LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:53

Thêm vào BST

Báo xấu

139
lượt xem 26
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô thận của cá tra theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri. Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5µl (40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5µl (2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút. Qua thí nghiệm xác định được độ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN MAI THỊ LOAN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN MAI THỊ LOAN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH KS. NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân có phần đóng góp rất lớn của Cha Mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng; Thầy Cô đã có công dạy bảo và tất cả bạn bè luôn bên cạnh tôi giúp đỡ và động viên tôi. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Trúc Phương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi về mọi mặt trong quá trình tôi thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Trần Thị Tuyết Hoa cũng như toàn thể quý thầy cô Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm ơn chị Trần Việt Tiên, anh Lê Hữu Thôi và các anh chị Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Cảm ơn những người bạn thân của tôi cũng như tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản 31 đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại Giảng đường Đại học cũng như trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và Em trai tôi đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Mai Thị Loan -i- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TÓM TẮT Đề tài thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô thận của cá tra theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri. Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5µl (40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5µl (2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút. Qua thí nghiệm xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2 ng. Hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E. ictaluri. Ngoài ra trong quá trình chuẩn hóa thay đổi hàm lượng Tag DNA polymerase từ 5U/µl xuống còn 3U/µl. Thực hiện phản ứng PCR với ADN được chiết tách trực tiếp từ thận với qui trình đã được tối ưu, phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E. ictaluri ở vị trí 407bp. - ii - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ........................................................................................ i TÓM TẮT ............................................................................................. ii MỤC LỤC............................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................ vi DANH SÁCH HÌNH ............................................................................. vii PHẦN I: GIỚI THIỆU ........................................................................... 1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................... 3 2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL........................ 3 2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri........................................................ 4 2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam .. 4 2.2.1.1 Trên thế giới............................................................................... 4 2.2.1.2 Ở Việt Nam ................................................................................ 4 2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri ............................ 5 2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm ............................... 6 2.3 Chiết tách acid nucleic ..................................................................... 6 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) ....................................... 7 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 13 3.1 Thời gian và địa điểm ...................................................................... 13 3.2 Dụng cụ và hoa chất......................................................................... 13 3.2.1 Dụng cụ ........................................................................................ 13 3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn ................................................ 13 3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR ............................................ 13 3.2.2 Hóa chất........................................................................................ 14 3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn ....................................... 14 3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR ........................................... 14 3.3 Phương pháp nghiên cứu.................................................................. 15 - iii - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm ........................................................... 15 3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể ................................................................. 15 3.3.1.2 Cá thí nghiệm............................................................................. 