Luận văn Thạc sĩ Vi sinh vật học thú y: Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu

Chia sẻ: Tri Lễ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:158

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xác định được tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội; sản xuất được kháng thể đơn dòng đặc hiệu của vi khuẩn E.coli O157:H7. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Vi sinh vật học thú y: Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRONG THỊT BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU PHẠM THỊ TÂM CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC THÚ Y
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm ở Việt Nam đang được Chính phủ và hầu hết các Ngành, các cấp và người tiêu dùng quan tâm. Gần đây báo chí thường xuyên lên tiếng phản đối việc sử dụng hormone, kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật không đúng mục đích và không phù hợp với các qui định, gây ảnh hưởng nguy hiểm đến sức khoẻ con người. Việc phát hiện thấy chất sudan trong lòng đỏ trứng gà, melamin trong sữa, kim loại nặng gấp nhiều lần so với ngưỡng quy định là những hồi chuông cảnh báo cho sự mất an toàn của thực phẩm đang lưu hành tại Việt Nam. Theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm – Bộ Y Tế, năm 2010 cả nước đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc bệnh, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử vong. Nguyên nhân chính là do vi khuẩn (Salmonella, Streptoccocus, E. coli Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và hóa chất) [2]. E.coli O15:H7 là một trong các chủng vi khuẩn nguy hiểm gây ngộ độc thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới với các hội chứng: tiêu chảy, viêm ruột xuất huyết, urê huyết (Haemolytic ureamic syndrome-HUS). Thịt bò và các sản phẩm chế biến từ bò là những loại thực phẩm có nguy cơ cao nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7. Theo báo cáo của Griffin P.M, (1995) [47], 3,7% mẫu thịt bò ở vùng Nam Mỹ nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7. Ở Châu Á, E.coli O157:H7 đã được phát hiện ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia (Yamada, 1993) [144], (Son Radu, 1998) [133]. Ở Việt Nam, vi khuẩn này được phát hiện thấy trong phân bò với tỷ lệ 2% (Norobu và cộng sự, 2005) [90]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu của các tác giả trong nước đã phát hiện thấy các gen độc tố điển hình của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò, thịt lợn, phân bò, phân lợn với tỷ lệ mẫu nhiễm khá cao (Phạm Công Hoạt và cộng sự, 2003) [3], (Trần Thanh Phong và cộng sự, 2007) [5].
2 Như vậy, với điều kiện chăn nuôi kém vệ sinh và đặc biệt là điều kiện giết mổ mất vệ sinh, thiếu kiểm soát như hiện nay ở Việt Nam thì nguy cơ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 vào các loại thực phẩm và gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng là rất dễ xảy ra. Với mục đích xác định sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò để chủ động trong công tác phòng, điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm và sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit xác định nhanh vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu”. 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định được tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội; - Sản xuất được kháng thể đơn dòng đặc hiệu của vi khuẩn E.coli O157:H7. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Việc xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 và các đặc tính sinh hóa cũng như độc lực của vi khuẩn này sẽ là cơ sở để xác định dịch tễ học của hội chứng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này gây ra, từ đó tạo cơ sở để xây dựng các biện pháp phòng ngừa quá trình ô nhiễm thực phẩm và điều trị bệnh do vi khuẩn này gây nên. - Đề tài đã đưa ra được quy trình chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu với vi khuẩn E.coli O157:H7 có thể ứng dụng để sản xuất các kit chẩn đoán huyết thanh học xác định vi khuẩn này.
3 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài đã xác định được sự có mặt của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở Hà Nội và một số vùng phụ cận, đồng thời chứng minh được khả năng gây bệnh của các chủng này. - Đề tài đã chế tạo được 2 kháng thể đơn dòng đặc hiệu 100% với vi khuẩn E.coli O157:H7. Hai kháng thể này đã được sử dụng trong nghiên cứu tạo phức hợp kháng thể và hạt nano silica để phát hiện số lượng vi khuẩn E.coli O157:H7 do Viện Công nghệ sinh học chủ trì thực hiện. - Việc xác định được vi khuẩn E.coli O157:H7 và sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit phát hiện vi khuẩn sẽ góp phần tích cực trong công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 4. Những đóng góp mới của đề tài Kết quả của đề tài hoàn toàn mới ở Việt Nam, với các lý do: - Đề tài được thực hiện với đối tượng là vi khuẩn E.coli O157:H7 nhiễm trong thịt bò và đặc tính gây điển hình. Kết quả của đề tài là minh chứng đầu tiên cho sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò ở Hà Nội và các vùng phụ cận. - Lần đầu tiên ở Việt Nam chế tạo được kháng thể đơn dòng đặc hiệu của vi khuẩn E.coli O157:H7 để ứng dụng vào quy trình xác định vi khuẩn trong thực phẩm và chẩn đoán cho bệnh nhân ngộ độc thực phẩm.
