Luận văn Thạc sĩ Vi sinh vật: Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:122

Thêm vào BST

Báo xấu

170
lượt xem 31
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Vi sinh vật: Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii, khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii, điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Vi sinh vật: Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH ------ Nguyễn Hoàng Minh Huy KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii. CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ THANH Tp. HCM, 2006
LỜI CÁM ƠN Trên hết, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ TRẦN THỊ THANH, người đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài; với tất cả tinh thần tình thương và trách nhiệm cô đã giúp tôi hoàn thành luận văn, bên cạnh đó tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức quí báu nơi cô cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học. Tôi chân thành cám ơn thầy cô ở khoa sinh, khoa hóa - trường đại học sư phạm tp HCM, thầy cô ở bộ môn sinh hóa - trường đại học khoa học tự nhiên, đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài luận văn cũng như thầy cô công tác tại phòng thí nghiệm vi sinh - sinh hóa, phòng thí nghiệm sinh lý thực - trường đại học sư phạm tp HCM đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp HCM, tháng 3 năm 2006 NGUYỄN HOÀNG MINH HUY
MỤC LỤC Trang Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn: 3 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái. 3 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn. 6 1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn: 10 1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh. 10 1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh. 11 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. 13 1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh. 15 1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh. 16 1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh. 19 1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối. 21 1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc. 21 1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh. 22 1.2. Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn: 22 1.2.1. Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn. 22 1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn. 30 1.3. Vai trò của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phòng chống nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: 31 1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng. 31 1.3.2. Vai trò của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phòng chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng. 40 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1. Vật liệu: 47 2.2. Phương pháp: 52 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật. 52 2.2.1.1. Phương pháp làm phòng ẩm quan sát hình thái vi thể của xạ khuẩn. 52 2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán trên thạch. 53 2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật. 53 2.2.2. Phương pháp hóa sinh. 54 2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử của xạ khuẩn. 54 2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích
thích sinh trưởng thực vật. 55 2.2.3. Phương pháp hóa lý. 57 2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh. 57 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh. 57 2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhóm chức trong cấu trúc hóa học của chất kháng sinh. 60 2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng hoà tan trong các dung môi của chất kháng sinh. 61 2.2.4. Phương pháp khác. 61 2.2.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị nhiễm bệnh. 61 2.2.4.2. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng ra khỏi đất. 62 2.2.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt. 62 2.2.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên sự phát triển của cây con. 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN. 3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn 63 Streptomyces dicklowii. 3.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn. 63 3.1.2. Đặc điểm sinh trưởng phát triển trên các môi trường nuôi cấy khác nhau. 64 3.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn. 66 3.2. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 72 3.2.1. Thử họat tính kháng sinh. 72 3.2.2. Lựa chọn môi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 73 3.3. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 76 3.3.1. Ảnh hưởng pH ban đầu: 76 3.3.2. Ảnh hưởng chế độ thông khí: 78 3.3.3. Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu: 80 3.3.4. Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon: 83 3.3.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ: 85 3.4. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn 89 Streptomyces dicklowii. 3.4.1. Lựa chọn dung môi thích hợp. 89 3.4.2. Tách chiết và tinh sạch kháng sinh: 92 3.4.3. Tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 95