15 3.3.1.3 Vi khuẩn gây cảm nhiễm ............................................................ 15 3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................ 16 3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn............................................ 17 3.3.3 Phương pháp PCR......................................................................... 19 3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR ........................................................ 19 3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) ..................................................................................................... 19 3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy ..................................................... 20 3.3.3.2.1 Chiết tách acid nuleic (Bartie và ctv, 2006) ............................. 20 3.3.3.2.2 Khuếch đại ADN: (Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) ...... 21 3.3.3.2.3 Điện di .................................................................................... 22 3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu.............................................. 22 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................... 24 4.1 Kết quả phân tích vi sinh.................................................................. 24 4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................... 24 4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa.............. 24 4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh)25 4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) ............................................................ 25 4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 ................ 26 4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase .............................................................................................................. 27 4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút. .............................................................................................................. 27 4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR .............................................. 28 - iv - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
4.3.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy ............................................ 28 4.3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu ...................................................... 30 4.3.3 Kết quả chuẩn hóa qui trình khuếch đại phát hiện E. ictaluri (Panangala và ctv, 2007) .......................................................................................... 31 4.4 Kết quả phản ứng PCR .................................................................... 33 4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) ...... 33 4.4.2 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách được tối ưu ............................................................................................ 35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................... 36 5.1 Kết luận ........................................................................................... 36 5.2 Đề xuất ............................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................... 37 -v- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR ........................................ 20 Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa ........ 25 Bảng 4.2 Hàm lượng DNA chiết tách (theo Taggart et al., 1992) ............ 25 Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 ............................................................................................................... 26 Bảng 4.4 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase ..................................................................................................... 27 Bảng 4.5 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút .................. 28 Bảng 4.6 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 5U/µl) .................................................................................. 31 Bảng 4.7 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 4U/µl) .................................................................................. 31 Bảng 4.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 3U/µl) .................................................................................. 32 - vi - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan ....................................................................... 24 Hình 4.2 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ thận ........................................................................................................ 29 Hình 4.3 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ vi khuẩn .................................................................................................. 29 Hình 4.4 Kết quả điện di thí nghiệm xác định tính đặc hiệu. ................... 30 Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Tag DNA polymerase khác nhau............................................................................. 32 Hình 4.6 Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri, qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol-chloroform (Taggart et al, 1992) ........ 33 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR, chuẩn hóa qui trình chiết tách lần 1............ 34 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với qui trình tối ưu ................... 35 - vii - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
