intTypePromotion=1

Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

0
15
lượt xem
0
download

Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết tập trung nghiên cứu chế tạo kháng thể (IgG, IgY) và tinh sạch kháng thể sẵn có đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N. atra, có thể sử dụng để phát triển bộ xét nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn hổ mang N. atra.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ<br /> KHÁNG NỌC RẮN HỔ MANG Naja atra<br /> Nguyễn Ngọc Tuấn*; Trịnh Thanh Hùng**<br /> Đặng Hồng Thanh***; Nguyễn Đặng Dũng*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: nhiễm độc nọc rắn nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc<br /> để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân. Biện pháp<br /> điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân (BN) bị nhiễm độc nọc rắn là huyết thanh kháng nọc rắn<br /> (HTKNR) đặc hiệu; tuy nhiên, trước hết cần xác định được loài rắn độc gây ra tai nạn rắn cắn.<br /> Vật liệu và phương pháp: chế tạo và tinh sạch 3 kháng thể đặc hiệu nọc rắn hổ mang miền Bắc<br /> N. atra nhằm sử dụng làm nguyên liệu phát triển xét nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn N. atra.<br /> Kết quả: đã chế tạo và tinh sạch thành công 2 kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N. atra<br /> từ huyết thanh thỏ và từ l ng đỏ trứng gà được gây miễn dịch (tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện<br /> Quân y) và tinh sạch 1 kháng thể từ huyết thanh ngựa được gây miễn dịch (do Đài Loan cung cấp).<br /> Kết luận: có thể sử dụng các kháng thể sau tinh sạch để phát triển bộ xét nghiệm miễn dịch<br /> phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang N. atra.<br /> * Từ khoá: Nọc rắn; Naja atra; Kháng thể.<br /> <br /> Study on Production and Purification of Antibodies Specific to<br /> Naja Atra Snake Venom<br /> Summary<br /> Introduction: Snake envenomation, if not promptly treated, may lead to death or severe<br /> complications in the snakebite victims. One of the most effective therapies for snakebite victims<br /> relies on administration of specific antivenin, once the causal snake species is identified.<br /> Current methods of choice for snake venom identification include immunoassay, which needs<br /> venom-specific antibodies for its development. Materials and methods: 3 antibodies specific to<br /> Naja atra venom antigen were isolated and purified by conventional methods. Results: We have<br /> successfully produced and purified 3 antidobies specific to N. atra venom, 2 of which were<br /> created by ourselves (at Vietnam Military Medical University) and the other was kindly provided<br /> by Center for Toxicology, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan. Conclusions:<br /> These 3 antibodies can be utilized as materials for development of rapid immunoassays for<br /> N. atra snake venom detection.<br /> * Key words: Snake venom; Naja atra; Antibody.<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bộ Khoa học và Công nghệ<br /> *** Viện Y học Phòng không - Không quân<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 28/10/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/12/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 29/12/2015<br /> <br /> 77<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Rắn độc cắn là một trong những tai<br /> nạn nguy hiểm thường gặp đối với nông<br /> dân, công nhân lâm trường và bộ đội hoạt<br /> động dã ngoại. Nhiễm độc nọc rắn nếu<br /> không được điều trị kịp thời có thể dẫn<br /> đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng<br /> nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc<br /> sống của nạn nhân sau khi sống sót.