Một số tính chất của dịch bacteriocin từ hai chủng vi khuẩn lactic chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của chúng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam

Chia sẻ: Danh Tuong Vi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

72
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát hiệu suất tách chiết bacteriocin thô từ dịch canh trường của hai chủng vi khuẩn lactic T8 và T13, đồng thời xác định độ bền của dịch bacteriocin với nhiệt độ, pH và enzyme.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Một số tính chất của dịch bacteriocin từ hai chủng vi khuẩn lactic chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của chúng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA DỊCH BACTERIOCIN TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CHỨNG TỎ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG BẢO QUẢN NGUYÊN LIỆU THỦY SẢN Ở VIỆT NAM SOME CHARACTERISTICS OF BACTERIOCIN EXTRACTS FROM TWO STRAINS OF LACTIC ACID BACTERIA REVEAL THEIR POTENTIAL APPLICATION FOR SEAFOOD PRESERVATION IN VIETNAM TS. Nguyễn Văn Duy1, ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh2 TÓM TẮT Việc sử dụng bacteriocin - peptide kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật nhằm kéo dài thời gian bảo quản và nâng cao mức độ an toàn thực phẩm là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng. Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát hiệu suất tách chiết bacteriocin thô từ dịch canh trường của hai chủng vi khuẩn lactic T8 và T13, đồng thời xác định độ bền của dịch bacteriocin với nhiệt độ, pH và enzyme. Kết quả chỉ ra rằng qui trình tách bacteriocin thô từ canh trường vi khuẩn lactic đạt hiệu suất 92,1% đối với chủng T8 và 77,2% với T13. Hoạt độ bacteriocin thô từ chủng T8 là 6000 AU/ml và từ chủng T13 là 8000 AU/ml khi sử dụng chủng chỉ thị là Bacillus 1.1. Bacteriocin từ 2 chủng này đều bền với điều kiện nhiệt độ khử trùng, với khoảng pH rộng từ 4-10 và với enzym proteinase K nhưng bị bất hoạt hoàn toàn bởi enzym α-chymotrypsin. Những tính chất này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm nói chung và nguyên liệu thủy sản nói riêng ở Việt Nam. Từ khóa: bacteriocin, bảo quản thực phẩm, nguyên liệu thủy sản, vi khuẩn lactic ABSTRACT Bacteriocins - antimicrobial peptides from lactic acid bacteria are expected to be popularly used for expanding the preservation time and enhancing the safety of foods. The present study aims to investigate the efﬁciency of bacteriocin extraction from cell cutlture of two lactic acid bacteria strains T8 and T13, and to deﬁne the stability of bacteriocins to heat, pH and enzyme. Results have shown that the efﬁciency of bacteriocin extraction from the strains T13 and T8 approaches 92.1% and 77.2%, respectively. The activity of bacteriocin from the strain T8 is determined as 6000 AU/ml and from the strain T13 as 8000 AU/ml against with the indicator strain Bacillus 1.1. Bacteriocins from both strains are stable in autoclave condition, to a broad pH range of 4-10 and to enzyme proteinase K but completely inactivated by α-chymotrypsin. These characteristics of bacteriocins reveal their potential application for preservation of seafoods in Vietnam. Keywords: bacteriocin, food preservation, lactic acid bacteria, seafood I. ĐẶT VẤN ĐỀ trình sản xuất cũng như chất lượng, độ an toàn và Một trong những ứng dụng của công nghệ ổn định của các sản phẩm thực phẩm. Trong nhiều sinh học trong chế biến thực phẩm là tuyển chọn thập kỷ qua, việc sử dụng ồ ạt các chất phụ gia và cải thiện các chủng vi sinh vật và các sản phẩm trong bảo quản và chế biến thực phẩm đã trở thành từ chúng, với mục tiêu hướng tới là tối ưu các qui một vấn đề