4 Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu 1.1 Vi khuÈn E.coli g©y bÖnh Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn thường trú trong đường ruột của người và động vật máu nóng. Hầu hết các chủng E.coli là vô hại. Tuy nhiên, do sự suy giảm miễn dịch hoặc có sự tổn thương ở niêm mạc đường tiêu hoá mà ngay cả các chủng E.coli thông thường cũng có thể gây bệnh. Với các chủng gây bệnh, vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua bề mặt màng nhày niêm mạc hoặc da và gây nên 3 hội chứng lâm sàng chủ yếu, bao gồm: i) nhiễm khuẩn đường tiết niệu, ii) nhiễm trùng huyết hoặc viêm màng não, và iii) viêm ruột, tiêu chảy. Theo thống kê của James Nataro và cộng sự, (1998) [53], các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh được chia thành 5 nhóm ( phụ lục bảng 1). + Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các chủng E.coli gây viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi (Polotsky và cộng sự, 1977) [106]. + Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gồm các chủng E.coli tiết ra 2 độc tố ruột bền nhiệt (heat stable toxin- ST) và độc tố ruột không bền nhiệt (heat-labile enterotoxin- LT). Trong ®ã, độc tố LT hoạt hóa men adenyl cyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’ monophosphat). Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl- và bicarbonat tách ra khỏi tế bào đồng thời ức chế Na+ bên trong tế bào, gây hiện tượng kéo nước từ tế bào, mô vào lòng ống tiêu hóa và hậu quả là gây tiêu chảy mất nước. Còn độc tố ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’ monophosphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước gây ra tiêu chảy. Những chñng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảy trầm trọng và kéo dài (Levine và cộng sự, 1987) [70].
5 + Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những chñng E.coli này bám lên niêm mạc và làm bong tróc gây loét niêm mạc do đó gây tiêu chảy lẫn máu (giống triệu chứng bệnh lỵ do vi khuẩn Shigella) (DuPont và cộng sự, 1971) [35]. + Nhóm EAEC (Enteroaggregative E.coli): là nhóm E.coli gây tiêu chảy nhưng không sản sinh độc tố (Cravioto và cộng sự, 1979) [29]. + Nhóm EHEC: là nhóm E.coli gây tiêu chảy xuất huyết, đại diện là vi khuẩn E.coli O157: H7. Vi khuẩn này gây bệnh ở người với các triệu chứng cấp tính như: tiêu chảy cấp, xuất huyết đường tiêu hoá, phân có lẫn máu, gây hội chứng ure huyết (HUS-Haemolytic Uraemic Syndrome), trường hợp nghiêm trọng có thể gây tử vong. 85-95% các ca bệnh nhiễm E.coli O157:H7 là có biểu hiện hội chứng urê huyết (Riley và cộng sự, 1983) [119]. E.coli O157:H7 là vi khuẩn duy nhất thuộc loài E.coli duy nhất gây ngộ độc thực phẩm ở người. Theo ước tính của CDC, (1999) [26], hàng năm số ca nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 tại nước này chiếm khoảng 20.000 người, trong đó, khoảng 250 trường hợp tử vong. Nguyên nhân của tình trạng ngộ độc này là do E.coli O157:H7 nhiễm trong nước uống, rau xanh, thịt bò và các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ bò. Theo các tác giả Faith và cộng sự, (1996) [39], Hancock và cộng sự, (1994) [48], tỷ lệ E. coli O157:H7 trên gia súc non lớn hơn ở gia súc trưởng thành. Còn theo nghiên cứu của Doyle và cộng sự, (1997) [34] cho biết: E. coli O157:H7 có mặt trong 3,7% mẫu thịt bò bán lẻ, 1,5% mẫu thịt lợn, 1,5% mẫu thịt gà, 2% mẫu thịt cừu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu khác của Le Saux và cộng sự, (1993) [68], cũng chứng minh rằng vi khuẩn E. coli O157:H7 nhiễm trong thịt bò tái, sữa tươi và bánh humburger là nguyên nhân gây nhiều vụ ngộ độc thực phẩm ở Mỹ và Canada. Ngoài ra, người ta cũng đã xác định được sự có mặt của vi khuẩn này ở sốt mayonaire (Griffin, 1995) [47], nước
