Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ……o0o…… TRẦN THỊ MỸ TRANG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƯỜNG RUỘT CHO HEO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH …..o0o….. TRẦN THỊ MỸ TRANG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƯỜNG RUỘT CHO HEO

Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số:

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học TS. Trần Thanh Thủy Thành phố Hồ Chí Minh 2006

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng chân thành và biết ơn sâu sắc đến:

Phòng Khoa học và Công nghệ sau đại học Trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh, Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Sóc Trăng, Ban giám hiệu Trường cao đẳng Sư phạm Sóc Trăng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học.

TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đễ và tạo mọi điều kiện

tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận văn.

Quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, Sinh lý, Sinh hóa Trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài.

Gia đình anh Bùi Thủy Lâm và chị Ngũ Ái Nữ, 443/1 Ấp Đông Hải, xã Đại Hải, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thí nghiệm chế phẩm.

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến những người thân của tôi, gia đình và bạn

bè luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Trần Thị Mỹ Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... 3

MỤC LỤC ............................................................................................................. 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. 7

DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... 8

DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. 10

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ .............................................................................. 11

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 12

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 13

1.1. Giới thiệu về probiotic .......................................................................................... 13

1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic ......................................................................... 13

1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic ................ 13

1.1.3. Cơ chê tác động của probiotic ......................................................................... 14

1.1.4. Vai trò của probiotic ........................................................................................ 18

1.2. Vi khuẩn lactic ...................................................................................................... 22

1.2.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 22

1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic ................................................................................. 23

1.2.3. Quá trình lên men lactic .................................................................................. 24

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic ...... 26

1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống ..................................................................................................................... 29

1.3. Giới thiệu về heo con ............................................................................................ 30

1.3.1. Vị trí phân loại của heo. .................................................................................. 30

1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con ............................................................... 30

1.3.3. Các bệnh đường ruột ồ heo con ....................................................................... 31

1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị ...................................................................... 32

1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên gia súc, gia cầm ...... 34

1.4.1. Những nghiên cứu trong nước ......................................................................... 34

1.4.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài ..................................................................... 35

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 36

2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 36

2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 36

2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 36

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 36

2.1.4. Môi trường ....................................................................................................... 37

2.2. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 41

2.2.1. Khả năng sinh axit lactỉc của vi khuẩn lactic .................................................. 41

2.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sình lý, sinh hóa ..................................... 42

2.2.3. Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn lactic ................................................. 46

2.2.4. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đêm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch ................................................................................................ 47

2.2.5. Khảo sát sự sinh trưởng và và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vỉ khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang .......................................... 47

2.2.6. Phương pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic ...................................................... 50

2.2.7. Tạo chế phẩm probiotic ................................................................................... 50

2.2.8. Thương pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa ........................ 51

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 54

3.1. Tuyển chọn các chủng vỉ khuẩn lactic cố các đặc tính phù hợp vời yêu cầu tạo chế phẩm probiotic ...................................................................................................... 54

3.2. Khảo sát hoạt tính đề kháng vời các chất kháng sình của các chủng B,N4,L2 ........................................................................................................................................ 56

3.3. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vỉ khuẩn lactic được tuyển chọn ..................................................................................................................... 57

3.3.1. Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2 .................................................. 57

3.3.2. Các đặc điểm sinh ly, sinh hóa và phân loại chủng B, N4, L2 ....................... 58

3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối tế bào của 3 chủng vi khuẩn lactic ................................................................................................... 62

3.4.1. Ảnh hưởng cửa môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khôi của các chủng vi khuẩn lactic............................................................................................................ 62

3.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic ................................................................................................. 65

3.5. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện tối ưu ............................................................................................................. 74

3.6. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic sau khi đông khô ............... 76

3.7. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống vi khuẩn lactic ........................................................ 77

3.8. Tạo chế phẩm probiotic ........................................................................................ 78

3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic trong chế phẩm PSPoi ............................................................................................................................. 78

3.10. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm PSP01 ............................................... 79

3.11. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm PSP01 trên heo con sau cai sữa .................. 80

3.11.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa ............................................................ 80

3.11.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa .................................................................. 82

3.11.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn .................................................................................... 83

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 85

Kết luận ......................................................................................................................... 85

Đề nghị .......................................................................................................................... 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 87

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Đuôi enzym

ase

Lactobacillus agilis

B

Colony forming unit (mật độ tế bào)

CFU

Đối chứng

ĐC

Enterotoxigenic E. coli

ETEC

Gram âm

G-

Gram dương

G+

Lactobacilus acidophilus Môi trường

L2 MT

Lactobacillus salivarius

N4

Optical density (mật độ quang)

OD

Đuôi cơ chất

ose

Vi khuẩn

VK

Vi sinh vật

vsv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước Bảng 1.2. Một số bacteriocin do VK lactic sinh ra Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên heo con và heo trưởng thành Bảng 1.4. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi Bảng 1.5. Nhu cầu axit amin của một số loài VK lactic Bảng 1.6. Nhu cầu vitamin cần cho sự phát triển của một số loài VK lactic Bảng 1.7. Thí nghiệm ở heo con Bảng 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Bảng 3.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng VK lactic Bảng 3.2. Hoạt tính đối kháng của VK lactic đối với VK kiểm định Bảng 3.3. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của chủng B, N4, L2 Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N4, L2 theo nhiệt độ Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N4, L2 ở những pH khác nhau Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N4, L2 ở những nồng độ muối khác nhau Bảng 3.7. Khả năng lên men các loại đường của các chủng VK lactic Bảng 3.8. Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa của chủng B, N4, L2 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của các chủng B, N4, L2 Bảng 3.16. Động thái quá trình tạo sinh khối, sinh axit lactic và độ pH của 3 chủng VK lactic Bảng 3.17. Tổng hợp các điều kiện để thu sinh khối tế bào của 3 chủng VK lactic Bảng 3.18. Sự biến động số lượng tế bào của 3 chủng VK lactic theo thời gian bảo quản Bảng 3.19. Hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với các chủng VK kiểm định Bảng 3.20. Sự biến động số lượng tế bào của 3 chủng VK trong chế phẩm PSPoi theo thời gian bảo quản Bảng 3.21. Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau cai sữa (%) Bảng 3.22. Tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi Bảng 3.23. Hệ số tiêu tốn thức ăn trong thời gian thí nghiệm

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường tiêu hoa (Salminen, 1998) Hình 1.2. L. acidophilus Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa glucose thành axit lactic bằng con đường lên men lactic đồng hình (a) và lên men lactic dị hình (b) Hình 2.1. Phương pháp khoan lỗ thạch Hình 3.1. Khả năng sinh axit lactic của chủng L2 và chủng B Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với E. coli và s. typhỉmurỉum của chủng B, N4 và L2 Hình 3.3. Hoạt tính kháng neomicin, kanamicin, gentamicin của B, N4, L2 Hình 3.4. (a) Hình thái khuẩn lạc của chủng B, N4 và L2

(b) Hình thái tế bào của chủng B, N4 và L2 được chụp trên kính hiển vi điện

tử quét X15.000- 20.000 Hình 3.5. Các chủng B, N4 và L2 sau đông khô Hình 3.6. Chế phẩm PSP()1 trước và sau khi đóng gói

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng

B Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng N4

Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng L2

Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng N4

Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của pM ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B

Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng N4

Đô thị 3.9. Anh hưởng của nguôn nitơ đèn sự tạo thành sinh khôi của chủng L2

Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của

chủng L2

Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của nguôn cacbon đến sự tạo thành sinh khôi của chủng L2 Đồ

thị 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

Đồ thị 3.13. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng B

Đồ thị 3.14. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng N4

Đồ thị 3.15. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng L2

Đồ thị 3.16. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các lô thí nghiệm

Đồ thị 3.17. Kết quả tăng trọng giữa các lô thí nghiệm

Đồ thị 3.18. Hệ số tiêu tốn thức ăn giữa các lô thí nghiệm

MỞ ĐẦU

VK lactic được biết đến từ lâu với vai trò quan trọng đối với sức khoe con người cũng như các vật nuôi. Chúng có tác dụng cạnh tranh và đối kháng với các VSV gây bệnh, giúp cân bằng hệ VSV tự nhiên trong đường ruột, tiết các enzym tiêu hoa giúp tăng cường chuyển hoa thức ăn,... Ngoài ra, chúng còn làm giảm lượng cholesteron trong máu, chữa các bệnh rối loạn đường ruột, bệnh viêm dạ dày cấp tính và chống lại hiện tượng nhờn thuốc sau thời gian điều trị kháng sinh dài ngày, đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, cho những người ăn kiêng, ... [11].

Xuất phát từ cơ sở trên, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra nhiều chế phẩm sinh học khác nhau từ các VK lactic, chủ yếu là từ nhóm Lactobacillus, để bổ sung các vsv có lợi, nhằm tạo sự cân bằng cho hệ vsv đường ruột, mang lại sức khoe lâu bền cho vật nuôi. Hướng nghiên cứu này được gọi là vi trùng liệu pháp (bacteriotherapy) và các chế phẩm được sử dụng theo hướng chữa trị này được gọi là các chế phẩm probiotic.

Hiện nay, bệnh đường ruột của heo con ở giai đoạn sau cai sữa đã ảnh hưởng đến năng suất nuôi và gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Việc sử dụng thuốc kháng sinh dài ngày để trị bệnh đường ruột cho heo sẽ tạo khả năng đề kháng với các chất kháng sinh của vsv gây bệnh. Vì vậy, việc phòng và trị bệnh bằng chế phẩm probiotic nhằm tăng cường khả năng tự đề kháng bệnh cho vật nuôi là cách làm có hiệu quả lâu dài và an toàn sinh học. Đây cũng chính là vấn đề mà các nhà nghiên cứu, người chăn nuôi đang hết sức quan tâm.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu là : "Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactỉc để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo”.

Với mục tiêu :

Nghiên cứu và sử dụng một số chủng VK lactic nhằm bổ sung vào bộ giống tạo chế phẩm phòng và trị bệnh đường ruột cho heo. Nội dung của đề tài bao gồm :

- Tuyển chọn các chủng VK lactic có khả năng sinh axit lactic cao, có khả năng cạnh tranh và đối kháng với các vsv kiểm định, có khả năng đề kháng với các kháng sinh trị bệnh đường ruột của heo.

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa và phân loại các chủng

VK lactic được tuyển chọn.

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối tế bào của các

chủng VK lactic được tuyển chọn.

- Xác định tỷ lệ tổ hợp giống VK lactic trong chế phẩm. - Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic trong phòng thí

nghiệm.

- Kiểm tra chất lượng chế phẩm. - Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về probiotic

1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic

Sự hiểu biết về probiotic của con người bắt nguồn từ sự hiểu biết về hệ VK đường ruột kháng bệnh ở người và vật nuôi. Khái niệm probiotic đầu tiên được mô tả như là hệ vsv trong thức ăn bổ sung cho người và vật nuôi.

Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức

ăn có chứa "Lactobacilius acidophilus" [46].

Năm 1965, thuật ngữ probiotic được đưa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm

mô tả những vsv có khả năng kích thích sinh trưởng của một sô vật nuôi.

Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng trưởng

của heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46].

Năm 1989, Fuller (Anh) định nghĩa probiotic như là một thức ăn bổ sung vsv sống, có tác động có lợi đến vật chủ nhờ khả năng duy trì sự cân bằng hệ vsv đường ruột. Theo Lee (Singapore), Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) thì “Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa tế bào VK sống hoặc những phần tử của VK mà nó ảnh hưởng có lợi cho sức khoe của vật chữ” [41], [42], [46].

1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic

Theo Lee, Nomoto, Salminen, Gorbach (1999), những VK lactic có lợi thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic như L. acidophilus, Lactobacillus deibrueckii subs, Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium ...

Theo Power và Moore (1994), trong probiotic ngoài các VK lactic có lợi còn có nấm men và nấm mốc như Saccharomyces cerevislae (nấm men), Aspergillus niger và Aspergillus oryzae (nấm mốc)

Bảng 1.1 dưới đây giới thiệu một vài sản phẩm probiotic ở một số nước đã sử

dụng VK lactic là nguồn vsv chính trong chế phẩm.

Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước [46], [56]

Chức năng

Dạng sản phẩm

Sản phẩm, nhà sản xuất, xuất xứ

Chủng VK lactic sử dụng

L. bulgaricus

Sữa lên men

LCl,Nestlé (Mỹ, Pháp, Ý, Anh, Đức)

Kích thích hệ thống miễn dịch

L, ịohnsonìì

L. bulgarỉcus L.

Tăng cường sức khỏe

Sữa lên men

PAIGEN TWINU, CP-MEDI (Thái Lan)

acidophilus

L. bulgaricus L.

Tăng cường sức khỏe

Thuốc bột

Lactinex, Hynson (Mỹ)

acidophilus L. acỉdophỉlus

Bột

Biol, Viện Sinh học nhiệt đới TP. HCM (Việt Nam)

Phòng chống các chứng rối loạn tiêu hoa, giảm tiêu hao thức ăn cho heo

L. acidophilus

Bột

Phòng chống bệnh tiêu chảy cho heo

Organic Green, Han Poong (Nam Triều Tiên)

Các VK lactic trong chế phẩm probiotic có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của vsv gây bệnh. Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đường ruột, tạo môi trường không thuận lợi cho vsv có hại phát triển. Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H202, sản xuất các enzym tiêu hoa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (Bi, B2, B6, B12), khử độc tố trong đường ruột [1], [42], [46].

Nấm men trong chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa axit amin, các vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hoa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các vsv có lợi hoạt động và sinh sản. Ngoài ra, chúng còn tiết các enzym tiêu hoa như amylase, protease,...

Nấm mốc trong chế phẩm probiotic có vai trò tạo sinh khối chứa nhiều axit amin, sản xuất enzym amylase, protease nhằm làm tăng khả năng tiêu hoa thức ăn ở vật nuôi [1], [1 1], [42], [46].

1.1.3. Cơ chê tác động của probiotic

1.1.3.1. Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh

Khi cung cấp thường xuyên các vsv có lợi dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật với liều lượng thích hợp (1,2 tỉ CFU/ kg thức ăn/

ngày), chúng sẽ phát triển, chiếm ưu thế và cạnh tranh với các vsv có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng, về khối lượng các chất sinh ra bởi VSV[15],[41],[42],[46]. Chẳng hạn, khi cho heo Large White sử dụng L. fermentum 14 kết hợp với S. salivarius 312, sẽ làm giảm số lượng lớn E. coli trong dạ dày và tá tràng. Khi chỉ dùng L. fermentum 14, cũng có tác dụng làm giảm số lượng E. coli trong dạ dày [46].

1.1.3.2. Sản xuất các chất kháng khuẩn

Tiêu chuẩn quan trọng để chọn VK lactic sử dụng trong chế phẩm probiotic là khả năng tạo ra điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VK gây bệnh. Tác nhân ức chế VK gây bệnh không chỉ là axit lactic mà còn bởi những chất ức chế đặc hiệu khác như axit hữu cơ, ethanol, H202, diacetyl, ...[11], [46], [48]. * Kháng khuẩn do sinh axit hữu cơ và ethanol

Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sần sinh axit lactic thì nhóm VK lactic lên men dị hình tạo ra cả những axit hữu cơ khác như axit acetic, axit formic, axit propionic, ... Những sản phẩm này làm giảm pH của môi trường và khi pH đạt đến một mức nào đó sẽ đủ để loại trừ những vsv gây hại trong đường ruột. Chẳng hạn như các vsv gây thối hỏng thực phẩm (B. subtilis, p. vulgaris, B. mensenterium, Clostridum), các vsv gây bệnh như E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium, Salmonella cholerasuis (gây sốt thương hàn), ... Ngoài ra, một số VK lactic lên men dị hình còn tạo ra ethanol, có vai trò ức chế một số loài VK cạnh tranh, dù đó là sản phẩm chiếm tỉ lệ thấp trong quá trình lên men [1], [8], [l1], [15].

* Kháng khuẩn do sinh H202

Một số chủng Lactobacillus như Lactococcus ỉactis, Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H202 (hydrogen peroxide) khi chuyển từ môi trường kị khí sang hiếu khí. Vì VK lactic không có catalase nên trong điều kiện có oxygen, chúng sẽ sinh ra H2O2. Năm 1951, Whater và đồng nghiệp đã chứng minh khả năng ức chế Staphylococus aureus của Lactobacillus lactis nhờ khả năng sinh ra H202 [1], [l1].

* Kháng khuẩn do sinh diacetyl

Diacetyl được sinh ra bởi nhiều loài VK lactic. Đây là chất có khả năng ức chế sự phát triển nhiều vsv gây bệnh. Hoạt tính ức chế này tăng lên trong môi trường axit, ức chế mạnh hơn đối với VK G" và nấm mốc, đặc biệt với M. turberculosis (VK gây bệnh lao). Tuy nhiên, nồng độ tối thiểu cổ tác dụng của chúng thường cao hơn mức thường thấy trong thực phẩm. Vì vậy, tác dụng của riêng diacetyl không thể giải thích cho khả năng kháng khuẩn của VK lactic [1], [l1].

1.1.3.3. Kháng khuẩn do sinh bacteriocin

Theo Maria E.c. Bruno và cộng sự : "Bacteriocin của VK lactic là các phân tử protein mang điện dương, kích thước nhỏ (từ 30 - 60 axit amin), trung tính, có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các VK có quan hệ chủng loại gần với chủng VK sinh bacteriocin đổ Bacteriocin của VK lactic thực sự là một phát hiện có giá trị trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men. Bacteriocin thường có phổ

thấy một kháng khuẩn hẹp. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho số bacterỉocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK G+ và G- . Bacteriocin của VK lactic được chia làm 3 nhóm :

+ Nhóm I : bao gồm những bacteriocin có khối lượng phân tử nhỏ hơn 30 Kdal, chịu nhiệt độ cao như lactacin từ L. Acidophilus 11088, pediocin PA-1 từ p, acidilactici.

+ Nhóm II : là những bacteriocin có khối lượng phân tử lớn hơn 30 Kdal, không bền nhiệt, mất hoạt tính khi xử lý ở 100°c trong 30 phút như helveticin J từ L. helveticus, lactacin B từ L. acidophilus N2.

+ Nhóm HI : bao gồm các polypeptit chứa axit amin dị thường lanthionin

nhưnisin [41], [42], [45], [46].

* Cơ chê tác động của bacteriocin

Bacteriocin gây ra hiện tượng suy yếu hoặc phá vỡ lực đẩy proton (PMF : proton motive force) trong các bào quan sinh năng lượng như liposome và trong toàn bộ tế bào của vsv nhạy cảm với bacteriocin đó. Lực đẩy proton đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi năng lượng của tế bào nên sự phá vỡ hoặc làm suy giảm lực này sẽ dẫn đến tình trạng thiếu hụt ATP trong tế bào, khả năng vận chuyển các chất dinh dưỡng cũng như duy trì các cofactor như K+, Mg2+ bị ức chế và cuối cùng dẫn đến giết chết tế bào vsv nhạy cảm với bacteriocin đó.

Cơ chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt như sau : bacteriocin được hút bám trên màng tế bào vsv nhạy cảm với nó, tác động lên màng tế bào này và làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất, gây những thương tổn không thể khắc phục được. Sau đó, bacteriocin dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm thay đổi pH nội bào, dẫn đến phá vỡ hoặc làm suy giảm động lực proton, đồng thời gây ra sự thoát các axit amin tiền tích tụ trong tế bào và các thành phần nội chất khác của tế bào ra ngoài môi trường thông qua các lỗ thủng trên màng tế bào. Cuối cùng, tế bào chết do mất năng lượng [41], [42], [46], [48].