<br /> Xác định chính xác nọc độc của loài rắn<br /> gây tai nạn trong cơ thể nạn nhân rắn cắn<br /> có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, vừa<br /> giúp sơ cấp cứu đúng cách, vừa định<br /> hướng lựa chọn đúng loại HTKNR đơn<br /> đặc hiệu để sử dụng, đem lại hiệu quả<br /> điều trị cao và an toàn hơn cho nạn nhân<br /> [1, 3, 4]. Theo WHO, thuốc điều trị hiệu<br /> quả nhất cho BN bị nhiễm độc nọc rắn là<br /> HTKNR [7, 8]. Tuy nhiên, để lựa chọn<br /> HTKNR đặc hiệu, trước tiên cần xác định<br /> loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn. Tại<br /> miền Bắc, rắn hổ mang N. atra là một<br /> trong số các loài rắn có tần suất gây tai<br /> nạn rắn độc cắn và tỷ lệ tử vong do rắn<br /> cắn tương đối cao. Đến nay, tại Việt Nam<br /> chưa có báo cáo về việc phát triển kít<br /> phát hiện nọc rắn hổ mang N. atra cho<br /> chẩn đoán loài rắn gây tai nạn rắn cắn.<br /> Nhờ tính đặc hiệu của phản ứng kết<br /> hợp kháng nguyên - kháng thể, các phản<br /> ứng miễn dịch được coi là những kỹ thuật<br /> tốt nhất được sử dụng để phát hiện nọc<br /> độc [7]. Nổi bật trong các kỹ thuật miễn<br /> dịch chính là xét nghiệm dựa trên nguyên<br /> lý sắc ký miễn dịch. Tuy nhiên, để phát<br /> triển được bộ xét nghiệm miễn dịch phát<br /> hiện nọc rắn độc dựa trên nguyên lý sắc<br /> 78<br /> <br /> ký miễn dịch cần có ít nhất 2 kháng thể<br /> từ 2 loài khác nhau có hiệu giá cao và<br /> đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn. Xuất<br /> phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành<br /> nghiên cứu chế tạo kháng thể (IgG, IgY)<br /> và tinh sạch kháng thể sẵn có đặc hiệu<br /> với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N. atra,<br /> có thể sử dụng để phát triển bộ xét<br /> nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn hổ<br /> mang N. atra.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Đối tượng nghiên cứu:<br /> - Động vật thí nghiệm: thỏ đực 12 con,<br /> cân nặng 2 - 2,5 kg chia làm 4 lô; gà mái<br /> trong độ tuổi đẻ trứng 12 con, cân nặng<br /> 1,5 - 2 kg chia làm 4 lô; động vật thí nghiệm<br /> được Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm,<br /> Học viện Quân y cung cấp và nuôi trong<br /> điều kiện đủ thức ăn, nước uống trong<br /> suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.<br /> - Huyết thanh ngựa trước và sau khi<br /> gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn<br /> hổ mang N. atra do Trung tâm Độc chất,<br /> Bệnh viện Đại học Y Trung Hoa, Đài Loan<br /> cung cấp (theo Đề tài hợp tác khoa học<br /> Nghị định thư giữa Việt Nam và Đài Loan).<br /> * Vật liệu nghiên cứu:<br /> Nọc tổng số của rắn hổ mang N. atra<br /> do Trại rắn Vĩnh Sơn, Vĩnh Phúc cung<br /> cấp, số lượng 1 g; nọc tổng số của 4 loài<br /> rắn độc khác (Hổ đất, Lục xanh, Chàm<br /> quạp và Hổ chúa) do Trung tâm Nuôi<br /> trồng và Bảo tồn Dược liệu Quân khu 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> (Trại rắn Đồng Tâm) cung cấp, số lượng<br /> mỗi loại 100 mg. Nọc rắn được thu thập<br /> bằng phương pháp kích thích cơ học<br /> tuyến nọc cho rắn tiết nọc vào cốc sạch<br /> (theo quy trình của WHO [9]), tạo hỗn<br /> hợp nọc của ít nhất 30 cá thể rắn mỗi<br /> loài, không phân biệt giới, có độ tuổi và<br /> kích thước khác nhau nhằm bảo đảm tính<br /> đại diện loài.