đáng lo ngại với sức khỏe người tiêu , Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường – Trường Đại học Nha Trang 1 2 88 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 dùng. Nhiều nghiên cứu, vì thế, đã tập trung vào các lactic để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật hợp chất kháng khuẩn tự nhiên được tiết ra từ các nhằm kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm nói loài vi khuẩn lên men thực phẩm nhằm ức chế các chung và nguyên liệu thủy sản nói riêng là một vi sinh vật không mong muốn. Bacteriocin là một hướng nghiên cứu được cho là có nhiều triển vọng. hợp chất kháng khuẩn được sản sinh từ các vi sinh Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo vật. Chúng có thể được dùng trong bảo quản thực sát hiệu suất tách chiết bacteriocin thô từ dịch canh phẩm vì có bản chất peptide/protein, nên dễ dàng trường của 2 chủng vi khuẩn lactic, đồng thời xác bị thủy phân bởi các protease trong đường ruột của định độ bền của dịch bacteriocin với nhiệt độ, pH người, và vì thế mà không gây dị ứng cho con người và enzym (protease) làm cơ sở cho việc sản xuất (Vuyst, Leroy, 2007; Zhang et al., 2010). bacteriocin ứng dụng trong bảo quản các loại Các vi khuẩn lactic và các sản phẩm chuyển hóa của chúng từ lâu đã được sử dụng trong các loại thực phẩm lên men truyền thống và không hề có tác dụng phụ. Do đó bacteriocin từ nhóm vi khuẩn nguyên liệu thủy sản. Đây là thông báo đầu tiên ở Việt Nam về tính chất của dịch bacteriocin thuộc lớp I (lantibiotic) từ vi khuẩn lactic. này thường được sử dụng trong thực phẩm. Hiện II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU nay, sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm 1. Chủng vi sinh vật đang được quan tâm nghiên cứu vì chúng có thể kéo dài thời gian bảo quản, tăng cường bảo vệ thực phẩm trong các điều kiện nhiệt độ bất thường, làm giảm nguy cơ truyền bệnh qua chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hư hỏng thực phẩm, và giảm tỷ lệ sử dụng chất bảo quản hóa học (Deegan et al., 2006; Gálvez et al., 2010). Trong những năm qua, ngành thuỷ sản đã phát triển và vươn lên thành một trong những ngành kinh tế hàng đầu trong sản xuất thực phẩm xuất khẩu và tiêu dùng trong nước. Nhưng thực tế cho thấy việc bảo quản nguyên liệu sau đánh bắt của nhiều loại nguyên liệu thủy sản như cá, tôm, mực... còn nhiều hạn chế. Hiện các loại nguyên liệu thủy sản chủ yếu Các chủng vi khuẩn lactic T8 và T13 sinh bacteriocin phân lập từ nước dưa lên men truyền thống và chủng vi khuẩn gây thối thực phẩm (Bacillus sp. 1.1) được lấy từ bộ sưu tập chủng của nhóm nghiên cứu chúng tôi tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang (Nguyễn Văn Duy, Lưu Thị Thúy, 2011). Chủng Bacillus 1.1 được sử dụng làm chủng chỉ thị để đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin. Các chủng vi khuẩn lactic và Bacillus được nuôi trên các môi trường tương ứng lần lượt là MRS và TSB theo mô tả của Trần Linh Thước (2007), và được bảo quản trong glycerol 20% ở nhiệt độ -70oC. được bảo quản theo phương pháp ướp đá nhưng 2. Thu nhận bacteriocin thô từ canh trường nuôi thường không có đủ lượng đá để giữ nhiệt độ của vi khuẩn lactic nguyên liệu ≤ 4 C. Mặt khác bảo quản nguyên liệu Hai chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong theo phương pháp ướp đá thường đòi hỏi phải có môi trường MRS lỏng ở pH 6,2 - 6,8 và nhiệt độ dụng cụ chứa đựng lớn, nên giá thành cao. Do đó 370C trong 18-20 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở người dân thường lạm dụng các loại phụ gia độc 5000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút. Thu dịch nổi và hại như kháng sinh, hàn the, ure... trong bảo quản loại cặn. Sau đó dịch nổi