Bảng 1.2. Một số bacíeriocin do VK lactic sinh ra [46]

1.1.3.4. Điều hòa phản ứng miễn dịch

Probiotic có thể ảnh hưởng lên lympho bào B. Chẳng hạn, khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hoa 3H-thymidine trong tế bào lách ở chuột. Chúng cũng có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [41], [46].

1.1.3.5. Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột Khi chúng ta sử dụng L. rhamnosus dưới dạng sữa lên men, sẽ kích thích hoạt động enzym của VK đường ruột và khả năng biến dưỡng của VK đường ruột [41], [46].

1.1.3.6. Cân bằng hệ vi khuẩn trong ruột người

trong

Khi cho bệnh nhân rối loạn dạ dày, ruột sử dụng L. acidophilus, B. bifidum và B. breve sẽ làm gia tăng số lượng của Lactobacillus và giảm số lượng ruột. Còn khi cho bệnh nhân bệnh bạch cầu sử của E. coli dụng Bifidobacterium sp. và L. acidophilus, hệ VK đường ruột và nấm men sẽ được

phục hồi. Vì khi sử dụng thuốc chữa trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số vsv có lợi trong đường ruột [46].

1.1.4. Vai trò của probiotic

Hiện nay trên thế giới có nhiều loại chế phẩm được bào chế từ các chủng vsv sống, chúng được chế biến dưới nhiều dạng khác nhau như dạng lỏng, dạng đông khô, dạng viên nén,...

Mục đích chung của các chế phẩm này là tăng cường sức khỏe, chống bệnh tật, nhất là phòng và trị các bệnh về đường tiêu hóa. Trên cơ sở đó, người ta hướng vào việc phân lập và chọn chủng vsv đưa vào đường tiêu hóa nhằm khôi phục lại sự hoạt động bình thường của hệ vsv ở đó [15], [41], [46].

1.1.4.1. Vai trò của probiotic đối với sức khỏe con người a. Phòng ngừa, chữa trị bệnh tiêu chảy và sự nhiễm trùng vi khuẩn ở dạ dày,

ruột

Những trẻ em bị nhiễm Rotavirus sẽ bị tiêu chảy do Rotavirus nhân đôi trong tế bào hình trụ, làm cho phần đỉnh của nhung mao bị bào mòn dẫn đến một phần màng nháy của ruột bị phá hủy. Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophỉlus và L. reuteri sẽ làm giảm 1/2 số trẻ bị nhiễm và giúp tăng cường hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể (IgA là kháng thể sản sinh nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiện chức năng chống VK trên bề mặt niêm mạc) ...[l1], [41], [46].

Khi sử dụng Lactobacilius rhamnosus dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô thì khoảng 95% trẻ em được sử dụng sẽ giảm thời gian tiêu chảy trong 1 ngày. Anh hưởng của Lactobacillus rhamnosus rõ ràng sau ngày đầu tiên chữa trị. Bệnh nhân khi dùng Lactobacillus rhamnosus sẽ ít nôn mửa hơn là dùng các chế phẩm khác mà không có VK lactic. Bệnh nhân sẽ không còn tiêu ra máu sau ngày thứ hai chữa trị [41], [42], [46].

b. Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa

Trong cơ thể, đường lactose dưới tác dụng của enzym p-galactosidase sẽ bị phân giải thành glucose và galactose. Các loại đường này sẽ dễ dàng được hấp thu qua ruột non vào máu. Khi thiếu hệ thống enzym này đường lactose không được tiêu hóa sẽ được chuyển xuống ruột già. Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi những VK đường ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng. Điều này gây bất lợi cho việc tiêu hóa sữa. Nhưng nếu thay sữa bằng sữa lên men, lượng lactose sẽ giảm đi, đồng thời enzym P- galactosỉdase được tăng cường bởi VK lactic, sẽ làm giảm đi những triệu chứng của bệnh này. Vì vậy, sự hấp thu lactose ở những người sử dụng yaourt tốt hơn những người sử dụng sữa [41], [42], [46]. c. Phòng và trị một số bệnh khác

Khảo sát trên 34 bệnh nhân táo bón sử dụng BBG (chủng B. breve của Yakult) kết hợp với TOS (Transgalactosyl Oligosaccharide). Kết quả là có 19 bệnh nhân khỏi bệnh (56%) [41], [46].

Sử dụng yaourt với liều lượng thích hợp, hàm lượng cholesterol trong cơ thể sẽ giảm. Ảnh hưởng này xuất hiện chậm và kéo dài khoảng 6 ngày sau khi ngừng sử dụng yaourt. Cơ chế này có liên quan đến sự tổng hợp protein điều hòa. Tác nhân này có thể là hydroxymethyl glutarate [41], [46].

Đối với một số bệnh nhân bị các bệnh về gan mãn tính. Có thể sử dụng

L. acidophilus để cải thiện tình trạng bệnh của họ [41], [42].

trong phân

Những bệnh nhân nhiễm trùng đường hô hấp và đường niệu thường có hàm (l05tế bào/g phân). Khi bệnh nhân lượng cao Candida ở uống Bifidobacterium, hàm lượng Candida sẽ giảm đáng kể và sự nhiễm trùng cũng giảm [41], [42], [46].

Các VK lactic trong chế phẩm probiotic còn có khả năng kháng các tác nhân gây ung thư thông qua việc làm giảm các enzym nitroreductase, azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiền ung thư thành chất gây ung thư [l1], [46].

Khi cho bệnh nhân ung thư cổ tử cung và bệnh nhân ung thư bàng quang sử dụng L. casei Shirota với một liều thích hợp, chúng sẽ giúp tăng cường thoái hóa khối u trong sự điều trị phóng xạ, giúp kéo dài sự sống, ngăn chặn giảm bạch cầu trong thời gian chữa trị, ngăn chặn sự tái trở lại của khối u [41], [46], [48].

Bên cạnh đó, probiotic còn có khả năng ngăn chặn bệnh tiểu đường và bệnh cao huyết áp. Kết quả nghiên cứu trên chuột cho thây, khi cho chuột sử dụng L. casei sẽ làm giảm tỷ lệ tiểu đường của chuột ; nhưng L. casei (LEx) không ảnh hưởng trên chuột bình thường [46].

Tóm lại, VK lactic trong chế phẩm probiotic được sử dụng để kiểm soát hầu hết các chứng rối loạn đường ruột, chứng không dung nạp lactose, chứng viêm ruột cấp tính do Rotavirus. Probiotic còn giúp ngăn cản sự phát triển của các mầm bệnh trong ruột, làm giảm hậu quả do điều trị phóng xạ, trị táo bón, ... Đó là những bệnh liên quan đến sự mất cân bằng của hệ VK đường ruột và các mức độ viêm niêm mạc ruột làm cho tính thấm của ruột tăng. Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy VK lactic còn có khả năng làm giảm lượng cholesterol trong máu, chữa những bệnh về gan và sự nhiễm trùng đường niệu, kéo dài sự sống cho những bệnh nhân ung thư, đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, cho những người ăn kiêng,...

Hình 1.1. Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường

tiêu hóa (Salminen, 1998)

1.1.4.2. Vai trò của probiotic đối với vật nuôi a. Cải thiện tỷ lệ tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho người sản xuất. Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một hay nhiều chủng VK latic có chức năng cải thiện khu hệ VSV đường ruột, nâng cao chất lượng sản phẩm, tận dụng thức ăn, …

Nghiên cứu sử dụng probiotic trên heo con 4 tuần tuổi và heo trưởng thành với 4

lô thí nghiệm. Kết quả thu được thật đáng khích lệ

Bảng 1.3. Ảnh hưởng probiotic và axit lactic trên heo con và heo trưởng thành

Điều này cho thấy khi sử dụng L.acidophilus với liều lượng 750mg/kg thức ăn đối với heo 4 tuần tuổi, đã làm cho heo tăng trọng bình quân mỗi ngày là 0,159kg và tăng khả năng chuyển hóa thức ăn. Axit lactic cũng giúp heo gia tăng khối lượng cơ thể nhưng nó không có tác dụng trên heo trưởng thành.

Tóm lại, hệ vsv đường ruột của động vật trong đó có các VK lactic có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Nó sản sinh nhiều axit lactic, axit acetic, axit pyruvic, axit propionic, chuyển pH ruột sang axit, do đó có tác dụng ức chế vsv gây bệnh đường ruột. Ngoài ra, nó còn có vai trò quan trọng là tổng hợp vitamin nhóm B, vitamin nhóm K, sản sinh các enzym (amylase, pectinase, cellulase) làm tăng khả năng tiêu hoa chất dinh dưỡng.

b. Cải thiện sự đề kháng bệnh Các tác giả khảo sát trên 312 heo con mới sinh, chia thành 2 lô thí nghiệm. Ở lô thí nghiệm có sử dụng chế phẩm VBP (B. pseudolongum preparation), còn lô đối chứng không sử dụng chế phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng chế phẩm VBP cho heo ngay sau khi sinh với liều lượng 0,5g/ ngày, liên tục trong 10 ngày và tiến hành theo dõi bệnh tiêu chảy trong 3 tuần. Kết quả là hiếm thấy bệnh tiêu chảy ở nhóm cho ăn VBP trong suốt tuần đầu mới sinh của heo con. Trong khi hơn 60% nhóm kia mắc bệnh tiêu chảy. Nói chung, tiêu chảy xảy ra ít hơn ở nhóm dùng VBP so với nhóm không dùng trong suốt thời gian bú mẹ (từ 1-21 ngày tuổi). Những heo con sử dụng VBP có sức khỏe tốt và lớn nhanh hơn [42], [46], [48].

Bên cạnh đó, độc tố đường ruột được sinh ra bởi các VK gây bệnh có thể được trung hòa bởi probiotic. Những nghiên cứu có liên quan đến Lactobacillus buigaricus cho thấy vsv này sản sinh một chất trao đổi trung hòa có tác dụng đối với độc tố ruột được giải phóng ra từ coliform hoặc E. coli, mặc dù các chất trung hòa chưa được nhận diện (Mitchell và Kenworthy, 1976). Hoặc là khi cho heo con sử dụng 500 ml sữa nuôi cấy có L. Bulgaricus/1 khẩu phần ăn, nó làm giảm tỷ lệ E. coli ở trực tràng. Từ đó làm giảm tỷ lệ tiêu chảy và giảm tỷ lệ chết trên heo con [15], [46], [48].

Bảng 1.4. Anh hưởng của probiotic lên vật nuôi [46]

Vật nuôi

Probiotic

Liều sử dụng

Ảnh hưởng

Bò đực cai sữa

B. pseudolongum

lg/ngày

Heo còn bú

B. pseudolongum 0,5g/ ngày

Heo cai sữa

L, bulgaricus

500ml/ll 36g/ll

Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu chảy. Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu chảy, sức khỏe tốt hơn. Tỷ lệ % E. coli thấp ở trực tràng, giảm tỷ lệ chết ở heo.

1.2. Vi khuẩn lactic

Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã dần khám phá ra những bí

ẩn về VK lactic và quá trình sinh hoa do chúng tạo ra.

Năm 1780, nhà hoa học Thụy Điển Scheele lần đầu tiên đã tách được axit lactic

từ sữa bò lên men chua.

Năm 1847, Blondeau đã công nhận axit lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi

phản ứng lên men.

Năm 1857, Luois Pasteur (Pháp) chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả

hoạt động của một nhóm VK đặc biệt gọi là VK lactic.

Năm 1873, Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên

là Bacterium lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis).

Từ đó đến nay các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loại VK lactic khác

nhau và công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic đã được hình thành từ năm 1881.

Trong tự nhiên, VK lactic có mặt ở nhiều nơi : trong phân, rác, niêm mạc ruột, ... Đặc biệt có nhiều trong sản phẩm lên men chua. VK lactic ngày càng được ứng dụng trên qui mô lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacilỉus, Streptococcus,... [1], [li], [14], [47], [50].

1.2.1. Đặc điểm hình thái

VK lactic là tên gọi của một nhóm VK thu nhận năng lượng nhờ phân giải

cacbonhydrat và sinh ra axit lactic. Chúng được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae.

Mặc dù nhóm VK này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả dạng que ngắn, que dài và cả VK hình cầu), song về mặt sinh lí chúng lại tương đối đồng nhất với các đặc điểm sau :

+ Đều là VK Gram dương (G+). + Không tạo thành bào tử. + Hầu hết không di động. + Là vsv hiếu khí tùy ý hoặc kỵ khí không bắt buộc.

1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic

VK lactic bao gồm các chi : Aerococcus, Ailoiococcus, Carnobacter, Pediococcus, LactobacilluSy Leuconostoc, Lactococcus,

Enterococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus và Bifidobacterium.

Những vsv được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm thuộc về các Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Trong như Lactobacillus,

chi đó Lactobacillus chiếm vị trí quan trọng nhất [li], [14], [47], [50].

* Streptococcus : Tế bào hình cầu hay oval, đường kính nhỏ hơn 2

μ

m, dạng đôi hay chuỗi ngắn hoặc dài, ưa ấm, nhiệt độ thích hợp khoảng 37°c. Có khả năng phân giải nhiều loại đường như glucose, mantose, lactose. Chúng đóng góp vào việc tạo hương vị cho sản phẩm, nhất là chất lượng sữa.

Streptococcus faecalis : Tế bào hình cầu, đường kính nhỏ hơn lụm, thường ở dạng cặp hoặc 4 tế bào. Phát triển tốt ở nhiệt độ từ 20°c - 40°c. Nhiệt độ tối thích cho sự tăng trưởng là 37°c. Chúng có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí hoặc kỵ khí. Lên men lactic đồng hình tạo ra lượng axit khoảng 90-95%. Trong điều kiện pH trung tính Streptococcus faecalis còn tạo ra một số chất có khả năng kháng khuẩn như ethanol, axit axetic, diacetyl, H202. Một số chủng sinh bacteriocin dạng cytolysin, streptococcin và nisin. Hiện nay, người ta thường sử dụng chủng Streptococcus faecalis cùng với L. acidophilus và Bifidobacterium trong chế phẩm probiotic trị bệnh tiêu chảy cho heo [li], [14], [47], [50].

μ

Lactobaciilus : Tế bào hình que dài hoặc ngắn, thường dạng chuỗi, kích thước dao động trong khoảng 0.5-1.2 X l-10 m. Tế bào không di động ; gram dương ; không sinh bào tử. Chúng là dạng kỵ khí không bắt buộc, có thể tăng trưởng ở nhiệt độ từ 5°c - 53°c nhưng nhiệt độ tăng trưởng tối thích từ 30°c -40°c. Chúng có thể sống ở pH<5. Một số chủng thuộc loại kỵ khí nghiêm ngặt.

Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus rất phức tạp, cần phải có nguồn cacbonhydrat, axit amin, peptit, các este của axit béo, dẫn xuất của các axit nucleic, vitamin và khoáng chất. Lactobacillus có thể sử dụng glucose để lên men đồng hình và cho sản phẩm cuối cùng có hơn 85% là axit lactic, hay lên men dị hình cho sản phẩm cuối cùng gồm axit lactic, C02, ethanol.

Lactobacillus gồm 25 loài, chia thành 3 nhóm đồng hình bắt buộc, dị hình bắt buộc, dị hình tùy ý. Các nhóm VK lactic này đều tạo ra axit lactic nhưng axit do từng nhóm tạo ra khác nhau về cấu hình đồng phân của axit lactic. Những loài như L. salivarius, L. casei tạo ra đồng phân L+, trong khi những loài khác như Lactobacillus delbrueckii subsp., L. bulgaricus, L. johnsonii tạo ra D- và cuối cùng L. acidophilus, L. helveticus tạo ra cả đồng phân D+ và L-[50].

Lactobacillus được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt, ... Chúng tạo hương thơm (ví dụ : mùi hương yaourt là acetaldehyde hình thành từ sự phân giải treonin bởi enzym aldolase của Lactobacillus), nâng cao giá trị dinh dưỡng, làm chậm quá trình hư hỏng sản phẩm và làm giảm sự nhiễm khuẩn.

μ

+ L. acidophilus L. acidophilus gọi tên thông thường là VK probiotic. Tế bào hình que, kích thước trung bình khoảng 0,6-0,9 X l,5-6,0 m, tồn tại ở dạng đơn lẻ hay kết thành chuỗi ngắn, không di động, là VK gram dương (G+). Đây là VK ưa nhiệt, có thể phát triển ở nhiệt độ 45°c. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37 °c - 40°c, tối thiểu 20°c. Trong sữa lượng axit do nó tích tụ tới 2.2%. Một số chủng có khả năng tạo màng nhầy [li], [14], [47], [50]. Hình 1.2. L. acidophilus

L. acidophilus có lợi đối với hệ vsv đường ruột. Chúng có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết và 8 ngày trong dịch ruột. Hiện nay, người ta sử dụng sinh khối chủng này như là một loại thuốc để chữa các bệnh như chứng rối loạn đường tiêu hóa, tiêu chảy cấp tính hoặc mãn tính, táo bón, trướng bụng, hoặc do dùng kháng sinh, dùng hoa trị làm phá vỡ sự cân bằng của hệ vsv đường ruột [l1], [14], [47], [50].

* Leuconostoc : Tế bào hình oval; đôi; chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài ; đòi hỏi nhiều về mặt dinh dưỡng. Lên men dị hình tạo axit lactic và các sản phẩm phụ, axit acetic, etanol, C02; có khả năng tạo hương thơm cho bơ, sữa chua do có chất acetylmetyl carbinol hay acetonin [l1], [14], [47], [50].

* Bifidiobacterium : Là những trực khuẩn kị khí ; lên men lactic dị hình ; sản phẩm chính là là axit lactic và axit acetic (tỷ lệ 3:1) cùng với một lượng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic ; khác biệt với các VK lên men lactic dị hình khác là khổng sinh C02. Ưa ấm, nhiệt độ sinh trưởng tối thích từ 31°c - 41°c [l1],[14], [47], [50].

1.2.3. Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường với tích lũy axit lactic trong

môi trường. Có thể tóm tắt theo phương trình sau:

Các loài VK lactic khác nhau về cơ chế lên men glucose. Một vài VK lactic lên men đường tạo axit lactic, nhóm này gọi là lên men đồng hình, một số nhóm khác ngoài axit lactic còn tạo rượu và C02, nhóm này gọi là lên men dị hình [l1], [14], [47], [50].

1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình

Các VK lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) và cho ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90-98%). Chỉ một phần nhỏ piruvat được decacboxyl hoa và chuyển hoa thành axit acetic, etanol, acetoin và C02. Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ thuộc sự có mặt của oxi.

Một số VK lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis, Lactobacilius acidophilus, L. casei, L. cremoris, L. helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus lactis, s. thermophilus, p. cerevỉsiae [47], [50]. 1.2.3.2. Lên men lactic dị hình

VK lactic lên men dị hình do thiếu 2 enzym chủ yếu của con đường EMP là aldolase và triozophosphat-merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đường pp (pentose -phosphat). Quá trình chuyển hóa triozophosphat thành axit lactic giống như lên men đồng hình.

Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài axit lactic (40%), còn có các sản phẩm khác như axit succinic, rượu etylic (20%), axit acetic (10%), các chất khí còn lại (20%) [14], [47], [50].

