Mức độ biểu hiện của một số gen mã hóa cho serine protease và hoạt độ trypsin-like protease của tôm sú (Penaeus monodon) bị nhiễm virus đốm trắng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

14
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của các gen mã hoá serine protease bao gồm hai gen mã hoá clip-serine protease (PmPPAE1, PmPPAE2), hai gen mã hoá trypsin-like protease (PmTLP1, PmTLP2) và hoạt độ trypsin-like protease trong một số bộ phận khác nhau của tôm sú nhiễm virus đốm trắng (white spot syndrome virus - WSSV) đã được phân tích.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Mức độ biểu hiện của một số gen mã hóa cho serine protease và hoạt độ trypsin-like protease của tôm sú (Penaeus monodon) bị nhiễm virus đốm trắng

VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 Original Article Expression of some Serine Protease Encoding Genes and Trypsin-like Protease Activity in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) Infected with White Spot Syndrome Virus Le The Thai, Quach Hong Thai, Nguyen Thi Hong Loan* VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Received 20 July 2022 Revised 07 September 2022; Accepted 09 September 2022 Abstract: In this study, trypsin-like protease activity and expression of serine protease encoding genes (PmPPAE1, PmPPAE2 - clip-serine proteases and PmTLP1, PmTLP2 - trypsin-like proteases) in the different tissues of black tiger shrimp were determined. The expression level of PmPPAE1 and PmPPAE2 was the highest in the hemolymph; meanwhile that of PmTLP1 and PmTLP2 was the highest in the hepatopancreas. In the hemolymph of white spot syndrome virus (WSSV)-injected shrimp, the expression of PmPPAE1, PmPPAE2 and PmTLP2 genes was upregulated by 2.32, 2.57 and 4.56-fold, respectively, whereas the expression of PmTLP1 was downregulated by 1.47-fold relative to the control group (injected with phosphate buffered saline). In the hepatopancreas of WSSV-injected shrimp, the expression levels of PmPPAE1, PmPPAE2 increased by 2.24 and 3.99-fold, respectively, and that of PmTLP1 and PmTLP2 decreased by 1.51 and 1.29-fold, respectively. Trypsin-like protease activity was found increased 3.25-fold and decreased 4.1-fold, in the hemolymph and hepatopancreas of WSSV-infected shrimp, respectively. These data indicate the role of serine proteases in immune response of the shrimp. Keywords: Clip-serine protease, Penaeus monodon, serine protease, trypsin-like protease, WSSV. D* _______ * Corresponding author E-mail address: loannguyen@hus.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5491 104
L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 105 Mức độ biểu hiện của một số gen mã hóa cho serine protease và hoạt độ trypsin-like protease của tôm sú (Penaeus monodon) bị nhiễm virus đốm trắng Lê Thế Thái, Quách Hồng Thái, Nguyễn Thị Hồng Loan* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 20 tháng 7 năm 2022 Chỉnh sửa ngày 07 tháng 9 năm 2022; Chấp nhận đăng ngày 09 tháng 09 năm 2022 Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của các gen mã hoá