6 hoa quả chưa thanh trùng (Besser và cộng sự, 1993) [14], (Mc Carthy, 1996) [78] và rau sống (Morgan, 1988) [83]. Ở Việt Nam, mặc dù chưa có báo cáo về số trường hợp ngộ độc thực phẩm do E.coli O157:H7, tuy nhiên, theo báo cáo của Noboru và cộng sự, (2005) [90], 2/100 mẫu phân bò nuôi tại Việt Nam có mặt vi khuẩn này. Theo một số các nghiên cứu ở trong nước của tác giả như: Phạm Công Hoạt và cộng sự, (2003) [3] đã xác định được 8/33 mẫu phân lợn tiêu chảy nhiễm độc tố Stx của vi khuẩn E.coli O157:H7. Còn trong nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Phong và cộng sự, (2007) [5], các gen độc tố đặc trưng của vi khuẩn E.coli O157:H7 như Stx1, Stx2, eae, hly, stb được phát hiện thấy trong thịt bò, thịt lợn, phân bò, phân lợn bình thường và tiêu chảy với tỷ lệ tương đối cao, cụ thể: có tới 50% mẫu phân bê tiêu chảy, 57,1% mẫu phân bò bình thường, 55,9% mẫu thịt bò mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC; còn trên lợn thì có đến 33,3% mẫu phân lợn con tiêu chảy, 62,5% mẫu phân lợn con cai sữa tiêu chảy, 20% mẫu phân lợn bình thường, 24,5% mẫu thịt lợn mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC. 1.2 Các đặc tính của vi khuẩn E.coli O157:H7 1.2.1 Đặc tính sinh học 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái E.coli O157: H7 là trực khuẩn hình que ngắn, bắt màu gram âm, kích thước tế bào khoảng 2x0,5µm, không hình thành nha bào, có lông và roi, có khả năng di động. Khuẩn lạc vi khuẩn dạng S, tròn trơn, bóng, có lớp màng bao bọc, gắn chặt trên bề mặt môi trường thạch, khuẩn lạc có màu nâu nhạt trên môi trường thạch Sorbitol MacConkey(SMAC). 1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy
7 Khác với hầu hết các chủng E.coli khác, E.coli O157:H7 không lên men đường D-sorbitol, do đó, môi trường thạch Sorbitol MacKonkey được sử dụng làm môi trường đặc hiệu để phân biệt vi khuẩn này (March và cộng sự, 1986) [77]. Trên môi trường SMAC, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen. Theo Thompson, (1990) [139], E.coli O157:H7 không sinh enzyme β- glucuronidase, do đó trên môi trường có bổ sung cơ chất 4- methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG), vi khuẩn này không phát quang, trong khi các vi khuẩn E.coli khác lại có khả năng đó. Vì vậy, người ta có thể phân biệt được khuẩn lạc E.coli O157:H7 trên môi trường thạch MUG dưới ánh sáng tử ngoại. Ngoài ra, khuẩn lạc E.coli O157:H7 có thể phân biệt được trên môi trường Rainbow Agar O157 (Biolog Inc., Mỹ) hoặc Fluorocult E.coli O157 (Merck, Đức). Trên môi trường thạch Fluorocult® khuẩn lạc của vi khuẩn này có màu xanh nhạt trong khi các E.coli khác có màu vàng. Còn trên môi trường thạch Rainbow, khuẩn lạc vi khuẩn E.coli O157 có phổ màu đen, xám, đỏ, xanh, tím. 1.2.1.3 Sức đề kháng + Nhiệt độ: khả năng thích ứng với nhiệt độ của vi khuẩn E.coli nhóm EHEC, bao gồm cả chủng E.coli O157:H7 tương tự với các nhóm khác. Theo Doyle và cộng sự, (1984) [32], chủng vi khuẩn này bị ức chế ở điều kiện trên 440C. Tuy nhiên, Palumbo và cộng sự, (1995) [99] lại cho biết, khả năng thích ứng với nhiệt độ của E.coli O157:H7 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy: trong môi trường BHI (Brain Heart Infusion), vi khuẩn này vẫn phát triển tốt ở nhiệt độ 450C, còn với môi trường EC (E.coli) thì chúng lại bị ức chế ở nhiệt độ 440C. Theo Buchanan và cộng sự, (1994) [21], Rajkowski và cộng