<br /> Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund<br /> không hoàn chỉnh, kháng thể đơn clon<br /> kháng IgG thỏ đánh dấu enzym peroxidase,<br /> kháng thể đơn clon kháng IgY gà đánh<br /> dấu enzym peroxidase và cơ chất OPD<br /> (o-phenylenediamin) (Hãng Sigma).<br /> Các hoá chất khác và vật tư tiêu hao<br /> dùng cho gây miễn dịch và phản ứng<br /> ELISA đều đạt tiêu chuẩn phân tích và<br /> chính hãng sản xuất cung cấp.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> * Chế tạo kháng nguyên từ nọc rắn:<br /> Nọc rắn ở dạng đông khô được hoà tan<br /> trong dung dịch NaCl 0,9% thành dạng<br /> dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Ly tâm<br /> dung dịch nọc, thu dịch nổi và lọc vô trùng<br /> qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm.<br /> Trộn dung dịch nọc với tá chất Freund<br /> theo tỷ lệ 1:1 về thể tích tạo thành huyền<br /> dịch kháng nguyên để gây miễn dịch.<br /> Huyền dịch kháng nguyên được chế tạo<br /> mới cho mỗi lần gây miễn dịch và được<br /> giữ ở 40C đến khi sử dụng.<br /> * Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng<br /> nọc rắn:<br /> Được tiến hành theo quy trình gây<br /> miễn dịch nhiều mũi nhắc lại theo mô tả<br /> của Selvanayagam và CS [6]. Gây miễn<br /> <br /> dịch lần đầu với kháng nguyên trộn tá<br /> chất Freund hoàn chỉnh, gây miễn dịch<br /> nhắc lại với kháng nguyên trộn tá chất<br /> Freund không hoàn chỉnh. Khoảng cách<br /> giữa các lần gây miễn dịch 3 tuần.<br /> Bảng 1: Liều kháng nguyên sử dụng gây<br /> miễn dịch.<br /> Lô thỏ (T), ô gà (G) T1, G1 T2, G2 T3, G3 T4, G4<br /> Mũi 1<br /> <br /> 50<br /> <br /> 75<br /> <br /> 100<br /> <br /> 125<br /> <br /> Nồng độ<br /> kháng<br /> nguyên<br /> <br /> Mũi 2<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> Mũi 3<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> (g/ml)<br /> <br /> Mũi 4<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> Mũi 5<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> Phương pháp gây miễn dịch:<br /> - Đối với thỏ: tiêm theo đường tiêm<br /> dưới da dọc 2 bên sống lưng thành nhiều<br /> mũi, mỗi mũi khoảng 50 l huyền dịch,<br /> tổng thể tích một lần tiêm là 1 ml huyền<br /> dịch.<br /> - Đối với gà: tiêm trong cơ ngực lớn<br /> thành nhiều mũi, mỗi mũi khoảng 50 l<br /> huyền dịch, tổng thể tích một lần tiêm<br /> 1 ml huyền dịch.<br /> Lấy máu động vật thí nghiệm trước khi<br /> gây miễn dịch và 7 ngày sau mỗi lần gây<br /> miễn dịch để phát hiện sự có mặt của<br /> kháng thể kháng nọc rắn. Máu thỏ được<br /> lấy từ động mạch tai, máu gà lấy từ động<br /> mạch cánh.<br /> Trứng gà được thu thập 7 ngày sau<br /> lần gây miễn dịch thứ ba để phát hiện<br /> kháng thể đặc hiệu trong l ng đỏ trứng.<br /> * Kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện<br /> kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh:<br /> - Kháng nguyên nọc rắn tổng số (nồng<br /> độ 20 g/ml pha trong dung dịch đệm<br /> 79<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> carbonate-bicarbonate pH 9,6) được cố<br /> định trên bề mặt giếng ELISA bằng phương<br /> pháp hấp phụ thụ động ở 400C/12 giờ.<br /> Tiếp đó, bề mặt giếng ELISA được che<br /> phủ (blocking) bằng dung dịch BSA 1%.