serine protease bao gồm hai gen mã hoá clip-serine protease (PmPPAE1, PmPPAE2), hai gen mã hoá trypsin-like protease (PmTLP1, PmTLP2) và hoạt độ trypsin-like protease trong một số bộ phận khác nhau của tôm sú nhiễm virus đốm trắng (white spot syndrome virus - WSSV) đã được phân tích. Kết quả cho thấy PmPPAE1 và PmPPAE2 biểu hiện cao nhất trong huyết tương; trong khi đó, PmTLP1 và PmTLP2 biểu hiện cao nhất trong gan tuỵ của tôm sú. Khi tôm sú bị nhiễm WSSV, mức độ biểu hiện của các gen PmPPAE1, PmPPAE2 và PmTLP2 trong huyết tương tăng lần lượt là 2,32; 2,57 và 4,56 lần; và mức độ biểu hiện của PmTLP1 giảm 1,47 lần so với nhóm tôm đối chứng (chỉ tiêm đệm phosphate chứa muối-PBS). Trong gan tuỵ của tôm nhiễm WSSV, mức độ biểu hiện của các gen PmPPAE1, PmPPAE2 cũng tăng lần lượt là 2,24 và 3,99 lần và mức độ biểu hiện của PmTLP1 và PmTLP2 giảm lần lượt là 1,51 và 1,29 lần so với đối chứng. Hoạt độ trypsin-like protease tăng 3,25 lần và giảm 4,1 lần tương ứng trong huyết tương và gan tuỵ của tôm sú nhiễm WSSV so với nhóm đối chứng. Kết quả nghiên cứu này cho thấy vai trò của các serine protease trong đáp ứng miễn dịch của tôm sú khi nhiễm WSSV. Từ khóa: Clip-serine proteases, Penaeus monodon, serine protease, trypsin-like protease, WSSV. 1. Mở đầu * Serine protease là một trong những họ protease lớn nhất trong giới động vật thực hiện Ngành nuôi tôm mang lại lợi ích kinh tế nhiều chức năng quan trọng khác nhau từ tiêu quan trọng ở các nước nhiệt đới. Tuy nhiên, hoá thức ăn đến đáp ứng miễn dịch [3]. Trypsin dịch bệnh trong đó có bệnh do virus đốm trắng hay trypsin-like protease (TLP) là một enzyme (White spot syndrome virus - WSSV) gây ra là điển hình thuộc nhóm serine protease, enzyme nguyên nhân chính thường gây thiệt hại lớn đến này có ba gốc axit amin là histidine, aspartic và sản lượng tôm. Vì vậy, việc kiểm soát dịch serine trong trung tâm hoạt động, phân giải cơ bệnh của tôm là hết sức cần thiết [1]. Nghiên chất đặc hiệu BapNA và bị ức chế mạnh bởi cứu về đáp ứng miễn dịch ở tôm là cơ sở để N-α-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) [4]. phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh Các gen mã hóa serine protease được hiệu quả. Tôm chỉ có hệ thống miễn dịch bẩm nghiên cứu nhiều là thuộc họ Clip-serine sinh, trong đó hệ thống hoạt hoá protease (Clip-SP), có vai trò hoạt hoá proPO prophenoloxidase (proPO) tạo phenoloxidase thành PO, còn được gọi là PPAE (proPO - hoạt động (PO) có vai trò quan trọng [2]. activating enzyme). Clip-SP có 2 miền chính: _______ trypsin protease chứa trung tâm hoạt động với * Tác giả liên hệ bộ ba axit amin tương tự như các trypsin và Địa chỉ email: loannguyen@hus.edu.vn miền Clip với trình tự 6 gốc cysteine tạo thành https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.5491 3 cầu disulfide [2, 5-7].
