác sĩ trên toàn thế giới
đang nỗ lực không ngừng để tìm ra các biện pháp phát hiện sớm, phòng ngừa và
chữa trị ung thƣ. Đây là một vấn đề rất quan trọng đối với mỗi quốc gia và thế giới,
đòi hỏi tập trung nguồn nhân lực trình độ cao và tài chính lớn.
1.1.3. Nguyên nhân gây ung thƣ
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thƣ. Các nhà khoa học xác định
rằng các dạng ung thƣ đều có nguyên nhân từ những bất thƣờng trong gen của các
tế bào bị biến đổi. Sự bất thƣờng này do ảnh hƣởng của các chất sinh ung thƣ nhƣ
khói thuốc lá, chất phóng xạ, chất hóa học,… Một số nguyên nhân ung thƣ khác có
thể là do sai sót mang tính di truyền trong quá trình tự sao của ADN, do đó tất cả
các tế bào đều tăng sinh bất thƣờng. Sự di truyền của ung thƣ đƣợc xác định do ảnh
hƣởng của các yếu tố gây ung thƣ và hệ gen chủ. Một số yếu tố di truyền khác ảnh
hƣởng đến ung thƣ là sự methyl hóa ADN và ARNs micro [1;2;4].
Bình thƣờng sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình sinh sản và quá trình chết
của tế bào đƣợc điều hòa để đảm bảo tính toàn vẹn của cơ quan và mô. Tuy nhiên
khi các gen đột biến gây ung thƣ trong tế bào đƣợc hoạt hóa thì tế bào tránh đƣợc sự
chết theo chƣơng trình (apoptosis) và phân chia không kiểm soát, có khả năng hình
5
thành các khối u lành hoặc ác tính (ung thƣ) [4].
Hai yếu tố quan trọng trong hệ gen dẫn đến ung thƣ là sự tích lũy các đột
biến soma và tăng cƣờng tính bất ổn di truyền.
Số lƣợng đột biến ở tế bào ung thƣ nhiều hơn tế bào bình thƣờng. Khi các
đột biến diễn ra ở các gen sửa chữa ADN, các gen ức chế khối u hay đột biến gen
tiền ung thƣ thành gen ung thƣ đƣợc kết hợp với nhau thì gây ra sự tăng sinh một
cách không kiểm soát của các tế bào [2; 4].
Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ [3]
Sự có mặt của các đột biến khác nhau dẫn đến nguy cơ chọn lọc không mong
muốn trong quần thể tế bào. Trong trƣờng hợp ung thƣ, tế bào nào mang đột biến
6
tăng cƣờng sinh trƣởng sẽ có ƣu thế đƣợc chọn lọc [2; 4].
1.2. Protein kháng nguyên CD47 và kháng thể kháng CD47
1.2.1. Protein kháng nguyên CD47- đích trong điều trị ung thư
Hình 1.5: Mô hình cấu trúc thụ thể CD47 [16]
Gần đây, protein bề mặt tế bào CD47 đã đƣợc phát hiện biểu hiện quá mức ở
nhiều loại tế bào ung thƣ khác nhau[43]. Biểu hiện CD47 tăng cao trong 57 trên 115
(49,5%) mẫu ung thƣ dạ dày giai đoạn đầu (T1b). Hơn nữa, họ phát hiện ra rằng tỷ
lệ sống sót sau 5 năm đối với các trƣờng hợp dƣơng tính với CD47 thấp hơn đáng
kể so với các trƣờng hợp âm tính với CD47 (54,8 so với 79,9%; p = 0,0067), cho
thấy sự biểu hiện quá mức của CD47 có thể là một yếu tố tiên lƣợng xấu độc lập
cho ung thƣ dạ dày. Tƣơng tự, một nghiên cứu gần đây [44] tiết lộ rằng CD47
thƣờng đƣợc biểu hiện quá mức trong khối u của bệnh nhân ung thƣ buồng trứng và
có liên quan đến các đặc điểm lâm sàng bất lợi và tiên lƣợng xấu. Các bệnh ung thƣ
khác ở ngƣời cũng đã đƣợc báo cáo, một số trong đó bao gồm ung thƣ bạch cầu tủy
cấp tính, ung thƣ hạch không Hodgkin (NHL), ung thƣ dạ dày, ung thƣ gan, ung thƣ
phổi tế bào nhỏ và ung thƣ vú [17]. Trong hầu hết các trƣờng hợp, biểu hiện CD47
cao có liên quan đến di căn xa và tiên lƣợng xấu, cho thấy rằng liệu pháp chống
CD47 là một chiến lƣợc đầy hứa hẹn để chống ung thƣ.
Điều hòa tăng biểu hiện CD47 là một cơ chế đặc biệt quan trọng đƣợc các tế
bào gốc ung thƣ sử dụng để vƣợt qua hệ thống miễn dịch, điều này dẫn tới sự tái
phát của bệnh ung thƣ [6]. Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy sự gia tăng biểu hiện
7
protein CD47 trên các tế bào tạo máu ở ngƣời, đặc biệt là trong bệnh ung thƣ bạch
cầu tủy bào cấp tính (AML) và trong bệnh bạch cầu tủy mãn tính, các tế bào chống
1.2.2. Kháng thể kháng CD47 và liệu pháp điều trị đích CD47 trong điều trị ung thư
lại quá trình thực bào thông qua tƣơng tác CD47-Sirpα [7; 9].
Nhiều hƣớng nghiên cứu đã đƣợc xây dựng nhằm vô hiệu hóa tƣơng tác
CD47-SIRPα theo các cơ chế khác nhau [37]. Cơ chế thứ nhất, kháng thể kháng
CD47 có thể khóa tƣơng tác giữa CD47 trên tế bào khối u và SIRPα trên các tế bào
thực bào cho phép quá trình thực bào diễn ra.
Cơ chế thứ hai, kháng thể kháng CD47 có thể loại bỏ các khối u thông qua
cơ chế phụ thuộc vào Fc bao gồm gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể và gây độc tề
bào phụ thuộc bổ thể.Một kháng thể kháng CD47 đã đƣợc chứng minh có tác dụng
kích thích gây độc tế bào qua trung gian NK để kháng lại dòng tế bào ung thƣ ở
ngƣời [39]. Cơ chế thứ ba, kháng thể kháng CD47 loại bỏ khối u bằng cách kích
hoạt trực tiếp quá trình apoptosis.Kết quả của một số nghiên cứu đã công bố cho
thấy, một vài kháng thể kháng CD47 kích thích các tế bào ung thƣ chết theo chƣơng
trình thông qua cơ chế không phụ thuộc caspase [38; 41; 24; 42]. Cơ chế thứ tƣ ,
kháng thể kháng CD47 có khả năng bất hoạt tƣơng tác CD47-SIRPα dẫn đến tế bào
tua có khả năng tóm bắt khối u và trình diện kháng nguyên cho tế bào T-CD4 và T-
CD8, kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch kháng lại khối u [15].
Hình 1.6. Các cơ chế nhắm trúng đích con đƣờng CD47- SIRPα trong ung thƣ [10].