được điều chỉnh pH đến 7 nguyên liệu thủy sản, gây nên tình trạng mất an bằng NaOH 1N để loại bỏ ảnh hưởng của các acid toàn thực phẩm. Vì vậy, việc nghiên cứu, tìm kiếm hữu cơ do vi khuẩn sinh ra. Cuối cùng, dịch này các phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn với được sử dụng trực tiếp cho các thử nghiệm xác định người sử dụng là yêu cầu rất cấp thiết. Hướng sử hoạt độ bacteriocin thô. Hiệu suất của qui trình tính dụng bacteriocin - tác nhân sinh học từ vi khuẩn bằng tỉ lệ giữa khối lượng dịch nổi thu được với khối 0 TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 89 Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn lượng của dịch bacteriocin ban đầu. 3. Xác định hoạt độ của bacteriocin thô Chủng chỉ thị Bacillus 1.1 được nuôi trong môi Soá 1/2012 thô từ 2 chủng T13 và T8 với nhiệt độ, pH và enzym được chỉ ra ở Bảng 1 và Hình 1. Bảng 1. Độ bền của dịch bacteriocin thô với nhiệt độ, pH và enzym trường TSB thạch mềm (0,75% agar) có bổ sung chất nhuộm màu methylene blue 0,4% ở 370C trong 24 giờ. Thạch được đục lỗ với đường kính 5 mm, lấp đầy lỗ với 50-100 µl dịch vi khuẩn lactic và ủ ở nhiệt độ 370C trong 12-24h. Hoạt tính bacteriocin của mẫu thí nghiệm được xác định theo đường Điều kiện xử lý Đối chứng Hoạt tính còn lại (AU/ml) Chủng T8 Chủng T13 6000 8000 Xử lý nhiệt độ: kính vòng ức chế d (mm) và theo đơn vị hoạt độ 60oC, 60 phút 5200 7200 AU/ml. Hoạt tính của bacteriocin (AU/ml) là nghịch 100oC, 60 phút 3600 6400 đảo của nồng độ pha loãng cao nhất (D), tại đó 121oC, 15 phút 4800 7000 pH 2, 30 phút 2200 3200 nhỏ vào giếng trên đĩa thạch (Deraz et al., 2005; pH 4, 30 phút 5600 7400 Gao et al., 2010). pH 6, 30 phút 5800 7800 4. Xác định độ bền với nhiệt độ, pH và enzym pH 8, 30 phút 5900 8000 pH 10, 30 phút 5800 7200 pH 12, 30 phút 0 0 6000 7800 0 0 bacteriocin vẫn thể hiện vòng kháng rõ ràng với chủng chỉ thị (d ≥ 6 mm). Công thức tính như sau: AU/ml = (1000/V)*D trong đó V (ml) là thể tích dịch Dịch bacteriocin được xử lí với nhiệt độ, enzym và pH khác nhau. Hoạt tính bacteriocin còn lại được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch như mô tả ở trên. Để xác định độ bền nhiệt, Xử lý pH: Xử lý enzym: dịch bacteriocin được xử lý ở nhiệt độ 60oC, 100oC proteinase K trong 60 phút và 121oC trong 15 phút. Để xác định α-chymotrypsin độ bền với enzym, dịch bacteriocin được trộn với proteinase K hoặc α-chymotrypsin (Promega) ở nồng độ cuối cùng đạt 1 mg/ml, ủ ở 50oC trong 3h, sau đó bất hoạt enzym tại 80oC trong 20 phút. Để xác định độ bền pH, dịch nổi được điều chỉnh đến các giá trị pH trong khoảng từ 2-12 bằng cách sử dụng dung dịch HCl 1N hoặc NaOH 1N, và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37oC. Sau đó các mẫu được trung hòa tới pH 7 trước khi xác định hoạt tính còn lại của bacteriocin (Lee et al., 2007). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Kết quả từ Bảng 1 cho thấy dịch bacteriocin thô từ 2 chủng vi khuẩn lactic này rất bền nhiệt, hoạt tính chỉ giảm 10-13% khi xử lý ở nhiệt độ 60oC trong 60 phút, giảm 13-20% ở điều kiện khử trùng 121oC trong 15 phút và 20-40% ở 100oC trong 60 phút (Hình 1A-B). Kết quả này phù hợp với một nghiên cứu khác về các chủng Lactobacillus phân lập từ phế liệu rau quả tại các chợ địa phương ở Ấn Độ. Theo nghiên cứu này, các chủng vi khuẩn lactic có thể sinh tổng hợp các loại bacteriocin bền nhiệt ở 100°C hoặc 121°C trong 10 phút (Lade et al., 2006). Sau khi ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 30 Thêm vào đó, bacteriocin từ các chủng vi khuẩn phút, hiệu suất thu nhận bacteriocin của các chủng lactic T8 và T13 có thể được xếp vào các bacteriocin T8 và T13 đạt lần lượt là 92,1% và 77,2% và hoạt độ lớp I (lớp lantibiotic) bao gồm các peptide có khối bacteriocin được xác định lần lượt là 6000 AU/ml và lượng phân tử thấp và bền nhiệt (Chen, Hoover, 8000 AU/ml. Kết quả về độ bền của dịch bacteriocin 2003). 