Phương trình tóm tắt

Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa glucoso thành axit lactic bằng con đường lên men

lactic đồng hình (a) và lên men dị hình (b)

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic

1.2.4.1. Nguồn cacbon

Nguồn cacbon quan trọng nhất cho VK lactic là monosaccarit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng câu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit malic, axit pyruvic,...

Các loài VK lactic khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Chẳng hạn L. delbrueckii có thể sử dụng các đường maltose, glucose, galactose, saccharose, dextrin và không sử dụng được lactose, raffinose, trong khi L. bulgaricus có thể sử dụng được lactose nhưng lại không sử dụng được maltose và saccharose [l1], [14], [47], [50].

1.2.4.2. Nguồn nitơ

Một số các VK lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẩn trong môi trường. Chỉ một số ít các loài có khả năng sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ.

- hoặc P03

Để giúp cho quá trình sinh trưởng và phát triển, VK lactic còn cần những cơ chất hữu cơ phức tạp khác chứa nitơ như các sản phẩm thúy phân protein từ thịt, cazein, pepton, ... Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho quá trình phát triển sinh khối của VK lactic

1.2.4.3. Các muối vô cơ Để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng và phát triển, VK lactic cần rất nhiều các 2-, S2-, Mg2+, Mn2+, đặc biệt hợp chất vô cơ như Cu2+, Fe2+ hoặc Fe3+, K+, PO4 là Mn2+. Chính Mn2+ ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của VK lactic. Đối với Lactobacillus thì Mg2+, Mn2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra axit lactic. Ngoài ra, Mg2+ còn là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp VK sử dụng tốt hơn các loại đường [l1], [14], [47], [50].

1.2.4.4. Các chất sinh trưởng

Đối với VK lactic, các chất sinh trưởng bao gồm một trong các loại như các góc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các axit béo, các thành phần của màng tế bào và các vitamin thông thường, ... Các chất này có vai trò quan trọng trong việc gia tăng sinh khối và sinh axit lactic của các chủng VK lactic.

Các VK lactic, đặc biệt là các loài thuộc chi Lactobacilllus, rất cần vitamin cho sự sinh trưởng và phát triển. Do đó, phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất có chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, dịch tự phân nấm men và nhiều chất khác. Các vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít VK lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin [l1], [14], [47], [50].

Rogosa và cộng sự (1961), cho rằng axit nicotinic và axit pantotenic rất cần thiết cho sự phát triển của tất cả các loài VK lactic. VK lactic lên men dị hình rất cần thiamin.

loài VK

Ngoài vitamin và axit amin, VK lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ cho sự phát triển. Chẳng hạn như các axit hữu cơ như axit acetic, axit citric, axit oleic, ... Đó chính là lý do tại sao người ta lại sử dụng acetat, citrat, Tween-80 (một dẫn xuất của axit oleic), trong thành phần môi trường phân lập và nuôi cấy VK lactic (Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus lactic. Một vài bulgaricus) rất cần các axit béo không no cho sự phát triền [l1], [14], [47], [50].

1.2.4.5. Oxy

Đa số VK lactic là loài hô hấp tùy tiện. Chúng không có hệ enzym hô hấp xitocrom cũng như hệ enzym catalase. Chúng vẫn có khả năng oxy hóa rất nhiều chất nhờ sử dụng oxy phân tử. Người ta đã chứng minh được rằng hệ enzym peroxydase có trong VK lactic có thể thực hiện các chức năng thay cho hệ enzym dehyrogenase, khi đó oxy được sử dụng như là chất nhận hydro. Quá trình oxy hóa ở VK lactic thường kèm theo việc tạo thành H202. Một số VK lactic (Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus faecalis, Lactobacillus brevis, ...) có thể khử được H202 thành H20 cùng với sự tham gia của một số chất bị oxy hoa [l1], [14], [47], [50].

Phương trình tóm tắt Peroxydase NADH + H+ + H2O2 → NAD+ + H2O + ½ O2

1.2.4.6. Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của VK lactic. Điều này có ý nghĩa khi sử dụng chúng trong công nghiệp. Khoảng nhiệt độ phát triển của VK lactic khá rộng. Một số loài có thể phát triển ở 55°c, một số khác có thể phát triển ở 5°c. Nói chung đa số VK lactic có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15°c - 40°c.

Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều nhất đến các phản ứng enzym. Trong một khoảng nhiệt độ nào đó thì tốc độ phản ứng enzym tăng khi nhiệt độ tăng, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì sẽ xảy ra sự biến tính protein. Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 40°c - 45°c được gọi là VK ưa nhiệt (thermophile). Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 20°c - 40°c được gọi là loại ưa ấm (mesophile) [ 11 ], [ 14], [47], [50].

1.2.4.7. pH

Hoạt động của VK lactic, đặc biệt là hệ enzym của chúng, chịu tác động mạnh của pH. Mỗi enzym đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzym là mạnh nhất. Tuy nhiên, pH nội bào của VK lại không tương ứng với pH tối ưu của các enzym nội bào mà nó chứa.

Điều này có thể được giải thích rằng tác động của pH lên hoạt tính enzym dựa

trên sự tác động vào các yếu tố trao đổi chất của tế bào (Lechninger, 1979).

Đa số các VK lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacillus) ; 5,5 - 6,5 (Pediococcus) ; 6,3 - 6,5 (Leuconostoc). Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống VK lactic có thể chịu được là khác nhau. Chẳng hạn Lactobacillus có thể chịu được pH = 3,2 - 3,5 ; Pediococcus có thể chịu được pH = 3,5 - 4,4.

Trong quá trình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các loại vsv khác. Sau đó khi lượng axit tích lũy đủ lớn thì chính VK lactic cũng bị ức chế. Sự axit hoa tế bào chất gây ra sự tích lũy nội bào axit lactic. Chính axit lactic lại là một chất ức chế, đặc biệt là khi nó ở dạng không phân ly. Axit lactic là một axit có độ phân ly trung bình (pKa = 3,86) (Gatje, Gottsegalk, 1991).

Khi pH càng giảm thì tỷ lệ dạng không phân ly càng tăng, do đó mức độ ức chế càng tăng. Tốc độ phát triển cũng như lượng sản phẩm trao đổi chất sẽ giảm khi lượng axit lactic quá nhiều. Cân bằng hóa học giữa dạng phân ly và dạng không phân ly của axit lactic còn phụ thuộc vào nhiệt độ cũng như sự có mặt của các bazơ vô cơ [l1], [14], [47], [50].

1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống

VK lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, chế biến bảo quản thực phẩm, y học, nhưng nhiều nhất hiện nay là trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống, ... Có thể kể một vài ứng dụng như sau :

+ VK lactic được sử dụng để lên men thu nhận axit lactic. Hiện nay, người ta thường sử dụng các chủng VK lactic là L. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii để sản xuất ra axit lactic.

+ VK lactic có ý nghĩa quan trọng đối với ngành công nghiệp sữa. Có thể kể đến vài sản phẩm phổ biến như yaourt, phomat, .... Chủng lên men thường sử dụng nhất là s. thermophilus, s. lactis, L. acidophilus, L. bulgaricus [l1], [14], [47], [50].

+ Đáng kể nhất hiện nay, là việc ứng dụng VK lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống, nhất là trong nông nghiệp và các vấn đề về môi trường. Trong chăn nuôi, người ta sử dụng VK lactic để ủ chua thức ăn gia súc.

Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm axit lactic còn cổ một số chất có giá trị như chất thơm, vitamin, kháng sinh,... Do đó, thức ăn gia súc ủ chua rất có giá trị về mặt dinh dưỡng, góp phần làm tăng năng suất trong chăn nuôi. Một số chủng VK lactic thường dùng là L. pianlarum, Leuconosioc mesenieruides.

Hiện nay có rất nhiều các chế phẩm sinh học ra đời để phục vụ cho chăn nuôi. Các chế phẩm gây chú ý hiện nay là các chế phẩm probiotic, Khi đưa probiotic vào đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm, các vsv có lợi sẽ nhanh chóng phát triển và nhân nhanh số lượng, tạo môi trường axit ở ruột non và ruột già, tiết ra các chất kháng sinh làm ức chế và tiêu diệt các vsv có hại, không cho chúng phát triển. Từ đó, làm giảm các bệnh về đường tiêu hoa như tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, hoại thư, táo bón,... Ngoài ra, chúng còn tiết ra các axit hữu cơ và các enzym tiêu hóa như protease, pectinase, làm tăng hệ số chuyển hóa thức ăn ở gia súc, gia cầm [11], [14], [47], [50].

Cùng với các biện pháp hóa học, các chế phẩm sinh học cũng ra đời để phục vụ cho trồng trọt. Các chế phẩm gây tiếng vang mạnh mẽ hiện nay là chế phẩm EM hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu. Chế phẩm này được coi là có hiệu quả rất mạnh trong việc cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết các vấn nạn về ô nhiễm môi trường. VK lactic sinh ra axit lactic từ các nguồn cacbon khác nhau được tạo bởi VK quang dưỡng và nấm men trong chế phẩm probiotic. Axit lactic có khả năng ức chế sự sinh sản của một số VK có hại, tạo điều kiện phân hủy nhanh các đại phân tử hữu cơ.

Quan trọng là VK lactic không tạo ra các sản phẩm độc hại cho các VSV sống chung trong chế phẩm cũng như cho môi trường sống và cây trồng [11], [14], [47], [50].

1.3. Giới thiệu về heo con

1.3.1. Vị trí phân loại của heo.

1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con

1.3.2.1. Đặc điểm bộ máy tiêu hóa của heo con

Heo con mới sinh, sự tiết các enzym tiêu hóa ở dạ dày và ruột non còn yếu, chỉ đủ sức tiêu hóa các loại thức ăn đơn giản, dễ tiêu như sữa mẹ (Nguyễn Như Pho, 2001). Khả năng tiết HC1 của dạ dày rất ít, chỉ đủ để hoạt hóa men pepsinogen thành pepsin. Do pepsin hoạt động yếu, sự tiêu hóa protein sữa nhờ enzym trypsin của tuyến tụy. Trong 2 tuần tuổi đầu tiên, heo con không có enzym amylase của tuyến tụy. Amylase của tuyến nước bọt tiết nhiều nhất vào lúc 2-3 tuần tuổi, sau đó giảm 50%. Amylase của tuyến tụy được tiết mạnh từ 3-5 tuần tuổi nên thời kỳ này có thể cai sữa được. Trước 20 ngày đến một tháng tuổi, dạ dày heo con hầu như không tiêu hóa được protein thực vật. Số lượng và hoạt tính của các enzym tiêu hóa sẽ tăng dần theo ngày tuổi và đến tuần thứ 7 mới đạt được mức độ như heo trưởng thành, [16], [17].

1.3.2.2. Thành phần hệ vi sinh vật đường ruột của heo con

Khi heo mới sinh, hệ vsv đường ruột chưa có hoặc có rất ít. Nhờ quá trình bú mẹ và liếm láp trên nền chuồng mà vsv từ bên ngoài đã dần đi vào đường tiêu hóa của heo con. Hầu hết vsv từ bên ngoài đi vào đường tiêu hóa sẽ bị tiêu diệt và thải ra ngoài. Một số ít thích nghi được sẽ sinh sản, phát triển và tạo thành hệ vsv đường ruột.

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977) và Niconxkij (1983), hệ vsv đường ruột động

vật rất phong phú và được chia làm 2 loại :

+ Loại vsv tùy nghi thay đổi tùy theo thức ăn, môi trường đường tiêu hóa, sức đề kháng của cơ thể, ... như nấm men, nấm mốc, Proieus, Salmonelia, Klebsielia, E. coli, Clostridium, Shigella,... đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm [15], [16], [17].

+ Loại vsv bắt buộc thích nghi với môi trường dạ dày - ruột và tham gia phân giải các chất dinh dưỡng. Chẳng hạn như VK lactic, VK sản sinh amylase và protease, một số VK tổng hợp vitamin nhóm B. Các vsv gây thối rữa lại là nguồn gây bệnh đường ruột (£. coli) [15], [22], 123].

1.3.3. Các bệnh đường ruột ồ heo con

1.3.3.1. Bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli

Có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy ở heo con như do bộ máy tiêu hóa của heo con phát triển chưa hoàn chỉnh, do điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng kém, không được bú sữa mẹ, do heo con bị nhiễm lạnh hoặc bị viêm rốn, do bú quá nhiều làm cho thức ăn ứ lại không tiêu, do không được cung cấp đầy đủ chất sắt, do heo mẹ bị viêm vú, viêm tử cung kết hợp với điều kiện vệ sinh chuồng trại kém làm cho mầm bệnh từ bên ngoài xâm nhập vào đường tiêu hóa heo con,...

Theo Đào Trọng Đạt và cộng Sự (1995), 45% các trường hợp bị tiêu chảy ở heo con là do E. coli gây ra. Nhiều tác giả cho rằng E. coli sinh sống bình thường trong đường ruột của động vật, nhưng chỉ trở nên cường độc và gây bệnh khi sức đề kháng của con vật sút giảm (do chăm sóc nuôi dữơng kém, do bị stress hoặc do cai sữa,...).

Hầu hết E. coli gây bệnh đều sinh một hay nhiều yếu tố bám, nhờ đó chúng có thể bám vào các thụ thể đặc hiệu ở các tế bào niêm mạc ruột, hoặc trong dịch nhầy bao phủ ruột. Sự bám dính của E. coli lên các tế bào niêm mạc ruột là giai đoạn đầu tiên của sự khởi phát bệnh tiêu chảy.

Sự bám dính này được xem là điều kiện cần thiết trong cơ chế sinh bệnh tiêu chảy. E. coli bám trên niêm mạc ruột, sản sinh độc tố ruột làm thay đổi chất điện giải ở ruột non, kết hợp với chất khí sinh ra do thức ăn không tiêu hóa bị lên men, làm tăng nhu động ruột, dẫn đến tiêu chảy (Nguyễn Ngọc Hải, 1999 ; Đào Trọng Đạt và cộng sự, 1995) [15], [22], [23], [32].

Ở heo sơ sinh, bệnh có thê xuất hiện trong vòng 1 2- 4 8 giờ sau khi sinh, phổ biến từ 1 - 10 ngày tuổi. Heo lười bú, tiêu chảy phân lỏng, phân từ màu vàng chuyển sang màu nâu, cơ thể mất nước, suy yếu, chết trong vòng vài ngày sau khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy.

Ở heo cai sữa, bệnh xuất hiện sau 5 - 1 0 ngày do thay đổi khẩu phần ăn, heo

biếng ăn, suy yếu, phân lỏng, chết do mất nước [15], [22], [23], [32]. 1.3.3.2. Tiêu chảy do Salmonella (Phó thương hàn) Thời gian nung bệnh 3 - 4 ngày. Tỷ lệ heo con theo mẹ và sau cai sữa mắc bệnh cao hơn các lứa tuổi khác. Thể viêm cấp tính xảy ra trên heo con theo mẹ với các triệu chứng như tiêu chảy phân vàng, nhiều nước, sốt vừa (40,6°c -41,5°C), sau vài ngày vi trùng xâm nhập vào phổi gây viêm phổi, có thể thấy xuất huyết ở vùng da mỏng sau 5 - 6 ngày mắc bệnh, heo con suy nhược nặng, nằm liệt, có thể co giật nhẹ rồi chết, tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Thể nhiễm trùng máu thường xảy ra trên heo con với các

triệu chứng như hạch treo ruột sưng và xuất huyết, lách xung huyết và rất dai, phổi có khi viêm, xuất huyết [15], [22], [23], [32].

1.3.3.3. Tiêu chảy do cầu trùng (Bisospara suis)

Bệnh tập trung vào giai đoạn 5 - 25 ngày tuổi, tỷ lệ chết là 15 - 20%. Heo con tiêu chảy phân trắng sau đó chuyển sang vàng, gầy ốm, lông xù, không có dấu hiệu sốt và ói mửa. Chẩn đoán dựa vào lứa tuổi mắc bệnh, đặc điểm phân. Kiểm tra noãn nang cầu trùng trong phân bằng phương pháp phù nổi [15], [22], [23], [32].

1.3.3.4. Bệnh phân trắng ở heo

Bệnh thường gặp ở heo sơ sinh từ 1 - 21 ngày tuổi, ở giai đoạn này tỷ lệ mắc bệnh cao hơn ở những giai đoạn khác, đồng thời kèm theo hội chứng phân trắng rõ rệt. Bệnh diễn biến ở nhiều mức độ khác nhau do nhiều yếu tố tác động. Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng bệnh phân trắng heo con xảy ra là do nhiều nguyên nhân phối hợp. Vì vậy, phòng trừ bệnh cũng phải bằng những biện pháp tổng hợp.

Thời gian nung bệnh khoảng 1 ngày. Giai đoạn này heo con ỉa khó khăn, phân táo đen và nhỏ như hạt đậu đen. Sau đó, phân heo con chuyển sang sền sệt màu vàng. Hai đến ba ngày sau phân nhanh chóng chuyển thành trắng như vôi hoặc xám. Trong phân có lẫn những hạt sữa chưa tiêu và có bọt khí. Có trường hợp mới mắc bệnh đến ngày thứ ba phân đã loãng như nước, tháo ra tung tóe. Lúc này heo con mất nước nặng. Ngoài những biểu hiện trên còn có hội chứng thần kinh co giật từng cơn,... [15], [22], [23], [32].

1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị

1.3.4.1. Phòng bệnh Phòng bệnh cần phải chú trọng đến sự giảm tỷ lệ ô nhiễm E. coli cường độc ở môi trường xung quanh bằng chế độ vệ sinh tiêu độc tốt, duy trì điều kiện chăn nuôi thích hợp, đồng thời bảo đảm miễn dịch cao. Một trong những yếu tố quan trọng nhất để phòng bệnh tiêu chảy do E. coli là duy trì cho heo con môi trường thích hợp (32°c - 34 °c đối với heo chưa cai sữa và 28°c - 30°c cho heo vừa mới cai sữa). Không để chuồng bị lạnh và bị gió lùa, vì heo con rất dễ bị mất nhiệt do bề mặt da quá rộng so với thể trọng.

Khẩu phần ăn cần được cải tiến nhằm giảm sự khu trú E. coli trong ruột. Việc bổ sung axit lactic vào nước uống có thể làm giảm độ pH trong dạ dày và sẽ ức chế sự nhân lên nhanh chóng của VK E. Col1 gây bệnh. Cho heo non ăn canh trùng có Streptococcus faecium có thể sẽ giảm tỷ lệ tiêu chảy (Morkoc và cộng sự, 1984).

Việc tiêm vacxin phòng bệnh cho heo mẹ từ 6 và 2 tuần lễ trước khi đẻ, cũng như tiêm chủng hoặc cho heo con uống vacxin phòng bệnh cũng là biện pháp phòng bệnh có hiệu quả [15], [22], [23].

1.3.4.2. Điều trị a. Điều trị bằng kháng sinh

Trong thực tế rất nhiều loại kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh tiêu chảy do E. coli, Salmonella, cầu trùng, ... như ampicillin, tetracyclin, chloramphenicol, cephalothin, gentamicin, neomicin, ... Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng các chế phẩm trên dao động trong một giới hạn rất khác nhau.

Nguyên nhân hiệu quả thuốc kháng sinh bị giảm là do sự nhờn thuốc của VK đường ruột. Để việc điều trị có kết quả, cần chọn thuốc dựa vào độ nhạy cảm của mầm bệnh đối với thuốc. Để xác định độ nhạy cảm đó phải tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ.