8
1.3.3. Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư
Hiện nay, một số các liệu pháp nhắm đích CD47/ SIRPα đang đƣợc nghiên
cứu thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng, bao gồm các kháng thể thông thƣờng,
polypeptide tái tổ hợp và các phân tử bispecific (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPa [8,9,35]
Điều trị nhắm mục tiêu CD47/ SIRPα theo phát triển lâm sàng
Công ty
Kháng thể
Giai đoạn
Mô tả
kháng CD47
thử nghiệm
Forty Seven Inc
Hu5F9-G4
Giai đoạn 1
Kháng thể kháng CD47
đƣợc nhân hóa, phân lớp
IgG4 của ngƣời
Celgen
CC-90002
Giai đoạn 1
Kháng thể kháng CD47
đƣợc nhân hóa
Trillium
TTI – 621
Giai đoạn 1
Protein SIRPα-Fc, phân
lớp IgG1 của ngƣời
Therapeutics Inc
ALX148
Giai đoạn 1
Biến thể SIRPα có ái lực
cao
Alexo Therapeutics NI-1701
Tiền lâm sàng
Kháng thể lƣỡng tính
kháng đầy đủ CD47/CD19
Novimmune
NI-1801
Tiền lâm sàng
Kháng thể đầy đủ kháng
CD47/ mesothelin
Tioma Therapeutics Undisclosed
Tiền lâm sàng
Kháng thể kháng CD47
Surface Oncology
Tiền lâm sàng
Kháng thể kháng CD47
đầy đủ
Effi-DEM
Tiền lâm sàng
Kháng thể kháng SIRPα
OSE
Immunotherapeutics
9
Các kháng thể kháng CD47 là các liệu pháp đặc hiệu tốt nhất nhắm tới phức
hệ CD47/ SIRPα. Chúng đã đƣợc chứng minh hiệu quả in vitro và in vivo và các
kháng thể kháng CD47 đã đƣợc thử nghiệm chống lại nhiều khối u máu ác tính và
bệnh lý khối u rắn, và chúng đã bắt đầu đƣợc thử nghiệm lâm sàng (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPa [8,9,35]
Thử nghiệm lâm sàng trị liệu nhắm mục tiêu CD47/SIRPa
Ngày bắt đầu
Tên Kháng thể
Thử nghiệm trên các bệnh
Giai đoạn
thử nghiệm
8/2014
Hu5F9-G4
Khối u ác tính, ung thƣ hạch
Giai đoạn I
3/2015
CC-90002
Khối u rắn, đa u tủy, hoặc u
Giai đoạn I
lympho non-hodgkin
11/2015
Hu5F9-G4
Bệnh bạch cầu tủy cấp tính
Giai đoạn I
01/2016
TTI - 621
Khối u ác tính
Giai đoạn I
03/2016
CC-90002
Bệnh bạch cầu tủy cấp tính,
Giai đoạn I
hội chứng myelodysplastic có
nguy cơ cao
09/2016
TTI - 621
Khối u rắn, nấm mycosis
Giai đoạn I
11/2016
Hu5F9-G4
U lympho không Hodgkin tế
Giai đoạn I/II
bào B
11/2016
Hu5F9-G4
Khối u ác tính
Giai đoạn I/II
02/2017
ALX148
Khối u rắn, u lympho
Giai đoạn I
Hiện nay các nghiên cứu về kháng thể kháng CD47 vẫn đang phát triển trên
thế giới.
1.3. Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ
Kể từ khi cấp phép cho liệu pháp kháng thể đơn dòng (mAb) đầu tiên OKT3
vào năm 1986, tính đặc hiệu, tính linh hoạt và tính đa dạng của kháng thể và dẫn xuất
kháng thể đã trở thành nhóm dƣợc phẩm sinh học lớn nhất [27]. Kháng thể đơn dòng
có tiền sử sử dụng an toàn, cơ sở khoa học rõ ràng. Tính đến tháng 10 năm 2018, hơn
80 kháng thể đã đƣợc EMA/FDA đƣa ra thị trƣờng hoặc phê duyệt cho nhiều chỉ định
bệnh bao gồm ung thƣ, viêm/tự miễn dịch, cấy ghép, bệnh truyền nhiễm và tim mạch,
10
huyết học, dị ứng và nhãn khoa. Hơn 500 sản phẩm, bao gồm các sản phẩm thế hệ 2
và các định dạng kháng thể mới, hiện đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng trên toàn thế
giới [27; 28; 29].
Dựa trên bản chất mô hình tự nhiên của kháng thể, cả về cấu trúc và chức
năng, cho phép tạo ra các mảnh liên kết kháng nguyên nhỏ hơn, chẳng hạn nhƣ
mảnh Fab, mảnh đơn chuỗi (scFv), kháng thể đơn miền và mảnh kết tinh (Fc),
thông qua tách dòng phân tử, kỹ thuật kháng thể và thậm chí các phƣơng pháp
enzyme. Các mảnh kháng thể sau đó có thể đƣợc sử dụng một mình hoặc liên kết
với các phân tử hoặc mảnh khác để tạo ra các phân tử lƣỡng tính, đa đặc hiệu, đa
liên kết hoặc đa chức năng để đạt đƣợc nhiều hiệu ứng sinh học [4].
Các mảnh kháng thể có thể cung cấp một số lợi thế so với việc sử dụng các
kháng thể thông thƣờng.
1.4. Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv)
Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) tạo ra một protein đơn chuỗi có ái lực với
kháng nguyên tƣơng đƣơng với kháng thể gốc. Trình tự và độ dài peptide liên kết có
thể khác nhau giữa các scFv để tối ƣu ái lực đối với kháng nguyên và tăng sự bền
nhiệt. Chiều dài của peptide liên kết có thể tạo ra khoảng cách ~ 3,5nm giữa VL và
VH mà không làm gián đoạn sự hình thành vị trí liên kết kháng nguyên [34].
Hình 1.5. Cấu trúc của scFv
ScFv có một số lợi thế so với mAb thông thƣờng. Đầu tiên, kích thƣớc nhỏ
lý tƣởng cho sản xuất quy mô lớn trong các hệ thống vi sinh vật [35]. Ngoài ra, vì
11
các chuỗi mã hóa VL và VH đƣợc mã hóa trên cùng 1 gen, không cần phải cân bằng
vùng hằng định chuỗi nhẹ (CL) và chuỗi nặng (CH). Điều này cho phép các mảnh
đƣợc sản xuất nhanh hơn, với năng suất cao hơn và với chi phí thấp hơn so với
mAbs kích thƣớc đầy đủ, thƣờng yêu cầu hệ thống biểu hiện động vật có vú [36].
Kích thƣớc nhỏ cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập của mô và gắn kết với các
epitopes, đặc biệt hữu ích cho sự thâm nhập khối u trong liệu pháp miễn dịch ung
thƣ [37; 38]. Việc thiếu vùng Fc sẽ loại bỏ nguy cơ kích hoạt tế bào miễn dịch và
các kháng thể nhƣ gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), thực bào tế bào phụ
12
thuộc kháng thể (ADCP), hoặc gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (CDC) [32].
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
Gen mã hóa kháng thể kháng CD47 (anti-CD47) do phòng CNTBĐV
cung cấp.
Cặp mồi LH47F/LH47R và T7promoter/T7terminator đƣợc tổng hợp bởi
công ty IDT (Mỹ).
Cặp mồi
Trình tự
LH47F: 5’ - AGTGGCGGATCCGGAGGAGCT-3’
LH47F/LH47R
LH47R: 5’- GACCTTCTCGAGATGGCTTTTGCT-3’
T7 Promoter: 5’-GTAATACGACTCACTATAGGG-3’
T7 Terminator: 5’- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’
T7promoter/T7terminator
Các chủng vi khuẩn E.coli DH5α, BL21(DE3)
Vector biểu hiện: pET22b+
Enzyme cắt giới hạn gồm BamHI và XhoI, enzyme gắn nối T4 ligase
(BioLabs)
Hóa chất: Cao nấm men (Yeast extraction), Tryptone, Agar, NaCl, Tris-
base, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr, Agarose, Polyarylamide, Bis-acrylamide, IPTG,
X-gal, và các hóa chất khác do hãng Merck cung cấp.
Kháng sinh và môi trƣờng nuôi cấy: Ampicilin, Penicilin-Streptomycin,
RPMI 1640 (Thermofisher), FBS, môi trƣờng LB lỏng, LB đặc.
Dung dịch: các dung dịch đệm TAE, SDS-PAGE running buffer, PBS, và
các dung dịch (dung dịch I, dung dịch II, dung dịch III) với các thành phần chi tiết
đƣợc trình bày trong bảng phụ lục 2.
2.2. Thiết bị
13
Máy PCR, máy chạy điện di, máy li tâm lạnh, máy lắc ổn nhiệt, bể ổn nhiệt, lò vi sóng, tủ lạnh sâu(-80oC), máy vortex, máy đo pH, tủ cấy vô trùng, Pipetman
các loại (Gilson, Pháp), máy soi chụp gel, kính hiển vi điện tử và các trang thiết bị
khác của phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công Nghệ Sinh Học ,
Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 bằng phản ứng PCR
Đoạn gen mã hóa mảnh kháng thể scFv kháng CD47 đƣợc khuếch đại bằng
phản ứng PCR với cặp mồi LH47F/LH47R. Thành phần phản ứng gồm 12.5 μL
GoTaq master mix, 1 μL primer LH47F 10pM, 1 μL primer LH47R 10pM, 2 μL khuôn, 8.5 μL H2O. Chu kỳ nhiệt của phản ứng: bƣớc 1: biến tính 94oC trong 3 phút; bƣớc 2: chu trình lặp lại 30 chu kỳ (94oC trong 45 giây, 52oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút 20 giây); bƣớc 3: hoàn thiện sản phẩm ở 72oC trong 8 phút; bƣớc 4: làm mát sản phẩm PCR ở 10oC trong 30 phút.