90 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 Hình 1. A-B) Độ bền của dịch bacteriocin từ chủng T13 với nhiệt độ và enzym (T13 ĐC: mẫu đối chứng, T13 100: xử lý ở nhiệt độ 100oC, T13 121: xử lý ở nhiệt độ 121oC, proK: xử lý với proteinase K, α-chymotrypsin: xử lý với α-chymotrypsin). C-D) Độ bền pH của dịch bacteriocin từ chủng T8 (Các giá trị pH xử lý tại 2, 4, 6, 7, 8 và 10 được chỉ ra). Chủng Bacillus 1.1 được sử dụng làm chủng chỉ thị. Hơn nữa, dịch bacteriocin thô từ 2 chủng T8 và bền với ảnh hưởng của nhiệt độ, hoạt tính giảm từ T13 có độ bền rất tốt trong dải pH rộng 4-10. Khi xử 100% xuống còn 50% khi xử l‎í ở nhiệt độ 121oC lý ở những giá trị pH trên trong 30 phút, hoạt tính trong 15 phút. Nisin là một polypeptide thuộc lớp đối kháng còn lại của bacteriocin vẫn được duy trì lantibiotic, trong mạch có 34 amino acid được tạo hoặc chỉ bị giảm ít hơn 10% (Hình 1C-D). Kết quả ra nhờ quá trình lên men của Lactococcus lactis này có ‎ý nghĩa thực tiễn rất lớn bởi phần lớn các (Kojic et al., 1991). Do khả năng kháng lại các vi sinh bacteriocin từ vi khuẩn lactic có khoảng hoạt động vật Gram dương gây ngộ độc thực phẩm chính như pH rất hẹp, và chủ yếu hoạt động tốt ở pH acid do Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes, sản sinh ra acid lactic và acid acetic trong quá trình nisin trở thành chất phụ gia trong công nghiệp thực lên men. Chẳng hạn, mặc dù là một bacteriocin đã phẩm được hơn 50 nước sử dụng trên toàn thế giới được thương mại hóa và được biết đến rộng rãi (Hata et al., 2010). nhất trong số các protein có hoạt tính kháng vi sinh Cuối cùng, kết quả nghiên cứu về độ bền khi xử vật, nisin chỉ thể hiện độ bền cao trong điều kiện lý với các enzym protease khác nhau cho thấy dịch acid. Khi tăng pH từ 3 tới 7, nisin trở nên không bacteriocin từ 2 chủng T8 và T13 vẫn giữ được hoạt TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 91 Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 tính với proteinase K nhưng bị bất hoạt hoàn toàn cao hơn mẫu đối chứng 37%, trong đó các chỉ tiêu với α-chymotrypsin (Hình 1A-B). Điều này xác nhận màu và mùi cho điểm cảm quan khác biệt rõ nhất bản chất protein của bacteriocin từ 2 chủng nghiên giữa hai mẫu (Nguyễn Văn Duy, Phạm Ngọc Minh cứu, đồng thời phù hợp với một số nghiên cứu Quỳnh, 2011). Hơn nữa, hàm lượng protein tương trước đây. Chẳng hạn, plantaricin C, một peptide có đối của mẫu cá thí nghiệm lớn hơn mẫu đối chứng khối lượng 3,5 kDa, có nguồn gốc từ Lactobacillus 27,4% nhưng hàm lượng NH3 tương đối thấp hơn plantarum LL441 là một bacteriocin rất bền nhiệt 18,9%. Cuối cùng, sau khi lây nhiễm với vi khuẩn (bền trong điều kiện xử lý nhiệt 100oC trong 60 phút, Salmonella và Vibrio cholerae, các mẫu cá giò có 121 C trong 15 phút), bền với các dung môi hữu cơ nhúng dịch bacteriocin giảm được tương ứng 4 lần (methanol, chloroform, acetonitrile) và các enzym và 3 lần sự gia tăng mật độ tế bào của 2 loại vi pepsin, proteinase K, α-amylase và lipase, nhưng khuẩn này so với mẫu đối chứng. Những kết quả bị bất hoạt bởi pronase, trypsin, và α-chymotrypsin trên cho thấy chất lượng cảm quan, hóa học và vi (1 mg/ml) (Gonzalez et al., 1994). sinh của cá giò vẫn được duy trì sau 7 ngày bảo o Những kết quả trên chỉ ra rằng bacteriocin từ quản bằng dịch bacteriocin từ vi khuẩn lactic chủng 2 chủng T8 và T13 có thể thuộc vào lớp lantibiotic T8. Điều này chứng tỏ khả năng ứng dụng rất tốt bền nhiệt, bền pH, có trọng lượng phân tử thấp của dịch bacteriocin từ vi khuẩn này trong bảo quản (