Ngoài kháng sinh có thể dùng các chế phẩm sulfamid và nitroíuran để điều trị. Tuy theo nguyên nhân gây bệnh mà chọn lựa điều trị bằng kháng sinh nào cho phù hợp. Có thể sử dụng một số loại kháng sinh với liều dùng như sau :

_ Chloramphenicol:

+ Ngày 1 và 2 : 50 mg cho1 kg thể trọng. + Ngày 3 và 4 : 30 mg cho 1kg thể trọng. + Ngày 5 và 6 : 20 mg cho 1 kg thể trọng.

_ Tetracyclin : Dùng liều tương tự như chloramphenicol. b. Điều trị bằng các chế phẩm probiotic

Trong đường ruột của động vật, hệ vsv luôn ổn định sẽ bảo đảm trạng thái cân bằng cho hoạt động của đường ruột. Khi hệ vsv đường ruột được cân bằng thì những vsv có lợi, phần lớn là VK lactic chiếm đến 90%, hoạt động hữu ích cho đường ruột.

Nếu sự cân bằng bị phá vỡ thì những VK có hại cạnh tranh phát triển, gây rối loạn đường tiêu hóa, gây tiêu chảy. Loại VK thường gặp là E. coli, Enterococcus, Clostridium, Proteus, ...

Xuất phát từ cơ sở trên, nhiều nhà nghiên cứu đã chế nhiều chế phẩm khác nhau từ các VK hữu ích, chủ yếu là từ nhóm Lactobacillus để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng cho hệ vsv đường ruột. Hướng nghiên cứu này được gọi là vi trùng liệu pháp (bacteriotherapy) và các chế phẩm được sử dụng theo hướng chữa trị này được gọi là các chế phẩm probiotic.

Các chế phẩm probiotic dùng trong gia súc có thể được đưa vào cơ thể dưới

dạng nước. Người ta pha thuốc trong nước hoặc sữa rồi cho chúng uống.

ở nước ta, các chế phẩm B. subtilis, yaourt, men tiêu hoa, biolactyl đều là dạng thuốc nước dùng cho gia súc uống. Chế phẩm probiotic cũng có thể được chế tạo thành dạng bột hoặc dạng hạt để trộn vào thức ăn.

Cũng có thể dùng chế phẩm probiotic qua heo mẹ, lúc trước và sau khi đẻ cho

tới khi cai sữa [15], [22], [23].

Hiện nay, trên thế giới có nhiều loại chế phẩm probiotic được sử dụng rộng rãi cả trong nhân y cũng như thú y. Dưới đây là một số kết quả dùng chế phẩm probiotic cho heo.

Dùng probiotic làm thuốc phòng trị bệnh ở heo con, thuốc được cho uống với liều 6.l09 tế bào Lactobacillus acidophilus và 6.l09 tê bào Enterococcus faecium, mỗi ngày một lần, 3 ngày liền cho heo con sơ sinh [15], [22], [23].

Probiotic có thể được trộn vào thức ăn cho heo mẹ (mỗi ngày 4 - 6kg thức ăn) với hàm lượng là 6.l09 tế bào Lactobacillus acidophilus và 6.l09 tế bào Enterococcus faecium, liều 15 ngày trước và 21 ngày sau khi đẻ. [15], [22], [23].

1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên gia súc, gia cầm

1.4.1. Những nghiên cứu trong nước

Ở nước ta có các công trình nghiên cứu về lĩnh vực này của Viện Thú y quốc

gia như:

+ Yaourt và canh trùng Subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của heo

con (Đào Trọng Đạt, Vũ Đình Hưng, 1962).

+ Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đường ruột của gia súc

(Lê Thị Tài và cộng sự, 1968 - 1978).

+ Chế phẩm vsv (Saccharomyces boulardi) với bệnh phân trắng heo con (Phan

Thanh Phượng và cộng sự, 1968 - 1978).

+ Chế phẩm Biolactyl để phòng trị bệnh đường ruột của heo (Phan Thanh

Phượng và cộng sự, 1979 - 1984).

+ Chế phẩm Biol để phòng trị bệnh đường ruột của heo (Viện Sinh học nhiệt

đới TP. HCM, 2003).

Các nghiên cứu trên đều khẳng định kết quả phòng trị bệnh đường ruột ở heo và

tác dụng điều tiết kích thích sinh trưởng của chế phẩm probiotic.

Năm 2002, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã sử dụng chế phẩm VITOM.l và VITOM.3 của Nga trong phòng trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà. Kết quả thu được là tăng trọng trên heo tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát (VITOM.3) ; tăng trọng trên gà tăng 11,8%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 99% (VITOM.l và VITOM.3). Khi so sánh hiệu quả điều trị tiêu chảy trên heo con từ sơ sinh đến 3 tuần tuổi giữa VITOM.1 và các kháng sinh norcoli, octacin, colistin, tác giả ghi nhận tỉ lệ khỏi bệnh ở lô dùng VITOM là 100% và tỉ lệ tái phát 25% trong khi ở lô dùng kháng sinh có tỉ lệ khỏi bệnh 80,7% và tỉ lệ tái phát 52,38%.

Phạm Khắc Hiếu và cộng tác viên (2002), nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm EM 1 trên heo con đã cho thấy phế phẩm EM 1 có tác dụng ức chế đối với E. coli, Saimoneila, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococccus, Clostridium, Sarcina lutea. Kết quả số lượng VK E. coli trong phân giảm, tỷ lệ tiêu chảy giảm và tăng trọng nhanh.

1.4.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài

Theo Lema và cộng sự (2001), dùng probiotic cho heo với L. acidophilus (lô 1), Streptococcus faecium (lô 2), hoặc phối hợp giữa L. acidophilus với Streptococcus faecium (lô 3), hoặc giữa L. acidophilus với s. faecium, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum và L. piantarum (lô 4). Để kiểm tra sự bài thải của VK E. coli Q157, ông đã trộn các VK trên với liều 6xl06 CFU/ kg thức ăn liên tục trong 7 tuần. Kết quả cho thấy lô 4 có sự bài thải VK E. coli trong phân thấp hơn các lô khác. Khác biệt này hoàn toàn có ý nghía so với lô đối chứng không dùng probiotic.

Kyriakis và cộng sự (1999), nghiên cứu ảnh hưởng của probioic LSP 122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm được tiến hành trên 4 lô : lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng VK Bacillus toyoi với liều l06 tế bào/kg thức ăn và lô 4 sử dụng B. lichenì/ormis với liều l06 và l07 tế bào/ kg thức ăn. Kết quả thí nghiệm giữa các lô khác biệt hoàn toàn và có ý nghĩa so với lô đôi chứng (P< 0,05). Ngoài ra, tăng trọng/ ngày, tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với đối chứng. Trong đó lô sử dụng l07 tế bào B. licheniformis cho kết quả tốt nhất.

Theo Tuomola và cộng sự (1999) làm thí nghiệm dùng các VK probiotic như Lactobacillus GG, L. johnsonii, L. rhamnosus để cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột với VK E. coli, s. typimurium, s. enteritidi. Kết quả cho thấy Lactobacillus GG, L, johnsonii và L. rhamnosus làm giảm sự bám dính của E. coli từ 90 - 91% ; riêng s. typhimurium bị giảm khả năng bám dính đến 77% bởi Lactobacillus johsonii và 83% bởi L. casei.

Tóm lại, các công trình nghiên cứu được tóm lược ở trên đã sử dụng các chế phẩm probiotic cho gia súc, gia cầm để ức chế vsv gây bệnh, phòng ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và hệ số tiêu tốn thức ăn,... Mặc dù, các công trình nghiên cứu những khía cạnh khác nhau, sử dụng các chế phẩm có thành phần khác nhau nhưng đều có kết luận là probitic có ảnh hưởng có lợi trên vật nuôi.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Nguyên liệu

Các chủng VK lactic (B, B1 N1, N4, K4 (KC4), K5 (K5.5), C7) trong bộ sưu tập giống của phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm TP. HCM. L2 trong chế phẩm men tiêu hóa antibio.

Các chủng VK kiểm định : Santeu sp., Streptococcus sp., Bacillus subtilis, B. pimitilis, Prabli sp., Salmonella typhimurium, Sarcina lutea, Serratia sp., Shigella flexneri, Klebsiella sp., Enterococcus sp. do Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.

E. coli, Salmonella choleraesuis do Viện Pasteur TP. HCM cung cấp. Enzym a -amylase và protease do Viện Sinh học nhiệt đới TP. HCM cung

cấp.

2.1.2. Hóa chất

Cao nấm men, cao thịt, sữa gầy, tween 80 (Đức). Glucose, saccharose, lactose, galactose, maltose, dextrin, sorbitol, pepton, MnS04, NaCl, CaC03, KOH, phenol, axit lactic, phenolphtalein, NaOH, gentian violet, KI (Trung Quốc).

MgS04.7H20, FeCl3, K2HP04, KH2P04, fuchsin kiềm, FeS04, (NH4)3C6H307

(Nhật Bản).

: 30

μ g μ Agar, CH3COONa, cồn, glutamat (Việt Nam). Đĩa giấy kháng sinh chuẩn do Công ty TNHH Nam Khoa cung cấp. g + Tetracycline (Te) : 30 g + Neomicin (Ne) + Ampicillin (Am) : 30 g g + Nalidixic axit (Ng) : 30 μ + Kanamicin (Kn) : 30 g + Cloramphenicol (Clo) : 30 μ + Gentamicin (Ge) : 10 g

g + Ceftazidime (Ce) : 5 μ μ μ μ 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ

Tủ sấy, tủ ấm MEMMERT (Đức), nồi hấp vô trùng HUXLEY (Đài Loan), tủ giữ mẫu VESTFROST REETECH (Đan Mạch), máy li tâm thường HETTICH (Đức), máy li tâm lạnh HETTICH (Đức), tủ lạnh, máy đo pH WTW (Đức), kính hiển vi OLYMPUS (Nhật Bản), kính hiển vi chụp hình OLYMPUS (Nhật Bản), kính hiển vi soi nổi OLYMPUS (Nhật Bản), pipetman NICHIGO (Nhật Bản), máy quang phổ SHIMADZU (Nhật Bản), máy đông khô VIRTIS (Mỹ), máy lắc điểu nhiệt GEHARD (Đức), cân điện tử SATURIUS (Đức), tủ cấy (Trung tâm nhiệt đới Việt Nga).

Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm : ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, que

gạt, que cây, pipet, đầu typ các loại, đèn cồn, màng lọc millipore ( Ø = 0,3 m), ...

μ

2.1.4. Môi trường

* MT cacbonat agar (MT1) MT dùng để phân lập VK lactic.

2g 0,5ml lOg lOg 5g 5g 2g

Cao thịt Tween 80 Glucose Cao nấm men Pepton CaC03 CH3 COONa Dung dịch muối (*) 0,5ml Thạch 20g Nước cất 100ml pH = 6,8

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121°c trong 20 phút (*) Dung dịch muối

MgS04.7H20 4g NaCl 0,2g MnS04. 4H20 2g FeS04 . 7H20 0,2g Nước cất 100ml * MT MRS (De Man-Rogosa-Sharp) (MT2)

Dùng để nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý sinh hóa gồm

: MT MRS agar, MRS dịch thể (không có agar).

pH = 6,5 ± 0,2

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC trong 20 phút

*MT MPA (Meat extract – Pepton Agar) (MT3)

Dùng để nuôi cấy một số chủng VSV kiểm định

Cao thịt 3g

NaCl 5g

Pepton 10g

Thạch 20g

Nước cất 1000ml

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC trong 20 phút

*MT nước chiết giá đậu (MT4)

Nước chiết giá đậu 50% thể tích MT

Peton 20g

Saccharose 20g

0,2g K2HPO4

0,58g MgSO4.7H2O

2g MnSO4.4H2O

Nước cất đủ 1000ml

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC trong 20 phút

Dùng 300g giá đậu đun sôi với 100 lít nước cất trong 30 phút, lọc lấy nước trong.

*MT nước chiết cà chua (MT5)

Nước cà chua 400ml

Glucose 10g

Cao nấm men 10g

Dung dịch A 5ml

Dung dịch B 5ml

Bổ sung nước cất cho đủ 100ml

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC trong 20 phút

Dung dịch A: K2HPO4 (2,5g), KH2PO4 (2,5g), H2O (250ml)

Dung dịch B: MgSO4.7H2O (10g), NaCl (5g), FeSO4.7H2O (5g), MnSO4.4H2O (5g), H2O (250ml)

Dùng 0,5kg cà chua thái nhỏ đun sôi với 0,5 lít nước trong 60 phút lọc lấy nước trong.

*MT có chất tăng trưởng (MT6)

Glucose 20g

Pepton 10g

Chất tăng trưởng 8g

(Vitamin nhóm B: B2, B3, B6)

1g (NH4)2SO4

1,5g KH2PO4

4g K2HPO4

Nước cất 1000ml

pH = 7

Hấp 1atm/20 phút

*MT không có chất tăng trưởng (MT7)

Glucose 20g

Pepton 10g

1g (NH4)2SO4

1,5g KH2PO4

4g K2HPO4

Nước cất 1000ml

pH = 7

Hấp 1atm/20 phút

*MT thử hoạt tính protease (MT8)

Glucose 0,05g

Nước chiết thịt 5ml

Gelatin 10g

Pepton 0,1g

1,5g KH2PO4

1,5g K2HPO4

NaCl 3g

Agar 20g

Nước cất 1000ml

Hấp 1atm/20 phút

*MT thử khả năng di động của VK lactic (MT9)

Cao thịt 5g

Pepton 5g

Glucose 5g

Dịch tự phân nấm men 5% thể tích

Tween 80 0.5ml

0,1g MnSO4.4H2O

Kali citrat 1g

Bromocresol tía 1,6% 2,8ml

Agar 15g

Nước cất 1000ml

pH = 6,5

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC trong 20 phút

2.2. Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Khả năng sinh axit lactỉc của vi khuẩn lactic

2.2.1.1. Phương pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25], [36], [37]

Dựa vào đặc tính của chủng VK lactic trên MT cacbonat agar là CaC03 sẽ tan

khi tác dụng với axit lactic tạo nên vòng trong suốt xung quanh mỗi khuẩn lạc.

Phương pháp

Chuẩn bị các đĩa petri chứa MT cacbonat agar vô trùng. Dùng que cấy đầu nhọn trích ly các khuẩn lạc riêng lẻ khác nhau trên thạch nghiêng cấy chấm điểm sang MT cacbonat agar, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 4 ngày thấy xuất hiện vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lượng axit sinh ra càng nhiều.

Xác định khả năng sinh axit lactic bằng hiệu số (D - d, mm). D :

Đường kính vòng phân giải CaC03. d : Đường kính khuẩn lạc VK lactic.

2.2.1.2. Định tính axit lactic bằng thuốc thử uphenmen [12], [13], [36] Khi axit lactic tác dụng với phenol có trong thuốc thử uphemen sẽ làm thuốc thử có màu xanh dương đậm chuyển sang màu vàng. Sự đổi màu càng rõ thì lượng axit sinh ra càng nhiều. Phương pháp Dùng que cấy trích ly các chủng VK đã thuần khiết cấy vào các ống nghiệm chứa 9ml MT MRS dịch thể, nuôi cây tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó đem li tâm để tách tế bào VK, thu dịch trong. Lấy 3ml dịch cho vào ống nghiệm đã chứa sẩn 2ml thuốc thử uphenmen. Tiến hành đồng thời 2 ống nghiệm đối chứng.

Đối chứng (1) : 3ml axit lactic 0,1% + 2ml thuốc thử Đối chứng (2) : 3ml MRS dịch thể không cấy VK + 2ml thuốc thử. Quan sát sự đổi màu của thuốc thử để chọn các chủng có khả năng lên men tốt. 2.2.1.3. Định lượng axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ Therner [12],

[13],[25], [36], [37]

Xác định hàm lượng axit lactic trong dịch lên men bằng dung dịch kiềm chuẩn

nhờ có sự đổi màu của thuốc thử phenophtalein.

Phương pháp Lấy 10 ml dịch lên men, bổ sung 20 ml nước cất và 1 hoặc 2 giọt phenolphtalein 1% trong cồn. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi màu hồng xuất hiện bền trong 30 giây thì dừng lại. Đọc số ml NaOH 0,1N đã chuẩn rồi ghi lại. Tính độ axit bằng công thức :

°T = số ml NaOHx 10 % axit lactic = °T x 0,009 (°T: Độ Therner, 1 độ Therner tương ứng với 9mg axit lactic)

2.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sình lý, sinh hóa

2.2.2.1. Các đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic * Quan sát hình thái khuẩn lạc [12], [13], [36] vsv khi phát triển trên bề mặt

các MT đặc trưng sẽ hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó.

Phương pháp Lấy một ít dịch nuôi cây đã hoạt hóa 24 giờ, pha loãng ở nồng độ cần thiết. Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 mi dịch VK nhỏ lên bề mặt MT MRS. Dùng que gạt dàn đều dịch trên mặt thạch. Để trong tủ ấm 30°c trong 2 - 3 ngày. Quan sát và nhận xét các đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước, tính chất bề mặt của khuẩn lạc bằng kính hiển vi soi nổi.

* Quan sát hình thái tế bào Tiêu bản giọt ép [12], [13], [36] Dùng que cấy lấy một giọt dịch VK đặt vào giữa lam kính. Đặt lamen lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh tạo thành bọt khí. Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi ở bội giác x 100. Quan sát hình thái VK, sự sắp xếp tế bào. Tiêu bản nhuộm Gram [12], [13], [36] Dựa vào khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím

kết tinh và iốt, hình thành hai loại phức chất khác nhau.

Loại 1: vẫn giữ nguyên màu sắc của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý

bằng cồn, vsv dạng này thuộc Gram (+) (hắt màu tím).

Loại 2: Không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và

bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. vsv dạng này thuộc Gram (-) (bắt màu hồng).

Phương pháp

_ Làm vết bôi : Lấy 1 giọt canh trường hoặc một ít khuẩn lạc VK đặt vào giữa

phiến kính, dàn đều tạo thành vùng tròn nhỏ, để khô tự nhiên.

_ Cố định vết bôi : Kẹp phiến kính, hơ nhẹ mặt dưới trên đèn cồn vài lần.

_ Nhuộm vết bôi :

Đặt miếng giấy thấm lên vết bôi. Nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên giấy thấm giữ trong một phút. Nhỏ lugol lên vết bôi, giữ trong mội phút. Rửa bằng cồn 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước.

Nhuộm bổ sung tuchsin kiềm 10-30 giây, rửa lại bằng nước. Để khô và xem tiêu

bản với vật kính dầu x100. Ghi nhận khả năng bắt màu Gram của VK.

2.2.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa * Khả năng di động [12], [13], [36] Dựa vào khả năng di chuyển của VK trên MT bán lỏng có chất chị thị màu. Phương pháp

Nhỏ một giọt dịch có chủng VK nghiên cứu vào giữa đĩa petri trong đỏ cổ chứa 10 - 15 ml MT9. Nuôi ở nhiệt độ phòng 2 ngày sau đổ đem ra quan sát. Nếu VK có khả năng chuyển động thì axit hữu cơ sinh ra sẽ khuếch tán đều về các phía và làm thay đổi

màu của chất chỉ thị trên toàn bộ bề mặt đĩa petri. Nếu VK không có khả năng chuyển động thì sự đổi màu chất chỉ thị chỉ thấy ở xung quanh giọt dịch VK nhỏ vào. Nhận xét sự di chuyển của VK trong MT, từ đỏ xác định khả năng di động của chúng.