2.3.2. Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 0,8% : cân 0,8g agarose cho vào 100 ml dung dịch
TAE 1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50oC rồi rót dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lƣợc. Sau khoảng
30 phút khi gel đã đông, gỡ lƣợc ra, đặt bản gel vào bể điện di. Rót đệm TAE 1X
vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 5mm.
Tra mẫu DNA : Lấy mẫu DNA trộn với loading dye 6X rồi tra vào các
giếng trên bản gel.
Chạy điện di ở điện thế 95-100V, trong thời gian khoảng 25-30 phút.
DNA di chuyển từ cực âm đến cực dƣơng. Quan sát sự di chuyển màu bromophenol
blue để biết khi nào cần dừng điện di.
Soi gel: Bản gel đƣợc lấy nhẹ ra khỏi khay và ngâm vào dung dịch EtBr
nồng độ 2 µg/ml trong khoảng 5 phút rồi rửa lại bằng nƣớc. Hiển thị kích thƣớc
DNA dƣới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi gel. Ƣớc tính kích thƣớc của
14
DNA bằng cách đối chiếu với thang DNA chuẩn.
2.3.3. Cắt vector và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn
Sản phẩm PCR nhân gen anti-CD47 với cặp mồi LH47F/LH47R và vector
pET22b+ đƣợc cắt đồng thời bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI.
Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR gồm 20 μL sản phẩm PCR, 3 μL
BamHI, 3 μL XhoI, 5 μL Buffer, 19 μL H2O.
Thành phần phản ứng cắt vector pET22b+ gồm 15 μL vector, 3 μL BamHI,
3 μL XhoI, 5 μL Buffer, 24 μL H2O.
Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC, qua đêm.
2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và vector pET22b+ sau phản ứng cắt bằng kit
tinh sạch
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bột kit GeneJET PCR purification
(Fermentas). Các bƣớc tinh sạch đƣợc thực hiện theo chỉ dẫn kit:
Bổ sung dung dịch binding buffer với thể tích bằng thể tích của mẫu cần
tinh sạch, trộn đều.
Chuyển toàn bộ hỗn hợp ở trên lên cột tinh sạch. Ly tâm cột 12 000 v/ph
trong 1 phút, loại dịch qua cột.
Bổ sung 700 μL dung dịch washing buffer lên cột. Ly tâm cột 12 000 v/ph
trong 1 phút, loại dịch qua cột.
Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để loại hoàn toàn dịch, bỏ dịch qua cột.
Chuyển cột sang ống eppendorf mới. Bổ sung 45 µL H2O lên cột, để cột ở
nhiệt độ phòng khoảng 1-3 phút.
Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để thu sản phẩm tinh sạch qua cột.
Chúng tôi tiến hành nuôi chủng E.coli BL21 tái tổ hợp trong 50 mL môi trƣờng LB có bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL và cảm ứng IPTG 5 mM 3 h ở 37oC, tốc độ lắc
200 vòng/phút. Ly tâm loại dịch môi trƣờng nuôi cấy để thu sinh khối tế bào. Đồng
hóa tế bào trong dung dịch Guanidinium Lysis Buffer (Guanidine HCl 6M, sodium
phosphate 20 mM, pH 7.8, NaCl 500 mM), sau đó siêu âm, phá vỡ tế bào và ly têm
15
thu dịch nổi cho quá trình tinh sạch. Do kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp có 6 Histidine ở đầu C nên có ái lực cao với Ni2+, vì vậy chúng tôi tinh sạch kháng thể
này bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực với Ni-NTA resin. Trong quá trình tinh sạch, Imidazole đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni2+ trong phức hợp Ni2+- histidine.
Các protein lẫn trong dịch chiết kháng thể tái tổ hợp đƣợc loại bỏ khỏi kháng thể tái
tổ hợp ở nồng độ Imidazole 50 mM. Sau đó kháng thể tái tổ hợp đƣợc đẩy ra khỏi
cột nhờ buffer đẩy (Native Elution Buffer), chúng tôi thu 2 phân đoạn với thể tích 1
mL/phân đoạn ở nồng độ Imidazol 250 mM
2.3.5. Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+
Thể tích phản ứng gắn nối 10 μL gồm 3 μL sản phẩm PCR, 2 μL vector pET22b+, 1 μL buffer, 1 μL T4 ligase, 3 μL H2O. Ủ phản ứng ở 16oC qua đêm. Sau
đó, sản phẩm ghép nối gen đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.3.6. Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt
Chuẩn bị tế bào khả biến Lấy chủng tế bào đƣợc cất ở - 20oC, cấy vạch tế bào trên đĩa môi trƣờng
LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 37oC.
Nhặt một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi lắc ở
37oC qua đêm.
Cấy chuyển 1% dịch nuôi tế bào qua đêm sang môi trƣờng LB mới. Nuôi
lắc ở 37oC đến khi OD600 đạt 0.5-0.7.
Chuyển dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút. Ly tâm thu tế bào ở 4oC, 4000 v/ph, 5 phút.
Loại dịch nổi, hòa tan cặn tế bào trong 300 µl CaCl2 0.1M, đặt trong đá
10 phút.
Ly tâm ở 4oC , 4000 v/ph, 5 phút, loại dịch. Hòa tan tủa trong 100 µl (CaCl2 0.1 M , glycerol 30%), giữ ở -80oC.
Biến nạp Lấy tế bào khả biến giữ trong tủ -80oC ra, đặt trên đá khoảng 30 phút.
Bổ sung dung dịch sau phản ứng gắn vào ống eppendorf chứa bào khả
16
biến, đặt trong đá 30 phút.
Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, sau đó đặt ngay ống tế bào vào đá để trong
5 phút.
Bổ sung 100µl môi trƣờng LB, nuôi lắc 200 v/ph ở 37oC trong 1 giờ.
Cấy trải dịch tế bào trên môi trƣờng LB/agar bổ sung Amp (100µg/ml). Nuôi ở tủ ấm qua đêm ở 37oC.
2.3.7. Tách plasmid từ vi khuẩn E. coli theo phƣơng pháp mini-prep của
Sambrook
Hóa chất: dung dịch I, dung dịch II và dung dịch III, dung dịch 25:24:1 với
các thành phần đƣợc trình bày cụ thể trong bảng phụ lục 2.
Quy trình
Nuôi tế bào trong môi trƣờng LB lỏng: lấy một khuẩn lạc từ đĩa petri nuôi trong 2 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicilin 100µg/ml, nuôi lắc ở 37oC,
200 v/ph.
Hòa tan tế bào trong 150 µl dung dịch I.
Bổ sung 150 µl dung dịch II, đảo nhẹ ống nghiệm.
Bổ sung 150 µl dung dịch III, đảo đều ống nghiệm, để ở trong đá 10 phút.
Bổ sung 450 µl dung dịch 25:24:1, đảo đều ống nghiêm.
Ly tâm ở 13000 v/ph trong 15 phút.
Hút cẩn thận pha trên cho vào ống eppendorf mới. Bổ sung 500 µl Isopropanol, để ở -20oC khoảng 30 phút.
Ly tâm ở 13000 v/p, 15 phút để thu tủa.
Rửa tủa bằng cồn 70%. Làm khô tủa, hòa tan tủa trong H2O bổ sung RNase, ủ ở 37oC, 30 phút. Điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose.