8 sự, (1995) [108], nhiệt độ tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn E.coli O157:H7 là khoảng 8-100C. + Độ pH: theo Buchanan và cộng sự, (1992) [20], pH thích hợp cho vi khuẩn E.coli O157:H7 là 5,5-7,5. Vi khuẩn này bị ức chế mạnh ở mức pH 4,0-4,5, tuy nhiên ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của vi khuẩn còn phụ thuộc vào các yếu tố có liên quan khác như: thời gian, nhiệt độ nuôi cấy, loại axit, nồng độ axit sử dụng để chuẩn độ môi trường (Leyer và cộng sự, 1995) [71]. Còn theo nghiên cứu của Benjamin và cộng sự, (1995) [13], Buchanan và cộng sự, (1996) [22], các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC có khả năng chịu được độ pH 2,5 trong 2-7 giờ ở 370C. Trong các loại thực phẩm lên men như nước ép trái cây, pho mát, E.coli O157:H7 có thể tồn tại sau vài tháng. Tuy nhiên, khả năng sống sót của vi khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào thời gian bảo quản, ví dụ: trong nước ép hoa quả vi khuẩn có thể tồn tại từ 2-3 ngày ở 250C, nhưng ở 80C, vi khuẩn chỉ tồn tại từ 10-30 ngày (Zhao và cộng sự, 1993) [148]. + Khả năng chịu mặn: theo Buchanan và cộng sự, (1994) [22], vi khuẩn E.coli O157:H7 có thể chịu được nồng độ muối từ 0,5-5%. 1.2.2 Đặc tính sinh hoá Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 được thực hiện sau bước nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu SMAC. Các khuẩn lạc có màu vàng nâu nhạt được cấy chuyển lên môi trường thạch LB (Luria Agar), sau 18 giờ nuôi cấy ở 420C, thu nhận các khuẩn lạc đứng riêng rẽ để làm các phản ứng sinh hóa như trong bảng 1.1.
9 Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn E.coli O157:H7 ( Samuel và cộng sự, 1998) [122] Phản ứng Kết quả phản ứng β-Glucuronidase - Sorbitol - Salicin - Esculin - Arginine dihydrolase - Adonitol - Inositol - Cellobiose - Urease - Citrate - KCN - Sucrose + Glucose (acid) + Glucose (gas) + Indol + Arabinose + Trehalose + Mannitol + Lactose + Maltose + Rhamnose + Xylose + Lysine decarboxylase + Ornithine decarboxylase + Raffinose + Dulcitol + Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính
10 Phản ứng không lên men đường D-sorbitol được thực hiện trên môi trường SMAC. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen. Phản ứng âm tính β-glucuronidase của vi khuẩn E.coli O157:H7 được thực hiện với môi trường có bổ sung cơ chất 4-methylumbelliferyl-β-D- glucuronide (MUG). Vi khuẩn này không sản sinh enzyme β-glucuronidase vì vậy không thủy phân 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide thành 4- methylumbelliferone và glucuronide vì vậy khi quan sát khuẩn lạc vi khuẩn E.coli O157:H7 dưới ánh sáng đèn tử ngoại, ta không nhìn thấy hiện tượng phát quang do 4-methylumbelliferone. Các phản ứng lên men đường lactose, glucose, sinh H2S và sinh hơi được thực hiện trên môi trường thạch KIA (Kligler Iron Agar). Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 gây hiện tượng lên men đường lactose tạo nên màu vàng ở phần thạch nghiêng, lên men đường glucose tạo màu vàng ở phần thạch đứng. Vi khuẩn này không sinh H2S nên không tạo màu đen trong ống thạch. Phản ứng sinh indol được thực hiện bằng thuốc thử Kovac. Vi khuẩn E.coli O157:H7 được tăng sinh trong môi trường Tryptone Water Buffer ở 370C trong 20 giờ rồi bổ sung 1ml xylen vào ống canh khuẩn, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữa cơ, sau đó nhỏ 1-2 giọt Kovac có chứa p- dimethylaminobenzaldehyde vào ống canh khuẩn. Vi khuẩn E.coli O157:H7 sản sinh enzyme tryptophanase vì vậy sẽ phân giải tryptophan có trong môi trường Tryptone Water Buffer để tạo thành indol. Vì vậy, khi nhỏ thuốc thử Kovac vào canh khuẩn, indol sẽ kết hợp với p-dimethylaminobenzaldehyde để tạo thành phức hợp có màu đỏ hồng trên bề mặt ống nghiệm.