106 L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 Nhiều loại trypsin và TLP của tôm đã được 2. Thực nghiệm phát hiện và có mặt chủ yếu trong gan tuỵ với 2.1. Nguyên liệu khối lượng phân tử (KLPT) trong khoảng 11 kDa đến 50 kDa [8-12]. Trypsin hay TLP được Tôm sú (20-25 g/con) từ đầm tôm nuôi tổng hợp ban đầu ở dạng zymogen trước khi quảng canh tại cảng Đình Vũ, Hải An, được tiết và hoạt hoá trong tuyến tiêu hoá như Hải Phòng. đã được thấy ở tôm thẻ chân trắng Litopenaeus Các hóa chất enzyme phiên mã ngược vannamei [10]. Ở tôm, vai trò chính của TLP M-MLV, nTaq-HOT được mua từ Enynomic được biết đến là phân giải protein trong thức ăn, (Hàn Quốc); bộ kit tách RNA Easy-spinTM giúp cho quá trình tiêu hóa của tôm dễ dàng Total RNA Extraction Kit được mua từ hơn [13, 14], tham gia vào hệ thống hoạt hoá iNtRON (Hàn Quốc); master mix SensiFAST™ proPO [2, 5, 7] và quá trình đáp ứng miễn dịch SYBR Lo-ROX được mua từ (Bioline, UK); các [3, 15]. cặp mồi được đặt hàng từ Phù Sa (Việt Nam). Các Phân tích trình tự một số gen mã hoá các hóa chất còn lại đều được mua từ các hãng tin TLP (XM_027367621, JQ277721 và X86369) cậy và đạt độ tinh khiết phân tích. của tôm thẻ chân trắng bằng công cụ Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) cho 2.2. Phương pháp nghiên cứu thấy các gen này đều mã hóa cho một số trypsin Giải phẫu tôm và thu thập các bộ phận: với trình tự 266 axit amin và KLPT khoảng 28 tôm sú sống được giải phẫu để thu các bộ phận: kDa [13]. Ngoài ra, khi tiến hành so sánh các gan tụy, cơ đầu, cơ thân và huyết tương. Mẫu trình tự trên với hệ gen của tôm sú đã cho thấy được nghiền trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ có sự tương đồng khoảng 90% với gen mã hóa và đồng nhất trong đệm Tris-HCl 50 mM pH 8, trypsin của tôm sú (XM_037920629 - NaCl 50 mM (đệm A) theo tỉ lệ 1 g mẫu: XM_037920635). Ở tôm trắng Trung Quốc 3 mL đệm. Dịch đồng nhất sau đó được ly tâm Fenneropenaeus chinensis, 4 gen mã hóa các ở 12000 vòng/phút ở 4 oC trong 30 phút để thu trypsin-like serine protease với KLPT khoảng dịch nổi. Huyết tương được hút ra từ phần dưới 25 kDa, lần lượt kí hiệu là FcTry1, FcTry2, đốt bụng thứ hai của tôm bằng xi lanh 1 mL đã FcTry3 và Fctry4 được biết có biểu hiện trong có sẵn 0,1 mL đệm A. Các dịch chiết được bảo gan tuỵ và mức độ biểu hiện của chúng thay đổi quản ở -80 oC cho đến khi sử dụng. khi tôm bị nhiễm WSSV [3]. Phân tích trình tự Thu mẫu WSSV và định lượng virus: phần gen và axit amin của 4 protein FcTry1- FcTry4 đầu của tôm nhiễm WSSV (cung cấp bởi Viện cho thấy có độ tương đồng cao, tương ứng Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 2) được nghiền khoảng 80% và 90% với trình tự gen và axit đến đồng nhất trong đệm TN (Tris-HCl 10 mM amin của TLP ở tôm sú. Trong khi đó, trình tự và NaCl 10 mM pH 7,5) theo tỷ lệ 1 g mẫu: axit amin của protein mã hóa bởi gen 1 mL đệm. Dịch nghiền được ly tâm PmPPAE1 (ACP19558.1) [5] chỉ tương đồng 3500 vòng/phút, 4 °C, 15 phút để thu dịch nổi rất thấp (38,06%) với TLP của tôm sú. Như có WSSV. DNA của virus WSSV trong dịch vậy, dù có chung miền trypsin protease nhưng nổi được tách chiết bằng Viral gene-spin Viral chúng vẫn mã hóa cho các serine protease khác DNA/RNA extraction kit (INtRON, Hàn Quốc) nhau. Trên cơ sở các nghiên cứu về các gen mã theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Số bản sao hóa