2.3.8. Chọn dòng plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp PCR
Chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng mọc trên đĩa thạch rồi tiến hành
tách plasmid và chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7 promoter/T7
terminator bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide trên vector pET22b+ nằm ở hai
17
đầu vùng đa tách dòng (MCS) là vị trí nhận biết của các enzyme cắt giới hạn. Thành
phần của phản ứng 25 μL gồm 12.5 μL GoTaq master mix, 1 μL primer T7
promoter 10pM, 1 μL primer T7 terminator 10pM, 2 μL DNA plasmid, 8.5 μL H2O. Chu kỳ nhiệt của phản ứng: bƣớc 1: biến tính 94oC trong 3 phút; bƣớc 2: chu trình lặp lại 30 chu kỳ (94oC trong 45 giây, 50oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút 20 giây); bƣớc 3: hoàn thiện sản phẩm ở 72oC trong 8 phút; bƣớc 4: làm mát sản phẩm PCR ở 10oC trong 30 phút.
2.3.9. Quy trình biểu hiện kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện E.coli
Cấy hoạt hóa 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch vào 2 ml môi trƣờng LB bổ sung
Ampicilin 1000 µg/mL. Nuôi lắc ở 37OC, 200 v/ph, qua đêm.
Cấy chuyển 1% dịch môi trƣờng đã nuôi cấy qua đêm vào môi trƣờng mới bổ sung Amp 1000 µg/mL theo thể tích phù hợp, nuôi lắc ở 37oC, 200 v/ph. Khi
OD600 của môi trƣờng nuôi cấy đạt 0.6, hút ra 500 µL dịch môi trƣờng, sau đó tế
bào đƣợc cảm ứng với IPTG 0.5 mM. Thu mẫu cảm ứng sau 3-5 h và mẫu cảm ứng
qua đêm. Ly tâm thu sinh khối tế bào.
2.3.10. Quy trình điện di protein SDS-PAGE
Hòa tan sinh khối tế bào trong đệm lysis buffer (NaH2PO4 50mM, NaCl
300mM, pH 8.0). Sau đó bổ sung SDS sample 5X (Tris HCl 60mM, Glycerol 25%,
SDS 2%, 2-mercaptoethanol 5%, bromophenol blue 0.1%) và xử lý mẫu ở nhiệt độ 100oC khoảng 10 phút.
Protein tổng số của từng mẫu tế bào đƣợc tra trên các giếng của gel
polyacrylamide 12% trong đệm SDS-PAGE 1X.
Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở điện thế 75V cho đến khi thuốc nhuộm
trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel.
Ngâm bản gel trong dung dịch nhuộm (Methanol 50% (v/v), Acid acetic
10% (v/v), Coomassie Brilliant Blue 0,2% (w/v)) trong 30 phút.
Tẩy gel bằng dung dịch tẩy (Methanol 50% (v/v), Acid acetic 10% (v/v)
18
cho đến khi có thể quan sát rõ các băng protein.
2.3.11. Tinh sạch kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp bằng phƣơng pháp sắc ký ái
lực với Ni-NTA resin
Ly tâm thu sinh khối tế bào từ 50 mL môi trƣờng. Đồng hóa sinh khối tế bào
trong 8 mL dung dịch Guanidin Lysis Buffer (6 M Guanidin hydrochloride, Sodium
phosphate 20 nM, pH 7.8, NaCl 500 mM). Siêu âm để phá tế bào trong 5 phút.
Ly tâm dịch sau siêu âm ở 5 000 v/ph, 10 phút. Thu dịch nổi để chuyển lên cột Ni2+ . Đảo đều cột trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Cố định cột theo chiều
thẳng đứng.
Rửa cột 2 lần bằng 4 mL Denaturing Binding Buffer (Urea 8 M; Sodium
phosphate 20 mM, pH 7.8, NaCl 500 mM). Sau đó rửa cột 2 lần bằng 4 mL Denaturing
Wash Buffer (Urea 8 M; Sodium phosphate 20 mM, pH 6, NaCl 500 mM).
Rửa cột 4 lần bằng 8 ml dung dịch Native Wash Buffer (Native
Purification Buffer và Imidazole 250 mM, pH 6). Giải hấp protein bằng 6 ml Native
Elution Buffer và thu 1ml/phân đoạn.
2.3.12. Nuôi cấy dòng tế bào Jurkat
Hoạt hóa tế bào Jurkat: Làm ấm môi trƣờng nuôi cấy ở 37oC.
Lấy ống giữ dòng tế bào trong Nitơ lỏng ra và đặt nhanh vào bể ổn nhiệt 37oC đồng thời khuấy nhẹ ống tế bào trong nƣớc để làm rã đông tế bào cho đến khi
tế bào tan hoàn toàn (khoảng 1-2 phút).
Hút dịch tế bào vào ống falcon 15 chứa 5 mL môi trƣờng RPMI. Ly tâm tế
bào 800 v/ph, 3 phút để loại bỏ DMSO.
Hòa tan nhẹ nhàng tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy rồi hút nhẹ dịch tế
bào chuyển vào bình nuôi cấy chuyên dụng T-flask chứa môi trƣờng RPMI1640 bổ
sung FBS 10% và kháng sinh PS 0.1%.
Đặt bình nuôi cấy tế bào vào tủ nuôi 37oC, CO2 5%. Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi quang học, soi ngƣợc. Khi tế
bào phát triển phủ kín khoảng 90% bình (sau khoảng 72 h) thì tiến hành cấy chuyển
19
tế bào sang các bình khác.
Cấy chuyển
Mục đích: Tăng sinh tế bào, duy trì tế bào ở trạng thái hoạt động.
Thu dịch tế bào vào ống falcon 15, ly tâm tế bào 800 v/ph, 3 phút để loại
bỏ môi trƣờng cũ.
Hòa tan nhẹ nhàng tế bào trong môi trƣờng RPMI mới. Chia dịch huyền
phù tế bào sang các bình T-flask mới chứa môi trƣờng RPMI1640 bổ sung FBS
10% và kháng sinh PS 0,1%.
Nuôi tế bào trong tủ ấm ở 37oC, CO2 5%.
2.3.13. Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang
Chuẩn bị tế bào
Ly tâm dịch tế bào nuôi cấy ở 1500 v/ph, 5 phút, bỏ dịch, thu sinh khối tế
bào. Số tế bào cần dùng là 105 – 106 tế bào.
Rửa tế bào bằng 1 mL dung dịch PBS 1X. Ly tâm với tốc độc 1500 v/ph
khoảng 5 phút, loại dịch nổi, thu tế bào.
Cố định tế bào
Ủ tế bào với 400 µL dung dịch paraformaldehyde 4% (pH 7.4) khoảng 10
phút . Sau đó ly tâm 1500 v/ph, 5 phút.
Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 800 µL dung dịch PBS 1X vào ống tế bào, đảo
trộn đều. Sau đó ly tâm 1500 v/ph, 5 phút, loại dịch nổi, thu tế bào.
Làm thấm màng tế bào
Bổ sung 700 µL dung dịch đệm PBS 1X chứa Triton X-100 0.1%, đảo
trộn đều và ủ tế bào ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút.
Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 800 µL dung dịch PBS 1X vào ống tế bào, đảo
trộn đều. Sau đó ly tâm 1500 v/ph, 5 phút, loại dịch nổi, thu tế bào.
Blocking
Bổ sung 1 mL dung dịch đệm PBS 1X chứa BSA 2% vào tế bào. Ủ tế bào ở
nhiệt độ phòng khoảng 60 phút.
Ủ tế bào với kháng thể
20
Bố trí 2 mẫu:
Mẫu 1: Tế bào Jurkat ủ với kháng thể anti-CD47-GFP (đặt của hãng
Biosciences)
Pha loãng kháng thể anti-CD47-GFP trong 500 µL dung dịch đệm PBS
chứa BSA 0.1% theo tỷ lệ 1:50 và bổ sung vào tế bào, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 3 h.
Rửa tế bào 3 lần với 500 µL dung dịch đệm PBS 1X bằng cách ly tâm ở
1500 v/ph, 5 phút.
Hòa tan tế bào trong 100 µL dung dịch PBS 1X, sau đó hút dịch tế bào
vào đĩa chuyên dụng để quan sát tế bào dƣới kính hiển vi huỳnh quang.
Mẫu 2: tế bào Jurkat ủ với kháng thể tái tổ hợp anti-CD47 sau đó ủ tiếp với
kháng thể anti-CD47-GFP.