11 1.2.3 Đặc tính gây bệnh Bệnh do vi khuẩn E.coli O157:H7 được coi là bệnh truyền lây giữa người và gia súc. Vi khuẩn này ký sinh trong đường ruột của bò, hươu, cừu vì vậy nó có thể nhiễm vào tất cả các loại thực phẩm, thức ăn, nước uống có tiếp xúc với phân nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, E.coli O157:H7 không gây bệnh cho các loài gia súc này. Ở người, E.coli O157:H7 là một serotype thuộc loài E.coli có khả năng gây ngộ độc thực phẩm, xuất huyết và phù thũng ở màng nhầy niêm mạc ruột (Griffin, 1990) [46]. Các triệu chứng bệnh do vi khuẩn này thường xuất hiện sau hai ngày nhiễm khuẩn (phụ lục hình 1). Biểu hiện ban đầu ở bệnh nhân thường không tiêu chảy nhưng có cảm giác đau quặn bụng và sốt nhẹ. Sau khoảng 24-48 giờ, bệnh nhân tiêu chảy mạnh, đau bụng và mất nước. Trong một số trường hợp, bệnh nhân xuất hiện hội chứng urê huyết. Sau 1 tuần mắc bệnh, bệnh nhân có biểu hiện da dẻ nhợt nhạt, xuất huyết các mạch máu ngoại vi, giảm tiểu cầu, giảm đi tiểu, phù thũng, suy thận cấp (Moake, 1994) [82]. Theo Tarr, (1995) [138], 10% bệnh nhi dưới 10 tuổi có hội chứng urê huyết (HUS) do vi khuẩn E.coli O157:H7, trong đó, tỷ lệ tử vong là 3 - 5%, khoảng 12- 30% số đó xuất hiện các di chứng suy thận, tăng huyết áp, thần kinh, tiểu đường, đột quỵ. 1.2.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli O157:H7 1.2.4.1 Độc tố Shiga toxin- Stx Stx được chia thành 2 loại chính, không gây miễn dịch chéo cho nhau, đó là Stx1 và Stx2, mỗi chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 mang một hoặc cả hai loại độc tố này. Trong đó, Stx1 có tính ổn định cao, còn Stx2 được chia thành nhiều nhóm phụ khác nhau như: Stx2c, Stx2v, Stx2vhb, Stx2e. Stx2e gây phù thũng chủ yếu trên lợn.
12 Trên thực tế, Stx còn được phát hiện thấy ở các chủng gây bệnh đường tiêu hoá như: V.cholerae, V.parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, E.coli K-12, và một số chủng E.coli khác (O’Brien và cộng sự, 1987) [91]. Ở dạng nguyên mẫu, Stx có trọng lượng phân tử là 78 kDa, chứa 2 tiểu phần A và B, trong đó, tiểu phần A là một phân tử protein có trọng lượng phân tử là 32 kDa được phân ly thành 2 chuỗi peptide nhỏ là A1 có trọng lượng 28 kDa (mang hoạt tính enzyme) và A2 có trọng lượng 4 kDa, hai mảnh peptide này liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfua. Phần B có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa chứa 5 liên kết đặc hiệu với điểm thụ cảm globotriaosylceramide (Gb) trên bề mặt của tế bào vật chủ. Khi độc tố gắn lên màng tế bào, chúng được thẩm thấu qua các hốc tế bào rồi đi vào hệ thống golgi và lưới nội chất (Sandvig và cộng sự, 1994) [123], phần A gắn với tiểu phần 60S của ribosom và ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào vật chủ (hình 1.1). Kết quả là gây gián đoạn quá trình tổng hợp protein và gây chết các tế bào biểu mô đường tiết niệu, đường tiêu hoá hoặc các tế bào có chứa Gb3, Gb4. Loài thỏ không có yếu tố này trên bề mặt tế bào biểu mô ruột nên vi khuẩn E.coli O157:H7 không gây tiêu chảy và các triệu chứng liên quan tới ngộ độc thực phẩm. Trong đường tiêu hoá, độc tố Stx có thể gây tổn thương hoặc làm chết các tế bào lông nhung trên biểu mô ruột (Kandel và cộng sự, 1989) [55], (Keenan và cộng sự, 1986) [61]. Để chứng minh khả năng gây bệnh đường tiêu hoá của độc tố Stx, Sjogren và cộng sự, (1994) [130] đã sử dụng chủng vi khuẩn E.coli RDEC-1 gây bệnh tự nhiên trên thỏ với triệu chứng tiêu chảy không có máu lai với thực khuẩn thể mang gen Stx cho thỏ uống. Kết quả thí nghiệm cho thấy, thỏ cho uống chủng vi khuẩn lai có biểu hiện bệnh tích nặng hơn rất nhiều so với thỏ uống chủng tự nhiên E.coli RDEC-1 với các triệu chứng như: thay đổi huyết áp, phù thũng, xuất hiện nhiều đám tổn thương trên niêm mạc đường tiêu hóa.