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng. 98 3.5.1. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên nấm bệnh hại cây trồng: 98 3.5.2. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên tuyến trùng hại cây trồng. 101 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý của cây trồng. 107 3.6.1. Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên khả năng nảy mầm của hạt: 107 3.6.2. Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên sự phát triển của cây con: 108 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 111
Ở ĐẦU Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất rõ: làm giảm năng suất cây trồng, giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng. Từ thế kỷ 18 Anton De Bary đã đặt nền móng môn khoa học bệnh cây (1853). Để khắc phục những thiệt hại do bệnh cây gây ra, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học, … trong đó sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa và ngăn chặn bệnh hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử dụng, hiệu quả cao nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phòng bệnh cho cây đạt hiệu quả lớn. Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học cũng như phân hóa học người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống rất lớn. Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất, nước làm cho người và gia súc bị ngộ độc. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn lâu trong đất của các chất hoá học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo thời gian. Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa học đã tạo nên dư lượng lớn không cho phép trong rau màu và lương thực, gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết trong thời gian qua. Để khắc phục nhược điểm này của thuốc hóa học cũng như bảo vệ môi sinh, người ta đã tìm kiếm các biện pháp và phát hiện vai trò của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của hệ sinh thái. Bằng các biện pháp khống chế sinh học, người ta đã từng bước sản xuất ra nhiều chế phẩm vi sinh vật ở qui mô lớn và được sử dụng trong công tác phòng trừ sâu bệnh. Càng ngày người ta càng sử dụng rộng rãi những chế phẩm kháng sinh từ các chủng xạ khuẩn đối kháng, mà đặc tính của những chất kháng sinh 1
đó đã thoả mãn được những tính chất cần thiết để có thể sử dụng trong bảo vệ thực vật, như: - Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây. Ở một số nồng độ thích hợp chúng còn kích thích khả năng nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây. - Không gây hại cho người và gia súc. - Có hiệu lực trong một thời gian nhất định ở ngoài môi trường tự nhiên. - Có tác dụng tiêu diệt một cách có chọn lọc vi khuẩn gram dương, hoặc vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh. Dicklow.M.B cùng cộng sự vào năm 1996 đã công bố patent số 5549889 về loài Streptomyces dicklowii, loài có khả năng kháng nấm và tuyến trùng hại cây trồng, rất thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học trong nông nghiệp. Chúng tôi nhận được chủng Streptomyces dicklowii từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn này được nhập từ Mỹ. Để tiến tới sử dụng có hiệu quả chủng xạ khuẩn này trong điều kiện môi trường Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii” 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái: Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vô ti (Amytoz), không phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng có những đặc điểm giống nấm mốc hơn như có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn hệ sợi không có vách ngăn. Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc. Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan, 1998). Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi. Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn, và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có thể mang các màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím. 3
Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng. Đường kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngăn và không bị đứt đoạn. Tuỳ loại môi trường mà khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ. Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng loài mà cuống sinh bào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng có thể mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh 4
bào tử có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 – 7nm. (xem hình 1.2) Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường có hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử có các dạng như: dạng nhẵn (hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tóc. 5
Hình 1.3: Bào tử dạng gai ở Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo ijs.sgmjournals.org/.../ medium/frontcover.gif ) Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn ở Streptomyces violazeoruber (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg ) 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn: 1.1.1.2.1. Đặc điểm sinh lý nuôi cấy: Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạ khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất 6
trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm). Hầu như trong các loại đất đều có mặt của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa nhiệt. Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính. Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng sử dụng có thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụng bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vô cơ); protein, pepton, cao ngô, …(nguồn nitơ hữu cơ). 1.1.1.2.2. Khả năng sinh enzym của xạ khuẩn: Enzym là một chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào vi sinh vật, nó đóng một vai trò quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật. Enzym không những hoạt động xúc tác những phản ứng chuyển hóa trong cơ thể mà còn xúc tác những chuyển hóa bên ngoài môi trường – điều này có ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng enzym vi sinh vật vào công nghiệp, nông nghiệp,… Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận các loại enzym như: - Enzym amylaza: thu nhận từ các loài Streptomyces aureofaciens, Streptomyces diastochromogens, … - Enzym cenllulaza: thu nhận từ các loài Streptomyces antibioticus, Streptomyces sp. 0143, … - Enzym proteaza: thu nhận từ Streptomyces kinoluteus, Streptomyces verticillatus var. zynogenes, Actinomyces fradiae, … - Enzym kitinaza: thu nhận từ Streptomyces griseus, … Trong đó enzym proteaza của xạ khuẩn được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm – có tác dụng làm mềm thịt. Các chế phẩm được bán trên thị trường như: PRONAZA của Nhật (thu nhận từ Streptomyces griseus); M – zim của Mỹ (thu nhận từ Streptomyces fradiae) (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998). 7
Ngoài ra người ta còn chú ý một loại enzym quí ở xạ khuẩn là glucoza izomeraza, enzym này giúp biến đổi đường glucose thành đường fructose với độ ngọt cao hơn. (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998) CHO CH2OH GLUCOSE IZOMERAZA C=O (CHOH)4 (CHOH)3 CH2OH CH2OH Glucose Fructose Để thu enzym người ta thường thu canh trường nuôi cấy của chúng. Thành phần dinh dưỡng của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzym, nên để tăng sự tổng hợp enzym thì môi trường nuôi cấy phải có đầy đủ các thành phẩn dinh dưỡng đặc biệt cần bổ sung “chất cảm ứng” tổng hợp enzym, thường là cơ chất tương ứng của enzym cần tổng hợp. Thí dụ: trong tổng hợp proteaza của Actinomyces cần chất cảm ứng là protein đậu nành hay protein động vật. 1.1.1.2.3. Khả năng sinh vitamin của xạ khuẩn: - Vitamin B12: Cũng như vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng tổng hợp tốt vitamin B12, là loại vitamin mà ở động vật và thực vật không có khả năng tổng hợp. Nên trong công nghệ tổng hợp vitamin B12 thì con đường sản xuất chủ yếu là con đường sinh học mà xạ khuẩn và vi khuẩn là hai loài vi sinh vật người ta quan tâm nhất – các loài xạ khuẩn đó là: Actinomyces olivaceus, Actinomyces griseus, Actinomyces aureopacieus, Actinomyces pradiae, Actinomyces autibioticus, …Đáng kể nhất là xạ khuẩn Actinomyces olivaceus và loài vi khuẩn Propionibacterium shermanii là những chủng vi sinh vật được sử dụng trong công nghiệp sản xuất vitamin B12. - Caroten (tiền vitamin A): khi vào cơ thể người và động vật sẽ chuyển thành vitamin A. Các chủng xạ khuẩn được quan tâm là: Blakeslea trispora, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces chrestomyceticus … 8
1.1.1.2.4. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn: Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng của vi sinh vật được phát hiện từ rất sớm. Năm 1925, Saubert phát hiện auxin trong môi trường nuôi cấy nấm Rhizopus suinus, Kurosawa (1926) trích ly Gibberellin (GA) từ nấm Fusarium moniliforme. Năm 1926 E.Kurosawa (người Nhật) tìm thấy một loài nấm mốc tên Gibberella fugikuroi. Ông chứng minh rằng khi nấm nhiễm vào cây con, chúng làm cây con tăng trưởng với tốc độ cao. Năm 1930 người ta đã phân lập và kết tinh một chất từ Gibberella nay được gọi là gibberellin. Trong vòng 30 năm trở lại đây có hơn 70 chất khác nhau được phân lập từ nấm mốc và nhiều thực vật có hoa cũng được xếp vào nhóm gibberellin (GAs). Gibberellin thường được sử dụng trong các thí nghiệm là GA3 hay acid gibberellic. Có rất nhiều xạ khuẩn trong đất cũng có khả năng sinh tổng hợp Auxin - một dạng phytohoocmon rất có ý nghĩa đối với cây trồng. Auxin có vai trò quan trọng trong sự kiểm soát sự tăng dài của tế bào. Vì tế bào thực vật có vách bao bọc, nên tế bào chỉ có thể tăng trưởng được khi vách có thể được kéo dài ra. Vách được cấu tạo bởi phần lớn là đường đa mà thành phần chính là cellulose. Ở vách sơ cấp, cellulose hiện diện dưới dạng những sợi dài liên kết với các đường đa khác để tạo ra một mạng lưới. Khi tăng trưởng các liên kết có thể bị đứt tạm thời, do đó vách tế bào trở nên đàn hồi hơn và những vật liệu mới được chen vào. Auxin có vai trò chính trong cả hai quá trình trên. Trong các auxin, β – indole acetic acid (IAA) là một kích thích tố sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh IAA của xạ khuẩn: Các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA có thể kể như: Streptomyces olivochromoferus 1/247 9