* Kiểu hô hấp [12], [13], [36], [37]

Căn cứ vào khả năng sinh trưởng của vsv trong điều kiện cổ nồng độ oxy khác

nhau.

Phương pháp

Chuẩn bị các ống nghiệm thạch đứng chứa l0ml MT MRS agar. cấy các chủng VK vào ống nghiệm bằng que cây đầu nhọn theo phương pháp cấy trích sâu. Nuôi ở nhiệt độ 30°c trong 3 ngày. Nhận xét sự sinh trường của VK trong MT, từ đó xác định quan hệ của chúng với oxy.

* Hoạt tính catalase [12], [13], [36], [37] Dựa vào khả năng sinh catalase và phân giải H202 của các chủng vsv. Phương pháp

Nuôi 1% (v/v) chủng VK nghiên cứu trong MT MRS dịch thể ở 30°c trong 18 giờ. Nhỏ 1 giọt H202 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm 3000 vòng/20 phút. Nếu thấy hiện tượng sủi bọt thì chủng VK đó được coi là có hoạt tính catalase, nếu không sủi bọt thì không có hoạt tính catalase. Quan sát hiện tượng sủi bọt và ghi nhận kết quả.

* Hoạt tính protease [12], [13], [36], [37]

Dựa vào khả năng phân giải protein của các chủng vsv bằng cách đo kích thước vòng

phân giải xung quanh khuẩn lạc.

Phương pháp

Cấy chấm điểm các chủng VK lactic trên MT8, nuôi trong tủ ấm 3 - 5 ngày. Dùng thuốc thử HgCl2 10% đổ lên bề mặt MT nuôi cấy. Nếu VK lactic sinh protease sẽ tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Các vùng chưa phân huy sẽ có màu trắng đục do protein đã phản ứng tủa với HgCl2. Xác định hoạt tính protease bằng hiệu số(D - d, mm).

* Khả năng sinh khí từ glucose [12], [13], [36], [37]

Cấy 1% (v/v) dịch VK đã được hoạt hóa 24 giờ vào ống nghiệm chứa l0ml MT MRS dịch thể, bên trong đặt sẵn một ống durham chứa đầy MT MRS dịch thể. Các ống nghiệm được nút chặt bằng nút cao su. Sau 24 giờ nuôi cấy, nếu chủng có sinh khí, khí được tạo thành sẽ được bẫy lại thành bọt khí trong ống chuông durham, làm nổi ống chuông này. Quan sát khả năng sinh khí của chủng VK lactic nghiên cứu.

* Nhiệt độ phát triển [12], [13], [36], [37]

Mỗi nhóm vsv sẽ phát triển tốt ở nhiệt độ thích hợp và bị ức chê không phát

triển ở nhiệt độ không thích hợp.

Phương phấp

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml MT MRS dịch thể. Cấy 1% (v/v) dịch VK vào các ống nghiệm, nuôi ở các nhiệt độ 15°c, 25°c, 30°c, 35°c, 40°c, 45°c, 50°c trong 2 ngày. Riêng 15°c thì nuôi 7 ngày.

Quan sát sự sinh trưởng dựa vào khả năng làm đục MT ứng với mỗi nhiệt độ.

* pH ban đầu [12], [13], [36], [37] Nguyên tắc Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất của vsv trong điều kiện MT

pH thích hợp.

Phương pháp Chuẩn bị các ống nghiệm chứa l0ml MT MRS dịch thể. Điều chỉnh MT bằng CH3COOH 1 N hoặc NaOH 1 N về các giá trị pH 3,5; 4; 5; 6; 7; 8; 9,0; 9,5 (chỉnh pH sau khi hấp khử trùng). Bổ sung 1% (v/v) dịch VK vào các ống nghiệm chứa MT ứng với từng giá trị pH. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°c trong 2 ngày. Quan sát sự sinh trưởng phát triển của các chủng VK ứng với mỗi giá trị pH dựa vào mức độ đục MT.

* Khả năng lên men các loại đường [12], [13], [36], [37] Nguyên tắc Căn cứ vào khả năng lên men một số loại đường tạo thành axit lactic của VK. Sự có mặt của axit lactic sẽ làm thuốc thử phenol trong MT từ màu đỏ chuyển thành màu vàng.

Phương pháp Pha chế các MT MRS trong đó glucose được thay bằng các loại đường cần nghiên cứu : saccharose, maltose, galactose, lactose, sorbitol, dextrin. Điều chỉnh pH MT hơi ngả về kiềm, có bổ sung chất chỉ thị màu đỏ phenol, khử trùng Ì atm. Bổ sung 1% (v/v) dịch VK vào MT ứng với những nguồn cacbonhyđrat khác nhau. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°c trong 2 ngày. Nếu VK lên men loại đường nào thì chúng sẽ sinh axit làm pH MT đó giảm và có màu vàng. Quan sát khả năng sinh trưởng, phát triển của từng chủng VK ứng với mỗi loại cacbonhydrat cần nghiên cứu.

* Khả năng chịu mặn [12], [13], [36], [37] Nguyên tắc Khả năng sống trong điều kiện MT có nồng độ muối cao là những đặc trưng của

VK lactic, những đặc trưng đó có ý nghĩa về mặt phân loại.

Phương pháp Chuẩn bị các ống nghiệm chứa l0ml MT MRS có bổ sung NaCl : 0%, 1%, 2%, 4%, 5%, 6%, 6,5%. Bổ sung 1% (v/v) dịch VK vào các ống nghiệm, nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°c trong 2 ngày.

Quan sát khả năng phát triển của các chủng VK dựa vào mức độ làm đục MT

để xác định sự mẫn cảm của VK với nồng độ NaCl.

* Khả năng axit hoa môi trường [12], [13], [36], [37]

Dựa vào khả năng sinh axit của các chủng vsv, làm giảm pH của dịch nuôi cấy so

với pH ban đầu của MT.

Phương pháp

Cấy 1 % (v/v) dịch VK đã được hoạt hoa 24 giờ vào ống nghiệm chứa 10ml MT MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở 30°c, thu dịch nuôi cấy và đo pH tại các thời điểm : Oh, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h bằng máy đo pH. Đo pH và ghi nhận kết quả.

2.2.2.3. Xác định hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp khoan

lỗ thạch.

Nguyên tắc

Dựa vào chất khuyếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy vào MT thạch, chỗ nào có chất ức chế khuyếch tán nơi đó VSV kiểm định không mọc được và tạo thành vòng vô khuẩn.

Phương pháp

Phương pháp này cho phép xác định hoạt tính ức chế của các chủng VK lactic ở những thời điểm nuôi cấy xác định, nên có thể so sánh hoạt tính của các chủng khác

nhau hay của một chủng ở cùng một thời điểm. Vì vậy, phương pháp này được dùng để nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và phổ kháng khuẩn của các chủng VK lactic.

Hoạt tính ức chế được đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm). D : Đường kính vòng ức chế d : Đường kính lỗ khoan, d = 9 mm. Hiệu số (D - d, mm) càng lớn, hoạt tính ức chế của chủng VK lactic càng mạnh. Dựa vào vòng ức chế VK kiểm định, chọn các chủng VK lactic cổ khả năng kháng khuẩn mạnh và phổ kháng khuẩn rộng.

(*) Chuẩn bị ống nghiệm chứa 15 ml MT MPA agar để nguội đến 40°c. Sau khi trộn với VK kiểm định rồi mới đổ ra đĩa petri. Đợi thạch đông rồi đục lỗ có đường kính 9 mm. 2.2.2.4. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của vi khuẩn lactic * Phương pháp dùng đĩa giấy kháng sinh chuẩn [12], [13]

Các chất kháng sinh có thể khuếch tán trên MT thạch, ức chế các vsv mẫn cảm với chúng và tạo ra vòng vô khuẩn. Những vsv nào có khả năng kháng với chất kháng sinh thì có thể sinh trưởng và phát triển.

Phương pháp Hoạt hóa các chủng VK lactic cần nghiên cứu. Dùng pipet vô trùng hút 30 [ú dịch huyền phù VK lactic nhỏ vào giữa đĩa petri có chứa MT MRS agar. Dùng que gạt vô trùng dàn đều khắp mặt thạch.

Sau khi mặt thạch khô, dùng cặp vô trùng cẩn thận đặt các khoanh giấy lên trên bề mặt hộp petri đã cấy VK lactic sao cho các khoanh giây cách đều nhau và cách tâm 2,5 cm. Mỗi hộp đặt 3 đĩa giấy kháng sinh. Đặt các hộp vào tủ ấm 370c trong 1 6- 1 8 giờ rồi lấy ra kiểm tra kích thước vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa giấy kháng sinh. Nếu vòng vô khuẩn từ 15 - 25 mm, VK lactic không có khả năng kháng kháng sinh; nếu vòng vô khuẩn từ 11 - 14 mm, VK được coi là có khả năng đề kháng rất yếu với kháng sinh; nếu vòng vô khuẩn < 10 mm, VK được coi là có khả năng đề kháng với kháng sinh; còn nếu không có vòng vô khuẩn, VK được coi là có khả năng đề kháng mạnh với các chất kháng sinh.

2.2.3. Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn lactic

2.2.3.1. Giữ giống trên thạch nghiêng [12], [13], [36], [37]

Nuôi cấy các chủng VK đã được thuần khiết trên MT MRS thạch nghiêng, nuôi trong tủ ấm 30°c trong 72 giờ. Sau đó bảo quản ở nhiệt độ 4°c - 6°c và cấy truyền trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần.

2.2.3.2. Giữ giống bằng phương pháp đông khô [43] Nguyên tắc

Làm thăng hoa phần nước có trong MT nhũ hoa vsv ở áp suất

thấp. Phương pháp

Các chủng VK lactic được nuôi trên MT MRS dịch thể với những điều kiện tối ưu tới pha cân bằng (18 đến 24 giờ), ly tâm với tốc độ 3500 vòng/15 phút để thu sinh khối. Cho sinh khối tế bào của từng chủng vào từng ống đông khô chuyên dùng có sẵn 2 ml MT bảo quản (sữa gầy 10% + glutamat 1%), để các ống đông khô vào tủ lạnh (5°C) khoảng 12 giờ cho MT thật đông (Lưu ý, không để mẫu trong tủ lạnh quá lâu sẽ ảnh hưởng đến khả năng sống sót của các chủng VK sau đông khô). Sau khi MT bảo quản đông lại, chuyển các ống đông khô vào máy đông khô, điều chỉnh các thông số : nhiệt độ từ -45°c đến -50°c, áp suất chân không 20 mBar, thời gian đông khô từ 24 đến 27 giờ. Sau 24 giờ lấy mẫu ra và kiểm tra khả năng sống sót của VK bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Mẫu đông khô có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh.

Ưu điểm của phương pháp này là tỷ lệ sống sót của vsv rất cao, các đặc tính di

truyền của vsv không bị biến đổi, giông giữ được trong thời gian lâu.

2.2.4. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đêm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch

Pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml mẫu nhỏ vào giữa đĩa petri có chứa MT MRS agar. Dùng que gạt vô trùng dàn đều khắp mặt thạch. Mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa. Sau đó, úp ngược petri, bao gói cẩn thận và nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 2 - 3 ngày, đếm số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa, từ đó tính số lượng tế bào VK lactic trong mỗi g mẫu hay ml mẫu theo phương pháp đếm CFU (Colonies Forming Unit). Đếm 3 đĩa của mỗi độ pha loãng. Tính trung bình cộng của 3 lần đếm.

Số tế bào/ 1 ml mẫu = M . a . 10n . N

M : Số khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri; a : số giọt đếm được trong lml dịch mẫu; n : Hệ số pha loãng; N : Hệ số tính theo khối lượng khô tuyệt đối của mẫu.

2.2.5. Khảo sát sự sinh trưởng và và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vỉ khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang

Sự tăng trưởng của giống vsv có thể được biểu diễn bằng sự gia tăng mật độ tế bào (N/ml) hay sự gia tăng sinh khối giống theo thời gian nuôi cấy. Để theo dõi sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian nuôi cấy, có thể xác định một cách gián tiếp thông qua đo mật độ quang của dịch nuôi cấy.

Nguyên tắc vsv trong MT nuôi cấy có thể hấp thu hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Do đó, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán (độ đục) có mối tương quan thuận với số lượng vsv trong dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị

OD đo được tại bước sóng 600 nm trên máy quang phổ (Thực chất phương pháp này dựa trên sự tương quan tuyến tính giữa OD600 và logarit mật độ tế bào (N/ml)).

Phương pháp Nhân giống : Bổ sung 1% (v/v) giống vào các ống nghiệm chứa lo mi MT MRS

dịch thể, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng trong 24 giờ.

Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giông vào các ông nghiệm chứa các loại MT nuôi cấy cần khảo sát. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm : 0; 1; 2; 3; 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48 giờ. Tiến hành đo lặp lại 3 lần ở 3 ống nghiệm khác nhau, sau đó lấy giá trị trung bình của 3 lần đo.

Dựa vào giá trị OD600 đo được và số khuẩn lạc đếm được ở mỗi giá trị OD600 tương ứng, suy ra mật độ tế bào tương ứng với các giá trị OD600 ở các thời điểm khác nhau. Xác định số lượng tế bào ứng với mỗi giá trị OD600 đo được. Từ đó vẽ đồ thị sinh trưởng của các chủng.

2.2.5.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy [12], [36], [37]

Dùng 5 loại MT khác nhau để khảo sát : MT MRS dịch thể, nước chiết cà chua,

nước chiết giá đậu, có chất tăng trưởng, không có chất tăng trưởng.

Các loại vsv khác nhau, nhu cầu dinh dưỡng của chúng khác nhau nên có khả

năng phát triển khác nhau trên các MT.

Tiến hành Nhân giống (giống phần 2.2.5). Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giông vào các ống nghiệm chứa các loại MT nuôi cây khác nhau. Nuôi cây ở nhiệt độ 30°c. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Tiến hành đo tương tự như phần 2.2.5. Dựa vào giá trị OD600, chọn ra MT thay thế thích hợp nhằm hạ giá thành khi tạo chế phẩm.

2.2.5.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu [12], [13], [36], [37] Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất của vsv trong MT thích hợp

với các nồng độ pH khác nhau.

Tiến hành

Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua. Chỉnh pH ban đầu bằng NaOH 1 N và CH3COOH 1 N về các giá trị pH khác nhau : 3,5; 4; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7; 7,5. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm chứa các loại MT ứng với từng giá trị pH trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°c. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 -48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được pH ban đầu nào tối ưu cho sự sinh trưởng của các chủng VK.

2.2.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy [12], [13], [36], [37] Mỗi nhóm vsv sẽ phát triển tốt ở nhiệt độ thích hợp và bị ức chế không phát triển

ở nhiệt độ không thích hợp.

Tiến hành

Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giông vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở các nhiệt độ khác nhau : 25°c, 30°c, 35°c, 40°c, 50°c. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được ở nhiệt độ nào tối ưu cho sinh trưởng của các chủng VK.

2.2.5.4. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn nitơ đến sự tạo thành sinh khối

[12], [13], [36], [37]

Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên MT có nguồn nitơ khác

nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.

Tiến hành

Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ông nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nguồn nitơ : cao nấm men, dịch chiết nấm men, pepton. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 4 8 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng của các chủng VK.

2.2.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men [12], [13], [36], [37] Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên các MT có nồng độ cao

nấm men khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.

Tiến hành Nhân giống (giông phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nồng độ cao nấm men tương ứng : 0,5%; 1%; 1,5%; 2,0%; 2,5%. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm tương ứng với các nồng độ trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nồng độ cao nấm men thích hợp cho từng chủng VK.

2.2.5.6. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn cacbon đến sự tạo thành sinh

khối [12], [13], [36], [37]

Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên các MT có nguồn cacbon

khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.

Tiến hành Nhân giống (giông phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nguồn cacbon : glucose, saccharose, maltose, galactose, lactose. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm trên.

Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nguồn cacbon thay thế glucose nhằm hạ giá thành khi tạo chế phẩm. 2.2.5.7. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose [12], [13], [36], [37]

Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên các MT có nồng độ

saccharose khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.

Tiến hành

Nhân giông (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nồng độ saccharose tương ứng : 0,5%; 1%; 1,5%; 2,0%; 2,5%. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ông nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0; 12; 24; 36; 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nồng độ saccharose thích hợp cho sinh trưởng của các chủng VK.

2.2.6. Phương pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic

Nguyên tắc Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn giữa các chủng VK lactic nhằm phát huy hiệu quả tác

động tổng hợp của các chủng VK lactic sau phối trộn.

Phương pháp Có thể phối trộn các giống VK lactic thuần khiết theo theo tỷ lệ thể tích (v/v) hoặc

theo tỷ lệ số găm (g/g).

Khảo sát hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn trên với các chủng VK kiểm

định. Tiến hành nhân giống (giống phần 2.2.5).

Trước hết phối trộn các chủng VK lactic theo 4 tỷ lệ thể tích (ml/ml) (1:1: 1; 2: 1: 1; 1: 2: 1; 1: 1: 2). Xác định hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với các VK kiểm định bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Chọn tỷ lệ phối trộn nào cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất (vòng vô khuẩn, D - d lớn nhất).

Để tạo chế phẩm probiotic, tiến hành phối trộn các chủng sau khi đông khô theo

tỷ lệ 1 : 2 : 1 (g/g) cùng với lượng enzym thích hợp (g).

2.2.7. Tạo chế phẩm probiotic

Các loại chế phẩm probiotic hiện nay đều được sản xuất từ các loại vsv có lợi,

phần lớn là các VK lactic.

Quy trình tạo chế phẩm probiotic có thể được tóm tắt theo sơ đồ sau :

Quy trình tạo chế phẩm probiotic từ VK lactic có thể được thực hiện theo các

bước cơ bản sau :

_ Giữ giông và nhân giống VK lactic. _ Chọn MT lên men thích hợp và cho lên men để thu sinh khối. _ Đông khô sinh khối các chủng VK lactic. _ Xác định tỷ lệ phối trộn giữa các chủng VK lactic nhằm phát huy hiệu quả tác

động tổng hợp của các chủng VK lactic trong chế phẩm probiotic.

_ Có thể phối trộn chế phẩm probiotic với enzym nhằm làm tăng hiệu quả của chế phẩm. Có thể phôi trộn chế phẩm probiotic với enzym vào thức ăn theo tỷ lệ : lg chế phẩm probiotic : l,5g enzym : 1 kg thức ăn. Tỷ lệ phối trộn này được tham khảo theo một số công trình nghiên cứu ở Trường Đại học Nông lâm TP. HCM, Viện Sinh học nhiệt đới TP. HCM và một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường Việt Nam (Biol của Viện Sinh học nhiệt đới, Organic Green zs của Nam Triều Tiên sản xuất,...) _ Đóng gói và bảo quản chế phẩm. Sau khi phối trộn với enzym, chế phẩm probiotic

được đóng gói và bảo quản trong bao nhôm, được giữ ở nhiệt độ phòng.

2.2.8. Thương pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa

2.2.8.1. Điều kiện thí nghiệm

Giống heo sử dụng trong các thí nghiệm là giống heo lai giữa giông Landrat với

giống Yocsia.

Đối tượng thí nghiệm là heo con cai sữa giai đoạn 28 đến 56 ngày tuổi. Các heo con được chọn làm thí nghiệm đều được theo dõi tình trạng sức khỏe :

không bị còi, không bị bệnh tật và được tiêm phòng đầy đủ theo quy trình của trại.