13 Còn đối với hội chứng urê huyết, các chủng E.coli O157:H7 gây tiêu chảy lẫn máu thường kèm theo hội chứng này hơn các chủng gây tiêu chảy thông thường (Griffin, 1995) [47]. Bằng gây nhiễm thực nghiệm tiêm độc tố Stx1 và Stx2 cho thỏ cho thấy: ở các mô, cơ quan có nhiều điểm thụ cảm Gb3 như ruột non, hệ thần kinh trung ương xuất hiện các đám tổn thương lớn (Barrett và cộng sự, 1989) [12]. Còn ở thận, do thận thỏ không chứa các điểm thụ cảm Gb3 nên không xuất hiện tổn thương (Boyd và cộng sự, 1989) [17]. Đối với con người, Gb3 có nhiều trên ống tiết niệu, vì vậy, dưới tác động của độc tố Stx, các tế bào biểu mô cầu thận căng phồng, tổn thương, có hiện tượng lắng đọng tiểu cầu, hình thành các sợi tơ trong các tế bào cầu thận (Boyd và cộng sự, 1989) [17]. Sự tổn thương tế bào biểu mô cầu thận dẫn tới giảm khả năng lọc của thận, đây chính là nguyên nhân của hội chứng suy thận cấp, biểu hiện điển hình của HUS. Trên thực tế, Stx2 gây hội chứng urê huyết phổ biến hơn Stx1 (Boyd và cộng sự, 1989) [17], theo Pickering, (1994) [105] các chủng E.coli O157:H7 mang độc tố Stx2 thường gây tình trạng HUS mạnh hơn các chủng chỉ mang độc tố Stx1 hoặc cả hai loại độc tố này. Hình 1.1 Cấu trúc của độc tố Stx và cơ chế gây bệnh
14 1.2.4.2 Độc tố east1 (eaec) Theo Savarino và cộng sự, (1996) [124], tất cả các chủng E.coli O157:H7 đều mang gen eastA mã hoá nên độc tố east1 (phụ lục hình 2). Khả năng gây bệnh của độc tố này chưa được xác định nhưng độc tố này đã được tìm thấy trong phân của một số bệnh nhân tiêu chảy. 1.2.4.3 Enterohemolysin (hly) Ở vi khuẩn E.coli O157:H7, độc tố hly được mã hoá bởi gen nằm trên plasmid 60 mDa (phụ lục hình 2) (Schmidt và cộng sự, 1995) [127]. Theo Beutin và cộng sự, (1994) [15], ở Đức, có khoảng 90% chủng E.coli O157:H7 sinh độc tố Stx có mang gen mã hoá độc tố hly. Vai trò của độc tố này vẫn chưa được xác định rõ, tuy nhiên, khả năng dung giải hồng cầu và giải phóng heme cùng sắc tố hemoglobin của độc tố này giúp cho E.coli O157:H7 phát triển tốt hơn trên môi trường thạch máu. 1.2.4.4 Yếu tố bám dính Yếu tố bám dính của E.coli O157:H7 là OPM intimin có trọng lượng phân tử từ 94-97 kDa được mã hoá bởi gen eae. Trên lợn con, E. coli O157:H7 gây tổn thương dạng A/E ở ruột già với đặc điểm bám dính điển hình của vi khuẩn lên các tế bào biểu mô. Bên cạnh đó, các tác giả Ashkenazi, (1992) [8], Fratamico, (1993) [43] cũng cho thấy E.coli O157:H7 còn sản sinh yếu tố bám dính fimbriae, tuy nhiên các tác giả trên chưa xác định được gen mã hoá yếu tố này. 1.2.4.5 pO157 plasmid Theo Schmidt và cộng sự, (1994) [126], 1996 [128] hầu hết các chủng E.coli O157:H7 đều chứa plasmid pO157 có kích thước từ 93.6-104 kb, trên đó có các gen: gen mã hoá độc tố hly có trọng lượng 3.4 kb, gen mã hóa enzyme catalase-peroxidase (KatP), enzyme protease phân hủy serine (EspP).