Pha loãng kháng thể tái tổ hợp anti-CD47 trong 500 µL dung dịch đệm
PBS chứa BSA 0.1% theo tỷ lệ 1:20 và bổ sung vào tế bào, ủ ở nhiệt độ phòng
khoảng 3 h.
Rửa tế bào 3 lần với 500 µL dung dịch đệm PBS 1X bằng cách ly tâm ở
1500 v/ph, 5 phút.
Pha loãng kháng thể anti-CD47-GFP trong 500 µL dung dịch đệm PBS
chứa BSA 0.1% theo tỷ lệ 1:50 và bổ sung vào tế bào, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 3 h.
Rửa tế bào 3 lần với 500 µL dung dịch đệm PBS 1X bằng cách ly tâm ở
1500 v/ph, 5 phút.
Hòa tan tế bào trong 100 µL dung dịch PBS 1X, sau đó hút dịch tế bào
21
vào đãi chuyên dụng để quan sát tế bào dƣới kính hiển vi huỳnh quang.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nhân gen mã hóa kháng thể kháng CD47
Gen mã hóa kháng thể kháng CD47 (anti-CD47) có kích thƣớc khoảng 900
bp chứa một khung đọc mở mã hóa cho kháng thể có cấu trúc dạng scFv. Gen anti-
CD47 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu LH47F/LH47R.
Kết quả của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và đƣợc thể
(-)
1
2
hiện trên hình 3.1.
900 bp
Hình 3.1. Kết quả nhân gen anti-CD47 bằng phản ứng PCR. Cặp mồi LH47F/LH47R đặc hiệu gen anti-CD47. (-): Đối chứng âm không có khuôn, 1. Marker 1 kb, 2. Sản phẩm PCR kích thƣớc 900 bp.
Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy ở giếng số 2 xuất hiện băng đậm có
kích thƣớc khoảng 900 bp phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thƣớc của gen
anti-CD47. Kết quả này cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc có chất lƣợng tốt và phản
ứng nhân gen bằng phƣơng pháp PCR của chúng tôi đã thực hiện thành công. Tiếp
theo, sản phẩm nhân gen anti-CD47 đƣợc dùng để gắn nối vào vector pET22b+
nhằm tạo ra vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47.
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47
3.2.1. Cắt vector pET22b+ và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn
22
Vector pET22b+ và sản phẩm PCR đƣợc cắt đồng thời bằng hai enzyme cắt giới hạn là BamHI và XhoI. Phản ứng cắt đƣợc ủ ở 37oC qua đêm. Kết quả của
phản ứng cắt vector đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với vector
pET22b+ gốc và đƣợc thể hiện trên hình 3.2.
5493 bp
Hình 3.2. Cắt vector pET22b+ bằng enzyme cắt giới hạn. Vector pET22b+ đƣợc cắt đồng thời bằng hai enzyme BamHI và XhoI, phản ứng cắt đƣợc ủ ở 37oC, qua đêm. 1.Marker
1kb, 2. vector pET22b+ sau khi cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn, 3. vector pET22b+.
Kết quả điện di trên Hình 3.2 cho thấy vector pET22b+ đã đƣợc cắt mở vòng
bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI, sản phẩm cắt là 1 băng duy nhất với
kích thƣớc 5493 bp nằm giữa hai băng 5000 bp và 6000 bp của marker (đƣờng chạy 2).
3.2.2. Kết quả gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47
Kết quả gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+
Sản phẩm PCR và vector pET22b+ sau khi cắt đƣợc tinh sạch bằng kit tinh
sạch (GeneJET PCR Purification Kit) và đƣợc dùng để gắn nối với nhau
bằng enzyme T4 ligase nhằm tạo vector biểu hiện tái tổ hợp. Sau đó, sản
phẩm gắn nối đƣợc biến nạp vào chủng tế bào khả biến E. coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt.
Dịch tế bào sau biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB/agar bổ sung Amp 100 µg/ml. Sau khi ủ qua đêm ở 37oC, các khuẩn lạc trắng mọc trên đĩa thạch
23
(Hình 3.3).
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gen giữa sản phẩm PCR (khuếch đại gen
antiCD47) và vector pET22b+ vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Tế bào đƣợc ủ ở 37oC qua đêm để quan sát rõ hình thái khuẩn lạc trắng.
Kết quả trên Hình 3.3 cho thấy các khuẩn lạc phát triển đƣợc trên môi trƣờng
có kháng sinh ampicilin là do plasmid có mang gen kháng ampicilin. Hình thái của
các khuẩn lạc trắng tròn đều, không bị nhiễm, chƣa có khuẩn lạc vệ tinh (do thời
gian ủ thích hợp, các khuẩn lạc chƣa kịp phân giải Ampicilin trong môi trƣờng nên
các khuẩn lạc vệ tinh chƣa kịp mọc). Điều này cho thấy quá trình gắn nối sản phẩm
PCR đầu bằng vào vector pET-22b+ và quá trình biến nạp bằng phƣơng pháp sốc
nhiệt đã đƣợc chúng tôi thực hiện thành công.
Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc màu trắng mọc và phát triển đƣợc
trên môi trƣờng LB/agar có Amp đều mang plasmid tái tổ hợp chứa gen cần tách
dòng mà còn có cả vector gốc pET-22b+ tự đóng vòng. Do đó chúng tôi thực hiện
các thí nghiệm tiếp theo để sàng lọc đƣợc các khuẩn lạc thực sự có mang plasmid
tái tổ hợp, đó là: tách chiết plasmid, kiểm tra plasmid bằng phƣơng pháp PCR với
mồi T7 promoter/T7 terminator.
Kiểm tra sơ bộ các dòng mang gen anti-CD47
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng mọc trên môi trƣờng
kháng sinh chọn lọc để tách plasmid nhằm chọn đƣợc các dòng plasmid mang gen
24
anti-CD47. Kết quả điện di đƣợc thể hiện trên Hình 3.4.
Hình 3.4. Kiểm tra sơ bộ các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47. Hình ảnh điện di
so sánh kích thƣớc của 5 dòng với vector gốc pET22b+. 1. vector gốc pET22b+, 2. plasmid
dòng 1, 3. Plasmid dòng 2, 4. Plasmid dòng 3, 5. Plasmid dòng 4, 6. plasmid dòng 5.
Do đƣợc gắn thêm gen anti-CD47 nên kích thƣớc của vector tái tổ hợp lớn
hơn kích thƣớc của vector pET22b+ gốc.
Phân tích Kết quả điện di trên Hình 3.4 cho thấy ở các đƣờng chạy 1,2,3 và 5
đều xuất hiện 2 băng đó là hai dạng cấu trúc cuả plasmid. Trong đó plasmid ở
đƣờng chạy số 1,3 và 5 sáng và rõ hơn có băng cao hơn plasmid gốc nên chúng đều
có khả năng mang gen anti-CD47. Để khẳng định chắc chắn, chúng tôi tiến hành
phản ứng PCR với khuôn là các dòng plasmid trên cùng với đối chứng là plasmid
gốc với cặp mồi T7 promoter/T7 terminantor. Kết quả của phản ứng PCR đƣợc thể
hiện trên Hình 3.5 dƣới đây.
25
300 bp
Hình 3.5. Kiểm tra các dòng plasmid mang gen anti-CD47. Hình ảnh điện di sản phẩm
PCR với cặp mồi T7 promoter/T7 terminator, khuôn là plasmid gốc, plasmid dòng 1, 3 và
5. Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid gốc có kích thƣớc khoảng 309 bp, sản phẩm PCR
của các dòng tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 1300 bp. 1. plasmid gốc pET22b+, 2.
plasmid dòng số 1, 3. plasmid dòng số 3, 4. plasmid dòng số 5, 5. Marker 1 kb.
Cặp mồi T7 promoter/T7 terminator bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide
từ vùng đầu đến vùng cuối của vùng MCS (vùng đa tách dòng) trên vector
pET22b+. Do đó khi đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR, plasmid gốc đƣợc nhân
băng kích thƣớc khoảng 300 bp, plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân băng kích thƣớc
khoảng 1300 kb. Kết quả điện di trên Hình 3.5 cho thấy các sản phẩm PCR có kích
thƣớc phù hợp với tính toán lý thuyết, các dòng plasmid 1, 3 và 5 đều là các dòng
plasmid tái tổ hợp. Chúng tôi chọn dòng số 1 để giải trình tự gen.