Heo được cho ăn ba lần trong ngày. Sau mỗi bữa ăn, heo con được theo dõi tình trạng sức khoe để có biện pháp can thiệp kịp thời những heo bị bệnh. Nếu heo bị tiêu chảy, được điều trị bằng kháng sinh Bio D.o.c, liều lml/10 kg thể trọng và tiêm xoang bụng dung dịch hỗn hợp glucose 5% + calcium + cobal (theo điều trị chung của trại).

Chuồng được xây dựng kiên cố bằng gạch và ximăng, nền chuồng làm bằng ximăng có độ dốc 3 - 4%, dễ dàng cho sự thoát nước khi dọn vệ sinh, giữa các chuồng có vách ngăn bằng tường gạch cao 1m, mái chuồng được lợp bằng tôn ximăng. Xung quanh dãy chuồng có sử dụng tấm sáo để chắn gió, chắn mưa, nắng. Diện tích mỗi ô chuồng là 5m X 3m = 15m2, mỗi ô nuôi 8 con. Máng ăn bằng ximăng dài 2m, có hệ thống núm uống tự động cao 0,3m so với nền. Chuồng này được sử dụng để nuôi heo sau cai sữa.

Heo con được cho ăn bằng thức ăn viên hiệu Con cò của công ty thức ăn Con

cò (Cần Thơ, Việt Nam) trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.

Chế phẩm PSP01 và chế phẩm Biol được bổ sung bằng cách trộn đều vào thức

ăn với liều 2,5g/Kg thức ăn và được sử dụng liên tục trong thời gian thí nghiệm.

2.2.8.2. Thời gian, địa điểm và cách bố trí thí nghiệm Thời gian thí nghiệm từ ngày 24/09/05 đến ngày 24/10/05 Địa điểm : thí nghiệm được thực hiện tại trại chăn nuôi heo gia đình anh Bùi Thúy Lâm và chị Ngũ Ái Nữ, 443/1 Ấp Đông Hải, Xã Đại Hải, Huyện Kế Sách, Tỉnh Sóc Trăng.

Thí nghiệm được tiến hành trên 5 lô : Lô đối chứng 1 (ĐC 1) không sử dụng chế phẩm probiotic; Lô đối chứng 2 (ĐC 2) sử dụng chế phẩm Biol với liều l09 tế bào/ lkg thức ăn; Lô 3, 4, 5 là lô thí nghiệm sử dụng chế phẩm PSP01 với liều l09 tế bào/lkg thức ăn. Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày qua bảng 2.1.

2.2.8.3. Theo dõi các chỉ tiêu.

*Tỷ lệ tiêu chảy

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, heo được theo dõi hàng ngày, số con tiêu

chảy ở từng lô được ghi nhận lại.

Tỷ lệ tiêu chảy (%) = Tổng số ngày con tiêu chảy x 100

Tổng số ngày con nuôi

*Tỷ lệ tái phát

Tỷ lệ tái phát (%) = Số con tái phát x100

Tổng số con khỏi bệnh

*Tỷ lệ chết cho tiêu chảy

Là số heo chết do tiêu chảy được tính trong suốt quá trình thí nghiệm

Tỷ lệ chết (%) = Số con chết do tiêu chảy x 100

Số con nuôi

* Tăng trọng heo con trong thời gian thí nghiệm

Tăng trọng (Kg) = Trọng lượng ngày kết thúc thí nghiệm - Trọng lượng bắt đầu

thí nghiệm.

Trọng lượng đầu, trọng lượng cuối được xác định bằng cách : dùng cân đồng hồ cân trực tiếp từng con vào buổi sáng khi chưa cho heo ăn và chỉ dùng duy nhất 1cân trong suốt thời gian thí nghiệm. * Tiêu tốn thức ăn

Thức ăn cho mỗi lô thí nghiệm được cân từng ngày để cho ăn, thức ăn thừa trong máng sẽ được cân lại vào buổi sáng hôm sau. Từ đó, tính lượng thức ăn tiêu thụ của các lô thí nghiệm.

Tiêu tốn thức ăn = Tổng kg thức ăn tiêu thụ x 100

Tổng kg tăng trọng

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tuyển chọn các chủng vỉ khuẩn lactic cố các đặc tính phù hợp vời yêu cầu tạo chế phẩm probiotic

* Các tiêu chuẩn để chọn chủng vi khuẩn probiotic

_ Là VK hiện diện bình thường trong đường ruột của heo. _ Tạo axit lactic cao, chịu pH axit của MT. _ Có khả năng lên men lactic ức chế sự phát triển của các VK gây bệnh, VK gây

thôi.

_ Đề kháng được các chất kháng sinh. _ Làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu các chất dinh dưỡng.

* Khả năng sinh axit Lactic

Xác định khả năng hình thành axit tổng bằng cách cấy chấm điểm lo chủng VK lactic trên MT cacbonat agar. Sau 48 giờ, đo kích thước vòng phân giải CaC03. Chủng nào tạo vòng phân giải có kích thước lớn, chứng tỏ chủng đó sinh axit mạnh.

Hình 3.1. Khả năng sinh axit lactic của chủng L2 và chủng B

Xác định axit sinh ra là axit lactic bằng thuốc thử uphenmen. Khi tác dụng với axit lactic, thuốc thử uphemen sẽ chuyển từ màu xanh dương đậm sang màu vàng. Sự đổi màu càng rõ thì lượng axit sinh ra càng nhiều.

Tiến hành định lượng axit lactic của 10 chủng VK trên bằng phương pháp chuẩn độ Therner. Thu dịch nuôi cấy sau 24 giờ, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi màu hồng xuất hiện bền trong 30 giây thì dừng lại.

Các kết quả trên được thể hiện trong bảng 3.1. * Nhận xét Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, tất cả các chủng nói trên đều tạo vòng phân giải với CaC03, đều có phản ứng dương tính với thuốc thử uphenmen. Điều này khẳng định các chủng VK nói trên đều là VK lactic.

Trong số các chủng YK lactic trên cho thấy chủng : B, N4, L2, L3, có kích thước vòng phân giải CaC03 lớn nhất (D - d > 20 mm), tương ứng với hàm lượng axit lactic cao nhất (> 1,40 g/l). Từ đó, cho thấy các chủng sinh axit tổng cao cũng chính là các chủng sinh axit lactic cao. * Khả năng đối kháng

Tiếp tục khảo sát hoạt tính đối kháng của 10 chủng VK lactic trên với 13 chủng VK kiểm định chuyên gây bệnh đường ruột cho người và vật nuôi bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Hoạt tính ức chế được đánh giá bằng hiệu số (D - d, ram). Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2.

Từ bảng số liệu trên, chúng tôi nhận thấy, hầu như tất cả các chủng VK khảo sát đều có khả năng ức chế với các chủng VK kiểm định. Trong đó, chủng B, N4, L2 có khả năng ức chế các VK gây bệnh đường ruột khá mạnh (D - d > 14 -29 mm), có phổ kháng khuẩn rộng (ức chế cả VK G- lẫn VK G+). Đặc biệt, cả ba chủng đều có khả năng ức chế mạnh đối với các VK gây bệnh thương hàn và tiêu chảy cho heo như Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis (D - d > 22 -27 mm), ức chế rất

mạnh đối với Shigella flexneri (D - đ > 28 - 35 mm). Đây là trực khuẩn lị có tỷ lệ kháng kháng sinh rất cao. Chúng ức chế khá mạnh với E. con ( D- d > 1 2- 14 mm).

Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng E. coli và s. typhimưrium của chủng B, N4 và L2

Kết quả trên cũng khẳng định sản phẩm chính trong quá trình lên men của VK lactic là các axit lactic cố vai trò quan trọng đến khả năng kháng khuẩn của chúng. Các chủng có khả năng ức chế mạnh đồng thời là các chủng có khả năng sinh axit cao.

Kết hợp các đặc tính này chúng tôi chọn 3 chủng B, N4, L2 để tiếp tục nghiên

cứu.

3.2. Khảo sát hoạt tính đề kháng vời các chất kháng sình của các chủng B,N4,L2

Tiến hành xác định hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của các chủng B, N4, L2, bằng phương pháp dùng đĩa giấy kháng sinh chuẩn. Sau 48 giờ, xác định kích thước vòng vô khuẩn. Nếu D - d từ 15 - 25 mm, VK này được xem là không có khả năng đề kháng với các chất kháng sinh; nếu D - d < lo mm, VK này được xem là có khả năng đề kháng với các chất kháng sinh.

Hiệu sô D - d càng nhỏ thì hoạt tính kháng kháng sinh càng mạnh.

Ng, Kn). Sự có mặt của các kháng sinh này không làm mất đi hoạt tính cũng như sự tồn tại của VK lactic trong đường ruột của vật nuôi.

3.3. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vỉ khuẩn lactic được tuyển chọn

3.3.1. Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2

Dùng kính hiển vi soi nổi để mô tả hình thái khuẩn lạc trên MT MRS agar.

(b) Hình thái tế bào của chủng B, N4 và L2 được chụp trên kính hiển vi điện tử

quét X 15.000 - 20.000

Tiến hành làm tiêu bản giọt ép và nhuộm Gram để quan sát các đặc điểm hình

thái tế bào của các chủng.

Sau đó chụp hình tế bào trên kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 15.000-

20.000 lần.

Nhìn chung 3 chủng VK trên đều có hình que, tế bào dạng đơn hay xếp thành

đôi, thành chuỗi ngắn. Chúng thuộc G+, không di động, không sinh bào tử.

Khuẩn lạc tròn lồi, kích thước dao động từ 1,0 - 3,0 mm, màu trắng sữa, mép trơn. Bề mặt khuẩn lạc bóng ướt, gồ cao. Kết quả được trình bày tổng hợp ở bảng 3.8 và hình 3.4.

3.3.2. Các đặc điểm sinh ly, sinh hóa và phân loại chủng B, N4, L2

3.3.2.1. Kiểu hô hấp

Khi nuôi cấy các chủng B, N4, L2 trên MT thạch đứng, chúng tôi nhận thấy chủng B, N4, L2 đều phát triển dọc theo vết cấy từ bề mặt xuống tận đáy MT. Như vậy, các chủng này đều thuộc loại kị khí không bắt buộc. 3.3.2.2. Khả năng sinh khí C02 từ glucose

Khi cấy các chủng B, N4, L2 vào các ống nghiệm chứa 10 mi MT MRS lỏng trong đó có đặt sẩn một ông durham chứa đầy MT, đáy quay lên phía trên. Ống nghiệm được nút chặt băng nút cao su.

Sau 24 giờ, chúng tôi thấy ống durham không nổi lên. Chứng tỏ chúng không có

khả năng sinh khí C02, chúng thuộc loại VK lactic đồng hình.

3.3.2.3. Hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H202 3% lên sinh khối tế bào của chủng N4, B, L2 đã được ly tâm

từ dịch nuôi cấy 18 giờ (30°C). Kết quả không thấy có hiện tượng sủi bọt.

Như vậy, các chủng này không có hoạt tính catalase. Chúng không có khả năng oxi hóa H202 thành H20 và O2 để giải độc cho tế bào. Do đó các chửng trên đều thuộc loại kị khí không bắt buộc.

3.3.2.4. Hoạt tính protease

Cấy chấm điểm các chủng B, N4, L2 trên MT8, nuôi trong tủ ấm 3 - 5 ngày (30°C). Dùng thuốc thử HgCl2 10% đổ lên bề mặt MT nuôi cấy. Nếu VK lactic sinh protease sẽ tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Các vùng chưa phân huy sẽ có màu trắng đục do protein đã phản ứng tủa với HgCl2. Sau khi nuôi cấy và thử với thuốc thử HgCl2. Kết quả không thấy xuất hiện vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Chứng tỏ cả ba chủng : B, N4, L2, đều không sinh protease.

3.3.2.5. Nhiệt độ phát triển

Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng B, N4, L2 khi nuôi cấy trên

MT2 ở các nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 3.4.

Như vậy, các chủng B, N4, L2 sinh trưởng và phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 30°c - 40°c, nên thuộc loại ưa ấm. Còn ở nhiệt độ 15°c, 45°c, 50°c chúng sinh trưởng, phát triển không đều.

3.3.2.6. pH ban đầu Khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng B, N4, L2 khi nuôi cấy trên MT2 ở

các pH khác nhau được mô tả trong bảng 3.5.

Như vậy các chủng VK này đều có khả năng phát triển được ở biên độ pH rộng từ 3,5 - 9,5, có nghĩa là chúng có khả năng sống được trong cả MT axit và MT kiềm. Đây là đặc điểm có lợi cho hoạt tính kháng khuẩn vì đa số VK gây bệnh đều ưa thích MT kiềm. Chủng B, N4 phát triển tốt ở pH từ 5 - 8, chủng L2 phát triển tốt ở pH từ 5 - 6. 3.3.2.7. Khả năng chịu mặn

Nuôi cấy các chủng B, N4, L2 trong MT MRS dịch thể có các nồng độ muối cần khảo sát. Theo dõi khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng dựa vào mức độ làm đục MT. Kết quả được mô tả trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N4, L2 ở những

nồng

Như vậy, ngoại trừ chủng L2 thì các chủng N4 và B đều có khả năng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện MT có nồng độ muối rất cao (NaCl = 6,5%). Kết quả trên cho thấy các chủng có khả năng thích ứng với MT rất tốt.

3.3.2.8. Khả năng lên men các loại đường

Nuôi cấy các chủng này trong ống nghiệm chứa MT lên men với các loại đường

khác nhau, với chát chỉ thị màu là phenol đỏ.

Theo dõi sự sinh trưởng phát triển của chúng sau 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 300c. Dựa vào sự thay đôi màu sắc của MT, chúng tôi thu nhận được két quả như sau :

* Nhận xét Các chủng VK lactic khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Đây là đặc trưng rất có ý nghĩa về mặt phân loại. Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy 2 chủng B, N4 lên men được 7 loại đường (maltose, glucose, galactose, lactose, saccharose, dextrin, sorbitol). Trong khi L2 sử dụng được 6 loại, không sử dụng được sorbitol.

Từ các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa của các chủng VK lactic, đối chiếu với khoa phân loại của Bergey's (1986) cho phép chúng tôi có thế kết luận như sau : Chủng B, N4, L2 thuộc :

Họ : Lactobacillaceace Tộc : Lactobacilleae Chi : Lactobacillus

Dựa vào các kết quả trên chúng tôi tạm đặt tên ba chủng như sau :

+ Chủng B : Lactobacillus sp. B + Chủng N4 : Lactobacillus sp. N4 + Chủng L2: Lactobacillus sp. L2 Để luận văn được ngắn gọn v ề sau chúng tôi chỉ s ử dụng các ký hiệu chủng như

B, N4, L2.

Chúng tôi đã gửi 3 chủng đến phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội, để định danh tiếp tới loài. Dựa vào khoa phân loại của Bergey's (1986) và Okada (1992). Kết quả phân loại 3 chủng như sau:

+ Chủng Lactobacillus sp. B là Lactobacillus agilis + Chủng Lactobacillus sp. N4 là Lactobaciỉỉus salivarius + Chủng Lactobacillus sp. L2 là Lactobacillus acidophilus

Dựa trên cơ sở này cổ thể tiếp tục nghiên cứu s ử dụng các c h ủ n g trên để tạo chế

phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo.

3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối tế bào của 3 chủng vi khuẩn lactic

3.4.1. Ảnh hưởng cửa môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khôi của các chủng vi khuẩn lactic

Quá trình tạo thành sinh khối tế bào phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện và thành phần MT nuôi cấy. Do đó, việc nghiên cứu lựa chọn MT thích hợp cho mục đích này có vai trò vô cùng quan trọng.

Song vấn đề đặt ra là phải tìm được MT thích hợp nhưng đơn giản, với nguyên

liệu dễ kiếm, rẻ tiền phù hợp điều kiện sản xuất chế phẩm sinh học ở nước ta.

Chúng tôi sử dụng 5 loại MT : MRS dịch thể (MT2), nước chiết giá đậu (MT4), nước chiết cà chua (MT5), có chất tăng trưởng (MT6), không có chất tăng trưởng (MT7).

Nuôi cấy các chủng B và N4 ở nhiệt độ 35°c, pH ban đầu là 6,5; Chủng L2 ở

nhiệt độ 40°c và pH ban đầu là 5,5.

Xác định mật độ tế bào trên máy quang phổ ở bước sóng 600 n m trong thời gian từ 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 giờ. Kết quả đo được lập lại 3 lần ở 3 ống nghiệm khác nhau và lấy giá trị trung bình của 3 lần đo, số liệu được trình bày ở bảng 3.9 và đồ thị 3.1, 3.2, 3.3. * Nhận xét Dựa vào kết quả ở bảng 3.9 và đồ thị 3.1, 3.2, 3.3 cho thấy : MT MRS (MT2), vẫn là MT thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của 3 chủng VK lactic nói trên. Vì vậy, mà mật độ tế bào của 3 chủng B, N4, L2 gần mức cực đại ở thời điểm từ 12 đến 24 giờ (OD600> 2,000).

MT MRS là MT đáp ứng tốt cho nhu cầu dinh dưỡng của VK l a c t i c . Bởi vì trong MT MRS có rất nhiều những chất hữu cơ phức tạp như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, cazein, pepton; các hợp chất vô cơ như Cu2+, Fe2+, K+, P04, s2-, Mg2+,

Mn2+; các vitamin và axit amin, các axit hữu cơ như axit acetic, a x i t citric, axit oleic, ... nó cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của VK lactic, đặc biệt là các loài thuộc chi lactobacillus. Đó chính là lí do lại sao người ta lại sử dụng acetat, xitrat, tween 80 trong thành phần MT MRS.

MT nước chiết giá đậu (MT4), tốc độ sinh trưởng và phát triển của 3 chủng B, N4, L2 chậm hơn, mật độ tế bào thấp hơn nhiều so với MT2 và MT5. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của V ũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).

MT nước chiết cà chua (MT5), tốc độ sinh trưởng và phát triển của 3 chủng B, N4, L2 khá mạnh. M ậ t độ tế bào của 3 chủng B, N4, L2 trên MT nước chiết cà chua không kém nhiều lắm so với mật độ tế bào của 3 chủng trên MT MRS ở thời điểm từ 12 đến 24 giờ (đối với chủng B là 2,422 so với 2,683; N4 là 2,370 so với 2,683; L2 là 1,476 so với 2,552).

Động học phát triển của 3 chủng trên MT nước chiết cà chua vẫn giữ nguyên như khi phát triển trên MT MRS, nghĩa là giai đoạn phát triển logarit kéo dài khoảng 12 giờ sau đó là giai đoạn ổn định.

Nguyên nhân của hiện tượng n à y theo chúng tỏi do MT cà c h u n r ã i lún LI vitamin, chất khoáng và axit hữu cơ. VK lactic hầu như không có khả n ă n g tống hợp

được vitamin. Các vitamin có vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).

Còn ở MT6 và MT7, tốc độ sinh trưởng và phát triển của 3 chủng B, N4, Li yếu

nhất, mật độ tế bào thấp hơn nhiều so với MT2, MT4, MT5.

Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất lớn, việc sử dụng MT MRS vốn rất phức tạp và không kinh tế nên người ta thường chọn các MT đơn giản, rẻ tiền để thay thế nhằm giảm bớt các chi phí.

Trong số 4 loại MT thay thế được khảo sát. Chúng tôi thấy MT nước chiết cà chua (MT5) là thích hợp cho sự tạo thành sinh khối VK hơn so với 3 loại MT còn lại (MT4, MT6, MT7). Thời gian tốt nhất để thu sinh khối của 3 chủng trôn MT nước chiết cà chua là khoảng từ 24 đến 36 giờ.