15 Trong đó, EspP là một protein ngoại bào có khối lượng phân tử 104 kDa, có khả năng tách các nhân tố làm đông máu và gây độc đối với các tế bào thận. Đây là một trong các tác nhân tác động bổ trợ gây nên hội chứng urê huyết (Brunder, 1996) [20]. 1.3 Nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7 * Ở bò: Vi khuẩn E.coli O157:H7 có mặt trong thịt, sữa tươi, sữa chua, phomat do sự tạp nhiễm của vi khuẩn này từ phân bò trong quá trình giết mổ, bảo quản, chế biến. Theo Zhao và cộng sự, (1995) [149], tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 ở bê nhiều hơn bò trưởng thành, tuy vậy vi khuẩn này lại không gây bệnh ở bò (Brown và cộng sự, 1997) [18]. Nhóm tác giả này đã tiến hành kiểm tra phân của 965 con bò sữa và 11.881 con bò thịt ở Mỹ, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong các mẫu phân của bò sữa là 3,2% và bò thịt là 1,6%, với cường độ nhiễm dao động từ 102-105 CFU/1g phân. Tại Việt Nam, theo số liệu của Noboru và cộng sự, (2005) [90], 2/100 mẫu phân bò nuôi tại khu vực Hà Nội có chứa vi khuẩn E.coli O157:H7. Theo báo cáo của Faith và cộng sự, (1996) [39], Meng và cộng sự, (1995) [79], có nhiều hơn 1 chủng E. coli O157:H7 trong phân của một cá thể hoặc các cá thể trong một đàn. * Ở hươu: Theo báo cáo của Keene và cộng sự, (1997) [62]; Rice và cộng sự, (1995) [118]; Doyle và cộng sự, (1987) [33] khi nghiên cứu về tính tương đồng giữa các chủng E.coli O157:H7 ở bệnh nhân nhiễm khuẩn do ăn thịt bò tái nuôi tại khu vực có hươu và đã xác định được hươu tham gia vào chuỗi truyền lây vi khuẩn với vai trò là nguồn tàng trữ. Trong báo cáo này, các tác giả còn cho biết, E.coli O157:H7 đã được phát hiện thấy trong phân và các mảnh cắt của sừng hươu. * Ở cừu: Theo nghiên cứu của Kudva và cộng sự, (1996) [67], cừu là nguồn mang vi khuẩn E.coli O157:H7 mặc dù chúng không bị bệnh do vi
16 khuẩn này. Khả năng bài thải E.coli O157:H7 qua phân cừu phụ thuộc theo mùa, trong đó mùa hè có 31% mẫu phân dương tính, mùa thu là 5,7%, còn mùa đông thì không phát hiện mẫu dương tính. * Ở nước sinh hoạt: Theo Doyle và cộng sự, (1987) [33], nước là nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7 và là nguyên nhân trực tiếp gây bệnh cho người. Theo báo cáo của Faith và cộng sự, (1996) [39] thì nước cũng chính là nguồn gây nhiễm vi khuẩn này cho trâu bò. 1.4 Các phương pháp chẩn đoán, xác định vi khuẩn E.coli O157:H7 là vi khuẩn gây bệnh cho con người nhưng có nguồn gốc từ gia súc và các sản phẩm thực phẩm, vì vậy, phải có các hệ thống chẩn đoán, xác định vi khuẩn riêng cho người và động vật (Banatvala và cộng sự, 1996) [10], (Baqui và cộng sự, 1992) [11]. Về nguyên tắc chung, việc chẩn đoán, xác định vi khuẩn thường dựa trên 3 yếu tố: i) vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm hoặc thực phẩm; ii) kháng thể kháng O157 hoặc H7; iii) độc tố hoặc các gen độc tố. 1.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn * Môi trường tăng sinh: thường sử dụng môi trường Peptone Water Buffer có bổ sung kháng sinh vancomycin 8 mg/lít, cefuroxim 10 mg/lít và cefixime 0.05 mg/lít để ức chế các vi khuẩn gram âm khác như: Aeromonas spp., Proteus spp.; hoặc môi trường Modified Trypticase Soy Broth (mTSB) bổ sung novobiocin 20 mg/lít và acriflavin 10 mg/lít; hoặc môi trường E.coli Broth bổ sung novobiocin 20 mg/lít. Điều kiện tăng sinh là khác nhau với các đối tượng mẫu khác nhau, cụ thể: mẫu phân bò tăng sinh ở 370C/6 giờ, mẫu thịt tăng sinh ở 41-420C trong 6 giờ, mẫu sữa tăng sinh ở 41-420C trong 24 giờ. Trong trường hợp mật độ vi khuẩn quá ít, người ta có thể sử dụng phương pháp miễn dịch từ tính đồng thời với quá trình tăng sinh. Về nguyên lý, phương pháp từ tính sử dụng các hạt nam châm được phủ kháng thể đặc