Kết quả giải trình tự gen
Sử dụng cặp mồi T7 promoter/T7 terminator của vector để giải trình tự gen
dòng số 1 thu đƣợc trình tự nucleotite và dịch mã trình tự này sang trình tự axit
1 M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A 1 ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCG 21 M A M D I G I N S D P E E L Q V I Q P D 61 ATGGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGAC 41 K S V L V A A G E T A T L R C T A T S L 121 AAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGCGCTGCACTGCGACCTCTCTG 61 I P V G P I Q W F R G A G P G R E L I Y 181 ATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTAC 81 N Q K E G H F P R V T T V S D L T K R N 241 AATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGACCTCACAAAGAGAAAC 101 N M D F S I R I G N I T P A D A G T Y Y 301 AACATGGACTTTTCCATCCGCATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTAC 121 C V K F R K G S P D D V E F K S G A G T 361 TGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACT 141 E L S V R A K P S A P V V S G P A A R A 421 GAGCTGTCTGTGCGCGCCAAACCCTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCC 161 T P Q H T V S F T C E S H G F S P R D I 481 ACACCTCAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCACGGCTTCTCACCCAGAGACATC
26
amin chúng tôi đƣợc kết quả nhƣ sau:
181 T L K W F K N G N E L S D F Q T N V D P 541 ACCCTGAAATGGTTCAAAAATGGGAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCC 201 V G E S V S Y S I H S T A K V V L T R E 601 GTAGGAGAGAGCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCAAGGTGGTGCTGACCCGCGAG 221 D V H S Q V I C E V A H V T L Q G D P L 661 GACGTTCACTCTCAAGTCATCTGCGAGGTGGCCCACGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTT 241 R G T A N L S E T I R V P P T L E V T Q 721 CGTGGGACTGCCAACTTGTCTGAGACCATCCGAGTTCCACCCACCTTGGAGGTTACTCAA 261 Q P V R A E N Q V N V T C Q V R K F Y P 781 CAGCCCGTGAGGGCAGAGAACCAGGTGAATGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCC 281 Q R L Q L T W L E N G N V S R T E T A S 841 CAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAACGTGTCCCGGACAGAAACGGCCTCA 301 T V T E N K D G T Y N W M S W L L V N V 901 ACCGTTACAGAGAACAAGGATGGTACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAATGTA 321 S A H R D D V K L T C Q V E H D G Q P A 961 TCTGCCCACAGGGATGATGTGAAGCTCACCTGCCAGGTGGAGCATGACGGGCAGCCAGCG 341 V S K S H L E H H H H H H * 1021GTCAGCAAAAGCCATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
Hình 3.6. Trình tự nucleotide của gen mã hóa kháng thể anti-CD47 và trình tự axit amin
của kháng thể anti-CD47. Trình tự axit đƣợc đánh dấu màu xanh lá cây là đuôi His-tag. Mã
mở đầu ATG và mã kết thúc TGA đƣợc đánh dấu màu đỏ.
Kết quả giải trình tự cho thấy dòng số 1 mang đúng trình tự gen mã hóa
kháng thể anti-CD47 bao gồm 1059 nucleotide, có mã mở đầu ATG và mã kết thúc
TGA . Sáu bộ ba mã hóa cho Histidine nằm trƣớc mã kết thúc nên protein đích biểu
hiện chứa đuôi His-tag thuận lợi cho việc phát hiện và tinh sạch. Đoạn gen mã hóa
kháng thể anti-CD47 đƣợc gắn vào vector pET22b+ đúng chiều, đúng khung đọc và
không có đột biến. Dịch mã từ trình tự nucleotide của gen mã hóa kháng thể anti-
CD47 sang trình tự axit amin, chúng tôi thu đƣợc một protein có trình tự gồm 353
axit amin tƣơng đƣơng với khối lƣợng xấp xỉ 39 kDa đúng với kích thƣớc của
kháng thể anti-CD47 theo tính toán lý thuyết. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã
thiết kế và tạo thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen mã hóa
27
kháng thể anti-CD47.
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện
E.coli
Dòng plasmid số 1 sau khi khẳng định bằng phƣơng pháp giải trình tự gen
đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến BL21 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt và đƣợc nuôi cấy chọn lọc trên môi trƣờng LB agar có bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL ở 37oC
qua đêm. Trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng chứng tỏ các khuẩn lạc
này đều mang vector tái tổ hợp. Tiếp theo, cấy hoạt hóa 1 khuẩn lạc vào môi trƣờng
LB bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL qua đêm. Cấy chuyển 1% thể tích dịch môi
trƣờng nuôi cấy qua đêm sang môi trƣờng LB mới bổ sung Ampicilin µg/mL theo thể tích phù hợp, nuôi lắc tế bào ở 37oC cho đến khi OD của môi trƣờng đạt 0.6-0.8
thì bổ sung IPTG để cảm ứng biểu hiện protein đích. Trong nghiên cứu này, chúng
tôi khảo sát 2 nồng độ IPTG là 0.5 mM và 1 mM, thời gian biểu hiện là 3h và 16h, nhiệt độ biểu hiện ở 25oC, 30oC và 37oC. Protein tổng số của các thí nghiệm đã
khảo sát đƣợc điện di đồng thời trên cùng 1 bản gel SDS-PAGE 12% (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của kháng thể kháng CD47 ở tế bào vi khuẩn E.coli
BL21DE3 bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE. M. marker protein, 1. Mẫu trƣớc cảm ứng, 2. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 3h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 3. Mẫu cảm ứng IPTG 1 mM thu mẫu sau 3h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 4. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5
28
mM, thu mẫu sau 5h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 5. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37 oC, 6. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 25oC, 7. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, 8. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC.
Kết quả điện di trên Hình 3.7 cho thấy khi có mặt chất cảm ứng IPTG ở tất
cả các mẫu đã khảo sát tƣơng ứng với các đƣờng chạy từ 2-8 đều xuất hiện một
băng đậm có kích thƣớc khoảng 39 kDa đƣợc dự đoán là kích thƣớc của kháng thể
anti-CD47. Trong khi đó, mẫu không đƣợc cảm ứng IPTG (đƣờng chạy số 1) không
có băng này. Ở nồng độ chất cảm ứng 0.5 mM, thời gian cảm ứng 3 h, nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, protein đích đƣợc biểu hiện mạnh nhất thể hiện qua băng đậm (đƣờng
chạy số 2). Tại nồng độ IPTG 0.5 mM, thời gian cảm ứng 16 h và nhiệt độ nuôi cấy lần lƣợt là 25oC, 30oC và 37oC, hình ảnh điện di cho thấy protein đích biểu hiện
tƣơng ứng với các băng có độ đậm nhƣ nhau. Để rút ngắn thời gian nuôi cấy, chúng tôi chọn điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, nồng độ chất cảm ứng 0.5 mM và thời
gian cảm ứng biểu hiện 3 h để sản xuất kháng thể anti-CD47 trong các thí nghiệm
tiếp theo.
3.4. Kết quả tinh sạch kháng thể anti-CD47
Nhằm mục tiêu tạo ra đƣợc một lƣợng lớn kháng thể anti-CD47 ở dạng tinh
sạch, dựa trên kết quả phần tối ƣu hóa. Sau khi tinh sạch, kháng thể anti-CD47 đƣợc
kiểm tra độ sạch trên bằng phƣơng pháp điện di biến tính protein SDS-PAGE (Hình
29
3.8).
39 kDa
Hình 3.8. Kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể anti-CD47 sau quá trình tinh sạch. 1. Kháng
thể anti-CD47 tinh sạch ở phân đoạn 2, 2. Kháng thể anti-CD47 tinh sạch ở phân đoạn 1, 3.
Marker protein.
Kết quả điện di trên Hình 3.8 cho thấy, ở đƣờng chạy 1 và 2 chỉ xuất hiện
một băng đậm duy nhất tƣơng ứng với kích thƣớc khoảng 39 kDa là kích thƣớc của
kháng thể anti-CD47. Kết quả này cho thấy kháng thể anti-CD47 có độ tinh sạch
cao sau quá trình tinh sạch. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính của
kháng thể anti-CD47 sau tinh sạch.