PHẦN I GIỚI THIỆU Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đang phát triển không ngừng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nước nhà đặc biệt là cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon. Cá tra được nuôi nhiều ở An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ với nhiều mô hình khác nhau cả trong lồng bè, ao đất. Mặc dù năm 2008 ngành thủy sản nước ta gặp nhiều khó khăn nhưng giá trị xuất khẩu vẫn không ngừng gia tăng. Theo số liệu của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đã đạt 4 tỷ USD. 10 tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Xuất khẩu trong tháng 10 đạt 124.328 tấn, trị giá 478,23 triệu USD, tăng 30% về khối lượng và giá trị so với tháng 10/2007. Trong đó, cá tra, basa chiếm 32,4%, với 550.070 tấn, đạt mức tăng trưởng cao nhất, tăng 74,5% về lượng và 53,3% về giá trị so với cùng kỳ (http://www.fistenet.gov.vn/). Để có sản lượng cao như thế, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi trồng người nuôi còn tăng cả mật độ làm xuất hiện nhiều loại bệnh như mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết và một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra.v.v. Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì tần suất xuất hiện bệnh năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL gồm đốm trắng trên gan, thận (52,80%), xuất huyết (42,50%), phù mắt (20,70%) và vàng da (21,60%). Như vậy tần số xuất hiện của bệnh đốm trắng nội tạng là cao nhất (Nguyễn Trọng Bình, 2008). Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 (Ferguson và ctv, 2001) và trở nên trầm trọng vào 1999. Bệnh xuất hiện suốt chu kỳ nuôi, thường vào mùa lũ và cao điểm là vào tháng 7 và 8. Cá bị bệnh có biểu hiện bơi lờ đờ, tuy nhiên đa số cá bệnh không có những biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi, trong giai đoạn này nếu không áp dụng các phương pháp điều trị và môi trường nuôi quá bẩn bệnh sẽ trở nên trầm trọng và rất khó khăn trong việc điều trị. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung, 2004). Từ thực tế tình hình dịch bệnh đòi hỏi phải có một phương pháp giúp sớm tìm ra tác nhân gây bệnh từ đó có hướng xử lý và điều trị kịp thời. Hiện nay -1- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API20E. Tuy nhiên cả 2 phương pháp này cho kết quả chậm, mất nhiều thời gian nên chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán bệnh trong tình hình hiện nay. Gần đây Nguyễn Trúc Phương (2009) đã ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán nhanh vi khuẩn E.ictaluri, thời gian được rút ngắn ¼ lần so với phương pháp định danh truyền thống. Tuy nhiên phương pháp này vẫn phải trải qua một bước nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tổng hợp để được chủng vi khuẩn thuần. Nếu phương pháp này được thực hiện trực tiếp từ mô cá bệnh thì thời gian chẩn đoán sẽ được rút ngắn hơn nữa (chỉ mất khoảng 1 ngày). Do đó đề tài “Phát triển phương pháp PCR phát hiện Edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri nhanh, nhạy làm cơ sở cho việc điều trị có hiệu quả sau này. Mục tiêu Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri từ mô cá bệnh Nội dung 1. Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô cá bệnh 2. Tối ưu phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri 3. Xác định độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri -2- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long gồm 12 tỉnh và 1 thành phố trực thuộc Trung ương với tổng diện tích chiếm 3.960.000 ha chiếm 12% tổng diện tích tự nhiên của cả nước. Tiềm năng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản của vùng được xác định là khoảng 963.700 ha chiếm 57,61% tổng diện tích tiềm năng của cả nước. Năm 2002, đã có khoảng 73,9% diện tích tiềm năng này được sử dụng cho nuôi trồng thủy sản (Lê Xuân Sinh, 2005). Theo báo cáo của ngành Thủy sản năm 2006, cá tra basa đạt sản lượng 800.000 tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 773 triệu USD (tăng 50% so với năm 2005), và đến năm 2007 với sản lượng hơn 1,5 triệu tấn kim ngạch xuất khẩu cá tra đạt 974 triệu USD, chiếm 26% kim ngạch xuất khẩu toàn ngành thủy sản (kim ngạch xuất khẩu toàn ngành ước đạt 3,75 tỷ USD) (Trần Thanh Hoan 2008, trích dẫn bởi Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008). Theo Nguyễn Phú Son (2007), năm 2002 diện tích nuôi cá tra ao là 2.720 ha, đến năm 2005 tăng lên 3.548 ha, tăng bình quân hằng năm 18,6% trong 3 năm 2003 – 2005. Khi ngành nuôi trồng đã phát triển, nhiều đối tượng có giá trị kinh tế được đưa vào nuôi, các hình thức nuôi công nghiệp như thâm canh, siêu thâm canh được áp dụng phổ biến, sự đầu tư lớn về giống, thức ăn và năng suất cao luôn là điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh. Do vậy, khi nuôi trồng thủy sản càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn và đôi khi bệnh đã trở thành