Vì vậy, chúng tôi sử dụng MT nước chiết cà chua thay thếMT MRS để thu sinh khối VK lactic trong thực tiễn sản xuất. vấn đề tiếp theo là cần phải khảo sát các điều kiện tối ưu để thu sinh khối các chủng trong MT này.

3.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic

3.4.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy là một trong những yếu tố của MT có ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của vsv. Do đó, việc xác định nhiệt độ tối ưu cho sự tạo sinh khối là cần thiết. Để xác định nhiệt độ nào thích hợp cho sự gia tăng sinh khối tế bào của 3 chủng B, N4, L2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 3 chủng trên ở các nhiệt độ 25°c, 30°c, 35°c, 40°c, 45°c, 50°c. Xác định mật độ tế bào trên máy quang phổ ở bước sóng 600 nm trong thời gian từ 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và biểu diễn trên đồ thị 3.4 và 3.5.

* Nhận xét Ở đây, nhận thấy sự sinh trưởng, phát triển của các chủng phụ thuộc rõ rệt vào nhiệt độ. Khả năng này tốt nhất trong dãy nhiệt độ 30°c - 40 °c. Mật độ tế bào của 3 chủng đạt ở mức cao (OD600> 1,375) sau 24 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng của các chủng không đều nhau. Kết quả trên cho thấy, ở 25°c, pha log đến chậm sau 6 giờ đối với cả 3 chủng (OD600< 0,394).

Ở nhiệt độ 35°c, chủng B và N4 có tốc độ phát triển rất nhanh, sau 12 giờ nuôi cấy mật độ tế bào gần ở mức cực đại (OD600 > 2,000) và phát triển ổn định ở mức cao trong thời gian lên men tiếp theo. Điều đó có lẽ là do khả năng thích nghi nhanh chóng của chúng với MT ở nhiệt độ này. Còn ở 30°c mật độ tế bào của 2 chủng B, N4 chênh lệch không đáng kể so với khi phát triển ở 35°c.

Đối với chủng L2, mật độ tế bào thấp nhất ở 25°c (OD600= 0,623) và đạt giá trị cao trong khoảng nhiệt độ từ 35°c - 40°c (OD600 > 1,738) sau 24 giờ nuôi cấy. Đặc biệt ở 40°c tốc độ phát triển của chủng L2 cao nhất và đạt giá trị cực đại

(OD600> 1,896) sau 36 giờ nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).

Tóm lại, qua các kết quả trên chúng tôi nhận thấy :

+ Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng sinh khôi tế bào của chủng B và N4 là từ 30°c - 35°c.

+ Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng L2 là 35°c - 40°c.

Đây là các khoảng nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể (37°C), thích hợp cho sự phát triển của hầu hết các chủng vsv. Đặc điểm này có lợi cho việc sử dụng các chủng vào sản xuất chế phẩm probiotic để phòng và trị bệnh đường ruột cho heo.

3.4.2.2. pH ban đầu Trị số pH ban đầu ương MT có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của vsv. Đối với VK lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc rất nhiều vào pH.

Để xác định ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khôi của các chủng VK lactic trên, pH MT được điều chỉnh đến các giá trị 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5 bằng NaOH I N và CH 3COOH IN. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ.

Kết quả được trình bày ương bảng 3.11 và biểu diễn trên đồ thị 3.6.

OpH

5.0

■ pH

5.5

□ pH

18

24

30 36

Thời gian (giờ)

Đồ thị 3.6. Ảnh hường của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khôi của chủng L2

* Nhận xét Qua kết quả trên, chúng tôi nhận thây 2 chủng B và N4 có thể phát triển ở khoảng pH rộng từ 5,5 đến 7,5, tốc độ sinh trưởng của chúng ương khoảng pH từ 5,5 đến 7,5 không khác nhau nhiều.

Ở pH 6,5 tốc độ sinh trướng của chúng ổn định hơn và mật độ tế bào gần ở mức

cực đại sau 12 giờ nuôi cấy (OD600> 2,000).

Như vậy, pH ban đầu tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng B và N4

trong khoảng từ 6,0 - 6,5.

Chủng L2 có thể phát triển trong khoảng pH từ 5,0 đến 6,5, trong khoảng pH này tốc độ sinh trưởng của chúng khá ổn định. Ở pH 5,5 tốc độ sinh trưởng của chủng L2 ổn định hơn và mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600> 1,678).

Như vậy, pH ban đầu tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng L2 trong khoảng từ 5,5 - 6,0. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998).

Theo chúng tôi, pH ban đầu của MT có vai trò quan trọng, góp phẫn tạo điều kiện thuận lợi cho VK trong giai đoạn đầu của quá trình đồng hoa và tổng hợp các chất cần thiết. Do đó có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tạo thành sinh khối VK.

Chúng tôi nhận thấy cả 3 chủng đều phát triển tốt ở khoảng pH khá rộng Lừ 5,5 đến 7,5. Điều này rất có lợi bởi cho phép chúng có thể phát triển tốt ở nhiều MT sống khác nhau. Trong cùng MT, khi VK lactic tồn tại và phát triển được ở pH kiềm sẽ có khả năng ức chế, tiêu diệt VK gây thối, gây bệnh.

3.4.2.3. Nguồn thức ăn nitơ Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp của VK lactic rất cần những cơ chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thúy phân protein từ thịt, cao nấm men, pepton, ... Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho sự tạo thành sinh khối tế bào của VK lactic.

Để khảo sát vai trò của các nguồn nitơ đối với sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của các chủng B, N4, L2 trong MT nước chiết cà chua, chúng tôi sử dụng các nguồn nitơ là cao nám men, dịch chiết nấm men, cao thịt, pepton.

Xác định giá trị ODeoo tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong

bảng 3.12 và biểu diễn trên đồ thị 3.7, 3.8, 3.9.

* Nhận xét Khi thay đổi nguồn nitơ trong thành phần MT nuôi cấy thì tốc độ sinh trưởng của ba chủng VK nói trên có sự thay đổi đáng kể. Cả ba chủng B, N4, L2 đều phát triển tốt trong MT có nguồn nitơ là cao nấm men, mật độ tế bào gần ổ mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600 > 1,860), so với cao thịt (OD600 > 1,045), dịch chiết nấm men hoặc pepton (OD600> 0,687). Nguyên nhân do thành phần cao nấm men có nhiều chất hữu cơ phức tạp, rất cần cho sự tạo thành sinh khối tế bào của các chủng VK lactic.

Như vậy, sau MT MRS có thể chọn MT cà chua với nguồn nitơ cao nấm men là MT nghiên cứu sự tạo thành sinh khối của 3 chủng VK lactic trên. Kết quả nghiên cứu

của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).

3.4.2.4. Nồng độ cao nấm men Để xác định nồng độ cao nấm men thích hợp, chúng tôi nuôi cấy ba chủng VK trên trong MT nước chiết cà chua có bổ sung 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% cao nấm men. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 và biểu diễn trên đồ thị 3.10.

* Nhận xét Khi thay đổi nồng độ cao nấm men từ 0,5% đến 2,5% thì tốc độ phát triển của hai chủng Lactobacillus sp. B, Lactobacillus sp. N4 không thay đổi nhiều, mật độ tế bào gần ở mức cực đại (OD600> 2,000) sau 24 giờ nuôi cấy ở nồng độ 1,5% cao nấm men, mật độ tế bào của hai chủng B, N4 có sự chênh lệch không đáng kể so với các nồng độ còn lại.

Với chủng L2, tóc độ sinh trưởng tăng rõ rệt ở nồng độ cao nấm men từ 2,0% đến 2,5% (OD600 > 2,005) sau 24 giờ nuôi cấy. ở nồng độ từ 0,5% đến 1,5% tốc độ sinh trưởng chậm hơn.

Tóm lại qua các kết quả trên chúng tôi nhận thấy : + Nồng độ cao nấm men tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng B và từ

1% - 1,5%.

+ Nồng độ cao nấm men tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng L2

t ừ l % - 2 , 0 % .

Như vậy, để thu sinh khối tế bào của các chủng VK lactic trên có thể sử dụng MT nước chiết cà chua với nguồn nitơ cao nấm men với hàm lượng từ 1 % đến 2% là phù hợp.

3.4.2.5. Nguồn thức ăn cacbon

Người ta thường dùng đường để làm nguồn thức ăn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vsv dị dưỡng, nên mục đích của thí nghiệm này là nhằm xác định nguồn đường thích hợp nhất, rẻ tiến nhất cho sự gia tăng sinh khối tế bào của ba chủng B, N4, L2.

Ba chủng VK trên được nuôi cây với các nguồn đường như glucose, saccharose,

maltose, galactose, lactose, ở các điều kiện tối ưu đã được khảo sát.

Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong

bảng 3.14 và biểu diễn trên đồ thị 3.11.

* Nhận xét Trong các loại đường được khảo sát, tốc độ tăng trưởng của cả ba chủng không thay đổi nhiều, mật độ tế bào của chúng chênh lệch không đáng kể. Điều này chứng tỏ các chủng VK được khảo sát có khả năng sử dụng được nhiều loại đường khác nhau.

Như vậy, có thể sử dụng saccharose thay thế cho glucose ương quá trình lên men thu sinh khối, nhằm làm giảm giá thành khi sản xuất chế phẩm.

3.4.2.6. Nồng độ saccharose Với mục đích xác định nồng độ đường saccharose thích hợp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy ba chủng B, N4, L2 trên MT nước chiết cà chua có bổ sung 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% saccharose. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.15 và biểu diễn trên đồ thị 3.12.

* Nhận xét Khi thay đổi nồng độ saccharose từ 0,5% đến 2,5%, tóc độ phát triển của hai chủng B, N4 không thay đổi nhiều, mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600 > 2,000). Chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 1,5% saccharose, mật độ tế bào của hai chủng B, N4 tăng rõ rệt so với các nồng độ còn lại.

Đối với chủng L2, tốc độ sinh trưởng tăng rõ rệt ỏ nồng độ saccharose từ 1,0% đến 2,5%, mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600 > 1,427), ở nồng độ 0,5% tốc độ sinh trưởng chậm hơn.

Như vậy, để thu sinh khối các chủng VK khảo sát trong MT nước chiết cà chua có thể dùng nồng độ saccharose từ 1 - 1,5% với chủng B, N4 và 1 - 2% với chủng L2 là phù hợp.

Qua các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến khả năng tạo sinh khối tế bào của 3 chủng B, N4, L2, có thể xác định được các điều kiện tôi ưu cho sự tạo thành sinh khôi của 3 chủng như sau : + MT nước chiết cà chua. + Nhiệt độ từ 30°c - 35°c (B và N4); 35°c - 40°c (L2). + pH ban đầu là 6 - 6,5 (B và N4); 5,5 - 6,0 (L2). + Nồng độ cao nấm men là 1,0 - 1,5% (B và N4); 1,0 - 2,0% (L2). + Nồng độ saccharose là 1,0 - 1,5% (B và N4); 1,0 - 2,0% (L2).

3.5. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện tối ưu

Tiến hành nuôi cấy tĩnh 3 chủng B, N4, L2 trên MT nước chiết cà chua với các điều kiện tối ưa vừa khảo sát cho từng chủng. Xác định giá trị OD600, lượng axit tổng, sự thay đổi độ pH tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được mô tả trong bảng 3.16 và biểu diễn trên đồ thị 3.13, 3.14, 3.15.

* Nhận xét

Từ các kết quả trên cho thấy tại thời điểm từ 12 - 24 giờ, hàm lượng axit lactic tăng rõ nhất từ 1,062 - 1,341 g/1, tương ứng với sự giảm dẫn độ pH từ 4,332 đến 3,431, trong khi mật độ tế bào đạt mức cao nhất với OD600 khoảng 1,517 -2,422. Như vậy, mật độ tế bào tăng tỷ lệ thuận với hàm lượng axit lactic và tỷ lệ nghịch với độ pH theo thời gian.

Theo chúng tôi, thời điểm tốt nhất cho việc thu sinh khối của chủng B, N4 và L2 là khoảng thời gian 24 - 36 giờ. Đây là giai đoạn chuyển từ pha logarit sang pha phát triển ổn định trong quá trình sinh trưởng. Vì vậy, thu sinh khối ở giai đoạn này là tốt nhất.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998), Võ Thị Thứ và cộng sự (2003).

Tổng hợp kết quả nghiên cứu trong phần 3.4 và 3.5, chúng tôi có thể rút ra những

điều kiện tối ưu cho quá trình thu sinh khối 3 chủng VK lactic là :

3.6. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic sau khi đông khô

Mục đích đông khô các chủng vsv là phương pháp bảo quản giống lâu dài và làm nguồn nguyên liệu để tạo chế phẩm probiotic. Để đảm chất lượng chế phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sống sót các chủng sau quá trình đông khô.

Sau đó lấy mẫu ra và kiểm tra khả năng sống sót của các chủng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (kiểm tra ngẫu nhiên vài ống đông khô của ba chủng B, N4 và L2). Mẩu đông khô có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh. Kết quả được trình bày trong bảng 3.18.

* Nhận xét Từ kết quả ở bảng 3.18, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ sống sót sau 15 ngày đông khô của ba chủng B, N4 và L2 đều đạt trên 90% (l010 tế bào/1g mẫu); tỷ lệ sống sót sau 30 ngày đều trên 80% (l010 tế bào/lg mẫu); sau 3 tháng số lượng tế bào của các chủng B, N4 và L2 có giảm đi nhưng vẫn ở mức cho phép (l09 tế bào/ l g mẫu). Điều này chứng tỏ tỷ lệ sống sót sau đông khô của ba chủng rất cao so với mức cho phép (l09 tế bào/ lg mẫu).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu c ủ a Võ Thị Thứ và cộng sự (2003); Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2003). Đặc điểm này rất thuận lợi cho việc tạo chế phẩm probiotic. Khả năng sống sót cao sau quá trình đông khô chứng tỏ chúng không ảnh hưởng đến chất lương của chế phẩm sau một thời gian bảo quản.

3.7. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống vi khuẩn lactic

Mục đích việc phối trộn giống nhằm phát huy cao nhất thế mạnh c ủ a từng

chủng trong tổ hợp giống làm chế phẩm probiotic.

Tiến hành phối trộn ba chủng B, L2 và N4 theo tỷ lệ khác nhau : 1: 1: 1 , 2: 1 : 1 , 1 : 2 : 1 , 1 : 1 : 2 (v/v). Khảo sát hoạt tính đối kháng của từng tỷ lệ với một số chủng VK kiểm định bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.19.

* Nhận xét Trong 4 tổ hợp phối trộn trên, chúng tôi nhận thấy tổ hợp 1 : 2 : 1 có hoạt tính đối kháng với các VK kiểm định cao nhất (D - d = 17-31 mm) so với 3 tổ hợp còn lại (D - d = 11-29 ram). Khả năng đối kháng mạnh nhất với Streptococcus sp. (D - d = 31 ram), s. choleraesuis (D - d = 29 mm) và khá mạnh với E. coli (D - d = 19 ram). Đây là 3 chủng V K gây bệnh đường ruột phổ biến ở gia súc đặc biệt là heo. Do đó chúng tôi chọn tỷ lệ phối trộn 3 chủng là 1: 2: 1 (g/g) để tạo chế phẩm probiotic tiếp theo.

3.8. Tạo chế phẩm probiotic

Tiến hành nhân giống và lên men 3 chủng VK lactic trên trong MT nước chiết

cà chua, thu sinh khối ở pha ổn định, mang đi đổng khô.

Tiến hành phối trộn ba chủng B, N4 và L2 sau khi đông khô theo tỷ lệ l g chủng

B : 2g chủng L2: l g ch ủng N4.

Bổ sung enzym a-amylase và protease vào chê phẩm probiotic theo tỷ lệ: + l g ch ế phẩm probiotic + l,5g enzym (0,75g a-amylase + 0,75g protease) Việc bổ sung enzym nhằm làm tăng hiệu quả của chế phẩm trong việc phòng và

trị các bệnh về đường tiêu hóa cho heo.

Sau khi phối trộn với enzym oc-amylase và protease, chế phẩm probiotic được đóng gói (50g/ gói) và bảo quản trong bao nhôm, được giữ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành kiểm tra chất lượng của chế phẩm sau thời gian bảo quản khác n h a u . Chế phẩm trên được chúng tôi đặt tên là PSPoi.

3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic trong chế phẩm PSPoi

Chế phẩm PSP01 sau khi trộn với enzym được bảo quản trong bao nhôm, để ở nhiệt độ phòng. Cứ 15 ngày kiểm tra số lượng tế bào của các chủng B, N4 và L2. Có trong 1 gam chế phẩm PSP01 bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Kết quả được trình bày trong bảng 3.20.

* Nhận xét Do thời gian có hạn, chúng tôi chỉ kiểm tra được số lượng tế bào của các chủng sau 30 ngày bảo quản. Sau 30 ngày số lượng tế bào của các c h ủ n g B, N4 và L2 thay

đổi không đáng kể, số lượng tế bào của các chủng VK trong chế phẩm PSP01 đạt trên l09 tế bào/lg chế phẩm. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thứ và cộng sự (2003); Lê Tân Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2003).

Các tác giả đều cho rằng, số lượng tế bào của các chủng vsv trong chế phẩm

probiotic đạt trên l09 tế bào/lg chế phẩm là tốt nhất và sẽ mang lại hiệu quả cao nhất.

3.10. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm PSP01

Qua các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm PSP01 ở quy mô phòng thí nghiệm. Quy trình được tóm tắt theo sơ đồ sau :

* Giải thích quy trình công nghệ sản xuất chê phẩm PSP 0 1 Tiến hành nhân giống ba chủng B, N4 và L2 (1% v/v) trên MT nước chiết cà

chua trong điều kiện tối ưu đối với từng chủng.

Bổ sung 1% dịch nhân giống vào các ống nghiệm lớn có sẵn MT lên men, lên men trong điều kiện tối ưu của từng chủng (điều kiện tối ưu ở bảng 3.17). Tiến hành thu sinh khối của từng chủng ở pha ổn định và mang đi đông khô.

Sau khi đông khô, chúng tôi tiến hành tổ hợp giống theo tỷ lệ 1 g chế phẩm chủng B : 2g chế phẩm chủng L2: l g chế phẩm chủng N4. Sau khi tổ hợp giống chúng tôi được chế phẩm PSP01 tinh khiết dưới dạng bột trắng như sữa.

Tiến hành phối trộn chế phẩm PSP01 với enzym a-amylase v à protease vào thức ăn theo tỷ lệ : l g chế phẩm PSP01 : l,5g enzym (0,75g tt-amylase + 0,75g protease): 1 kg thức ăn.

Theo các nhà nghiên cứu, enzym a-amylase và protease được bố sung vào chế phẩm probiotic nhằm làm tăng hiệu quả của chế phẩm trong việc phòng và trị các bệnh về đường tiêu hóa cho heo. Cụ thể là chúng làm tăng hệ số tiêu hoa thức ăn, giúp heo tăng trọng nhanh và góp phần làm tăng khả n ă n g mi ễn dịch của chúng.

Trước khi bổ sung enzym vào chế phẩm PSP01, chúng tôi tiến h à n h kiếm tra

hoạt tính của chúng.

+ Hoạt tính của enzym a-amylase được kiểm tra bằng phương p h á p Smith &

Roe, kết quả đạt 1453.963 UI (mg tinh bột/g/phút).