3.5. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng
nguyên CD47
Khả năng liên kết của kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp thu đƣợc với kháng
nguyên CD47 đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang. Do Jurkat
là dòng tế bào biểu hiện mạnh CD47 nên dòng tế bào này đƣợc chọn để khảo sát. Sự
liên kết liên kết giữa kháng thể anti-CD47 và kháng nguyên CD47 biểu hiện trên bề
30
mặt tế bào Jurkat đƣợc thể hiện trên Hình 3.9.
Hình 3.9. Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47
biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat. (A). Hình ảnh tế bào Jurkat sau khi ủ với kháng thể
anti-CD47-GFP đƣợc quan sát dƣới ánh sáng trắng của kính hiển vi huỳnh quang, (B).
Hình ảnh tế bào Jurkat sau khi ủ với kháng thể anti-CD47-GFP đƣợc quan sát dƣới ánh
sáng có bƣớc sóng kích thƣớc 465 nm của kính hiển vi huỳnh quang, (C) Hình ảnh tế bào
Jurkat sau khi ủ với kháng thể anti-CD47 sau đó ủ tiếp với kháng thể anti-CD47-GFP đƣợc
quan sát dƣới ánh sáng trắng của kính hiển vi huỳnh quang, (D). Hình ảnh tế bào Jurkat
sau khi ủ với kháng thể anti-CD47 sau đó ủ tiếp với kháng thể anti-CD47-GFP đƣợc quan
sát dƣới ánh sáng có bƣớc sóng kích thƣớc 465 nm của kính hiển vi huỳnh quang.
Kết quả thu đƣợc trên Hình 3.9 cho thấy, mẫu 1 (Hình 3.9 B) có tín hiệu
huỳnh quang rất mạnh thể hiện tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên CD47 và
kháng thể anti-CD47-GFP. Mẫu 2 (Hình 3.9 D) có tín hiệu huỳnh quang rất yếu
chứng tỏ rằng kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp đã liên kết đƣợc với kháng nguyên
31
CD47 trên bề mặt tế bào Jurkat trƣớc khiến cho kháng thể anti-CD47-GFP hầu nhƣ
không còn vị trí để liên kết với kháng nguyên CD47. Kết quả này cho thấy kháng
thể tái tổ hợp anti-CD47 mà chúng tôi thu đƣợc có khả năng liên kết đặc hiệu với
CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat.
Miễn dịch huỳnh quang là phƣơng pháp nhận diện đích dựa trên tƣơng tác
đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể cho kết quả khách quan, chính xác và
đƣợc coi là một xét nghiệm tiêu chuẩn phát hiện sự biểu hiện của kháng nguyên trên
bề mặt tế bào với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Do đó, kết quả miễn dịch huỳnh
quang cho thấy kháng thể tái tổ hợp anti-CD47 dạng scFv đƣợc tạo ra trong nghiên
cứu này có độ đặc hiệu với kháng nguyên CD47 và có tiềm năng ứng dụng trong
32
việc chẩn đoán và điều trị bệnh ung thƣ máu.
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi đƣa ra
một số kết luận sau:
1. Đã đƣa gen mã hóa kháng thể antiCD47 có kích thƣớc khoảng 900 bp vào vector
biểu hiện pET-22b+.
2. Đã tạo ra đƣợc chủng biểu hiện BL21 (DE3) có khả năng biểu hiện kháng thể tái
tổ hợp antiCD47 kích thuớc 39 kDa trên điện di SDS – PAGE và xác định đuợc một
số điều kiện thích hợp để biểu hiện protein tái tổ hợp scFv antiCD47 là: nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM; nhiệt độ nuôi cấy là 37oC và thu mẫu sau 3 giờ cảm
ứng.
3. Đã buớc đầu tinh sạch thành công protein tái tổ hợp scFv antiCD47 và bƣớc đầu
thử nghiệm tƣơng tác đặc hiệu với kháng nguyên đích CD47 trên dòng tế bào Jurkat
bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang.
KIẾN NGHỊ
Dựa vào các kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này, tôi mong muốn tiến hành
thêm các nghiên cứu:
1. Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện và tinh sạch kháng thể anti-CD47 ở quy mô lớn.
33
2. Thử nghiệm sâu hơn các hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp thu đƣợc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo Tiếng Việt
1. Bộ môn Ung thƣ (2005), Ung thư học đại cương, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
2. PGS. TS Nguyễn Bá Đức (2009), Bài giảng ung thư học, Nhà xuất bản Y
học, Hà Nội.
3. Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2012), Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng,
Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội.
4. Lê Đình Sáng (2010), Bệnh học ung thư, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. PSG. TS Phạm Văn Ty (2008), Miễn dịch học, Nhà xuất bản giáo dục.
Tài liệu tiếng Anh
6. Huang Y, Ma Y, Gao P, Yao Z(2017). Targeting CD47: the achievements
and concerns of current studies on cancer immunotherapy. J Thorac
Dis:E168 – E174.
7. JaiswalS,JamiesonCH,PangWW(2009)CD47isupregulatedoncirculating
hematopoietic stem cells and le ukemia cells to avoid phagocytosis. Cell;
138:271 – 285.
8. Pang WW(2013), Pluvinage JV, Price EA, et al Hematopoietic stem cell and
progenitor cell mechanisms in myelodysplastic syndromes. Proc Natl Acad
Sci USA; 110:3011 – 3016.
9. Chao MP (2011), Alizadeh AA, Tang C, Jan M, Weissman-Tsukamoto R,
Zhao F, Park CY, Weissman IL, Majeti R. Therapeutic antibody targeting of
CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer
Res;71 (4):1374–1384.
10. Chao MP, Alizadeh AA, Tang C(2010). Anti-CD47 antibody synergizes with
rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma.
34
Cell; 142:699–713.
11. Chao MP (2012), Weissman IL, Majeti R. The CD47-SIRP alpha pathway in
cancer immune evasion and potential therapeutic implications. Curr Opin
Immunol. 24:225–232.
12. Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, etal.(2012)The CD47-signal
regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human
solid tumors. Proc Natl Acad Sci U S A; 109:6662–6667.
13. BetancurPA,AbrahamBJ,YiuYY,etal(2017).ACD47-associatedsuper-
enhancer links pro-inflammatory signalling to CD47 upregulation in breast
cancer. Nat Commun; 8:14802
14. Wernig G, Chen S-Y, Cui L, et al(2017). Unifying mechanism for different
fibrotic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A; 114:4757–4762
15. Kojima Y, Volkmer JP, McKenna K, et al(2016). CD47 blocking antibodies
restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature; 536:86 – 90
16. Yoshida K, Tsujimoto H, Matsumura K et al(2015). CD47 is an adverse
prognostic factor and a therapeutic target in gastric cancer. Cancer Med.
4(9), 1322–1333 .
17. Liu R, Wei H, Gao P et al(2017). CD47 promotes ovarian cancer progression
by inhibiting macrophage phagocytosis. Oncotarget 8(24), 39021–39032 .
18. Li Y, Lu S, Xu Y et al. (2017).Overexpression of CD47 predicts poor
prognosis and promotes cancer cell invasion in high-grade serous ovarian
carcinoma. Am. J. Transl. Res. 9(6), 2901–1910
19. Tong, B., & Wang, M. (2018). CD47 is a novel potent immunotherapy target
in human malignancies: current studies and future promises. Future
Oncology. doi:10.2217/fon-2018-0035 (bài gốc)
20. Jefferis, R. Recombinant antibody therapeutics(2009): The impact of
glycosylation on mechanisms of action. Trends Pharmacol. Sci, 30, 356–
362.
21. Li, F.; Vijayasankaran, N.; Shen, A.; Kiss, R.; Amanullah, A(2010). Cell
35
culture processes for monoclonal antibody production. MAbs, 2, 466–479.
22. Striedner, G.; Pfaffenzeller, I.; Markus, L.; Nemecek, S.; Grabherr, R.;
Bayer, K. Plasmid-free(2010)T7-based Escherichia coli expression
systems. Biotechnol. Bioeng.
23. Mairhofer, J.; Cserjan-Puschmann, M.; Striedner, G.; Nöbauer, K.; Razzazi-
Fazeli, E.; Grabherr, R. Marker-free(2010) plasmids for gene therapeutic
applications—Lack of antibiotic resistance gene substantially improves the
manufacturing process. J. Biotechnol.