có khả năng tạo thành 33 μgIAA/ ml canh trường, Streptomyces olivochromoferus 1/294 có khả năng tạo thành 9μgIAA/ ml canh trường, …( Lê Thị Hoa, 1998) Qúa trình sinh tổng hợp IAA ở vi sinh vật diễn ra khá phức tạp, bằng phương pháp đồng vị phóng xạ người ta xác định được IAA có nguồn gốc từ Triptophan (hình 1.5). Hình 1.5: Các con đường hình thành IAA ở vi sinh vật. (theo Lê Thị Hoa,1998) 1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn: 1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh: Có nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng điều trị bệnh nhưng nhìn chung có thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các chất có nguồn gốc vi sinh vật và thực vật có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp. Chất kháng sinh là một chất hóa học có hoạt tính kháng lại các vi sinh vật như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở động vật 10
và thực vật. Các vi sinh vật mẫn cảm với chất kháng sinh ở những mức độ khác nhau, đa số các vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm. 1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh: - Trên thế giới: Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện vào 1928, và được Abraham, Chain và Florey tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào 1941 (www.vinachem.com.vn), trong hơn nữa thế kỷ qua, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và với lượng sản xuất ngày càng lớn. Hơn thế nữa, cạnh bên chất Penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, từ vi khuẩn, từ xạ khuẩn. Những thành tựu tách chiết kháng sinh từ xạ khuẩn có minh chứng qua một số patent: patent số 3968204 Hamill, 1976 tách chiết kháng sinh A-2315 từ Actinoplanes philippinensis NRRL 5462; patent số 4331658 Hamill, 1982 tách chiết kháng sinh A-32887 từ Streptomyces albus NRRL 11109; patent số 4537770 Michel, 1985 tách chiết kháng sinh A41030 từ Streptomyces virginiae NRRL 12525; patent số 4637981 Hershberger, 1987 tách chiết kháng sinh A-4696G từ Actinoplanes missouriensis; patent số 4659660 Hamill, 1987 tách chiết kháng sinh A47934 từ Streptomyces toyocaensis NRRL 15009; patent số 5229362 Kirst, 1993 tách chiết kháng sinh A10255 từ Streptomyces gardneri. Đó là những patent của Mỹ, Mỹ cũng là một trong những nước sản xuất kháng sinh hàng đầu trên thế giới, bên cạnh các nước phát triển công nghiệp kháng sinh thì Hàn Quốc cũng đã có nền công nghiệp sản xuất kháng sinh, ngoài những kháng sinh tinh khiết dùng điều trị bệnh còn có kháng sinh dưới dạng chế phẩm sinh học như Biocontrol dưới dạng lỏng có thành phần bao gồm một số chủng Streptomyces sp.; Trung Quốc cũng là nước hết sức chú trọng phát triển công nghiệp kháng sinh, các nhà máy kháng sinh được xây dựng ở Tứ Xuyên, Thượng Hải, 11
Trường Sa, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất các nguyên liệu và các thành phẩm kháng sinh từ vi sinh vật. - Ở Việt Nam: chúng ta cũng đã có nhiều cố gắng trong việc tìm kiếm và sản xuất chất kháng sinh phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh, tách chiết cũng như nổ lực hợp tác với nước ngoài để sản xuất kháng sinh mặc dù kết quả chưa đáp ứng được so với nhu cầu thực tế. Những cố gắng ấy có thể tổng kết qua các mốc thời gian sau: Năm 1950, trong kháng chiến chống Pháp, GS Ðặng Văn Ngữ đã nuôi cấy Pénicillum và dùng dịch nuôi cấy để chữa vết thương cho thương binh; Năm 1962 - 1965, Liên Xô (cũ), theo yêu cầu của ta, đã khảo sát và thiết kế cho Việt Nam một nhà máy sản xuất thuốc kháng sinh, dự định đặt ở Phú Thọ (Bắc bộ), nhưng sau đó phải ngưng lại vì chiến tranh mở rộng ra miền Bắc; Năm 1968, Trung Quốc giúp ta thiết kế xưởng Tetracyclin 5 tấn/năm, trước dự định xây dựng ở Cao Bằng, sau chuyển về Sơn Tây rồi Việt Trì, nhưng do quan hệ giữa hai nước lúc đó có trục trặc nên công trình bỏ dở; Năm 1970, Ðơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Công Quyền làm chủ nhiệm ra đời, giáo sư và cộng sự đã có nhiều công trình nghiên cứu về kháng sinh: phân lập được một tập hợp khá lớn các chủng vi sinh vật trong đó đặc biệt có xạ khuẩn sinh kháng sinh có nguồn gốc từ đất Việt Nam. Đã tiến hành nghiên cứu sinh lý sinh hoá các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh và tách chiết, định loại được một số kháng sinh. Từ 1985 đến 1990, trong chương trình nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số 64C, Bộ Y tế đã cho nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin. Cũng trong thời gian này (từ 1985 – 1990), Liên Xô (cũ) thỏa thuận giúp ta xây dựng nhà máy kháng sinh 5 tấn/năm tại Xí nghiệp Dược phẩm TW 24, TPHCM. Công việc đang triển khai thì tình hình chính trị ở Liên Xô cũ chuyển biến không thuận lợi, nên công trình đình lại vào năm 1992. (theo Nguyễn Duy Cương, 2005). Đến nay, chúng ta cũng đã có một số dây chuyền bào chế kháng sinh đạt tiêu chuẩn GMC Aseane nhưng nguyên liệu phải nhập từ nước ngoài như: 12