serine protease của tôm đã được công bố và của WSSV được định lượng bằng phản ứng phân tích với trình tự gen của tôm sú, chúng tôi real-time PCR trên cơ sở nhân bản đoạn gen đã lựa chọn hai gen mã hoá các Clip-SP là đặc hiệu 126 bp (nucleotide 281344 - 281469) PmPPAE1 và PmPPAE2 [5, 6] và hai gen mã trên hệ gen WSSV (mã số KU216744.2) với cặp hoá TLP được ký hiệu trong nghiên cứu này là mồi WSSV-Fw: 5’-ACTAGGCTCTGACGACCTCT- PmTLP1 và PmTLP2 để đánh giá mức độ biểu 3’, WSSV-Rv: 5’-ACGGCATTCTTCATGGCTTC-3’ hiện của chúng khi tôm sú bị nhiễm WSSV. và mẫu chuẩn là plasmid pGEM tái tổ hợp mang
L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 107 đoạn gen 126 bp có nồng độ 3x102-3x108 bản 100 mM, 5 µl dNTPs 2 mM, 5 µl M-MLV sao/mL. Buffer 10X, 1 µl enzyme M-MLV 200 units/µl, Tách chiết tổng số RNA: RNA tổng số được bổ sung ddH2O đến 50 µl. Hỗn hợp của mỗi tách từ các bộ phận của tôm sú sử dụng kit tách phản ứng được trộn đều và được đặt vào máy RNA easy-spinTM Total RNA Extraction Kit PCR, sử dụng chu trình nhiệt như sau: 25 °C, (iNtRON, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà 10 phút để gắn mồi; 42 °C, 60 phút để tổng hợp sản xuất. Nồng độ và chất lượng RNA được cDNA; 95 °C, 5 phút để biến tính enzyme kiểm tra bằng đo độ hấp thụ tại bước sóng M-MLV. cDNA được bảo quản ở -20 ºC cho tới 260 nm trên máy Nanodrop ND2000 khi sử dụng. (ThermoFisher Scientific, Mỹ). Đánh giá mức độ biểu hiện gen bằng phản Tổng hợp cDNA từ RNA nhờ reverse ứng real-time PCR (RT-qPCR), sử dụng EF1 transcriptase: cDNA được tổng hợp bằng làm gen nội chuẩn. Các cặp mồi (Bảng 1) được M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, thiết kế dựa trên công cụ Primer Blast Hàn Quốc) với các thành phần phản ứng như (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). sau: 500 ng RNA, 2,5 µl random hexamer Bảng 1. Trình tự của các cặp mồi nhân bản các đoạn gen mã hoá serine proteases của tôm sú Kích thước sản phẩm Tên gen Mã Genbank Trình tự nucleotide (5’-3’) PCR (bp) Fw: CTTCAATTTTGGTCCCAACGGT PmPPAE1 FJ595215.1 113 Rv: TTTGGCATCGTCGGGAGTT Fw: GGGAGGGAGCAGCTACG PmPPAE2 FJ620685.1 119 Rv: CTTGCCTTCGATCTCTCGTC Fw: GGATGGCATTTCTGTGGTGC PmTLP1 XM_037920630.1 141 Rv: GCCCTCGTCAACTTCTAGGTTA Fw: CAACAGGGATGTGGATGAGG PmTLP2 XM_037920635.1 115 Rv: AGACAGCTTGAGCAGGGAGA Fw: TGGGCAAGGAGAAGATCCAT EF1-α MG775229.1 118 Rv: TCGATCGTTCGCTTGTCGAT G Nhân bản các gen PmPPAE1, PmPPAE2, hiện của các gen mã hóa serine protease giữa PmTLP1, PmTLP2 và gen nội chuẩn EF1-α mẫu tôm nhiễm WSSV với mẫu tôm không được thực hiện bằng RT-qPCR sử dụng master nhiễm WSSV được đánh giá theo phương pháp mix SensiFAST™ SYBR Lo-ROX (Bioline, UK). của Livak và Schmittgen (2001) [16]. Các gen Các thành phần phản ứng RT-qPCR được trộn đích là PmPPAE1, PmPPAE2, PmTLP1, đều và chu trình phản ứng được thực hiện ở PmTLP2, chu kỳ ngưỡng (Ct) của gen quan tâm 95 °C trong 2 phút để biến tính bước đầu DNA, phân lập từ tôm nuôi trong bể đối chứng không tiếp theo là 40 chu kỳ gồm 3 bước phản ứng: nhiễm WSSV (bể PBS) được ký hiệu là Ct i) Biến tính DNA ở 95 °C, 5 giây; ii) Gắn mồi ở (C/Tg); các bể thí nghiệm tôm nhiễm WSSV 60-62 °C, 10 giây; iii) Kéo dài chuỗi ở 72 °C, được ký hiệu là Ct (T/Tg). Tương tự EF1-α là 30 giây. Kết quả của RT-qPCR được phân tích gen nội chuẩn với chu kỳ ngưỡng trong bể đối bằng phần mềm Light Cycler 96. Mức độ biểu chứng và thí nghiệm tương tự như các gen đích