17 hiệu với kháng nguyên O157. Trong quá trình tăng sinh, nếu có mặt của vi khuẩn E.coli O157 thì dưới tác dụng của từ trường, chúng sẽ bị thu hút và gắn lên hạt nam châm. * Môi trường phân lập đặc hiệu: khác với các chủng vi khuẩn E.coli khác, E.coli O157:H7 không có khả năng lên men đường sorbitol và không có enzyme beta-glucuronidase. Dựa và hai đặc điểm này, người ta sử dụng các môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn, bao gồm: i) thạch SMAC có bổ sung D- sorbitol 1%, rhamnose 0.5% hoặc potassium tellurite 0,25% và cefixime 0.05 mg/lít. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nhạt do không lên men đường sorbitol; hoặc ii) môi trường thạch MUG có chứa 4- methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 không phát quang khi quan sát dưới tia tử ngoại. Phương pháp phân lập vi khuẩn trong mẫu phân phụ thuộc vào thời gian nhiễm khuẩn. Theo Tarr và cộng sự, (1990) [137], thời gian lấy mẫu phân bệnh nhân nghi nhiễm E.coli O157:H7 là 2 ngày sau khi bắt đầu có triệu chứng tiêu chảy, lúc này tỷ lệ phát hiện đạt 100%, còn nếu lấy mẫu sau 3-6 ngày hoặc sau 6 ngày thì tỷ lệ phát hiện chỉ còn 91.7 - 33.3%. 1.4.2 Phương pháp miễn dịch học Các phương pháp này chủ yếu sử dụng để phát hiện kháng nguyên O157 (kháng nguyên thân có bản chất lipopolysacharide) và H (kháng nguyên lông có bản chất protein). Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại KIT chẩn đoán hai loại kháng nguyên này. Tuy nhiên, CDC, (1999) [26] khuyến cáo nên sử dụng các loại kit latex phát hiện kháng nguyên O157 của các hãng Oxoid, Richmond Hill, Remel và kit latex phát hiện kháng nguyên H7 của Remel. Bên cạnh đó, phương pháp ELISA cũng cho hiệu quả chẩn đoán cao, theo Park và cộng sự, (1996) [101], phương pháp này cho độ nhạy lớn hơn phương pháp nuôi cấy, phân lập. Tuy vậy, tác giả này cũng cho rằng, kết quả
18 dương tính ELISA chỉ là cơ sở để tiếp tục thực hiện các phản ứng khác như: kiểm tra độc tố, PCR hoặc nuôi cấy để kết luận sự có mặt của vi khuẩn. Ngoài ra, FDA cũng khuyến cáo sử dụng kit sandwich ELISA của hãng Meridian Diagnostics, Inc. để phát hiện độc tố Stx1 và Stx2 của vi khuẩn E.coli O157:H7. Phản ứng này sử dụng kháng thể đa dòng kháng Stx và các kháng thể đơn dòng kháng Stx1, Stx2, vì vậy phản ứng cho phép phát hiện độc tố trong mẫu vi khuẩn nuôi cấy, mẫu thực phẩm, mẫu phân (trích theo Acheson và cộng sự, 1994) [7]. Theo Kehl và cộng sự, (1997) [63], kit ELISA trên có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 100% và 99,7%, trong khi đó, các giá trị này của phương pháp nuôi cấy trên thạch SMAC chỉ đạt 60% và 100%. 1.4.3 Phương pháp phát hiện độc tố Phản ứng này dùng để phát hiện độc tố Stx dựa trên khả năng gây bệnh tích trên tế bào Vero (Karmali, 1987) [56], (Karmali, 1989) [57]. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu được tăng sinh tiếp trên môi trường CAYE có thành phần: 2% casamino acid, 0.6% yeast extract, 0.25% NaCl, 0.87% K2HPO4, 0.0005% MgSO4, 0.0005% FeCl3 ở 370C trong 18 giờ để tách độc tố (Mundell, 1976) [85]. Canh khuẩn E.coli O157:H7 được ly tâm, thu dịch nổi rồi bổ sung vào các đĩa tế bào thận khỉ xanh châu Phi (VERO) và tiếp tục nuôi ở điều kiện 370C/ 3 ngày trong tủ ấm CO2. Kiểm tra bệnh tích tế bào sau mỗi 24 giờ và so sánh mẫu với đối chứng dương và âm. 1.4.4 Phương pháp PCR-Mutiplex Phương pháp này dùng để phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7. Theo Paton và cộng sự, (1997) [100] các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn này là Stx1, Stx2, eae, hly được phát hiện bằng các cặp mồi trong bảng 1.2.
19 Bảng 1.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR- Multiflex phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Paton và cộng sự, 1997) [100] Còn theo Blanco và cộng sự, (1997) [16], trật tự các cặp mồi để phát hiện các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 Stx2e, sta, stb, LT-I như trong bảng 1.3. Bảng 1.3 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR-Multiflex phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Blanco và cộng sự) [16] 1.5. Cấu trúc kháng nguyên của E.coli sp. và E.coli O157:H7 Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn có trong đường ruột của con người và động vật. Từ nhiều thập kỷ qua, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu về vi khuẩn này trên tất cả các góc độ: khả năng gây bệnh, đặc điểm hình thái,