tại xí nghiệp dược 24 tại thành phố Hồ Chí Minh nguyên liệu Ampicinlin và Amocillin từ nguyên liệu trung gian 6-APA nhập từ Belarut; bên cạnh đó vào 1999- 2000 tổng công ty dược Việt Nam đã chủ trì đề tài “Nghiên cứu công nghệ điều chế 6-APA, 7-ADCH và cephalexin từ penicillin G” và đề tài “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất các kháng sinh mới, hiệu quả bằng nguyên liệu trong nước”. Gần đây lãnh đạo Tổng công ty Hóa chất và tổng công ty Dược đã có văn bản trình chính phủ về hợp tác xây dựng nhà máy sản xuất 300 tấn/ năm các cephalexin bán tổng hợp thế hệ 1 và thế hệ 3 từ nguyên liệu trung gian 7-ADCA và 7-ACA nhập khẩu. Từ tình hình trên cho thấy sản xuất nguyên liệu kháng sinh trong nước là một nhu cầu hết sức cấp bách đối với chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam. Trong chiến lược phát triển khoa học công nghệ Việt Nam từ nay đến 2010 (do thủ tướng Phan Văn Khải ký) đã xác định Việt Nam phải sản xuất kháng sinh và phải sản xuất tự túc 60% thuốc dùng trong nước.(theo www.vinachem.com.vn ). Với tiêu chí trên cho thấy rất cần những công trình nghiên cứu và tiến tới sử dụng các chủng vi sinh vật trong đó đặc biệt là xạ khuẩn để sản xuất các kháng sinh dùng cho nhu cầu rất lớn được đặt ra hiện nay. 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh: 1.1.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy: - Độ thông khí: yếu tố thông khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên độ thông khí để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh kháng sinh; lượng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là lưu lượng thổi khí 1 thể tích môi trường /1 phút. - Nhiệt độ: có những loài xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt độ của môi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta khảo sát thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28OC – 30OC (nhiệt độ phòng thí nghiệm). Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm trong khoảng 18OC – 28OC. 13
- pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của môi trường. Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính, ở pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh. - Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là tuổi và khả năng đồng đều về mặt di truyền và hoạt tính trao đổi chất của giống phản ánh điều kiện nuôi cấy. Điều kiện của môi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhau tùy vào từng chủng và tuổi của bào tử giống. - Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định; Qui trình sản xuất chất kháng sinh thường được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có khuấy đảo và sục khí. 1.1.2.3.2. Thành phần môi trường nuôi cấy: Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào môi trường lên men. Trước hết là nguồn C, N và phosphat vô cơ. Các vi sinh vật khi đã phát triển trên môi trường nhân giống và cấy truyền lên môi trường lên men có nguồn gốc C, N và các thành phần môi trường khác nhau sẽ dẫn đến khả năng sinh các chất khác nhau. - Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc thông qua các nguồn cacbon khác nhau. Tuỳ thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; các loại đường đơn: Glucose, Manitole, … hay các loại đường kép: Saccarose, Lactose, … cũng có thể là các loại tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng có hoạt tính amylaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là tinh bột. - Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh 14
như Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi trường. nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngô, … nguồn nitơ vô cơ là: muối amon hoặc nitrat. 1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: Có nhiều quan điểm về chất kháng sinh, có quan điểm cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm thải của quá trình trao đổi chất của xạ khuẩn, cũng có quan điểm cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường sống tự nhiên. Dù theo quan điểm nào đi nữa thì các con đường sinh ra chất kháng sinh từ xạ khuẩn được tóm tắt như sau: - Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozit). - Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin). - Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác. Có thể phân biệt thành 4 dạng: + Chất kháng sinh nhóm polypeptit theo con đường trùng hợp các acid amin: bacitracin, polymycin. + Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polyme hóa các đơn vị acetat, propionat: chất kháng sinh nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin. + Chất kháng sinh aminoglycozit được tạo thành nhờ các phản ứng trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin. + Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonit từ các đơn vị acetat… 1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh: 1.1.2.5.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: 15