108 L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 và được ký hiệu tương ứng Ct (C/Ref) và Ct 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận (T/Ref). 3.1. Mức độ biểu hiện của các gen mã hóa Trong các bể thí nghiệm: ∆Ct (T) = Ct serine protease trong các bộ phận khác nhau (T/Tg) – Ct (T/Ref). của tôm sú Trong bể đối chứng : ∆Ct (C) = Ct (C/Tg) – Ct (C/Ref). Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện ∆∆Ct = ∆Ct (T) - ∆Ct (C). của các gen mã hoá serine protease trong 4 bộ Sau cùng, mức độ biểu hiện tương đối của phận khác nhau của tôm sú là cơ thân (CT), cơ gen đích trong bể thí nghiệm với bể đối chứng đầu (CD), huyết tương (HT) và gan tụy (GT) được tính theo công thức 2-∆∆Ct . được đánh giá bằng RT-qPCR sử dụng gen nội Nuôi tôm sú và lây nhiễm WSSV trong chuẩn EF1-α. Kết quả thu được (Hình 1) cho phòng thí nghiệm: tôm sú tại đầm nuôi được thấy các gen PmPPAE1, PmPPAE2, PmTLP1, vận chuyển về phòng thí nghiệm với hệ thống PmTLP2 đều biểu hiện trong các bộ phận sục khí để đảm bảo tôm sống khỏe mạnh. Các nghiên cứu. Trong đó, PmPPAE1 biểu hiện cao con tôm có kích thước và khối lượng tương nhất trong huyết tương và thấp nhất trong cơ đương được chia vào các bể kính có dung tích khoảng 50 lít có chứa 30 lít nước RO bổ sung đầu (Hình 1 A); PmPPAE2 biểu hiện cao nhất muối biển với nồng độ 5-10‰, mật độ khoảng trong huyết tương và thấp nhất trong cơ thân 8-10 con/bể, nhiệt độ 22-28 oC, pH 7,5. Sau khi (Hình 1 B); PmTLP1 biểu hiện cao nhất trong bổ sung các thành phần giúp cân bằng hệ vi gan tuỵ và thấp nhất trong cơ đầu (Hình 1 C) và sinh, tôm được nuôi thuần trong khoảng 3 ngày PmTLP2 biểu hiện cao nhất trong huyết tương, với thức ăn công nghiệp rồi được chia thành 2 gan tuỵ và thấp nhất trong cơ đầu (Hình 1D). nhóm: nhóm đối chứng (tiêm đệm PBS) và Charoensapsri và cộng sự [5, 6] đã xác nhóm thí nghiệm (tiêm 50 µl dịch WSSV nồng định sự biểu hiện của hai gen PmPPAE1 và độ 104 bản sao/mL). Mẫu (2 con tôm/nghiệm PmPPAE2 trong các cơ quan mang, ruột, tế bào thức) được thu tại các thời điểm 0 giờ và 48 giờ lympho, tim, huyết tương và gan tụy bằng sau tiêm WSSV để thu các bộ phận và đánh phương pháp RT-PCR kết hợp điện di sản phẩm giá sự mức độ biểu hiện, hoạt độ của các RT-PCR. Kết quả cho thấy cả hai gen đều biểu serine protease. hiện ở huyết tương và không thấy có ở các bộ Hoạt độ TLP được xác định bằng phương phận còn lại. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng pháp của Grenier và cộng sự [17] trên cơ sở phương pháp RT-qPCR với cặp mồi thiết kế đánh giá khả năng phân giải cơ chất BAPNA nhân bản đoạn DNA kích thước lần lượt là thành p-nitroaniline hấp thụ cực đại ở bước 113 bp và 119 bp, hai gen này đều biểu hiện ở sóng 410 nm. Quy trình thí nghiệm được tiến cả huyết tương và gan tụy, trong đó mức độ hành như sau: 260 µl nước cất được ủ với 80 µl đệm A 5X có CaCl2 50 mM và 50 µl BAPNA biểu hiện ở huyết tương là cao hơn ở gan tụy. 8 mM ở 37 oC trong 2 phút, sau đó bổ sung Đối với PmTLP1 và PmTLP2, chưa có nghiên 10 µl mẫu (tổng thể tích phản ứng là 400 µl) và cứu nào công bố về mức độ biểu hiện của hai đo số đọc ở 410 nm mỗi 2 phút từ thời điểm gen trên các bộ phận của tôm sú. Bốn gen 0 phút đến 10 phút. Một đơn vị hoạt độ được FcTry1, FcTry2, FcTry3 và FcTry4 mã hoá cho định nghĩa là lượng enzyme tối thiểu để tăng số các TLP của tôm trắng Trung Quốc [3] đã được đọc hấp thụ của p-nitroaniline ở 410 nm lên phát hiện thấy biểu hiện ở gan tụy và không 0,01/phút trong thời gian phản ứng là 10 phút. thấy biểu hiện ở huyết tương, tim, dạ dày, mang Phương pháp xử lý thống kê số liệu: các thí và ruột bằng phương pháp RT-PCR kết hợp với nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu được thu thập điện di. Sự khác nhau trong độ nhạy của hai và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 phương pháp nghiên cứu có thể là lý do dẫn đến và GraphPad Prism version 8 với p value < 0,05. sự sai khác của kết quả.
L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 109 Trên cơ sở kết quả thu được, hai bộ phận là serine protease của tôm sú khi bị nhiễm virus gan tụy và huyết tương đã được lựa chọn để đốm trắng WSSV trong các thí nghiệm đánh giá mức độ biểu hiện của các gen mã hoá tiếp theo. H A B C D Hình 1. Mức độ biểu hiện của các gen PmPPAE1 (A), PmPPAE2 (B), PmTLP1 (C), PmTLP2 (D) ở cơ thân (CT), cơ đầu (CĐ), huyết tương (HT) và gan tuỵ (GT) của tôm sú. Các dữ liệu được phân tích theo kiểm định t-test giữa từng bộ phận với nhau. Các chữ cái a, b, c biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu với p < 0,05. 3.2. Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá gen PmPPAE1, PmPPAE2 trong gan tuỵ của serine protease của tôm sú nhiễm WSSV tôm nhiễm WSSV cũng tăng lần lượt là 2,24 và 3,99 so với đối chứng (p < 0,05) (Hình 2 B). Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá Ngược lại, mức độ biểu hiện của gen PmTLP1 serine protease đã được đánh giá trong huyết và PmTLP2 trong gan tuỵ lần lượt giảm 1,51 và tương và gan tuỵ của tôm sú sau nhiễm WSSV. 1,29 (Hình 2 B). Kết quả cho thấy, mức độ biểu hiện của các gen PmPPAE1 trong tế bào máu (hemocyte) của PmPPAE1, PmPPAE2 và PmTLP2 trong huyết tôm sú được phát hiện tăng mức độ biểu hiện tương của tôm nhiễm WSSV đã tăng lần lượt là 1,36 lần sau 48 giờ nhiễm vi khuẩn Vibrio 2,32; 2,57 và 4,56 lần so với tôm đối chứng harveyi [5]. Tương tự, PmPPAF thuộc họ gen (được tiêm đệm PBS) và có ý nghĩa thống kê mã hóa cho serine protease có vùng domain với p < 0,05 (Hình 2 A). Trong khi đó, mức độ trypsin-like serine protease và chức năng tương biểu hiện của gen PmTLP1 giảm 1,47 lần tự PmPPAE1 và PmPPAE2 cũng tăng biểu hiện (Hình 2A). Tương tự, mức độ biểu hiện của các 2,5 lần trong huyết tương của tôm sú sau 48 giờ
110 L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 nhiễm WSSV [18]. Bên cạnh đó, PmPPAE1 và V. anguillarum [3]. Cho đến nay, chưa có PmPPAE2 cũng đã được biết là có vai trò trong nghiên cứu nào tiến hành đánh giá mức độ biểu quá trình hoạt hóa proPO thành PO để hình hiện của các gen mã hóa serine protease trong thành melanin nội sinh chống lại tác nhân xâm gan tụy của tôm sú. Nghiên cứu của chúng tôi nhập. Khi ức chế sự biểu hiện 2 gen trên bằng đánh gía mức độ biểu hiện của gen ở mức độ dsRNA, hoạt độ của PO trong huyết tương mRNA dựa trên 2-∆∆Ct của hai nhóm đối chứng giảm, đồng thời tỉ lệ tôm chết do vi khuẩn và thí nghiệm, cho phép xác định chính xác sự V. haveyi tăng lên [5, 6]. thay đổi biểu hiện của gen. Khi tôm bị nhiễm FcTry1, FcTry2, FcTry3 và FcTry4 trong WSSV, huyết tương là nơi xảy ra các phản ứng gan tuỵ của tôm trắng Trung Quốc được biết là miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể, từ đó có liên quan đến đáp ứng miễn dịch của tôm khi sinh ra các phân tử chống lại tác nhân xâm bị nhiễm WSSV. Cụ thể mức độ biểu hiện của nhiễm. Gen PmPPAE1 và PmPPAE2 có xu FcTry1, FcTry2 tăng, còn mức độ biểu hiện của hướng biểu hiện tăng ở huyết tương. Kết quả đã FcTry3, FcTry4 giảm tại thời điểm 24 giờ sau khẳng định thêm vai trò của PmPPAE1 và khi tôm nhiễm WSSV. Tuy nhiên, sự thay PmPPAE2 trong đáp ứng miễn dịch của tôm sú đổi mức độ biểu hiện của các gen này là đối với tác nhân xâm nhiễm là WSSV. không đáng kể khi tôm bị nhiễm vi khuẩn H A B Hình 2. Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá serine protease ở huyết tương (A) và gan tuỵ (B) của tôm sú nhiễm WSSV. Các dữ liệu được phân tích theo kiểm định t-test giữa nhóm tôm nhiễm WSSV so với đối chứng tiêm PBS với giá trị p
L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 111 lai xâm nhập, TLP dự trữ trong gan tụy sẽ được cũng suy giảm, biểu hiện thông qua việc tôm vận chuyển đến huyết tương và tham gia vào giảm ăn và kém hoạt động. Do đó, các nghiên quá trình đáp ứng miễn dịch. Đồng thời, khi cứu tiếp theo về vai trò của TLP trong đáp ứng tôm nhiễm virus, các hoạt động sống của tôm G miễn dịch của tôm sú là cần thiết. A B Hình 3. Hoạt độ của TLP ở huyết tương (A) và gan tuỵ (B) của tôm sú nhiễm WSSV. Các dữ liệu được phân tích theo kiểm định t-test giữa nhóm tôm nhiễm WSSV so với đối chứng tiêm PBS với giá trị p
112 L. T. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 38, No. 3 (2022) 104-112 Activating Enzyme and Its Role in PO Activation, Shrimp Penaeus vannamei, Comparative Developmental and Comparative Immunology, Biochemistry and Physiolog, Vol. 135, No. 2, Vol. 35, No. 1, 2011, pp. 118-123, 2003, pp. 373-383, https://doi.org/10.1016/S1096- https://doi.org/10.1016/j.dci.2010.09.002. 4959(03)00091-5. [7] M. Jearaphunt, P. Amparyup, P. Sangsuriya, [14] A. S. Paza, F. F. G. Carreña, A. M. Almazána, W. Charoensapsri, S. Senapin, A. Tassanakajon, N. Y. H. Saavedraa, G. Y. Plascencia, Differential Shrimp Serine Proteinase Homologues Expression of Trypsin mRNA in the White PmMasSPH-1 and -2 play a Role in the Activation Shrimp (Penaeus vannamei) Midgut Gland Under of the proPhenoloxidase System, Plos One, Starvation Conditions, Journal of Experimental Vol. 10, No. 3, 2015, Marine Biology and Ecology, Vol. 292, No. 1, https://doi.org/10.1016/j.dci.2007.03.005. 2003, pp. 1-17, [8] S. T. Jiang, M. W. Moody, H. C. Chen, https://doi.org/10.1016/S0022-0981(03)00142-4. Purification and Characterization of Protease from [15] C. Li, F. Wang, J. J. Aweya, D. Yao, Z. Zheng, Digestive Tract of Grass Shrimp (Penaeus H. Huang, S. Li, Y. Zhang, Trypsin of monodon), Journal of Food Science, Vol. 56, Litopenaeus vannamei is Required for the No. 2, 1991, pp. 322-326, Generation of Hemocyanin-derived Peptides, https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1991.tb05271.x. Development and Comparative Immunology, Vol. 79, 2018, pp. 95-104, [9] D. Lemos, J. M. Ezquerra, F. L. G. Carreno, Protein Digestion in Penaeid Shrimp: Digestive https://doi.org/10.1016/j.dci.2017.10.015. Proteinases, Proteinase Inhibitors and Feed [16] K. J. Livak, T. D. Schmittgen, Analysis of Digestibility, Aquaculture, Vo. 186, No. 1+2, Relative Gene Expression Data Using Real-time 2000, pp. 89-105, Quantitative PCR and the 2-∆∆Ct Method, Methods, https://doi.org/10.1016/S0044-8486(99)00371-3. Vol. 25, No. 4, 2001, pp. 402-408, [10] J. C. Sainz, F. L. G. Carreño, P. H. Cortés, https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262. Penaeus vannamei Isotrypsins: Purification and [17] D. Grenier, Inactivation of Human Serum Characterization, Comparative Biochemistry and Bactericidal Activity by a Trypsin-like Protease Physiology, Part B, Vol. 138, No. 2, 2004, Isolated from Porphyromonas gingivalis, Infection pp. 155-162, and Immunity, Vol. 60, No. 5, 1992, pp. 1854-1857, https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2004.03.002. https://doi.org/10.1128%2Fiai.60.5.1854- [11] T. Senphan, S. Benjakul, H. Kishimura, 1857.1992. Purification and Characterization of Trypsin from [18] T. H. Ma, J. A. Benzie, J. G. He, C. B. Sun, S. F. Hepatopancreas of Pacific White Shrimp, Journal Chan, PmPPAF is a pro-Phenoloxidase Activating of Food Biochemistry, Vol. 39, No. 4, 2015, Factor Involved in Innate Immunity Response of pp. 388-397, the Shrimp Penaeus monodon, Developmental https://doi.org/10.1111/jfbc.12147. and Comparative Immunology, Vol. 44, No. 1, 2014, pp. 167-168, [12] H. L. T. Nguyen, H. T. Quach, D. Q. Trinh, H. Q. Nguyen, B. Y. Pham, T. N. Dinh, T. T. Ngo, T. N. https://doi.org/10.1016/j.dci.2013.12.007. Phan, Partial Characterziation and Localization of [19] S. A. Lehnert, S. E. Johnson, Expression of Various Proteases from Penaeus Monodon Hemocyanin and Digestive Enzyme Messenger Fabricius, Decapoda, Penaeidae, Crustaceana, 1978, RNAs in the Hepatopancreas of the Black Tiger https://doi: 10.1163/15685403-bja10225. Shrimp Penaeus monodon, Comparative Biochemistry and Physiology Part B: [13] A. M. Almazán, F. L. G. Carreño, J. A. S. Paz, Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 133, G. Y. Plascencia, A. B. P. Uriarte, Effects of No. 2, 2002, pp. 163-171, Dietary Protein on the Activity and mRNA Level of Trypsin in the Midgut Gland of the White https://doi.org/10.1016/S1096-4959(02)00123-9. O P