24. Sonoda, H.; Kumada, Y.; Katsuda, T.; Yamaji, H(2011) Effects of
cytoplasmic and periplasmic chaperones on secretory production of single-
chain Fv antibody in Escherichia coli. J. Biosci. Bioeng.
25. Yuan, J.; Zweers, J.C.; Van Dijl, J.M.; Dalbey, R.E.(2010) Protein transport
across and into cell membranes in bacteria and archaea. Cell. Mol. Life
Sci, 67, 179–199.
26. Levy, R.; Ahluwalia, K.; Bohmann, D.J.; Giang, H.M.; Schwimmer, L.J.;
Issafras, H.; Reddy, N.B.; Chan, C.; Horwitz, A.H.; Takeuchi, T.(2013)
Enhancement of antibody fragment secretion into the Escherichia coli
periplasm by co-expression with the peptidyl prolyl isomerase, FkpA, in the
cytoplasm. J. Immunol. Methods
27. Costa S., Almeida A., Castro A., et al. (2014). Fusion tags for protein
solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel
Fh8 system. Front Microbiol, 5.
28. Jalalirad, R(2013). Production of antibody fragment (Fab)
throughout Escherichia coli fed-batch fermentation process: Changes in titre,
location and form of product. Electron. J. Biotechnol.
29. Ecker, D.M.; Jones, S.D.; Levine, H.L. (2015) The therapeutic monoclonal
antibody market. MAbs, 7.
30. Müller, D.; Kontermann, R.E(2014). Bispecific Antibodies. In Handbook of
Therapeutic Antibodies, 2nd ed.; Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, USA;
36
ISBN 9783527682423.
31. Drake, P.M.; Rabuka, D(2015). An emerging playbook for antibody-drug
conjugates: Lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for
improving efficacy and safety. Curr. Opin. Chem. Biol, 28, 174–180.
32. Nelson(2010), A.L. Antibody fragments: Hope and hype. MAbs, 2, 77–83.
33. Fernandes,J.C(2018). Therapeutic application of antibody fragments in
autoimmune diseases: Current state and prospects. Drug Discov. Today, 23,
1996–2002.
34. Kholodenko, R.V.; Kalinovsky, D.V.; Doronin, I.I.; Ponomarev, E.D.;
Kholodenko, I. V(2017)Antibody Fragments as Potential Biopharmaceuticals
for Cancer Therapy: Success and Limitations. Curr. Med. Chem..
35. Bird, R.E.; Hardman, K.D.; Jacobson, J.W.; Johnson, S.; Kaufman, B.M.;
Lee, S.M.; Lee, T.; Pope, S.H.; Riordan, G.S.; Whitlow, M.(1988)Single-
chain antigen-binding proteins.
36. Huston, J.S.; Levinson, D.; Mudgett-Hunter, M.; Tai, M.S.; Novotný, J.;
Margolies, M.N.; Ridge, R.J.; Bruccoleri, R.E.; Haber, E.; Crea, R.(1988)
Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity
in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia
coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879–5883.
37. Montoliu-Gaya,L.;Esquerda-Canals,G.;Bronsoms,S.;Villegas,S.
(2017)Production of an anti-Aβ antibody fragment in Pichia pastoris and in
vitro and in vivo validation of its therapeutic effect. PLoS ONE.
38. Spadiut, O.; Capone, S.; Krainer, F.; Glieder,A.; Herwig,C.(2014) Microbials
for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments. Trends
Biotechnol, 32, 54–60.
39. Yokota, T.; Milenic, D.E.; Whitlow, M.; Schlom, J.(1992) Rapid Tumor
Penetration of a Single-Chain Fv and Comparison with Other
37
Immunoglobulin Forms. Cancer Res.
40. Li, Z.; Krippendorff, B.F.; Sharma, S.; Walz, A.C.; Lavé, T.; Shah,
D.K.(2016) Influence of molecular size on tissue distribution of antibody
fragments. Mabs.
41. Cumber, A.J.; Ward, E.S.; Winter, G.; Parnell, G.D.; Wawrzynczak, E.J.
(1992)Comparative stabilities in vitro and in vivo of a recombinant mouse
antibody FvCys fragment and a bisFvCys conjugate. J. Immunol, 149, 120–
126.
42. Sanz, L.; Cuesta, Á.M.; Compte, M.; Álvarez-Vallina, L.(2005)Antibody
engineering: Facing new challenges in cancer therapy. Acta Pharmacol.
Sin, 26, 641–648.
43. Jain, A.; Jain, S. PEGylation(2008): An approach for drug delivery. A
review. Crit. Rev. Drug Carr. Syst.
44. Müller, D.; Karle, A.; Meißburger, B.; Höfig, I.; Stork, R.; Kontermann,
R.E(2007). Improved pharmacokinetics of recombinant bispecific antibody
molecules by fusion to human serum albumin. J. Biol. Chem.
45. Poiron, C.; Wu, Y.; Ginestoux, C.; Ehrenmann, F.; Duroux, P.; Lefranc, M.
international the information
(2008)IMGT®, ImMunoGeneTics system®. Nucleic Acids Res. , 37 (Suppl. S1), D1006–D1012.
46. Brinkmann, U.; Kontermann, R.E.(2017)The making of bispecific
antibodies. MAbs , 9, 182–212.
47. Holt, L.J.; Basran, A.; Jones, K.; Chorlton, J.; Jespers, L.S.; Brewis, N.D.;
Tomlinson, I.M.(2008) Anti-serum albumin domain antibodies for extending
38
the half-lives of short lived drugs. Protein Eng. Des. Sel.
PHỤ LỤC
1.2. Phụ lục 1
1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng Thành phần Nồng độ
Peptone 10 g/l
LB lỏng Cao nấm men 5 g/l
NaCl 10 g/l
Peptone 10 g/l
LB đặc Cao nấm men 5 g/l
NaCl 10 g/l
Agar 15 g/l
1.4.
Phụ lục 2
Các dung dịch tách plasmid
Dung dịch Thành phần Nồng độ
EDTA pH 8.0 10 mM
Dung dịch I Tris HCl pH 8.0 25 mM
Glucose 50 mM
SDS 1%
Dung dịch II NaOH 0.2N
60 ml 5M CH3COOK
Dung dịch III 11.5 ml CH3COOH đậm đặc
39
(100 ml) 28.5 ml H2O
Thành phần gel Polyacrylamide
Gel phân tách
Thành phần Thể tích
1,23ml H2O
Tris-HCl (3M; pH 8) 0,625ml
Acrylamid 2,1 ml
Glycerol 50% 1 ml
APS 10% 25 l
SDS 10% 25 l
Temed 4 l
Gel cô
Thành phần Thể tích
0,85ml H2O
Tris-HCl (pH 6,8; 1 M) 156,25µl
Acrylamide 212,5µl
APS 10% 12,5l
SDS 10% 6,25l
Temed 1l
Các dung dịch nhuộm, tẩy gel SDS-PAGE
Dung dịch Thành phần Nồng độ
CBB 0.2% (v/v)
Dung dich nhuộm gel Acetic acid 10% (v/v)
Methanol 40% (v/v)
H2O
Acetic acid 10% (v/v)
Dung dịch tẩy gel Methanol 40% (v/v)
40
H2O
Thành phần
Lượng
Nồng độ cuối
SDS
1 g
1%
Tris (pH 6.8) 0.5 M
25 ml
125 mM
Sucrose
15 g
15%
β- Mercaptoethanol
10 ml
10%
EDTA (pH 7.0) 0.1M
1 ml
1 ml
Bromphenol blue 1%
5 ml
0.05%
Nước khử ion
đến 1 lít
5X Sample (loading) buffer
Dung dịch đệm PBS 1X, pH 7.0 – 7.3
Thành phần Nồng độ
NaCl 9 g/L
0.975 g/L Na2HPO4
0.144 g/L KH2PO4
Dung dịch đệm TAE 50X
Thành phần Khối lƣợng (thể tích)
tính cho 1 L
Tris-base 242 g
57.2 mL Acid acetic
41
EDTA 0.5 M, pH 8 100 mL