nhân tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (Bùi Quang Tề, 2004). Ngoài ra, theo Lê Xuân Sinh và Lê Lệ Hiền (2008), trong tổng chi phí nuôi cá tra, thức ăn chiếm khoảng ¾, điều này có tác động lớn tới môi trường nước - một trong những nguyên nhân quan trọng nhất đối với việc bệnh xuất hiện ngày càng nhiều trên cá tra nuôi. Có nhiều loại tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi, tuy nhiên vi khuẩn là một tác nhân gây bệnh quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm phát triển và gây hạn chế mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản (Từ Thanh Dung, 2008) -3- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Theo Trần Anh Dũng (2005), khi nghiên cứu khảo sát tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở An Giang cho thấy, bệnh trên cá tra nuôi sự xuất hiện có tính mùa vụ rõ rệt, bệnh do ký sinh trùng hầu như xuất hiện quanh năm nhưng nhiều nhất là vào mùa mưa và mùa lũ rút, mùa khô thường ít hơn mùa lũ. Bệnh do vi khuẩn xuất hiện quanh năm, bệnh mủ gan xuất hiện nhiều vào mùa lũ, bệnh xuất huyết xuất hiện nhiều vào mùa lũ rút. Theo đó, tỉ lệ nhiễm các bệnh do vi khuẩn như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ chiếm 68,3%, mủ gan chiếm 61,0%, phù đầu 51,2% và bệnh vàng da chiếm 24,4%. Kết quả điều tra tại An Giang và Cần Thơ cho thấy các loại bệnh phổ biến trong nuôi cá tra thâm canh ở hai địa phương này là bệnh gan thận mủ, bệnh đốm đỏ, bệnh phù đầu, bệnh lở loét, trắng mang – trắng đuôi, lồi mắt-nổ mắt, nấm thủy mi, xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng. Trong đó bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận mủ với tỷ lệ chết là 80 – 90% nếu không có biện pháp điều trị kịp thời (Nguyễn Chính, 2005; Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008). 2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam 2.2.1.1 Trên thế giới Hawke (1979) lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng máu trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), với tên gọi là ESC (Enteric septicaemia of catfish). Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo (Hawke và ctv,1998). Bên cạnh xuất hiện ở miền Nam nước Mỹ bệnh còn được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona, và New Mexico. Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E. ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan. Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E. ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa có nhiệt độ thấp. Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28°C. 2.2.1.2 Ở Việt Nam Bệnh mủ gan được ghi nhận xuất hiện đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 với tên gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pangasius) (Ferguson và ctv 2001). Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10 – 90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi. Cá bị bệnh trên gan, thận và tỳ tạng -4- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1 – 3mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục nên thường gọi là bệnh mủ gan. Qua nghiên cứu E. ictaluri chính là tác nhân gây ra bệnh này (Từ Thanh Dung, 2004). Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì trong hai năm 2005 và 2006, tại các khu vực nuôi cá tra tập trung như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Vĩnh Long, cá tra thường nhiễm bệnh vào tháng 5 và 7. Thời điểm này, môi trường nước trong ao nuôi rất xấu do ảnh hưởng của lũ đổ về mang nhiều chất thải lẫn mầm bệnh. Cá thường bị nhiễm các bệnh vàng da, mủ gan, bệnh xuất huyết, và đốm đỏ. Kết quả điều tra 65 hộ nuôi cá tra thì có 100% số hộ ở Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ và 80% số hộ ở An Giang bị nhiễm bệnh (Thạch Thảo, 2008). Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh xuất hiện từ cuối 1998 và trở nên trầm trọng vào 1999. Ở ĐBSCL, bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ. Tuy nhiên bệnh bộc phát cao điểm vào tháng 7 và 8. Bệnh đốm trắng trên gan xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá giống và cá thịt, ở cả cá nuôi ao và nuôi bè. 2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri Vi khuẩn E. ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước thay đổi, di động yếu ở 25-30°C, ở nhiệt độ cao hơn không di động, H2S và indole âm tính, có khả năng lên men O/F. Cho phản ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxydase. E. ictaluri phát triển tốt ở 28oC trên môi trường TSA trong 48h tạo thành những khuẩn lạc màu trắng đục kích thước rất nhỏ, không có nhân, rìa có dạng không đồng nhất (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Tuy nhiên Plumb (1993) cũng có một số mô tả khác như có dạng hình que và kích thước biến đổi. So với E. tarda phát triển tốt ở 37oC trong khi E. ictaluri phát triển tốt ở 28oC, điều này lý giải vì sao vi khuẩn E. tarda ngoài gây bệnh trên cá còn gây bệnh trên nhiều loài động vật máu nóng khác như chim, gia súc, heo, động vật có vú ở biển. E. ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá. Dấu hiệu bệnh lý Theo Lê Thị Bé Năm (2002), cá bị bệnh thường giảm hoặc bỏ ăn, cá nổi trên mặt nước, bơi lội chậm chạp, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động, màu sắc nhợt nhạt. Một số cá bụng sưng và có những điểm xuất huyết trên đuôi, hậu môn, các tia vi. Bên trong cá bụng trương to, có những đốm trắng đường kính 1-3mm dưới bề mặt lớp biểu bì và khắp vùng gan, thận và tỳ tạng. Ngô Minh Dung (2007) cũng có những mô tả tương tự khi thí -5- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá tra. Tuy nhiên đa số cá không có biểu hiện bất thường bên ngoài (Từ Thanh Dung, 2004). 2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm trên cá nheo Mỹ (từ 15- 20cm) với mật độ vi khuẩn E. ictaluri 1,2 x 10 6tb/0,1ml ở 250C, tốc độ nước chảy 1lít/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ ngày. Tỉ lệ cá chết dao động từ 38 – 95.3%. Trong thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri của Phan Thị Mỹ Hạnh (2004), với mật độ vi khuẩn tương đương 1,5x10 6 tb/ml nhưng tỉ lệ chết trên cá tra cao hơn so với cá nheo Mỹ ở cùng thời gian thí nghiệm 7 ngày. Lương Trần Thục Đoan (2006) tiến hành gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá tra bằng hai phương pháp ngâm và tiêm với các mật độ vi khuẩn khác nhau, thời gian theo dõi trong 10 ngày. Kết quả cho thấy ở phương pháp ngâm cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3, tỷ lệ chết 75% với mật độ vi khuẩn là 1x 107 CFU/ml. Với phương pháp tiêm, thời gian xuất hiện cá chết là ngày thứ 2, tỷ lệ chết 100% trong 6 ngày với mật độ vi khuẩn 1x106 CFU/ml. Với thí nghiệm gây cảm nhiễm của Huỳnh Chí Thanh (2007), kết quả cho thấy cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở mật độ vi khuẩn 1,02x108 CFU/ml với tỷ lệ 91,66%. Với các mật độ 1,02x107 CFU/ml, 1,02x106 CFU/ml, 1,02x105 CFU/ml có tỷ lệ chết tương ứng là 66,66%, 33,33 % và 25%. Qua đó xác định được LD50 là 3,16x106 CFU/ml. Theo nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II kết hợp với công ty thuốc Thú Y TW (Navetco) (2008) sau khi phân lập và định danh vi khuẩn cho thấy 97% mẫu cá bệnh đều có dấu hiệu điển hình của bệnh đốm trắng với sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri. Tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm ngược, vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là vi khuẩn E. ictaluri được phân lập từ các mẫu cá bệnh. Kết quả nghiên cứu đã xác định, vi khuẩn E. ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận và lách cá tra. Kết quả thí nghiệm cũng xác định được liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 2,5 x 104 tế bào/0,2 ml/ cá có trọng lượng trung bình khoảng 30 gram (Nguyễn Thị Hiền, 2008). 2.3 Chiết tách acid nucleic Mỗi thí nghiệm thao tác gen đều đòi hỏi phải có nguồn acid nucleic đủ lớn và đủ tinh sạch. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzym nội bào giải phóng ra môi trường khi tế -6- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
bào bị phá vỡ). Các acid nucleic cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzym nội bào. (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), phương pháp tách chiết cơ bản gồm có ba bước: Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Thông thường nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong dung dịch phenol và chloroform, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa acid nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại. Bước 3: Tủa acid nucleic. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic ở dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzym, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có hai cách tủa thông dụng: - Tủa trong ethanol (ethylic alcohol), việc tủa này được thực hiện trong môi trường có nồng độ muối cao và nồng độ ethanol cao (2,5 dung tích ethanol/1 dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu như toàn bộ acid nucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên. - Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện diện của muối , thể tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa trong isopropanol. Trong cả hai phương pháp, acid nucleic sẽ được thu nhận lại bằng cách ly tâm. Sau đó cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được phát minh từ năm 1985 và được thừa nhận chính thức từ năm 1993 qua giải thưởng Nobel cho Kary Mullis - người phát minh ra nó, PCR hiện đang được ứng dụng rộng khắp tại Việt Nam. Nguyên tắc (Đặng Thị Hoàng Oanh 2007) -7- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn sau: Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40- 70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72oC, đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu. Đối chứng Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau: - Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để kiểm soát trường hợp trường hợp bị tạp nhiễm. - DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ. Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR -8- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005), phản ứng PCR có các nhân tố ảnh hưởng sau: - ADN mẫu: Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu ADN không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn ADN dài khoảng 1 – 1.5kb. Mẫu ADN tinh sạch sẽ cho kết quả tốt , tuy nhiên kỹ thuật chẩn đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu ADN không cần có độ tinh sạch cao. - Enzyme ADN-polymerase: Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerase do phản ứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ khác nhau. Enzyme thường được dùng là Taq- polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus) tách từ suối nước nóng nên chịu được nhiệt độ cao. Nhược điểm của enzyme này là không tổng hợp được trình tự ADN dài quá 3kb, hơn nữa enzyme này không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép. - Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi: Mồi là một chỉ tiêu quan trọng để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây: • Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc. • Mồi phải chọn đặc trưng cho ADN cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại trên gen • Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb) • Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp. • Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thường trong khoảng từ 4-50C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 720C. - Ảnh hưởng của các nucleotide: Cần phải có bốn loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20 - 200µM cho mỗi loại nucleotide. Nếu mất trạng thái cân bằng sẽ gây ra lỗi khi sao chép, nếu nồng độ các nucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả. - Môi trường phản ứng -9- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
• Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ tối ưu để thực hiện PCR từ 150-200µM. Nồng độ chuẩn cho từng khoản tương ứng, phải được xác định trong điều kiện thí nghiệm nhất định. • Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào. Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy acid nucleic. • Môi trường dung dịch đệm phải ổn định. - Thời gian và số lượng chu kỳ: Tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau. Ngoài ra thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc vào độ dài đoạn ADN cần nhân dòng. Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ. - Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác. Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng. Tuy nhiên, với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng cụ khuếch đại riêng. Ứng dụng của phương pháp PCR Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm: virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV) (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Theo Lê Đình Lương (2004) kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội. - Trong nghiên cứu khoa học kỹ thuật PCR giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm. - Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng, kỹ thuật PCR cho phép lựa chọn cặp cha mẹ làm giống chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ. - Trong y học PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh truyền nhiễm do virus, vi khuẩn, HIV-AIDS… Các hạn chế của phương pháp PCR - 10 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007), phương pháp PCR có các hạn chế sau: - Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb - Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. - Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic) Một số nghiên cứu về PCR Yang và ctv (2006) đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai loại virus IHHNV và WSSV trên tôm he. Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1, W2 lần lượt cho hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR lần lượt là 703 và 824bp (trích dẫn bởi Nguyễn Trúc Phương, 2008). Trần Thị Mỹ Duyên (2006) đã ứng dụng và tối ưu hóa qui trình PCR- genotyping với các thay đổi về thành phần hóa chất tham gia phản ứng, chu kỳ nhiệt của phản ứng thu được qui trình tối ưu phát hiện tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. Lê Hữu Thôi (2008) thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời YHV, GAV và β-actin. YHV và GAV là hai bệnh do virus trên tôm sú gây thiệt hại nặng đến nghề nuôi tôm của nước ta. Phương pháp giúp phát hiện đồng thời hai loại bệnh này trên tôm đồng thời kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong qui trình thông qua gen nội sinh β-actin. Kết quả sản phẩm PCR cho hai vạch 750 bp (YHV) và 216 bp (β-actin) ở bước 1 và 317 bp (GAV) ở bước 2. Trần Nguyễn Diễm Tú (2008) thực hiện qui trình phát hiện WSSV, HPV và β- actin trên tôm sú. Cũng như YHV và GAV, WSSV và HPV là hai bệnh gây thiệt hại nặng nề đến nghề nuôi tôm sú của nước ta. Kết quả sản phẩm PCR cho hiện vạch ở vị trí 1441 bp (WSSV) và 216 bp (β-actin) ở bước 1 và 941 bp (WSSV), 441 bp (HPV), 216 bp (β-actin) ở bước 2. Victor và ctv (2007) phát triển phương pháp m-PCR phát hiện cùng lúc ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá : Flavobacterium Columnare (504bp), E. Ictaluri (407bp), Aeromonas Hydrophyla (209bp). Gần đây nhất, Nguyễn Trúc Phương (2008) đã định danh E. ictaluri bằng phương pháp truyền thống và bằng bộ kit API20E, sau đó tiến hành kiểm tra lại bằng phương pháp PCR. Kết quả cho thấy 5 trong 7 chủng đã được định danh là E. ictaluri với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR là 407bp. Nguyễn Văn Hòa (2008), dùng qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol-Chloroform (Taggart et al, 1992) ly trích ADN từ cơ thịt cá lóc, - 11 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com