μ + Hoạt tính của enzym protease được kiểm tra bằng phương pháp Anson cải tiến, kết quả đạt 21.867 Anson ( mol Tyrosin/g/phút). Theo Nguyễn Lân Dũng và Lê Ngọc Tú (1982), hoạt tính của enzym cc-amylase và protease như thế là khá cao và sẽ mang lại hiệu quả cao trong chăn nuôi.

Sau khi phôi trộn với enzym a-amylase và protease, chế phẩm PSP01 được đóng gói và bảo quản trong bao nhôm, được giữ ở nhiệt độ phòng và kiểm tra chất lượng sau một thời gian bảo quản.

Hình 3.6. Chế phẩm PSP01 trước và sau khi đống gói

3.11. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm PSP01 trên heo con sau cai sữa

Mục đích thí nghiệm là nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm PSPoi đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy, hệ sô chuyển hoá thức ăn và khả năng tăng trọng của heo con sau cai sữa giai đoạn từ 28 ngày đến 56 ngày tuổi. So sánh hiệu quả của chế phẩm PSP01 so với hiệu quả của chế phẩm BioI do Viện sinh học nhiệt đới TP. HCM sản xuất và so với đối chứng không dùng chế phẩm.

3.11.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa

Kết quả theo dõi tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa (28 ngày tuổi) được tính bao gồm cả sô ngày heo con tiêu chảy tái phát trên tổng số ngày nuôi của tất cả heo con trong lô thí nghiệm. Tỷ lệ tiêu chảy trung bình của 5 lô thí nghiệm được trình bày qua bảng 3.21 và đồ thị 3.16.

* Nhận xét Kết quả khảo sát cho thấy, ở các lô thí nghiệm 3, 4, 5 , được bổ s u n g ch ế phẩm PSP01 với liều l09 tế bào/kg thức ăn, có tỷ lệ tiêu chảy thấp hơn so với lô ĐC2 (lô đối chứng bổ sung BioI) và lô ĐC1 (lô đối chứng không bổ sung chế phẩm). Như vậy, việc bổ sung liên tục PSP01 với liều l09 tế bào/kg thức ăn, cho heo con trong giai đoạn cai sữa đã có tác dụng làm giảm 42,87% - 62,89% t ỷ lệ tiêu chảy ở heo con so với lô ĐC1. Điều này chứng tỏ, PSP01 ngoài t á c d ụ n g c ạ n h tranh và đối kháng để loại trừ VK gây bệnh, còn cung cấp thêm một lượng vsv có lợi, giúp duy trì sự cân bằng hệ vsv đường ruột, từ đó làm g iả m tình trạng tiêu chảy ở heo con. Đặc biệt, ở các lô thí nghiệm 3, 4, 5, không có tỷ lệ t á i phát bệnh, còn ở lô ĐC1 tỷ lệ tái phát bệnh khá cao (66,66%) ( 2 con bị tái p h á t , 3 con được điều trị khỏi). Kết quả khảo sát của chúng tôi phù hợp với ghi n hậ n của một số tác giả như Trần Thị Thu Thúy (2003), khi sử dụng Organic Green để phòng bệnh tiêu chảy ở heo con cai sữa với liều 1,2 tỉ CFU/kg thức ăn liên tục trong 28 ngày, đã làm giảm 45,17% - 57,30% tỷ lệ tiêu chảy ỏ heo con so với l ô đối chứng; Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoe (2002), sử d ụ n g VITOM 1 , 1 liều 50mg/kgP, 2 ngày 1 lần trên heo con đế phòng bệnh tiêu chảy, kết q uả đã giảm 47,5% số heo con mắc bệnh so với lô đối chứng,...

Kết quả khảo sát trọng lượng heo con ở 28 ngày tuổi, 56 ngày tuổi và tăng trọng bình

quân từ 28 đến 56 ngày tuổi được trình bày qua bảng 3.22 và đồ thị

3.11.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa

* Nhận xét Kết quả khảo sát cho thấy, tăng trọng bình quân ở các lô cổ bổ s u n g chế phẩm (lô 3, 4, 5, ĐC2) đều cao hơn so với lô ĐC1. Tuy nhiên, t ă n g trọng bình quân giữa các lô 3, 4, 5 không đều nhau. Điều này có lẽ là do trọng lượng trung bình lúc bắt đầu thí nghiệm của heo con giữa các lô thí nghiệm không đều nhau, dẫn tới sự tăng trọng bình quân giữa các lô không đều nhau.

Theo Chiba (1996), trọng lượng heo con ở 4 tuần tuổi được x é p h ạ n g n h ư

sau : kém khi < 5 kg/con; trung bình khi đ ạ t từ 5 - 7,2 kg/con và tốt khi > 7,2 kg/con.

Chính trọng lượng khổng đều nhau giữa các heo con đã ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa thức ăn v à tăng trọng của heo. Vì thế mà ở lô 3, lăng trọng bình quân rất cao so với các lô 4, 5 và lổ ĐC2 (12,9kg/con so với 9, Ì kg/con ỏ lô ĐCl).

Như vậy, chỉ tiêu tăng trọng đạt cao nhất ở các lô có bổ s u n g chế phẩm, Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Thu Thúy (2003) và Thái Quốc Hiếu (2002).

Các tác giả đều cho rằng, ở tất cả các lô có bổ sung chế phẩm sinh học cho heo con,

đều cho kết quả tăng trọng cao hơn các lô đối chứng.

Các ghi nhận hệ số tiêu tốn thức ăn được tổng hợp trong bảng 3.23 và đồ thị 3.18.

3.11.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn

* Nhận xét Kết quả khảo sát cho thấy hệ số tiêu tốn thức ăn ở các lô có bổ sung chế phẩm PSP01 (lô 3 : 1,31; lô 4 : 1,24; lô 5 : 1,29) và BioI (lô ĐC2 : 1,16) đều thấp hơn rất nhiều so với lô ĐC1 (1,67). Ở lô ĐC2 (bổ sung BioI) hệ số tiêu tốn thức ăn thấp nhất, điều n à y có lẽ liên quan đến chất lượng enzym bổ sung v à o ch ế phẩm.

Qua các kết quả trên cho thấy khi bổ sung probiotic vào trong khẩu p hầ n ăn, các vsv có lợi sẽ nhanh chóng phát triển, chúng kết hợp với các e n z y m , l à m cho heo con ă n nhiều hơn, hấp thu dưỡng chất tốt hơn, chuyển hoa thức ă n tốt hơn, heo tăng trọng mau hơn, làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn. Kết q uả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Thu Thúy (2003) và Thái Quốc Hiếu (2002). Các tác giả cho rằng, ở tất cả các lô có bổ sung chế phẩm s i n h học, đều có hệ số tiêu tốn thức ă n thấp hơn so với các lô đối chứng.

Theo kinh nghiệm của các nhà chăn nuôi, hệ số tiêu tốn thức ă n khoảng 1,4 là

tốt nhất và đạt hiệu quả kinh tế nhất.

Qua các kết quả thử nghiệm chế phẩm ở trên, chúng tôi n hậ n thấy, h iệ u quả phòng và chữa bệnh tiêu chảy cho heo con của chế phẩm PSP01 tương đương với chế phẩm BioI của Viện sinh học nhiệt đới TP. HCM; Hệ số tiêu tấn thức ă n của chế phẩm PSP01 cao hơn chế phẩm BioI (1,29 so với 1,16), điều n à y có lẽ liên quan đến chất lượng enzym bổ sung vào chế phẩm.

Tuy nhiên, các số liệu chúng tôi ghi nhận được chỉ là bước thử nghiệm do số lượng heo con còn hạn chế trong giai đoạn dịch H5N1 có nguy cơ b ù n g p h ấ t ở Việt Nam.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

Từ những thực nghiệm trên, chúng tôi đã thu được những kết luận sau :

1 - Từ 10 chủng vi khuẩn lactic trong bộ SƯU tập giống của phòng thí nghiệm Vi sinh trường ĐHSP TP. HCM, qua khảo sát chúng tôi đã chọn ra được 3 chủng VK lactic B, N4, L2 có đặc tính phù hợp yêu cầu sản xuất chế phẩm probiotic là :

_ Có khả năng sinh axit lactic cao. _ Có hoạt tính đối kháng mạnh, phổ kháng khuẩn rộng với các v s v kiểm định (gây bệnh đường ruột), đặc biệt là các VK gây bệnh tiêu chảy cho heo n h ư E. coli, Salmonella typhimurium, Saimonella choieraesuis.

_ Có khả năng đề kháng tốt với các chất kháng sinh (trị đường r u ộ t ) n h ư

neomicin (Ne), nalidixic axit (Ng), kanamicin (Kn), gentamicin (Ge).

: Chủng Lactobacillus sp. B là Lactobacillus agilis thể kết luận

2- Kết quả nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa của 3 chủng B, N4, L2, phối hợp kết quả định danh đến loài của trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội. Dựa vào khoa phân loại của Bergey's (1986) và Okada (1992) có ; Chủng Lactobacillus sp. N4 là Lactobacillus salivarius ; Chủng Lactobacillus sp. L2 là Lactobacillus acidophilus.

3- Đã xác định được các điều kiện tối ưu cho sự tạo thành sinh khối của 3 c h ủ n g

là :

+ MT nước chiết cà chua. + pH ban đầu là 6 - 6,5 (đối với chủng B và N4); 5,5 - 6,0 (đối với chủng L2). + Nồng độ cao nấm men là 1,0 - l,5(g/l) (B và N4); 1,0 - 2,0 (g/1) (L2). + Nồng độ saccharose là 1,0 - l,5(g/l) (B và N4); 1,0 - 2,0 (g/1) (L2). + Nhiệt độ từ 30°c - 35°c (B và N4); 35°c - 40°c (L2). + Thời gian tối ưu để thu sinh khối từ 18 - 30 giờ (B và N4); 24 - 36 giờ (L2). 4- Đã xác định tỷ lệ phối trộn các chủng sau quá trình đông khô là 1:2:1 (B: L2: N4), cùng với việc bổ sung enzym theo tỷ lệ : 1 g chế phẩm PSP01 : l,5g enzym (0,75g a-amylase + 0,75g protease) : 1 kg thức ăn. Từ đó xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm PSP01.

5- Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm PSP01 cho thấy : Khả năng sống sót của 3 chủng VK trên sau 15 ngày đạt 93,24% - 95,68%; sau 30 ngày đạt 80,39% - 85,94% tương đương với chất lượng chế phẩm BioI đang được sử dụng trên thị trường.

6- Đã xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm PSP01 7- Bước đầu thử nghiệm chế phẩm PSPoi trên heo con sau cai sữa, giai đoạn 28 đến 56 ngày tuổi. Kết quả thu được : Tỷ lệ tiêu chảy 7,74% ; Tỷ lệ tái phát 0% ; Tăng trọng trung bình là 384,3g/ngày ; Hệ số tiêu tốn thức ăn 1,28%. So với lô sử dụng BioI, đạt chất lượng tốt hơn hay tương đương.

Đề nghị

Từ những kết quả nghiên cứu đạt được, chúng tôi xin đề nghị nghiên cứu tiếp

theo một số các nội dung.

_ Xác định bản chất của các yếu tố đối kháng của VK lactic với các V K kiểm

định.

_ Khảo sát chất lượng chế phẩm PSP01 trong các điều kiện bảo quản khác nhau. _ Tiếp tục thử nghiệm chế phẩm trên quy mô chăn nuôi rộng hơn làm cơ sở cho

việc sản xuất và sử dụng chế phẩm đại trà.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 1. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học Công nghiệp, Nxb Khoa học và

kỹ thuật, Hà Nội, tr.105-108.

2. Kiều Hữu Ảnh dịch (1983), Cơ sở hoa sinh của Vi sinh vật học Công nghiệp, Nxb

Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

3. Nguyễn Liêu Ba, Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương (2003), Đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus và Lactobacillus có khả năng ứng dụng để xử lý môi trường nuôi tôm, cá, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 388-391.

4. Lý Kim Bảng, Lê Thanh Bình, Tạ Kim Chỉnh (1998), ứng dụng vi khuẩn lactic trong việc bảo quản thức ăn xanh cho trâu bò, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, tập 10, tr. 455-457.

5. Báo Sài gòn giải phóng (Ngày 10/12/1999), Vai trồ của vi khuẩn lactic đối với cơ

thể, tr. 4.

6. Lê Thanh Bình (20-26/10/1997), Vỉ khuẩn lactic và kỹ thuật gen, những vấn đề và

triển vọng trong sản xuất thực phẩm, Unesco Worshop H à Nội, tr. 1-11.

7. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh

hóa, Nxb Đại học Quốc gia TP. HCM, tr. 55-69.

8. Nguyễn Thị Chính (chủ biên), Trương Thị Hoa (2005), Vi sinh vật y học, Nxb Đại

học Quốc gia Hà Nội.

9. Trần Thị Dân (2004), Sinh sản heo nái và sinh lý heo con, Nxb Nông nghiệp, TP.

HCM.

10. Trương Văn Dung, Phạm Sỹ Lăng (chủ biên), Nguyễn Ngọc Nhiên, Lê Văn Tạo, Nguyễn Hữu Vũ (2002), Một số bệnh mới do vi khuẩn và Mycoplasma ở gia súc - gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

11. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật

học, Nxb Giáo dục, Tr. 224-230.

12. Nguyễn Lân Dũng dịch (1980), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học v à Trung

học chuyên nghiệp.

13. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972, 1976, 1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, II, III, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

14. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, Nxb Giao dục, tr

133-138.

15. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa ở

lợn, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

16. Nguyễn Văn Đức (2005), Nguồn gen giống lợn móng cái, Nxb Lao động - Xã hội.

17. Hội chăn nuôi Việt Nam (2003), cẩm nang chăn nuôi lợn, Nxb Nông nghiệp, Hà

Nội.

18. Lê Tân Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Thị Hồng Vân, Võ Minh Sơn (2003), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II và kết quả thử nghiệm trên ao nuôi tôm, Hội nghị Công nghệ S i n h học toàn quố c, Hà Nội, tr. 75-79.

19. Đinh Duy Kháng, Nguyễn Thị Ngọc Ánh, Phan Văn Chi (1998), Sản xuất và xác định tính chất của kháng huyết thanh kháng Lactobacilỉus acidophilus, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, XXXVI, 2, tr. 7-11.

20. Đinh Duy Kháng và cộng sự (1988), Các thông số kỹ thuật quan trọng trong qui trình sản xuất bỉolactovin trong thùng lên men 15l/mẻ, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 36, số 4, tr. 30-34.

21. Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003), Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus probiotic CH 123 và CH 126 phân lập từ đường ruột của gà, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 101-105.

22. Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân, Trương Văn Dung (2003), Bệnh phổ biến ở lợn và

biện pháp phòng trị, Tập 1,2, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

23. Trương Lăng (2000), Hướng dẫn điều trị các bệnh lợn, Nxb Đà N ẵ n g .

24. Nguyễn Đức Lượng (1997), Công nghệ vi sinh vật, Tập I , Trường Đại học Bách

khoa, tr. 192-201.

25. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học, Tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc gia TP. HCM.

26. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẩn (1997), Thực tập vi sinh vật

học thực phẩm, Trường Đại học Kỹ thuật TP. HCM.

27. Nguyễn Hoài Nam (1986), Xác định hoạt lực khánh sinh bằng vi sinh vật, Tập I ,

Nxb Khoa học và Kỹ thuật.

28. Lương Đức Phẩm (2001), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm, Nxb Nông

nghiệp, tr 86-87.

29. Nguyễn Như Pho, Trần Thị Thu Thúy (2003), Tác dụng của probiotic đến bệnh tiêu chảy trên heo con, Hội nghị khoa học chuyên ngành Chăn nuôi thú y, Đại học Nông lâm TP. HOM, tr. 14-20.

30. Nguyễn Hữu Phúc (1998), Các phương pháp lên men thực phẩm truyền thống ở

Việt Nam và các nước trong vùng. Nxb Nông nghiệp.

31. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trương Thị Hồng Vân, Lê Tấn Hưng (2003), Khảo sát khả năng cạnh tranh và đối kháng của các vi sinh vật có trong chế phẩm BIO II với vỉ khuẩn gây bệnh cho tôm, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 353-357.

32. Nguyễn Vĩnh Phước (1977), Vi sinh vật học thú y, Tập 2, Nxb Đại học và Trung

học chuyên nghiệp, Hà Nội.

33. Trần Mỹ Quan, Nguyễn Thị Huyên, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Quang Tâm

(2003), Thực tập sinh hóa cơ sở, Nxb Đại học Quốc gia TP.HCM.

trình kiểm nghiệm thực, thực 34. Nguyễn Quang Tâm (2003), Giáo

lương phẩm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Tài liệu lưu hành nội bộ).

35. Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh. Nxb Giáo dục.

36. Trần Thanh Thúy (1998), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học. Nxb Giáo dục.

37. Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực

phẩm, mỹ phẩm. Nxb Giáo dục.

38. Võ Thanh Thứ (1992), Nghiên cứu sản xuất BIOLACTOVIN để phỏng và chống bệnh tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, bệnh hoại thư, bệnh táo bón, Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, tr. 45-46.

39. Võ Thanh Thứ (1993), Nghiên cứu bảo quản dược chủng Lactobacillus

acidophilus, Tạp chí Sinh học.

40. Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương (2003), Nghiên cứu tạo chế phẩm BOCHE và đánh giá tác dụng của chế phẩm đến môi trường nước nuôi tôm cá, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 119-122. 41. Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzym vi

sinh vật. Nxb Khoa học và Kỹ thuật.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

42. Carbonelle, F Dennis, A. Marmonier, G Pion, R Vargues (1987), Bactériologie

médicaie techniques usuelies, SIMEP SA Paris, France.

43. Gerald w . Tannock (1999), Probiotics A Critical Review, ưniversity of Otago,

Dunedin, New Zealand.

44. Kirsop B. E and Doyle A (1991), Maintenance of microorganisms and Cultured

cells, Amanual of Laboratory Methods, London.

45. M. Garriga, M. pascual, J.M. Moníort and M. Hugas (1998), Selection of lactobacillus for chicken probiotic adịunts, J. of Appl, Microbiol, vo]. 84, p. 125- 132.

46. Young Ju kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001), Study ôn the bacteriocin produced hy Lactobacillus sản phẩm GM 73 11, Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National ưniversity.

47. Yuan Kun Lee, Koji Nomoto, Seppo Salminen, Sherwood L. Gorbach

(1999), Handbook of probiotics, John Wiley & Sons, inc.

48. Seppo Salminen (1997), Lactic acid bacterìa, ưniversity of tưrku, Finland.

49. s. Salminen, M.A. Deighton, Y. Benno, S.L. Gorbach (1998), Lactic acid bacteria in health and disease, In lactic acid bacteria Microbiology and Funtional asspects. Marcel Delker Inc, p. 211-252.

50. Wood. B. J. B (1985), Mỉcrobiology of/ermented foods, voi Ì , Elsevier applied

science publishers, London and New yerle.

51. Wood. B. J. B and Holzapfel WH (1995), The genera of lactic acid

bacteria, Blackie Ademic and proíessional, codon, p. 19-48.

INTERNET 52. http://apresslp.gvpi.net/apfmicro/lpext.dll/fmicro/a0900-Ink?F=lempl.t. 53. http://apresslp.gvpi.net/apfmicro/lpext.dll/fmicro/a890-Ink?F=lempl... 54. http://apresslp.gvpi.net/apfmicro/lpext.dll/fmicro/a0905-ink7f-lempl... 55. http://www.foodwatch.com.au/probiotic.html. 56. http://www.enerex.ca/articles/lactic bacteria.htm