<br /> - Huyết thanh (thỏ, gà, ngựa) được pha<br /> loãng bậc 2. Nhỏ 100 l huyết thanh đã<br /> pha loãng vào giếng ELISA đã gắn kháng<br /> nguyên nọc rắn, ủ trong 30 phút ở nhiệt<br /> độ phòng. Kháng thể thỏ đặc hiệu với nọc<br /> rắn có mặt trong mẫu huyết thanh được<br /> phát hiện bằng kháng thể đánh dấu enzym<br /> peroxidase. Sau khi rửa loại bỏ các thành<br /> phần không gắn kết trong giếng ELISA,<br /> hoạt tính của enzym peroxidase (thể hiện<br /> sự có mặt của kháng thể đặc hiệu kháng<br /> nguyên nọc rắn) được khảo sát thông qua<br /> tác dụng xúc tác của enzym gây đổi màu<br /> cơ chất OPD (bằng cách bổ sung cơ chất<br /> OPD vào giếng phản ứng). Đo cường độ<br /> của phản ứng chuyển màu bằng máy đọc<br /> ELISA ở bước sóng 450 nm. Hiệu giá<br /> kháng thể trong huyết thanh được tính là<br /> độ pha loãng huyết thanh lớn nhất mà tại<br /> đó c n cho kết quả dương tính với kháng<br /> nguyên nọc rắn.<br /> <br /> - Tách chiết IgY từ trứng gà theo phương<br /> pháp được Hoàng Trung Kiên và CS mô tả<br /> [5]: tách l ng đỏ trứng khỏi lòng trắng, sau<br /> đó trộn với nước cất lạnh 40C (tỷ lệ 1:9 về<br /> thể tích) qua đêm; thu dịch nổi, lọc qua giấy<br /> lọc Whatman; dịch lọc được kết tủa phân<br /> đoạn lần lượt trong dung dịch amoni sulfat<br /> 25% và 40%; thu cặn, hòa tan trong dung<br /> dịch PBS 1X, tiếp đó thẩm tích (loại bỏ<br /> amoni sulfat) trước khi chạy sắc ký trao đổi<br /> ion. Chế phẩm kháng thể sau tinh sạch<br /> được khảo sát hoạt tính bằng kỹ thuật<br /> ELISA gián tiếp, đồng thời điện di SDSPAGE để kiểm tra độ tinh sạch.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng<br /> thể kháng nọc rắn hổ mang N. atra từ<br /> thỏ và gà.<br /> <br /> * Đánh giá phản ứng chéo giữa HTKNR<br /> với các nọc rắn khác:<br /> Phản ứng chéo giữa huyết thanh (thỏ,<br /> gà, ngựa) kháng nọc rắn N. atra với nọc<br /> rắn khác loài (rắn Hổ đất, Hổ chúa, Chàm<br /> quạp và Lục xanh) được khảo sát bằng<br /> kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kết quả ELISA<br /> dương tính thể hiện sự có mặt của kháng<br /> thể phản ứng chéo.<br /> * Tinh sạch kháng thể:<br /> - Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu<br /> được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký<br /> ái lực (sử dụng cột protein A cho huyết<br /> thanh thỏ, cột protein G cho huyết thanh<br /> ngựa), sau đó thẩm tích qua đêm ở 40C.<br /> 80<br /> <br /> Hình 1: Biến động hiệu giá kháng thể đặc<br /> hiệu trên thỏ và gà được gây miễn dịch.<br /> Kháng thể đặc hiệu bắt đầu xuất hiện<br /> sau mũi đầu tiên và tăng dần trong quá<br /> trình gây miễn dịch, đạt cao nhất sau 4 - 5<br /> lần tiêm kháng nguyên.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016<br /> <br /> 2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong HTKNR.<br /> <br /> Hình 2: Hiệu giá kháng thể đặc hiệu của 3 HTKNR.<br /> Hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh thỏ (T2, T3) và gà (G3) sau 5 lần gây miễn dịch<br /> đều đạt từ 128.000 - 256.000, hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh ngựa là 256.000.<br /> 3. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với kháng nguyên nọc<br /> rắn khác loài.<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> (1: nọc rắn Chàm quạp, 2: nọc rắn Lục xanh, 3: nọc rắn Hổ chúa, 4: nọc rắn Hổ đất)<br /> <br /> Hình 3: Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với nọc rắn khác loài.<br /> 81<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản