Một số tính chất Lý Hóa của chất kháng sinh M145 tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomyces s16

MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHẤT KHÁNG SINH M145<br /> TÁCH CHIẾT TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces S16<br /> BIỀN VĂN MINH<br /> PHẠM QUANG CHINH - LÊ THANH HẢI<br /> Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế<br /> Tóm tắt: Các tính chất lý hóa của chất kháng sinh M145 được tách chiết từ<br /> chủng Streptomyces S16 phân lập từ mẫu đất trồng Kim Long, thành phố<br /> Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế thuộc nhóm polyen. Chất kháng sinh M145 có<br /> hoạt tính kháng lại các chủng vi nấm VN_T, VN_X và Fusarium oxysporum<br /> gây bệnh thối cổ rễ cây lạc (Arachis hypogea L.) trong điều kiện in vitro.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 do chúng tôi phân lập từ đất trồng lạc Kim Long,<br /> thành phố Huế, tạo chất kháng sinh có hoạt tính chống các chủng vi nấm VN_T, VN_X<br /> và F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc (Arachis hypogea L.) trong điều kiện in<br /> vitro.<br /> Trong bài báo này, chúng tôi chỉ trình bày kết quả nghiên cứu về một số tính chất lý hóa<br /> của chất kháng sinh được tách chiết từ chủng Streptomyces S16.<br /> 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Đối tượng<br /> Chất kháng sinh tách chiết từ chủng Streptomyces S16<br /> Các chủng vi nấm VN_T, VN_X và Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc<br /> (Arachis hypogea L.)<br /> Vi khuẩn kiểm định: Escherichia coli, Staphylococus aureus<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.2.1. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ với F. oxysporum [1]<br /> - Thu dịch kháng sinh thô bằng phương pháp nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces<br /> S16 trên máy lắc sau 96 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng, sử dụng môi trường Gause-1 có<br /> thành phần tinh bột tan: 20g; K2HPO4.3H2O: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,5g; NaCl: 0,5g;<br /> FeSO4.7H2O: 0,01g; KNO3: 1g; Nước cất: 1000ml, sau đó chiết bằng n-butanol ở mức<br /> pH = 7,0, tách chất kháng sinh bằng cách cho hấp phụ nhựa trao đổi ion Amberlite<br /> IR120Na đã hoạt hóa vào cột, phản hấp phụ bằng acetone 20%. Kết tủa kháng sinh bằng<br /> methanol (8/1), hòa tan chất kháng sinh vào dung dịch đệm acetate phosphate borate pH<br /> 7,0 [4].<br /> <br /> Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm Huế<br /> ISSN 1859-1612, Số 02(22)/2012, tr. 28-33<br /> <br /> MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHẤT KHÁNG SINH M145…<br /> <br /> 29<br /> <br /> - Chế môi trường Gause-1 thạch đĩa có trộn trước vi nấm F. oxysporum, dùng khoan<br /> đồng có đường kính φ = 1cm khoan bỏ thỏi thạch rồi rót vào đó một lượng dịch kháng<br /> sinh thô tách chiết từ chủng Streptomyces S16 đã pha loãng ở trên, đem đặt ở nhiệt độ<br /> 2-40C trong 6 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán, vi nấm bị ức chế, sau đó ủ ấm 28300C sau 48- 72h quan sát vòng vô nấm.<br /> - Căn cứ vào kích thước vòng vô nấm để xác định hoạt tính kháng vi nấm.<br /> 2.2.2. Xác định độ bền nhiệt của dịch kháng sinh<br /> Dịch kháng sinh tách chiết từ chủng Streptomyces S16 được đun cách thuỷ ở nhiệt độ<br /> 40, 50, 60, 70 và 800C, kéo dài trong khoảng thời gian 15, 30 phút rồi tiến hành thử hoạt<br /> tính bằng phương pháp đục lỗ.<br /> 2.2.3. Xác định độ bền pH theo Egorov và cộng sự, 1983 [1], [5].<br /> 2.2.4. Định loại chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra theo Blinov và<br /> Khokhlov; Amman và Gottlieb, với vi nấm kiểm định là F. oxysporum [3], [4].<br /> Các bước tiến hành:<br /> - Nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 trên môi trường Gause-1 trong hộp petri.<br /> Sau 7 ngày đêm nuôi ở nhiệt độ 300C cho mọc kín bề mặt hộp thạch các khuẩn lạc, đem<br /> cắt nhỏ khối thạch trong hộp petri có chứa khuẩn lạc xạ khuẩn cho vào bình tam giác bổ<br /> sung thêm 5ml dung dịch methanol. Ngâm thạch trên trong dung môi này trong khoảng<br /> thời gian 2-3 giờ để chất kháng sinh chiết rút ra hết. Lọc dịch có chứa kháng sinh này<br /> bằng phễu thuỷ tinh có giấy lọc (các dụng cụ này tuyệt đối sạch về mặt hoá học). Để<br /> trong phòng tối thoáng gió làm cho dung môi bay hơi bớt.<br /> - Chấm dịch chất kháng sinh lên giấy sắc ký Whatman N01 loại chạy chậm với kích<br /> thước 1 x 20cm hệ dung môi n-butanol : acetic acid : nước (4:1:5); n-butanol : pyridine :<br /> nước cất (4:3:7). Dịch được chấm đi chấm lại nhiều lần dùng đèn cồn hơ nóng nhẹ giúp<br /> cho chóng khô vết chấm.<br /> - Sau khi sắc ký giấy kết thúc, dải giấy sắc kí trên được cắt thành từng mẫu nhỏ ghi kí<br /> hiệu mẫu, đặt lên bề mặt đĩa thạch đã trộn vi nấm F. oxysporum, đặt ở nhiệt độ 2-40C<br /> trong 6 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán ra trong khi F. oxysporum bị ức chế không<br /> phát triển, rồi nuôi ở nhiệt độ 28-300C trong 72 giờ, quan sát và phát hiện vị trí có vòng<br /> vô nấm.<br /> Xác định trị Rf theo công thức:<br /> Rf =<br /> <br /> Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm điểm hiện vòng vô nấm<br /> Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi chạy đến<br /> <br /> Căn cứ vào kết quả xác định trị Rf, đối chiếu với tài liệu định loại kháng sinh sẽ xác<br /> định được nhóm kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra [4].<br /> <br /> 30<br /> <br /> BIỀN VĂN MINH và cs.<br /> <br /> 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> 3.1. Một số tính chất lý hóa của chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra<br /> 3.1.1. Độ bền nhiệt của chất kháng sinh nghiên cứu<br /> Kết quả được trình bày ở hình 1.<br /> Hiệu số vòng vô nấm (mm)<br /> <br /> 30<br /> 25<br /> 20<br /> 30 phút<br /> <br /> 15<br /> <br /> 15 phút<br /> <br /> 10<br /> 5<br /> 0<br /> 40<br /> <br /> 50<br /> <br /> 60<br /> <br /> 70<br /> <br /> 80 Nhiệt độ 0C<br /> <br /> Hình 1. Đồ thị minh họa độ bền nhiệt của chất kháng sinh nghiên cứu<br /> <br /> Kết quả ở hình 1 cho thấy chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra kém chịu<br /> nhiệt, sau 15 phút ở ngưỡng nhiệt độ 500C hoạt tính kháng sinh giảm. Khi nhiệt độ ≥<br /> 800C thì hoạt tính kháng nấm hầu như không còn tác dụng với F. oxysporum gây bệnh,<br /> sau 15 phút ở ngưỡng nhiệt độ 800C hoạt tính kháng F. oxysporum (−) âm tính. Sau 30<br /> phút hoạt tính kháng sinh ở các mức nhiệt độ đều giảm manh hơn sau 15 phút xử lý.<br /> 3.1.2. Độ bền pH của chất kháng sinh nghiên cứu<br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum<br /> Kích thước vòng vô nấm<br /> Chất kháng sinh<br /> Mức pH<br /> (D − d) mm<br /> 5<br /> 13,0 ± 0,5<br /> Chủng<br /> 6<br /> 17,0 ± 0,5<br /> Streptomyces S16<br /> 7<br /> 21,5 ± 0,5<br /> tạo ra<br /> 8<br /> 16,5 ± 0,5<br /> 9<br /> 11,0 ± 0,5<br /> Ghi chú: D: đường kính vòng vô nấm; d: đường kính lỗ khoan đồng<br /> <br /> Kết quả thử nghiệm với F. oxysporum trong khoảng pH từ 5 − 9 cho thấy hoạt tính<br /> kháng nấm bền ở mức pH từ 6 − 8, kém bền ở mức pH ≥ 8 hoặc ≤ 6.<br /> 3.2. Định loại chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra<br /> 3.2.1. Xác định trị Rf của chất kháng sinh nghiên cứu<br /> Bằng phương pháp hiện hình sinh học. Căn cứ vào vị trí dải giấy sắc ký whatman №1<br /> có vòng vô nấm. Kết quả xác định trị Rf thu được như sau:<br /> <br /> 31<br /> <br /> MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHẤT KHÁNG SINH M145…<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả sắc ký giấy Whatman №1 chất kháng sinh nghiên cứu<br /> Chất kháng sinh<br /> Chủng<br /> Streptomyces S16<br /> tạo ra<br /> <br /> Hệ dung môi đã sử dụng<br /> n-Butanol : acid acetic : nước cất (4:1:5)<br /> n-Butanol : pyridine : nước cất<br /> (4:3:7)<br /> <br /> Rf<br /> 0,38<br /> <br /> Chất kháng sinh<br /> Antivirubin<br /> <br /> 0,61<br /> <br /> Kết quả sắc ký giấy cho thấy, khi chạy sắc ký giấy trong hệ dung môi n-butanol : acid<br /> acetic : nước cất (4:1:5) có trị Rf = 0,38; và hệ dung môi n-butanol : pyridine : nước cất<br /> (4:3:7) có Rf = 0,61<br /> 3.2.2. Đo phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu<br /> Đo phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu tại Trung tâm phân tích Đại học Huế. Kết<br /> quả đo quang phổ tử ngoại của chất kháng sinh thu được như hình 2:<br /> <br /> Hình 2. Hình quang phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu<br /> <br /> Kết quả đo phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu do chủng Streptomyces S16 có<br /> đỉnh hấp cực đại (λ= 317 – 325 nm).<br /> Căn cứ vào kết quả xác định trị Rf khi sắc ký giấy whatman №1 và kết quả đo quang<br /> phổ tử ngoại cực đại, chúng tôi cho rằng chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn<br /> Streptomyces S16 tạo ra có trị Rf tương tự chất kháng sinh antivirubin (T.Kusaka, H.,<br /> M.Shibata et, al, 1968) tưng ứng pentaen, thuộc nhóm polyen và chúng tôi tạm đặt tên<br /> là chất kháng sinh M145.<br /> 3.3. Thử nghiệm hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh trong điều kiện in vitro<br /> Kết quả thử nghiệm hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh thối cổ rễ (VN_T, VN_X và<br /> F.oxysporum) của dịch kháng sinh tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 sau<br /> lên men 72h trong môi trường Gauze-1 ở điều kiện in vitro được trình bày ở bảng sau:<br /> <br /> 32<br /> <br /> BIỀN VĂN MINH và cs.<br /> <br /> Bảng 3. Hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh của dịch lên men Streptomyces S16<br /> Đường kính vòng vô nấm (D-d)mm<br /> 2 ngày<br /> 3 ngày<br /> 4 ngày<br /> 5 ngày<br /> VN_T<br /> 20<br /> 19<br /> 18<br /> 16<br /> VN_X<br /> 18,5<br /> 17,5<br /> 17<br /> 15<br /> F. oxysporum<br /> 20<br /> 19<br /> 18<br /> 17<br /> Ghi chú: - D: Kích thước vòng vô nấm; d: Kích thước thỏi thạch<br /> - Chủng vi nấm gây bệnh VN_T và VN_X là do chúng tôi phân lập từ rễ cây đậu lạc bị<br /> bệnh thối gốc; F. oxysporum là đối chứng.<br /> Chủng<br /> <br /> Kết quả bảng 3 cho thấy sau 2 ngày hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh VN_T và VN_X và<br /> F. oxysporum của dịch lên men chưa cô đặc là cao nhất. Sau 3-5 ngày tiếp theo kích<br /> thước vòng vô giảm do hệ sợi nấm sinh trưởng phát triển mạnh mọc vươn ra làm che<br /> lấp vòng vô nấm. Vì vậy, cần cô đặc dịch lên men để tăng hiệu quả diệt nấm.<br /> 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ<br /> Các tính chất hóa lý của chất kháng sinh M145 được tách chiết từ chủng Streptomyces<br /> S16 từ đất Kim Long, thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế thuộc nhóm polyen.<br /> Chất kháng sinh M145 có hoạt tính kháng lại các chủng vi nấm VN_T, VN_X và F.<br /> oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc Arachis hypogea L. trong điều kiện in vitro.<br /> Đề xuất sử dụng chủng Streptomyces S16 làm đối tượng tạo chế phẩm kháng lại các<br /> chủng vi nấm VN_T, VN_X và F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc Arachis<br /> hypogea L.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]<br /> [2]<br /> [3]<br /> [4]<br /> [5]<br /> <br /> Nguyễn Lân Dũng và các tác giả (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật,<br /> NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.<br /> Lê Gia Hy và các tác giả (1992), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một<br /> số chủng xạ khuẩn Streptomyces phân lập ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, số 14(4).<br /> Biền Văn Minh, Nguyễn Văn Độ (2008), Một số tính chất lý hóa của chất kháng sinh<br /> M105 tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.S6, Tạp chí Khoa học & Giáo<br /> dục, trường ĐHSP Huế, số 02(06), tr.10-14.<br /> Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu xạ khuẩn kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn<br /> phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án Tiến sỹ sinh học, Hà Nội.<br /> Egorov N.X.(1983), Thực tập Vi sinh vật, NXB Mir, Maxcơva, Nguyễn Lân Dũng<br /> dịch, NXB ĐH&THCN, Hà Nội.<br /> <br />