Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Bước đầu nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ............... ***...............

BÙI ANH VĂN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ

NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)

VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ............... ***...............

BÙI ANH VĂN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ

NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)

VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ MAI HƯƠNG

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã

nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình.

Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

PGS.TS Lê Mai Hương người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực

hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này.

Tôi xin đươc bày tỏ lòng biết ơn đến đề tài “Nghiên cứu metagenome của

vi sinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: cây thuốc có củ (cây

nghệ), cây công nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng”

MS: ĐTĐLCN.14/4 thuộc chương trình Hợp tác Nghiên cứu Việt Nam – Hà

Lan, do PGS.TS Lê Mai Hương chủ nhiệm đã cho tôi cơ hội được thực hiện

nghiên cứu của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo của Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôi

kiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiên

cứu luận văn, là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Đình Luyện, Ths. Hoàng Kim Chi

và tập thể cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các

Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,

những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi

yên tâm học tập hoàn thành khóa học này.

Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô, Anh, Chị và gia đình dồi dào

sức khỏe, thành công trong sự nghiệp!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

hoàn toàn trung thực, chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp

đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình

bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc./.

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................ii

MỤC LỤC ........................................................................................................... iii DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ..................................................................... v DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .................................................................................... viii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3 1.1. Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.) ........................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................. 3

1.1.2. Thành phần hóa học .............................................................................. 4 1.2. Đại cương khu hệ nấm vùng rễ ................................................................... 5 1.2.1. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae) ............................................ 5 1.2.2. Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae) ............................................. 6 1.2.3. Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) ............................ 7

1.2.4. Một số loại nấm rễ khác. ....................................................................... 8 1.2.5. Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ................................................... 8 1.2.6. Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ.......................... 10

1.3. Vai trò khu hệ nấm vùng rễ ...................................................................... 11 1.4. Nấm vùng rễ trên cây thuốc ...................................................................... 15 1.5. Một số yếu tố tác động đến khu hệ nấm vùng rễ .................................... 15

1.5.1. Ảnh hưởng của các yếu tố lý học ..................................................... 15 1.5.2. Sự tương quan giữa các nhóm vi sinh vật với khu hệ nấm vùng rễ.17

1.6. Một số nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ ............................................... 17 1.6.1. Trên thế giới ........................................................................................ 17 1.6.2. Việt Nam ............................................................................................. 21 1.7. Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu các khu hệ vi sinh vật ...... 23 1.7.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics .............................................. 23 1.7.2. Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật đất...24 CHƯƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................... 26

iii

2.1. NGUYÊN LIỆU ........................................................................................... 26

2.1.1. Mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 26 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................. 26 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................. 26

2.1.5. Môi trường ............................................................................................. 26 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ..................................................................... 27

2.2.2. Phân lập bào tử AM ............................................................................ 28 2.2.3. Phân lập chủng nấm vùng rễ ............................................................... 28 2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM ......... 29 2.2.5. Hoạt tính sinh enzyme ngoại bào ........................................................... 29 2.2.6. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 29

2.2.7. Kỹ thuật PCR ......................................................................................... 30 2.2.8. Phương pháp Tách dòng gen thông qua vector pBT ............................. 31 2.2.9. Đọc và phân tích trình tự ....................................................................... 32

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................... 34 3.1. Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh .................................................... 34

3.2. Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến khu hệ nấm AM vùng rễ Curcuma longa L. ............................................................................................ 35 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM ...................................... 38 3.4. Phân lập các chủng nấm vùng rễ khác ................................................... 42 3.4.1. Phân lập mẫu rễ ................................................................................ 42 3.4.2. Phân lập mẫu đất vùng rễ ................................................................. 43 3.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ........................................................... 45 CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 49

4.1. Kết Luận .................................................................................................... 49 4.2. Kiến nghị ................................................................................................... 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 50

PHỤ LỤC ............................................................................................................ 56

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

STT Từ viết tắt Viết đầy đủ

1 AM Endomycorrhizae

2 EM Ectomycorrhizae

3 AEM

Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn

4 SEM Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48].............................................. 3

Hình 1. 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47] ................................................................... 6

Hình 1. 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46] ................................................................ 7

Hình 3. 1: Bào tử AM phân lập từ các mẫu đất N1t và N11t ............................. 35

Hình 3. 2: Khả năng sinh enzyme ngoại bào ...................................................... 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2. 1: Trình tự mồi sử dụng cho định danh các chủng nấm ........................ 30

Bảng 2. 2: Trình tự mồi cho định danh các chủng nấm AM............................... 31

Bảng 3. 1: Số lượng bào tử AM tổng số trong 100g đất phân lập ...................... 34

Bảng 3. 2: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở

khoảng thời gian khác nhau. ............................................................................... 35

Bảng 3. 3: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở điều

kiện nitơ khác nhau. ............................................................................................ 40

Bảng 3. 4: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ rễ cây nghệ ............................ 44

Bảng 3. 5: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ cây nghệ ............. 46

Bảng 3. 6: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập 47

vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3. 1: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất ...................... 37

Biểu đồ 3. 2: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất vùng rễ ở điều

kiện bón nitơ khác nhau ...................................................................................... 41

Biểu đồ 3. 3: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập ...47

viii

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

MỞ ĐẦU

Khu hệ nấm vùng rễ là quần hợp nấm - thực vật đóng vai trò quan trọng

trong quá trình phát triển của thực vật cũng như nhiều hệ sinh thái. Hơn 90%

các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vào

mối quan hệ này để tồn tại. Chúng phát triển bằng cách phát triển hệ sợi ra vùng

đất bao quanh rễ và lan dần ra xung quanh, nhờ đó làm tăng khả năng hấp thu

dinh dưỡng, nước của hệ rễ và đồng thời làm thay đổi cấu trúc đất theo chiều

hướng có lợi. Với tầm quan trọng và ý nghĩa thiết thực hình thức cộng sinh này

đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực

tiển sản xuất nông - lâm nghiệp ở nhiều nước trên toàn thế giới.

Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ

nghệ vàng chứa tinh dầu, đặc biệt curcumin – hoạt chất quý trong y dược. Nghệ

không chỉ làm gia vị để tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làm

thuốc, có nhiều loại nghệ nhưng nhưng nghệ vàng được sử dụng phổ biến trong

công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Nghệ vàng có vị đắng cay, mùi thơm

hắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Nghệ vàng dùng

để chữa các bệnh: viêm loét dạ dày, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt

Nghệ vàng còn dùng để điều trị ung thư, tiểu đường, viêm gan B, C, kháng nấm,

chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [9]. Hoạt chất Curcumin

trong củ Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin là thành phần chính của

Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa học là (1E,6E)-1,7-bis(4-

hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5dione. Curcumin có dạng bột

màu vàng được mệnh danh như một loại thần dược có khả năng phòng chống và

chữa được rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm,

chống oxy hóa, chống ung thư - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu

ở khối u, giúp tăng cường miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn,

kháng nấm, kháng virus. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhưng

khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ thì vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu. Vì vậy

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

đây là một hướng tiếp cận mới trong nghiên cứu toàn diện về cây nghệ trong

lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài “Bước đầu nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng (Curcuma

longa L.) và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng”, trong nghiên cứu này, chúng

tôi đã sử dụng kỹ thuật metagenomics để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu

tố dinh dưỡng tới khu hệ nấm vùng rễ, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Mục tiêu nghiên cứu: Xác định mức độ đa dạng khu hệ nấm rễ AM và đánh giá

một số chỉ tiêu sinh hóa.

Nội dung nghiên cứu:

 Khảo sát khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng: Phân lập và phân loại một

số chủng nấm vùng rễ nội cộng sinh và ngoại cộng sinh.

 Đánh giá ảnh hưởng hàm lượng nitơ, thời gian thu mẫu lên sự đa dạng

khu hệ nấm vùng rễ dụng kỹ thuật phân tích dữ liệu metagenomics.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.)

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Cây Nghệ vàng còn có tên “Uất kim”, Khương hoàng. Tên khoa học là

Curcumin longa L, họ gừng (Zingiberaceae), thuộc loại cây cỏ dại cao 0,6 – 1m

thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi cắt ngang có màu vàng sẫm [9]. Cây

nghệ vàng được trồng phổ biến trong nước, tuy nhiên tập trung nhiều nhất ở

vùng Hưng Yên, Thanh Hóa, Bình Dương. Trên thế giới có nhiều ở Ấn Độ,

Indonesia, Campuchia, Lào, Trung Quốc và một số nhiệt đới khác.

Hình 1. 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48].

Nghệ vàng thuộc chi Curcuma, họ gừng. Chi này có 15 loài, trong đó ở

Việt Nam tìm thấy 14 loài. Theo các nghiên cứu gần đây, còn có nhiều loài khác

trong chi này có hoạt chất Curcumin như C.aromatica (nghệ trắng), C.zedoaria

( nghệ đen), lượng Curcumin cao nhất (cỡ 0,3%) phổ biến nhất ở Việt Nam cho

nên rất thuận lợi cho việc dùng làm nguyên liệu sản xuất Curcumin [9].

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1.2. Thành phần hóa học

Bằng các nghiên cứu khoa học đã thực hiện từ năm 1988 đến nay thành

phần hóa học của củ nghệ vàng đã được xác định là gồm các thành phần chính

như curcumin, tinh dầu, tinh bột, v.v. Sau đây là các thành phần cụ thể:

 Chất màu curcumin 0,3% - 1%, tinh thể nâu đỏ ánh tím, không tan trong

nước, tan trong cồn, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục.

- Các chất màu vàng gọi chung là curcumin. Vào đầu thế kỉ XIX người ta

đã chiết được curcumin tinh thể không tan trong nước, tan trong cồn, ete, dầu

béo. Nhưng năm 1953 Srinivasan đã chứng minh bằng sắc kí cột silic rằng đó là

hỗn hợp:

- Curcumin chính thức (còn gọi là curcumin I) chiếm 60% đây là một

dixeton đối xứng không no có thể coi như là diferuloyl-metan (axit ferulic là

axit hydroxy-4-metoxy-3-xinamic).

- Curcumin II hay demetoxy-curcumin chiếm 24% và curcumin III hay bis-

demetoxy-curcumin chiếm 14% trong đó 1 hay 2 hydroxyxinamic thay cho axit

ferulic. Nếu dùng sắc kí trên giấy sẽ thấy các chất curcumin khác nữa nhưng với

lượng rất nhỏ.

- Năm 1977, Nguyễn Khang (Đại học Dược Hà Nội) đã chiết từ bột củ

nghệ sau khi đã cất lấy hết tinh dầu bằng benzen, sau đó thu hồi dung môi trong

áp lực giảm và kết tinh bằng cồn etylic cho tới khi có độ chảy không thay đổi và

một vết trên sắc kí lớp mỏng đã thu được 0,76 – 1,1% curcumin I tinh khiết, độ

chảy 182 -183°C. Nếu chọn củ nghệ thu vào tháng 1, tháng 2 có thể đạt tới

1,5% curcumin.

 Tinh dầu 1 – 5% có màu vàng nhạt, thơm. Trong tinh dầu gồm có 25%

cacbua tecpenic, chủ yếu là zingiberen và 65% xeton sespuitecpenic, các chất

tumeron, curcumen C15H24 một cacbon không no.

 Ngoài ra còn tinh bột, canxi oxalat, chất béo. Củ nghệ chứa 8 – 10%

nước, 6 – 8% chất vô cơ, 40 – 50% tinh bột nhựa.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.2. Đại cương khu hệ nấm vùng rễ

Trong tự nhiên, giữa các sinh vật đều có mối quan hệ với nhau, ảnh hưởng

lẫn nhau tạo thành quần xã sinh vật. Trong đó, quan hệ cộng sinh là cả hai cùng

sống chung và cùng tồn tại. Khi mối quan hệ đó phát triển đến mức độ cao thì

hình thành một loại cộng sinh. Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấm

trong đất với rễ của thực vật bậc cao, đây là mối quan hệ cộng sinh không thể

tách rời, ảnh hưởng đến nhau: Nấm không có rễ thì không thể tồn tại, cây không

có nấm thì sinh trưởng phát triển kém và chết. Sự cộng sinh giữa khu hệ nấm và

rễ cây mang lại lợi ích cho cả hai bên. Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên

được Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức – đưa ra vào năm 1885 để chỉ

mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh [35]. Thuật ngữ này

bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ).

Người ta thường chia khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ thành 3 loại:

nẫm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh.

Ngoài ra, còn có một số loại khác.

1.2.1. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae)

Nấm rễ nội cộng sinh là nấm với thể sợi nấm xuyên qua các tế bào rễ,

thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo

lớp vỏ bao ngoài rễ. Đặc trưng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của

rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lưới Hartig. Dựa vào

kết cấu sợi nấm có vách ngăn và vòi hút, người ta chia nấm nội cộng sinh thành

2 loại:

- Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM)

- Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải

phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và

chùm (Arbuscular).

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

So với nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh rất ít loài. Năm 1989, chỉ

mới phát hiện 133 loài nấm rễ nội cộng sinh [39]. Con đường xâm nhập của

nấm rễ nội cộng sinh:

Giai đoạn 1: Thiết lập điểm tiếp xúc và phát triển dọc theo bề mặt của rễ.

Giai đoạn 2: Một hoặc nhiều sợi nấm hình thành chỗ phồng thâm nhập vào

tế bào biểu bì hoặc tế bào vỏ để vào rễ.

Hình 1. 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47]

1.2.2. Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae)

Nấm rễ ngoại cộng sinh là nấm có sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡng chưa

hóa gỗ, không xuyên qua các tế bào mô rễ mà chỉ kéo dài giữa các tế bào. Đây

là một loại nấm hình thành mạng lưới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô

sợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút.

Nấm rễ ngoại cộng sinh thường có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận

thấy bằng mắt thường). Đặc trưng cơ bản của chúng là:

 Trên bề mặt rễ dinh dưỡng hình thành một màng nấm (mantle) do các sợi

nấm đan chéo nhau.

 Giữa các tế bào tầng vỏ rễ hình thành một mạng lưới do thể sợi nấm sinh

trưởng mà thành.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

 Do tác dụng của nấm rễ, bộ rễ ngắn, to, giòn và có màu sắc khác nhau,

tán rễ và biểu bì không có lông hút, bề mặt màng có nhiều sợi nấm kéo

dài ra.

Guo Xiuzhen và cộng sự đã phát hiện 140 loài, danh sách các loài, chi, họ,

nấm ngoại cộng sinh thường hình thành thể quả trên mặt đất như nấm gan bò

(Boletus), nấm bao ngỗng (Amatina), nấm tán đỏ (Russula), nấm da

(Thelephora), nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm cổ ngựa đậu màu

(Poisolithus)…[11]. Con đường xâm nhập của nấm rễ ngoại cộng sinh:

Giai đoạn 1: Sợi nấm tiếp xúc, nhận biết và bám chặt các tế bào biểu bì rế

ở gần đỉnh rễ của rễ non tích cực phát triển.

Giai đoạn 2: Ở giai đoạn này sự xâm nhập các sợi nấm hình thành lớp

phủ dày đặc trên bề mặt rễ.

Hình 1. 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46]

1.2.3. Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza)

Nấm rễ nội ngoại cộng sinh mang đặc trưng của 2 loại nội cộng sinh và

ngoại cộng sinh về hình thái cũng như sinh lý. Chúng thường có ở các rễ cây

thông (Pinaceae), cây Cáng lò (Betula alnoides), Đỗ quyên quả mọng (Arbutus)

và các cây thuộc họ Lan thủy tinh (Monotropaceae) [5].

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.2.4. Một số loại nấm rễ khác.

 Nấm rễ giả (Pseudo mycorrhiza): nấm rễ giả thường xuất hiện ở cây lá

kim, đặc biệt là các cây con vàng yếu, hoặc vườn ươm thiếu ánh sáng, có lúc

trên cây có phân bón nhiều. Loại này không có lưới Hartig và màng nấm nhưng

trong tế bào rễ vẫn có sợi nấm nội sinh. Có tác giả cho rằng sự hình thành sợi

nấm giả là do rễ nấm ngoại cộng sinh thoái hóa dần rồi do nấm gây bệnh xâm

nhiễm mà hình thành. Những nấm gây bệnh này không ảnh hưởng lớn đến cây.

 Nấm rễ ngoại vi (Peritrophic mycorrhiza): là nấm chỉ phủ một lớp lưới

sợi thưa ở bề mặt ngoài của rễ nhưng không xâm nhiễm vào rễ cây hoặc xâm

nhiễm ở mức nhẹ. Jan-Eriknylund cho rằng đó là giai đoạn đầu của lưới Hartig.

Theo Piche (1982) từ khi có lưới thưa đến khi có lưới Hartig chỉ mất 5-14 ngày.

Hiện tượng này không ảnh hưởng gì đến cây [16, 23].

1.2.5. Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ

 Nấm rễ nội cộng sinh:

Cũng như nấm ngoại sinh, sự xâm nhiễm của nấm rễ nội cộng sinh đến từ

bào tử. Bào tử trong đất, trong điều kiện thích hợp nẩy mầm, sinh trưởng, mọc

ra ống mầm, rồi hình thành sợi nấm vách dày có đường kính 20–30 µm, còn sợi

nấm sau khi tiếp xúc hình thành sợi nấm vách mỏng, đường kính chỉ 2–7 µm,

chất kích thích sinh trưởng nấm rễ do bộ rễ tiết ra làm cho những sợi này hướng

về rễ cây, tiếp xúc nhanh với rễ cây. Sau khi tiếp xúc chúng hình thành vòi bám

tạo thành điểm xâm nhiễm và thành “dùi sợi nấm” chọc thủng vỏ rễ. Điểm xâm

nhập thường cách đuôi rễ 0,5 –1 cm, rồi liên tục hình thành nấm rễ nội cộng

sinh mới. Nói chung điểm xâm nhiễm nấm rễ nội cộng sinh là vỏ rễ cây hoặc

qua lông hút mà nhiễm vào.

Khả năng xâm nhập của nấm rễ nội cộng sinh phụ thuộc rất lớn vào mức

độ già, non của lông hút và loài cây chủ. Rễ cỏ 3 lá (Trifolim repens) thường

phải sau 3 tuần, bạch đàn và cam quýt thường phải sau 1 tháng mới bắt đầu xâm

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

nhiễm. Về tỷ lệ xâm nhiễm người ta thường lấy ngô làm đối chứng, sau 2 tuần

tỷ lệ xâm nhiễm là 23 – 27%.

Cơ chế sợi nấm xuyên qua vách tế bào tầng bỏ rễ đến nay vẫn chưa rõ. Có

tác giả cho rằng sợi nấm hình thành dùi, có tác giả lại cho rằng sợi nấm sản sinh

enzyme. Nói chung, sợi nấm không xuyên qua tế bào phân sinh, cũng không

qua rễ cây có nốt sần cây họ Đậu [27].

Thể sợi nấm sau khi xâm nhập vào rễ có thể sinh trưởng nhanh len lỏi giữa

các tế bào rồi mới vào trong tế bào, cũng có thể phát triển giữa các tế bào,

nhưng không hình thành lưới Hartig như nấm ngoại sinh.

Sợi nấm sau khi vào trong tế bào liền bao quanh lấy nguyên sinh chất,

phân nhánh hình thành vòi hút, nhưng màng tế bào vẫn bao lấy nhánh sợi nấm

và nguyên sinh chất. Cuộc sống sợi nấm trong tế bào rất ngắn chỉ mấy ngày đến

mười mấy ngày là bị phân giải, nhưng tế bào nhiễm nấm vẫn sống và bị nhánh

sợi nấm khác tạo ra sợi nhánh mới. Cho nên, trong tế bào ta phát hiện cả sợi

nhánh, cả xác sợi nấm.

Có trường hợp sợi nấm xâm nhập vào tầng vỏ ngoài không phân nhánh.

Chúng chỉ phân nhánh ở tầng giữa và tầng trong của vỏ cây. Nhánh sợi nấm

trong tế bào rất nhỏ chỉ 0,5 – 1,0µm. Chỗ phân nhánh là nơi trao đổi chất dinh

dưỡng giữa nấm và rễ. Bởi vì ở gốc nhánh sợi nấm người ta phát hiện nhiều hạt

đường và giọt dầu, và trong dịch bào phát hiện có muối photphorat và một số

hợp chất hòa tan. Nhánh phân ra bị phân giải lại cung cấp cho rễ cây sử dụng

[5].

 Nấm rễ ngoại cộng sinh:

Theo quan điểm bệnh lý học, quá trình hình thành nấm cộng sinh cũng như

quá trình xâm nhiễm, chia ra các giai đoạn: tiếp xúc, xâm nhập, ủ bệnh hay phát

triển và xuất hiện. Trong đất hình thành nhiều bào tử nấm, sợi nấm, xâm nhiễm

vào bộ rễ, làm cho rễ cây ngừng sinh trưởng, phình lên và hình thành bao nấm,

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

sau đó sợi nấm phân nhánh thành bao. Sợi nấm xâm nhiễm vào tầng vỏ của rễ

dinh dưỡng, giữa tế bào hình thành mạng lưới gọi là lưới Hartig [5].

Trong một số trường hợp chúng không theo trình tự như trên mà hình

thành ngay lưới Hartig rồi hình thành bào sợi nấm, hoặc có lúc không hình

thành cả 2 loại này. Phần lớn nấm rễ chỉ cộng sinh với rễ dinh dưỡng. Từ hạt

nảy mầm ra lá thật, cây con sinh trưởng nhờ dinh dưỡng được cung cấp từ hạt,

còn sau đó cây cần dinh dưỡng trong đất. Giai đoạn này nếu bộ rễ tiếp xúc với

nấm rễ, thì sự hình thành rễ - nấm rất nhanh và rất có lợi. Cho nên những năm

gần đây, nhiều người dùng phương pháp cấy nấm vào cùng lúc cây con mới nảy

mầm ra lá thật và có thể đạt được mục đích rễ - nấm hóa cây mầm.

1.2.6. Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ

Do sự chọn lọc và tính thích nghi khác nhau, phạm vi tồn tại cây chủ khác

nhau. Một số loài nấm hình thành trên nhiều loài cây. Một số loài chỉ cộng sinh

trên một vài loài cây. Chengming (1995) chia những loài sống trên 5 loại cây

gồm 10 loài thuộc Amanita, Cantharenlus; những loài sống trên 2 – 3 loại cây

như Boletus, Ramaria; chỉ sống trên 1 loại cây có Suillus, Russula.

Có loài như Pisolithus tinctorius sống trên 72 loài cây, nấm mục rỗng mọc

đất (Cenococcum geophyllum) mọc trên 75 loài cây hạt trần.

Cùng một loài nấm nhưng chủng khác nhau cũng có tính chuyên hóa khác

nhau. Nấm Lactarius deliciosus có 3 kiểu chuyên hóa khác nhau (thông, vân

sam, lãnh sam). Có loài phạm vi cây chủ rất hẹp là nấm bụng màu trắng

(Hymenogaster albellus) chỉ có ở cây Bạch đàn.

Ngoài việc chọn loài cây thích hợp, các loài cây khác nhau có lúc cũng

chọn nấm thích hợp. Một số loài cây có thể dùng nhiều loài nấm khác nhau để

hình thành rễ nấm, thậm chí trên rễ của một loài cây có rất nhiều loài nấm cộng

sinh. Có nhiều loài cây như Thông 5 lá, Dương, Bạch đàn không có tính chuyên

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

hóa cao đối với nấm rễ. Bạch đàn Úc tự nhiên đã thu thập được 400 loài nấm

cộng sinh trên 81 chi Bạch đàn [3, 32].

Ngược lại, có nhiều loài nấm rễ có tính chuyên hóa rất mạnh, như nấm

ngoại cộng sinh trên họ cây Long não. Nếu như nấm cổ ngựa hạt đậu cấy lên

cây con giâm hom sẽ không hình thành rễ - nấm [3].

Nhiều nước Đông Nam Á như Indonesia, Malaysia, Philippin, Thái Lan,

Srilanca đều mở rộng nghiên cứu về nấm rễ cộng sinh với họ cây long não –

loài cây tượng trưng cho rừng mưa nhiệt đới. Chủ yếu là nấm mỡ sáp (Laccaria

laccuta) và nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm cổ ngựa đậu màu. Thái

Lan có 68 loài. Calimantan có 60 loài, Philippin có 14 loài… [18]

Những loài cây khác nhau, các giai đoạn phát triển khác nhau, loài nấm

cộng sinh cũng không hoàn toàn như nhau, nói chung những cây rừng non

lượng rễ - nấm rất ít, rừng già trưởng thành số loài chiếm nhiều nhất, nhưng

rừng quá già lại rất ít. Tổ thành quần thể nấm rễ thường thay đổi nấm Boletus và

Amanita thay thế dần nấm cổ ngựa vỏ cứng và chiếm dần ưu thế [18]. Không

những thế chúng biểu hiện sự giao thoa nhau. Ví dụ trên cây Bạch đàn và cây

Dương, lúc cây còn non sự xuất hiện nấm rễ nội cộng sinh là chính, nhưng đến

tuổi lớn nấm ngoại sinh lại chiếm ưu thế, cuối cùng là nấm ngoại cộng sinh thay

thế. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là do đặc tính sinh lý của cây ở các

giai đoạn khác nhau [3,7].

1.3. Vai trò khu hệ nấm vùng rễ

Nấm vùng rễ (đặc biệt nhóm nấm AM – arbuscular) là thể sống cộng sinh

bắt buộc, có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống của thực vật ở cạn, chúng có

vai trò thực tiễn trong nền kinh tế, khoa học và các chu trình vật chất, năng

lượng trong tự nhiên. Những hoạt động của nấm cũng như của thực vật có vai

trò hỗ trợ cho nhau. Nấm sử dụng nguồn cacbon từ thực vật dưới dạng đường

hexoses và các vitamin. Sự vận chuyển cacbon từ thực vật sang nấm được thực

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào. Tại các sợi nấm nội bào diễn ra

quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose, lipid…

cho hoạt động của nấm. Gần 20% cacbon do thực vật tổng hợp được chuyển

sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc từ thực vật được nấm biến đổi và

dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng thêm nguồn hữu

cơ trong đất.

 Tăng khả năng hấp thụ phốt pho và dinh dưỡng của cây chủ.

Lợi ích của AM đối với thực vật chủ yếu là tăng cường cải thiện hấp thụ

các chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng nhất là tăng cường hấp thụ

dinh dưỡng lân (P) (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây được

cung cấp nhờ nấm) [37]. Sợi nấm có thể lan rộng đến 8 cm quanh rễ và hấp thụ

chất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh

dưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần. Tốc độ thâm nhập của P qua sợi nấm cao

gấp 6 lần so với qua các lông rễ [8].

Trong đất luôn có lượng phốt pho nhất định, những gốc phốt phát khó hoạt

động, do kết hợp với Fe, Na, Al cố định trong đất mà thành các photpho không tan,

cây không thể hấp thu chúng. Số photpho đó có đến 1/2 - 1/3 thậm chí đến 95 – 99%,

chỉ có một lượng rất ít photpho hòa tan được cây sử dụng. Lông hút của rễ chỉ hút một

ít photpho hòa tan quanh rễ và xuất hiện hiện tượng thiếu photpho giả [8].

Nấm rễ nội sinh làm nhiệm vụ sản sinh enzyme Phosphatase chuyển

photpho không tan thành photpho hòa tan, cung cấp cho cây trồng. Hoạt tính

của enzyme tăng gấp mấy lần so với cây không có nấm rễ. Ngoài ra, nấm rễ có

thể sản sinh muối oxalat kết hợp với Fe, Al, muối P không tan trong đất, từ đó

mà làm tăng khả năng hút P của rễ cây [8].

 Hình thành chất kích thích sinh trưởng.

Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, nấm có vai trò kích thích sinh trưởng

thực vật bằng cách tiết ra rất nhiều các chất kích thích sinh trưởng như auxins,

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

cytokinins, axit gibberellic và một số chất kháng sinh để bảo vệ cây chủ chống

lại các mầm bệnh từ trong đất [33, 37].

 Nâng cao sức chống chịu và thích nghi với môi trường của cây trồng

Nấm rễ tham gia vào nhiều hoạt động có lợi cho cây trồng giúp cây sinh

trường và phát triển tốt. Mạng lưới rộng lớn của rợi nấm rất quan trọng trong

việc hấp thụ và lưu giũ nước. Trong điều kiện hạn hán, nấm rễ thực vật chịu hạn

hán tốt hơn thực vật không có nấm rễ [45].

Sự cộng sinh của nấm rễ nội cộng sinh có thể làm tăng cường sinh trưởng

của cây con lên đến 400%, giúp cây có khả năng chống chịu với điệu kiện khô

hạn và nghèo dinh dưỡng [14]. Ngoài ra, nấm rễ nội cộng sinh còn làm tăng khả

năng hấp thụ nước của rễ cây và bảo vệ rễ khỏi nguồn bệnh [14].

Thực tế ở những loài gỗ lớn có nấm rễ nội cộng sinh cho thấy cây vẫn tồn

tại và sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm rất thấp trong khi những cây không có

cộng sinh thì không sống được hoặc sinh trưởng yếu. Kết quả nghiên cứu cũng

cho thấy, sinh trưởng của cây con những loài gỗ lớn có sự cộng sinh đạt ngang

với cây không có sự cộng sinh nhưng chúng chỉ sử dụng lượng dinh dưỡng bằng

một nửa. Những loài sống phụ thuộc vào nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu là ở

những nơi đất chặt, khô cằn, có hệ rễ ít phân nhánh vì lúc đó lượng chất dinh

dưỡng tồn tại nhiều ở dạng khó tiêu, rễ cây không thể hấp thụ được mà phải nhờ

đến sự lan rộng của hệ sợi nấm [12].

 Cải thiện môi trường xung quanh

Nhiều nghiên cứu thăm dò điện tử chứng minh xung quanh rễ những cây

thông xuất hiện tầng kết dính rộng gấp nhiều lần so với cây thông không có nấm

rễ cộng sinh, tầng đó tạo ra khu trao đổi ion, bộ rễ tăng khả năng hấp thụ và vận

chuyển cây chủ, có lợi cho sinh trưởng phát triển của cây trồng.

Nấm rễ nội cộng sinh tạo ra các hợp chất hữu cơ Humic và “keo”

(polysaccharides ngoại bào) ràng buộc đất lại với nhau và cải thiện kết cấu đất. Kết

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

cấu đất ảnh hưởng hưởng tích cực đến sự tăng trưởng bằng cách thúc đẩy thông

khí, nước chuyển động vào đất, tăng trưởng gốc, phân phối dinh dưỡng [14].

Nấm rễ nội cộng sinh không chiếm tỷ lệ cao trong đất nhưng có vai trò

quan trọng trong việc điều chỉnh đặc tính sinh học của đất nhờ sự phân bổ rộng

khắp của hệ sợ nấm trong lớp đất tầng mặt. Nấm rễ nội cộng sinh có khả năng

hấp thụ trực tiếp các chất carbon do cây cố định và cấu thành đầu vào chính của

carbon và năng lượng trong đất, chúng phân phối lượng carbon này khắp cả khu

vực đất quanh rễ cây cho vi sinh vât sử dụng [43]. Lượng cacbon đáng kể được

vận chuyển bằng hệ sợi nấm từ cây này sang cây khác đã được xác định. Điều

này giúp giảm sự cạnh tranh giữa các loài khác nhau và góp phần vào tính ổn

định và đa dạng của hệ sinh thái.

Ngoài ra, trong đất có chứa ion Fe3+ ở dạng khó hòa tan. Nấm rễ nội công sinh đã tiết ra một hợp chất đặc biệt có khả năng hấp thụ mạnh ion Fe3+ và biến

đổi thành dạng dễ tan giúp cây dễ dàng sử dụng [35].

AM tham gia vào biến đổi mối quan hệ đất - cây - nước, tăng cường sự

thích nghi của thực vật với các điều kiện bất lợi (khô hạn, nhiễm kim loại). Ở

những nơi có hàm lượng kim loại nặng cao, AM có vai trò khử độc môi trường

giúp cây sinh trưởng tốt. Bắt đầu từ cải thiện hấp thụ nước và các chất dinh

dưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng của cây sẽ dẫn tới tăng hiệu suất quang

hợp, sự vận chuyển chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất của cây. Cây sinh

trưởng nhanh, giảm bớt việc sử dụng phân bón hóa học (đôi khi lên tới một nửa

lượng dự kiến) dẫn tới tăng thu nhập cho nông dân. Kết quả thử nghiệm phân

bón sinh học mycorrhiza trên cây Asparagus đã chứng minh được điều đó, khi

những nông dân sử dụng lượng phân bón hóa học cùng với phân bón sinh học

mycorrhiza thì năng suất cây trồng được cải thiện hơn 50% và thu nhập của

nông dân tăng 61% so với khi sử dụng chỉ mỗi phân bón hóa [33, 37].

 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Năm 1942 Davis phát hiện nấm rễ ngoại cộng sinh có thể làm giảm bớt

bệnh hại rễ. Các năm 1968, 1982, 1994 nhiều tác giả đều đề cập đến nấm cộng

sinh có thể giảm bệnh thối cổ rễ của thông xuống 25%, chúng không chỉ phòng

trừ bệnh mà còn xúc tiến sinh trưởng cây con, các bệnh tuyến trùng, bệnh mốc

sương, bệnh bướu rễ đều giảm đi rõ rệt [33].

1.4. Nấm vùng rễ trên cây thuốc

Tất cả các cây thuốc ở nhiều nước trên thế giới đều chứa những khu hệ

nấm rễ. Những khu hệ nấm rễ này có thể tổng hợp các chất giống như thuốc từ

cây chủ, hoặc tổng hợp nên một sản phẩm chứa một hay nhiều hợp chất có cấu

trúc hóa học gần giống như thế, tức là tương tự như thuốc từ cây thuốc mà nó

nội sinh. Ví dụ như trường hợp của các subglutinol do Fusarium subglutinans

tạo thành; nấm nội sinh vùng rễ này được phân lập từ một cây thuốc nổi tiếng

của Trung Quốc có đặc tính ức chế miễn dịch và khá tương đồng về mặt cấu

trúc với những hoạt chất đã biết của cây này [24].

1.5. Một số yếu tố tác động đến khu hệ nấm vùng rễ

Theo Bạch Phương Lan (2004), khu hệ nấm vùng rễ có thể bị ảnh hưởng

bởi các yếu tố sau:

1.5.1. Ảnh hưởng của các yếu tố lý học

- Nhiệt độ:

Để phát triển mỗi một sinh vật phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất

định. Ngoài khoảng nhiệt độ đó, vi sinh vật sẽ bị hạn chế sự phát triển. Nhiệt độ

thường gây cho khu hệ nấm những chiều hướng sau: Đối với nhiệt độ thấp

thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả năng chuyển

hoá các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các hệ enzym, dẫn đến thay đổi khả

năng trao đổi chất của chúng, vì thế các thành phần trong khu hệ nấm vùng rễ

mất khả năng phát triển và sinh sản, nhiều trường hợp dẫn chết. Khả năng gây

chết từ từ chứ không xảy ra đột ngột như ở nhiệt độ cao. Đối với nhiệt độ cao

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

thường gây chết một cách nhanh chóng. Đa số vi sinh vật bị chết ở 60°C - 80°C.

Một số khác chết ở nhiệt độ cao hơn. Đặc biệt bào tử có khả năng tồn tại ở nhiệt

độ lớn 100°C. Nhiệt độ cao thường gây biến tính protein, làm hệ enzym lập tức

không hoạt động được, vi sinh vật trong khu hệ nấm dễ dàng bị tiêu diệt.

- Độ ẩm:

Nước chiếm một tỷ lệ quan trọng trong hầu hết các thể sống. Nước giúp

hòa tan các chất dinh dưỡng trong nước và được hấp thu vào tế bào, mọi phản

ứng sinh hóa trong tế bào cần có nước mới xảy ra được. Không những thế, độ

ẩm còn ảnh hưởng đến hầu hết các hoạt động sống của vi sinh vật. Có những

loài thích nghi với môi trường ngập nước, có những loài có khả năng chịu khô

hạn cao. Nhưng phần lớn các vi sinh vật có khả năng phát triển mạnh ở độ ẩm

60-70%. Do ở độ ẩm này trong đất đã đạt được lượng nước và không khí cần

thiết. Nếu độ ẩm cao hơn, thì lượng khí trong đất sẽ bị thải ra, dẫn đến thiếu

không khí sẽ ức chế sự phát triển của khu hệ nấm. Tuy nhiên, trong điều kiện

khô hạn thì hầu như mọi quá trình sinh hóa đều bị trì trệ.

- Ánh sáng:

Hầu hết các thành phần trong khu hệ nấm vùng rễ phát triển tốt trong điều

kiện thiếu ánh sáng (do không có sắc tố quang quang hợp nên hình thức dinh

dưỡng của nấm là dị dưỡng hoại sinh). Ánh sáng trực tiếp của mặt trời và các tia

tử ngoại có thể gây ra những quá trình quang oxy hóa trong nguyên sinh chất tế

bào, đặc biệt là các nucleic acid. Dưới tác dụng của các bức xạ này các phản

ứng hóa học trong tế bào bị phá vỡ, vi sinh vật có thể bị tiêu diệt.

- Thành phần cơ học của đất:

Phần sinh khối chủ yếu của khu hệ nấm rễ có đến 90-99% được gắn với

pha rắn của đất, do các tiểu phần của đất ở pha rắn hấp thụ mạnh tế bào của vi

sinh vật. Tuy nhiên khả năng hấp thu này không cố định mà nó còn phụ thuộc

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, độ phân tán cũng như kích thước của

tiểu phần đất, mùa trong năm… các tiểu phần tự nhiên trong đất thì luôn có kích

thước không đều nhau, các tiểu phần càng lớn tích lũy càng nhiều chất hữu cơ,

nhiều chất dinh dưỡng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của khu hệ

nấm vùng rễ. Chính điều này đã góp phần quan trọng trong sự phân bố của các

thành phần khu hệ nấm rễ trong đất.

1.5.2. Sự tương quan giữa các nhóm vi sinh vật với khu hệ nấm vùng rễ

Ngoài những tác động của các điều kiện tự nhiên lên hoạt động sống của

khu hệ nấm vùng rễ, thì tác động của các yếu tố sinh học trong cùng hệ sinh thái

cũng ảnh hưởng phần không nhỏ như: sự hiện diện của các loài vi sinh vật khác,

các sản phẩm mà chúng tạo ra trong quá trình sống, tạo thành các chất ức chế

các hoạt động sống…của một loài vi sinh vật nào đó như:

+ Vi sinh vật nitrat hóa chỉ có thể tồn tại và phát triển trong đất, khi ở đó

có nhiều ammoniac, chất này là sản phẩm hoạt động sống của nhóm vi sinh vật

hoại sinh, từ sự phân hủy protein.

+ Actinomyces với một số loài vi nấm khác tạo thành kháng sinh dẫn đến

ức chế hoạt động sống, thậm chí tiêu diệt một số nhóm vi khuẩn, vì thế mà các

nhóm này không thể sống nơi có mặt của Actinomyces và các vi nấm khác.

+ Sự hiện diện của loài Phytonematode (tuyến trùng gầy bệnh) dẫn theo sự

hiện diện của nhiều loại vi nấm, các loài nấm này thường bắt tuyến trùng bằng

cách: lưới, vòng thắt hay chất nhầy dính dẫn đến sợi nấm sẽ cắm vào thân tuyến

trùng, tiết ra enzyme phân hủy tuyến trùng biến thành chất dinh dưỡng cho

mình.

1.6. Một số nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ

1.6.1. Trên thế giới

Nấm rễ (mycorrhizae) được biết tới từ khoảng hơn 400 triệu năm trước kể

từ khi con người bắt đầu quan sát sự phát triển của cây trong quá trình trồng

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

trọt. Sự hội tụ giữa nấm cộng sinh ở bộ rễ và cây trồng là sự liên quan hỗ sinh

phổ biến nhất trong tự nhiên và trong trồng trọt.

Cho đến nay nấm rễ được biết đến khoảng trên 200 loài được mô tả trong

khuôn khổ ngành mới Glomeromycetes. Tuy nhiên mới chỉ 4 bộ, 13 họ và 19

loài được nhận biết.

Vì tính ưu việt của khu hệ nấm vùng rễ nên đã được các nhà khoa học ở

khắp nơi trên thế giới nghiên cứu từ hơn 20 năm nay trên nhiều loại thực vật và

cây trồng khác nhau như: Cỏ phấn hương (ragweed), Black truffle, cây thông,

cây ngô, cây dã yên thảo (Petunias), hoa lan, cỏ ba lá, các loại cây ăn quả như

cam, chanh, táo…

Các nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ trên thế giới chủ yếu tập trung về

nghiên cứu khả năng tác dụng lên cây trồng, cách thức tác động lên cây trồng,

tương tác giữa với các loại vi khuẩn khác trong đất, khả năng giúp cây hấp thu

các chất dinh dưỡng, khả năng ứng dụng cũng như sản xuất nó.

Vai trò quan trọng của nấm vùng rễ trong sản lượng cây trồng nông nghiệp đã

được nghiên cứu khá phổ biến. Nấm vùng rễ là nhà điều phối chất dinh dưỡng cho

cây,thúc đẩy sự đồng hóa phốt pho cũng như các ion khác như kẽm, đồng, nitơ,

bảo vệ cây khỏi các nấm gây bệnh khác và tuyến trùng, làm tăng chất lượng đất và

giúp cây chủ kháng chịu sự tác động của các kim loại nặng [17].

Ngoài ra, kết quả phân tích phân tử cho thấy khu hệ nấm có tính đa dạng

gen không cao .Tuy nhiên, nấm có tính độc lập sinh thái vùng, tính giàu về

chủng loại các loài NNSR bị giảm theo cường độ sử dụng đất. Sự suy giảm về

quần thể này phụ thuộc vào các chế độ canh tác, sự lạm dung phân hóa học và

thuốc trừ sâu [15]. Ngoài ra là tính chất đất, sự thay đổi về mùa vụ, loại cây

trồng… cũng tác động đáng kể đến quần thể nấm rễ [41].

Vai trò của nấm rễ lên sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng được

nghiên cứu bởi nhiều tác giả. Nấm rễ được xem như yếu tố thúc đẩy làm tăng

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

trưởng cây (growth promoter). Chẳng hạn chủng nấm Piriformospora indica

được phát hiện bởi Verma et al., 1998 là một yếu tố làm tăng trưởng thực vật

mới là thành viên thuộc nấm đảm Basidiomycotina. Chủng này đặc trưng bởi sự

hình thành các hậu bào tử có vách dày dạng quả lê. Các tài liệu liên quan đều

cho thấy P. indica có tiềm năng to lớn cho sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật bởi

khả năng tạo các khuẩn lạc trên rễ cây [30]. P. indica có nhiều đặc tính quí

giống với các nấm rễ khác nhưng lại có điểm khác với nấm rễ là có thể nuôi cấy

trên môi trường nhân tạo. Khởi đầu là các nghiên cứu trên các đối tượng Zea

may, Nicotina tabacum, glycine max, Pisum satium. Về sau chủng nấm này

được nghiên cứu và đánh giá trên cây thuốc đã cho thấy sự tăng trưởng khi gây

nhiễm trên cây Withania somnifera và Spilanthes calva và sau đó là trên cây

thuốc Adhatoda vasica Nees [30].

Vai trò của nấm rễ còn thể hiện như một yếu tố kích thích cây sản sinh ra

các chất có hoạt tính tự bảo vệ mình thường được gọi là các phytoalexin.

Muraleedharan G.Nair et al., 1991 đã khảo sát vai trò của nấm rễ trên rễ cây

Trifolium repens trong việc kích thích cây chủ sinh ra các chất có hoạt tính kích

thích sinh trưởng của nấm rễ, chủng Penicillium digitatum và ức chế chủng gây

bệnh Rhizoctonia sp. khi nuôi cấy in vitro.

Ngoài ra là các nghiên cứu về khả năng kháng chịu và giúp cây chủ kháng

chịu sự nhiễm kim loại nặng của chính tác giả Posta Katalin và CS, 2006 cũng

đã cho thấy rõ vai trò của nấm rễ trong bảo vệ cây chủ tránh các điều kiện bất

lợi của môi trường.

Trong những năm 1980, sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô rễ đã mở ra

một hướng đi mới,cho phép nuôi cấy thành công một số chủng AM trong điều

kiện invitro. Sử dụng phương pháp này nấm AM và rễ cây được nhân lên đồng

thời và nhanh chóng qua một số lần cấy chuyển, thời gian được rút ngắn rất

nhiều và đảm bảo được độ thuần khiết cao.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Tháng 1 năm 2009, nhóm tác giả Venter,Marianne,Wilma đã báo kết quả

nghiên cứu trình bày thông tin khá đầy đủ và toàn diện và nhân nhanh AM-

invitro bao gồm:phương pháp tạo cộng sinh AM, nhân nhanh bào tử trong môi

trường invitro,các bước phân lập bào tử từ môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu

cũng đã tạo được thể dạng hạt chứa các bào tử có nhiều đặc điểm như mật độ

bào tử cao,có tính ổn định và phân tán tốt trong môi trường đất. Hạt chứa bào tử

có thể áp dụng trong sản xuất nông lâm ngư nghiệp như một loại chế phẩm có

thể dùng trực tiếp. Nghiên cứu cũng đề cập đến một số thành phần có thể bổ

sung vào dạng hạt này làm tăng tác dụng ở hiện trường như chất kích thích sinh

trưởng, các chất trao đổi thứ cấp.

Sanders là một chuyên gia về nấm mycorrhiza, khi cây được nấm đến sống

nhờ, ông nhận thấy cây lớn nhanh hơn vì nấm mang đến cho cây chất dinh

dưỡng thiết yếu là photphat. Photphat là nguồn lân đã góp phần làm nên cuộc

cách mạng xanh vào giữa thế kỷ 20 và đã thoả mãn được nhu cầu lương thực

cho toàn thế giới hồi đó. Sanders và các đồng nghiệm đang kiểm tra hiệu quả

những sản phẩm của mình tại bang Colombia trên những cánh đồng trồng khoai

tây và thấy chúng có thể cung cấp không dưới 50% lượng photphat mà cây cần.

Ông khẳng định: “Nghiên cứu tại Colombia cho thấy loại nấm này sẽ đạt hiệu

quả cao đối với những nước nhiệt đới”."(Loài nấm thay thế phân bón - Theo báo

Vietnamnet).

Đã có nhiều website công bố và quảng cáo về vai trò của nấm rễ với cây

trồng và các sản phẩm dung trong nông nghiệp như Myco.com hay Agrobio của

Hungary với các sản phẩm nổi tiếng được sản xuất từ các nấm rễ đã được

thương mại hóa. Hội nghị của ủy ban châu Âu về vấn đề này cũng được tổ chức

thường niên tại các nước châu Âu và chủ yếu là ở Hungary.

Tuy nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng hiện nay các chế phẩm từ

nấm rễ mới được bán rộng rãi ở các nước có nền khoa học phát triển ở châu Mĩ,

châu Âu và châu Đại Dương.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.6.2. Việt Nam

Việc phát triển nghiên cứu ứng dụng công nghệ nấm rễ trong nông, lâm

nghiệp phục vụ cây trồng và phục hồi sinh thái là một hướng đi quan trọng, phù

hợp với những nỗ lực phát triển trên thế giới. Vì vậy ở Việt Nam đã có một số

kết quả nghiên cứu bước đầu về mycorrhiza.

Tác giả Nguyễn Sĩ Giao đã nghiên cứu ứng dụng nấm rễ EctoMycorrhiza

cho sản xuất cây thông nhựa vườn ươm có chất lượng cao thông qua việc sử

dụng chất nhiễm tự nhiên (đất rừng thông) và tuyển chọn cho sản xuất nhiễm

(1981-1985). Do trình độ phát triển công nghệ nên kết quả còn hạn chế, chưa

đáp ứng được nhu cầu sử dụng chế phẩm một cách hiệu quả với số lượng lớn

cho sản xuất ươm và rừng trồng.

Phạm Quang Thu (2001-2004) với đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm

nấm nội cộng sinh đa chủng cho cây lâm nghiệp. Đề tài đã nghiên cứu sản xuất

chế phẩm nấm cộng sinh cho thông và bạch đàn dưới dạng bột chứa bào tử hữu

tính của nấm Pisolithus tinctorius và một số vi sinh vật chức năng. Hiệu quả của

chế phẩm khi nhiễm cho Bạch đàn PN2 trồng trên các lập địa thoái hóa cho thấy

có sự khác biệt rõ rệt với đối chứng.

Phạm Quang Thu & cs (2006-2007), đã nghiên cứu, phân lập một số chủng

nấm ngoại sinh rễ (NNSR- ectomycorhizal) trên cây lâm nghiệp. Kết quả

nghiên cứu là thu thập và giám định được 33 mẫu nấm ngoại cộng sinh, trong

đó có 16 loài cộng sinh với thông, 14 loài cộng sinh với bạch đàn và 3 loài cộng

sinh với cả thông và bạch đàn. Trong số 33 loài có 15 loài có khả năng phân lập

và nuôi cấy thuần khiết trong môi trường nhân tạo (6 loài cộng sinh với thông, 6

loài cộng sinh với bạch đàn, 3 loài cộng sinh với cả thông và bạch đàn). Tỷ lệ

thành công trong phân lập nấm ngoại cộng sinh với thông là 40%, với bạch đàn

là 42,9%. Tốc độ sinh trưởng nấm của các loài tương đối khác nhau, có 4 loài

nấm sinh trưởng nhanh, 8 loài trung bình và 3 loài sinh trưởng chậm. Đây là

nguồn gen về các nấm ngoại cộng sinh cho những nghiên cứu về khả năng cộng

sinh và ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây trồng [4].

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Phạm Quang Thu (2006-2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm

vi sinh hỗn hợp dạng viên nén cho bạch đàn và thông trên các lập địa thoái hóa,

nghèo chất dinh dưỡng [2,4]

Nguyễn Thị Dạ Thảo, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến (Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh) với đề tài nghiên cứu khoa học kĩ thuật về ảnh hưởng của

phân lân đến sinh trưởng, năng suất, tồn lưu dinh dưỡng và mật độ nấm cộng

sinh trên vùng đất xám tỉnh Tây Ninh vụ Đông Xuân (2004-2006) đã cho thấy

vai trò của cộng sinh nấm rễ cây không chỉ thúc đẩy sinh trưởng mà còn ảnh

hưởng tốt đến năng suất cây trồng nông lâm nghiệp [6]

Các tác giả Nguyễn Minh Châu, Lê Quốc Huy (Trung tâm Công nghệ Sinh

học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp) đã tiến hành nghiên cứu sản xuất

thử nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dưới dạng viên nang; thử nghiệm một số

dung dịch để bảo quản chế phẩm và đánh giá hiệu quả cộng sinh của chế phẩn

dạng viên nang với cây sao đen trong vườn ươm và ngoài đồngruộng. Kết quả

nghiên cứu cho thấy, chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang có nhiều ưu điểm

hơn các dạng khác, sợi nấm được bọc trong thể keo alginate nên có khả năng

tránh được sự tấn công của các vi sinh vật khác. Chế phẩm ECM dạng nang được bảo quản tốt nhất trong CaCl2 0,1M ở 40C, trong điều kiện này sợi nấm

được bọc alginate vẫn có thể tồn tại và phát triển tốt; nên sử dụng chế phẩm

ECM dạng nang tốt nhất trước 6 tháng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của

chế phẩm. Sử dụng chế phẩm cho cây sao đen giai đoạn vườn ươm đã cho hiệu

quả cộng sinh rất tốt thể hiện ở mức độ sinh trưởng, khả năng tăng cường hấp

thụ nước, dinh dưỡng và muối khoáng, khả năng lôi kéo các vi sinh vật có ích

trong đất tập trung gần vùng rễ, do đó nó không chỉ làm tăng chất lượng của cây

con mà còn cải tạo đất. Chế phẩm ECM áp dụng cho vườn ươm và trồng rừng,

bước đầu cho thấy, có tác dụng làm tăng sinh trưởng của cây chủ trong vườn

ươm từ 250-280% so với đối chứng và 130-170% so với đối chứng ở rừng

trồng. Cùng với đề tài nghiên cứu phương pháp nuôi cấy dung dịch lỏng in vitro

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Keo lai và Keo tai tượng nhằm làm nảy mầm bào tử AM và xúc tiến quá trình

hình thành cộng sinh AM trong rễ keo đã được tiến hành thành công. Kết quả

phương pháp là cơ sở quan trọng cho thử nghiệm phát triển phương pháp nuôi

cấy nhân nhanh sinh khối AM –invitro và Bioreactor cải tiến cho sản xuất chế

phẩm AM [2].

Tăng Thị Chính, Bùi Văn Cường (2007), nghiên cứu sự đa dạng nấm cộng

sinh Arbuscular Mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ đất ô nhiễm chì [5]

Trần Thị Dạ Thảo đã nghiên cứu về sự cộng sinh của nấm Mycorrhiza trên cây

ngô (Zea mays L. ssp. mays). Qua nghiên cứu cho thấy rằng nấm rễ có khả năng

rất lớn trong việc tiết kiệm nước tưới, tăng hấp thu dinh dưỡng và tăng năng

xuất cây trồng [6].

1.7. Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu các khu hệ vi sinh vật

1.7.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics

Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên được đưa ra năm 1985 bởi nhóm

nghiên cứu của Handelsman [20]. “Metagenomics” là phương pháp phân tích hệ

vi sinh vật các loài vi sinh vật trong các phức hệ vi sinh vật thu trực tiếp từ môi

trường tự nhiên thông qua phương thức đọc trình tự mà không cần nuôi cấy

[13,20,31] Là phương pháp phân tích hệ vi sinh vật trong tự nhiên không thông

qua quá trình nuôi cấy mà sử dụng các dữ liệu di truyền thông qua phân tích.

Đây là một ngành khoa học mới nhằm cung cấp cho các nhà khoa học công cụ

tiếp cận với hầu hết các loài vi sinh vật khó nuôi cấy trên môi trường nhân tạo.

Do đó, metagenomics cho phép nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi sinh vật mà

chưa từng được nghiên cứu trước đây, và cung cấp một nhận thức hoàn toàn

mới về cấu trúc và chức năng của từng hệ sinh thái từ sự đa dạng của đại dương

cho đến hệ tiêu hóa của con người. Như đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10%

trong tổng số lượng các loài vi sinh vật đã được quan sát trong tự nhiên là có thể

nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Những sinh vật không thể nuôi cấy

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

trên môi trường nhân tạo này đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáo

như phân hủy rác thải hay tổng hợp các hợp chất có thể sử dụng như là thuốc

hay kháng sinh. Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận với

các nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chưa được khai thác về đa dạng sinh học

trong các mẫu thu từ môi trường. Metagenomics được sử dụng như một công cụ

của hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vật liệu gen phân lập từ môi

trường. Quá trình đa bước này dựa vào 4 bước chính:

(1) phân lập các vật liệu gen;

(2) thao tác trên các vật liệu gen này;

(3) xây dựng thư viện gen;

(4) phân tích các vật liệu gen trong các thư viện metagenome.

Metagenomics là một ngành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãi

trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học.

1.7.2. Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật đất

Môi trường đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lương và sự đa dạng các loài

trong hệ vi sinh vật. Môi trường đất vùng rễ thích hợp cho các vi sinh vật vì nó

có chứa các khoáng chất với các kích cỡ, hình dạng và tính chất khác nhau kết

hợp cùng với hệ vi sinh vật và các hợp chất hữu cơ trong các quá trình phân hủy. Một ví dụ như: một gram của đất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinh vật nhân sơ, trong khi đó 1g của đất trồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109

tế bào sinh vật nhân sơ. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác

nhau, số lượng các sinh vật nhân sơ được xác định từ khoảng 2000 đến 18000

bộ gen trên một gram đất. Số lượng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các

loài hiếm và chưa được biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó,

số lượng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1g đất phải lớn hơn rất

nhiều (16177 loài đã được xác định bởi NCBI (National Center for

Biotechnology Information, 2005). Trong phân lập các vi sinh vật vùng rễ nói

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG I

chung và các vi nấm nói riêng kết hợp với metagenomics sẽ cho một kết quả cụ

thể và đầy đủ hơn về bức tranh đa dạng nấm vùng rễ (bao gồm nuôi cấy và

không nuôi cấy).

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Mẫu nghiên cứu

Các mẫu đất, rễ, củ cây Nghệ vàng được thu tại thôn Chi Lăng, xã Đại Tập,

huyện Khoái Châu, Tỉnh Hưng Yên vào tháng 3 năm 2017 và được lưu giữ lạnh (-20oC) tại Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất thiên

nhiên.

2.1.3. Hóa chất

Các hóa chất thực hiện thí nghiệm có nguồn gốc từ: Đức, Trung Quốc, Việt

Nam, Ấn Độ.

2.1.4. Thiết bị thí nghiệm

• Tủ cấy vi sinh - Box laminar PII (Đức)

• Tủ ấm 30ºC ÷ 30ºC – Memmert (Đức)

• Cân điện tử AL300 – Thụy Sỹ

• Nồi khử trùng Lequenx (Pháp)

• Máy lắc thường Gerhardt (Đức)

• Kính hiển vi điện tử Olympus (Nhật Bản)

• Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)

. Rây ướt các kích thước khác nhau 120µm, 60µm, 45µm,32 µm.

• Các dụng cụ cấy VSV (Việt Nam, Thụy Sỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ…).

2.1.5. Môi trường

 Môi trường phân lập nấm vùng rễ

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Môi trường MMN (g/L): Glucose 10g; (NH4)2PO4 0,25g; MgSO4.7H2O

0,0732g; KH2PO4 0,5g; CaCl2 0,0662g; NaCl 0,025g; FeCl3.6H2O 0,02g; Thiamine HCl 1x10-4g. Bổ sung kháng sinh sau khi khử trùng: 10ml

chloramphenicol 0,5% và 10ml chlotetracycline 0,5%.

 Môi trường nuôi cấy, lên men và giữ giống.

- Môi trường PDA(g/L): Khoai tây 200g (bỏ vỏ, thái nhỏ, đun sôi, lọc lấy

dịch); Đường 20g; Thạch 15g. Khử trùng ở 121°C trong 30 phút.

- Môi trường PDB (g/L): Khoai tây 200g (bỏ vỏ, thái nhỏ, đun sôi, lọc lấy

dịch); Đường 20g; Pepton 5g. Khử trùng ở 121°C trong 30 phút.

- Môi trường Czapek-Dox (g/L): Saccharose 30g; NaNO3 2g; KH2PO4 1g;

MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g; pH = 6 (chỉnh bằng HCl).

Khử trùng ở 121°C trong 30 phút.

- Môi trường Sabouraud (g/L): Pepton 10g; Glucose 20g. Khử trùng ở

110°C trong 30 phút.

 Môi trường thử hoạt tính enzyme

- Môi trường thử hoạt tính enzyme Phosphatase(g/L): Ca3(PO4)2 5g;

(NH4)2SO4 0,5g; KCl 0,2g; MgSO4.7H2O 0,1g; MnSO4.4H2O 0,001g;

FeSO4.7H2O 0.001g. Khử trùng ở 121°C trong 30 phút.

- Môi trường thử hoạt tính enzyme Xenllulase (g/l): CMC 5g; aga 20g;

dung dịch khoáng 200ml. Khử trùng ở 121°C trong 30 phút.

- Môi trường thử hoạt tính enzyme Amylase (g/l): tinh bột tan 10g; aga

20g. Khử trùng ở 121°C trong 30 phút.

2.1.6. Trình tự mồi

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bảng 2. 1: Trình tự mồi sử dụng cho định danh các chủng nấm Trình tự (5’-3’) Tên mồi STT

1 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC

2 ITS1 CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

Bảng 2. 2: Trình tự mồi cho định danh các chủng nấm AM

Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nguồn tham khảo

NS31 TTG GAG GGC AAG TCT GGT GCC (Simon & cs. 1992)

AM1 GTT TCC CGT AAG GCG CCG AA (Helgason & cs. 1998)

AM2 GTT TCC CGT AAG GTG CCA AA

(Santos-González &

cs. 2007) AM3 GTT TCC CGT AAG GTG CCG AA

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Phương pháp thu thập mẫu

Gạt bỏ 3cm đất bề mặt để loại trừ thảm mục thực vật. Dùng xẻng đã được

vô trùng bằng cồn đào lấy phần bầu đất quanh rễ cây (ở độ sâu 0 – 20cm). Đào

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

lấy rễ, củ và đất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non. Mẫu đất sau khi được thu

thập về để khô tự nhiên tránh môi trường ô nhiễm và riêng biệt, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2 - 5oC) trước khi sử dụng cho phân lập hoặc đồng nuôi cấy.

2.2.2. Phân lập bào tử AM

Phân lập bào tử AM trong mẫu đất thu thập ở hiện trường phân lập theo

phương pháp lọc ướt của Gerdeman và Nicolson (1963).

- Lấy 100 gam đất ngâm với 2 lít nước, khuấy nhẹ tạo thành dung dịch

huyền phù.

- Đổ từ từ dung dịch qua các rây có kích thước lần lượt là 1000, 250, 100, 45µm.

- Bỏ phần cặn trên rây 1000µm vì ở rây này thường không có bào tử mà

chủ yếu là các mảnh rác hữu cơ. Lấy phần cặn trên rây 250 µm, 100 và 45 µm

rửa sạch ly tâm lần 1 ở 5000 vòng/ 5 phút với nước. Bỏ dịch trong trong các ống

ly tâm lấy phần cặn hòa tan trong dung dịch đường sucrose 480g/l và ly tâm lần

2 với tốc độ 2500 vòng/ phút trong 5 phút. Sau ly tâm, đổ dịch nổi qua rây 45

µm và rửa sạch bằng nước cất rồi cho vào đĩa Petri để quan sát. Sau đó từ các

đĩa Petri này, tiến hành phân lập và đếm bào tử.

2.2.3. Phân lập chủng nấm vùng rễ

Phân lập rễ và củ: Theo phương pháp của Harvey và Linda (1991). Rửa

mẫu dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Khi bề mặt mẫu đã ráo nước, ngâm mẫu trong cồn 70oC trong 1 phút. Để mẫu khô trong tủ cấy vô trùng. Dùng dụng cụ

vô trùng cắt mẫu rễ thành những đoạn nhỏ dài từ 5-10mm, đặt các đoạn đó trên

đĩa Petri có môi trường phân lập (môi trường MMN), sau đó chuyển vào tủ ấm

30°C trong thời gian 48-72 giờ.

Phân lập mẫu đất: Lấy 10g đất cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất

vô trùng, đặt lên máy lắc trong 10 phút, sau đó để 1 phút cho lắng các hạt lớn. Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-4, dùng pipet hút dịch nhỏ vào đĩa petri có môi

trường phân lập (môi trường MMN), sau đó chuyển vào tủ ấm 30°C.

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Lựa chọn và lưu giữ giống: từ các sợi nấm mọc ra từ các mô rễ cây và đất

ở các đĩa phân lập, ria cấy trên môi trường MMN để tinh sạch chủng. Lựa chọn

các chủng sạch để cấy trên môi trường thạch nghiêng MMN hoặc khoai tây cho

việc lưu giữ giống và kiểm tra hoạt tính để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Chủng nấm được bảo quản, trước khi mang ra sử dụng cần được cấy truyền

sang ống thạch nghiêng để được hoạt hóa.

2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM

Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến

khu hệ AM, bao gồm 4 thí nghiệm. Bố trí thí nghiệm theo kiểu tổ hợp gồm các

công thức thí nghiệm với hàm lượng nitơ khác nhau.

Công thức N0: 0kg nitơ + 400kg phốt pho + 200kg kali (kg/ha/năm)

Công thức N150: 150kg nitơ + 400kg phốt pho + 200kg kali (kg/ha/năm)

Công thức N350: 350kg nitơ + 400kg phốt pho + 200kg kali (kg/ha/năm)

Công thức N500: 500kg nitơ + 400kg phốt pho + 200kg kali (kg/ha/năm)

Các công thức được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, mỗi ô cơ sở

gieo 10 hàng, 2 lần nhắc lại, khoảng cách trồng 40 x 40 cm.

2.2.5. Hoạt tính sinh enzyme ngoại bào

Hoạt tính các enzyme xenllulase, phosphatase, Amylase được xác định

theo phương pháp khuếch tán trên thạch.

2.2.6. Tách chiết DNA tổng số

Hệ ADN từ đất được tách chiết bằng kit PowerSoil DNA isolation (Mo Bio

Laboratories, Qiagen, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

Sản phẩm ADN tổng số được kiểm tra nồng độ bằng máy NanoDrop ND-

1000 và được kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.7. Kỹ thuật PCR

Trình tự mồi cho định danh các chủng nấm

Trình tự 2 mồi thông dụng (universal) của vùng gen ITS (internal

transcribed spacer): ITS4, ITS1F đã được tổng hợp theo công bố của Redecker

(2000) (Bảng 2.1).

Hỗn hợp phản ứng: 10 x Buffer 10 µl; dNTP mixture 16 µl; TaqTm 1,2 µl;

ADN (50 ng) 1 µl; Mồi xuôi 2 µl; Mồi ngược: 2 µl; H2O đến 100 µl.

Chu trình PCR vòng 1 cho hai mồi ITS4 và NS5 như sau: 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 30 chu trình với (94oC trong 30 giây, 57oC trong 1 phút, 72oC trong 3 phút) và cuối cùng là 72oC trong 10 phút.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và tinh sạch bằng

Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Đức). Sản phẩm này được sử dụng làm

khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều với mồi ITS1/ITS4. Kết quả

được đọc trên hệ thống phân tích tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer

(Applied Biosystems, Mỹ).

Trình tự mồi cho định danh cho các chủng nấm AM

Trình tự của vùng gen 18S rRNA dài khoảng 550 bp được khuếch đại bởi

bộ mồi bao gồm mồi xuôi NS31 (là mồi phổ thông - universal primer) và hỗn

hợp mồi ngược gồm các mồi AM1, AM2 và AM3. Bảng 2.2 là trình tự các mồi

được sử dụng để khuếch đại vùng gen 18S rRNA của các loài AM thuộc các chi

khác nhau của Glomercomycota.

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.8. Phương pháp Tách dòng gen thông qua vector pBT

Khuếch đại vùng gen 18S rRNA bằng cặp mồi NS1 và hỗn hợp mồi AM

(bao gồm AM1, AM2, AM3 với tỷ lệ bằng nhau) bằng phản ứng PCR với tổng

thể tích 25 µl gồm: 12,5 µl H2O; 2,5 µl 10X PCR buffer; 2,5 µl dNTP (25

mM); 2,5 µl MgCl2 (25mM); 1 µl hỗn hợp mồi AM (10 mM); 1 µl mồi NS1 (10

mM); 1 µl Taq và 2 µl DNA (30 ng/ul).

Chu trình nhiệt như sau: 94oC trong 4 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ của (94oC – 30 giây, 54oC – 30 giây, 72oC – 1 phút), cuối cùng là 72oC trong 10 phút và lưu ở 4oC. Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra chất lượng bằng điện di

trên gel agarose 1% rồi quan sát, chụp ảnh.

Sau khi nhân được đoạn gen 18S rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc

hiệu, phản ứng ghép nối được tiến hành giữa các đoạn gen và vector pBT bằng

enzyme T4 DNA ligase. Trên vector này có trình tự gen mã hóa cho protein phân

hủy chất kháng sinh ampicillin và trình tự gen GUS mã hóa cho protein phân hủy

chất chỉ thị X-gal từ không màu thành màu xanh khi có chất cảm ứng IPTG. Tạo

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

dòng gen 18S rDNA là bước quan trọng từ đó có thể nhân số lượng lớn gen quan

tâm, phục vụ cho bước biến nạp đọc trình tự các gene riêng lẻ.

Sau khi thực hiện phản ứng nối gen quan tâm với vector pBT, vector lai

ghép được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α và sau đó được cấy trải trên đĩa

môi trường LB (Luria Bertani) đặc có chứa 100 µg/ml ampicillin, 25 µg/ml X-

gal và 1 mM IPTG. Phương pháp biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc tế bào tái tổ hợp

mang gen được thực hiện dựa trên phương pháp sinh học thường quy.

Các khuẩn lạc mọc trắng mọc trên môi trường LB sau đó được lựa chọn

ngẫu nhiên để tách plasmid, kiểm tra các đoạn gene chèn và được sau đó được

giải trình tự trên máy ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, Mỹ).

2.2.9. Đọc và phân tích trình tự

Các mẫu plasmid mang gen quan tâm được sử dụng để giải trình tự bằng

máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.

Trình tự của mỗi mẫu được đọc theo hai chiều xuôi và ngược, sau đó được xác

định đoạn trình tự chung (contiq) bằng chương trình Seqman (DNA Laser Star).

Định danh các mẫu được thực hiện bởi công cụ BLAST (Basic Local

Alignment Searh Tool) bằng cách so sánh trình tự của mẫu với trình tự có được

trên cơ sở dữ liệu của Ngân hàng gen thế giới. Các mẫu sẽ được nhóm vào cùng

một Đơn vị tiến hóa (Operational Taxonomic Unit - OTU) nếu có mức độ tương

đồng cao. Theo Helgason và cộng sự (2002), đối với một loài vi sinh vật, trình

tự vùng gen của cùng một loài có biến dị do đó đối với vi sinh vật, những trình

tự nào có mức độ tương đồng cao (> 97%) là cơ sở để định danh loài.

Tên các loài vi sinh vật được định danh theo tên Chi của loài, ví dụ Glo

cho Glomus, Aca cho Acaulospora) và sau đó là con số, ví dụ trên mức tương

đồng 97% với trình tự mẫu nghiên cứu.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh

Phân lập các chủng nấm rễ AM từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ vàng

thu tại thời điểm sau khi cấy 1 tháng (N1t) và 11 tháng (N11t) theo phương

pháp lọc ướt của Gerdemann và Nicolson (1963). Kết quả số lượng bào tử

AM tổng số trong 100g đất được thể hiện ở bảng 3.1:

Bảng 3. 1: Số lượng bào tử AM tổng số trong 100g đất phân lập

STT Số lượng bào tử AM tổng Mẫu đất

số trong 100g đất

1 19  1 N1t

2 N11t 94  1

Các bào tử phân lập được được chia thành các nhóm dựa vào đặc điểm

hình thái. Ở mẫu đất N1t, bào tử màu đen chiếm ưu thế, chủ yếu là hình cầu,

với kích thước từ 70-100µm, bào tử màu vàng, nâu vàng chiếm số lượng nhỏ,

ở vài trường hợp có túi bào tử trong suốt. Mẫu đất N11t, dạng bào tử ưu thế

có màu nâu vàng cam, hình cầu, kích thước 120-190µm. Chúng tôi nhận thấy

tổng số bào tử AM, màu sắc, kích thước bào tử thay đổi một cách rõ ràng từ

thời điểm 1 tháng đến 11 tháng, số lượng bào tử mẫu đất N11t gấp 5 lần ở

mẫu đất N1t, chứng tỏ thành phần khu hệ nấm AM thay đổi, có thể xuất hiện

loài mới, hoặc chi mới ở thời điểm thu mẫu 11 tháng. Từ những kết quả phân

lập trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khu hệ

nấm AM.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3. 1: Bào tử AM phân lập từ các mẫu đất N1t và N11t

3.2. Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến khu hệ nấm AM vùng rễ

Curcuma longa L.

Các mẫu đất vùng rễ cây nghệ vàng được thu tại các thời điểm: 1 tháng sau khi trồng (ký hiệu N1t), 7 tháng sau khi trồng (N7t) và thời điểm thu hoạch (11 tháng sau trồng, N11t). Chúng tôi sử dụng kỹ thuật phân tích dữ liệu metagenomics nghiên cứu đa dạng loài AM có trong các mẫu đất vùng rễ được xác định bằng các phân tích trình tự chuỗi nucleotide của tiểu đơn vị ribosome nhỏ (18S) của DNA tổng số tách chiết từ mẫu đất thu tại 3 thời điểm bằng công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

Bảng 3. 2: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở khoảng thời gian khác nhau.

STT AM Xuất hiện trong mẫu

N1t N7t N11t

+ + 1 Acaulospora longula (#AJ306439)

+ 2 Acaulospora minuta (#FR869690)

+ 3 Acaulospora rogusa (#LN881566)

+ + 4 Acaulospora spinosa (#JX461237)

+ + 5 Acaulospora spinose (#KC193264)

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

+ + 6 Entrophospora infrequens (#U94713)

7 Diversispora sp. (#MH286006) + + +

8 Diversispora sp. (#MH286031) + + +

9 Diversispora sp. (#MH286014) + +

10 Diversispora sp. (#KP756538) + +

11 Diversispora sp. (#KP 756476.1) + + +

12 Gigaspora albida (#AF004705) + + +

+ + 13 Gigaspora gigantean (#AJ539242)

14 Gigaspora sp. (#MF599215) + +

15 Gigaspora sp. (#AF396820) + +

16 Gigaspora sp. (#MF599209) + +

+ + + 17 Scutellospora calospora (#KU136421)

+ 18 Scutellospora heterogama (#AF004692.1)

+ 19 Scutellospora pellucia (#AY035663.1)

20 Scutellospora sp. (#AF396813) + + +

21 Glomus claroideum (#AJ567810) + +

22 Glomus cubense (#JF692725) + +

23 Glomus etunicatum (#AJ239125) + + +

24 Glomus geosporum (#AJ319786) + +

25 Glomus indicum (#GU059543) + + +

+ 26 Glomus microaggregatum (#HG425991)

27 Glomus mosseae (#AM423117) + +

28 Glomus occultum (#AF005481.1) + + +

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

29 Glomus sp. (#MF614120) +

+ + 30 Rhizophagus intraradices (#FM865586)

31 Rhizophagus sp. (#KY416592) + +

+ 32 Funneliformis mosseae (#FR750031)

33 Funneliformis sp. (#MG008538) +

+ 34 Claroideoglomus luteum (#KP144302)

25 20 15

5 0

N1t

N7t

N11t

Mẫu đất

Loài

Chi

35 Paraglomus sp. (#MG076805) +

Biểu đồ 3. 1: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất

Kết quả đọc trình tự cho thấy các trình tự đều có mức độ tương đồng

100% với các trình tự của Ngân hàng gen (Genbank). Đặc biệt, kết quả xác

định đa dạng và số lượng các loài vi nấm của mẫu đất N1t, N7t và N11t

(Bảng 3.2) cho thấy, sự đa dạng về loài vi sinh vật đất trong cả 3 mẫu đất

không giống nhau. Mẫu N1t được xác định có 13 loài thuộc 7 chi khác nhau,

mẫu N7t được xác định có 26 loài thuộc 7 chi, mẫu N11t có 31 loài thuộc 9

chi khác nhau. Một số loài như Scutellospora calospora, Scutellospora sp.,

Glomus etunicatum, Glomus indicum, Glomus occultum… xuất hiện ở cả 3

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

mẫu đất, chứng tỏ chúng gắn liền với quá trình sinh trưởng và phát triển cây

nghệ từ khi mới trồng đến khi thu hoạch. Trong khi đó 1 số loài lại xuất hiện

gần thời điểm thu hoạch như Acaulospora minuta, Acaulospora rogusa,

Funneliformis sp., Claroideoglomus luteum.... Một số loài khác chỉ xuất hiện

ở giai đoạn đầu cây nghệ phát triển: Paraglomus sp., Glomus

microaggregatum… Thành phần khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ thay đổi theo

thời gian sinh trưởng và phát triển cây nghệ, biến động về số lượng loài, chi

theo hướng tăng dần số lượng theo thời gian.

Chúng tôi nhận thấy kết quả trên tương đồng với kết quả phân lập bào tử

AM, tại thời điểm sau khi trồng 1 tháng phân lập được 19  1 bào từ – kết quả

định danh cho 13 loài (7 chi) trong khi đó lượng bào tử phân lập ở thời điểm

11 tháng là 94  2 – định danh được 31 loài thuộc 9 chi. Kết quả trên chứng tỏ

thời gian thu mẫu ảnh hưởng rất lớn tới thành phần khu hệ nấm AM vùng rễ

cây nghệ.

Từ 3 mẫu đất thu tại các thời điểm khác nhau, xác định định được 35 loài

thuộc 10 chi khác nhau. So sánh với các nghiên cứu trước, chúng tôi nhận

thấy rằng đa dạng nấm rễ nội cộng sinh trên vùng rễ cây nghệ cao hơn so với

một số loại cây trồng ở việt nam. Chẳng hạn năm 2012 Trần Thị Như Hằng và

cộng sự đã nghiên cứu đa dạng AM trên rễ cây lúa và cây cà chua, các tác giả

đã phát hiện được 5 chi: Scutellospora, Glomus, Acaulospora, Gigaspora, và

Entrophospora [7]. Hay trong một nghiên cứu về đa dạng AM trên rễ cây cam

ở Quỳ Hợp, Nghệ An, từ 60 mẫu đất, các tác giả cũng chỉ phát hiện được 6

chi: Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis, Glomites and

Gigaspora), 16 loài [1].

3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM

Để nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến khu hệ nấm AM chúng tôi

tiến hành bố trí thí nghiệm với hàm lượng nitơ khác nhau (kg/ha/năm):

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

N0(0kg nitơ + 400kg phốt pho + 200kg kali), N150(150kg nitơ + 400kg phốt

pho + 200kg kali), N350(350kg nitơ + 400kg phốt pho + 200kg kali), N500(

500kg nitơ + 400kg phốt pho + 200kg kali). Thu mẫu đất vùng rễ cây nghệ

mỗi lô thí nghiệm tại thời điểm thu hoạch nghệ. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật

phân tích dữ liệu metagenomics nghiên cứu đa dạng loài AM có trong các

mẫu đất vùng rễ được xác định bằng các phân tích trình tự chuỗi nucleotide

của tiểu đơn vị ribosome nhỏ (18S) của DNA tổng số tách chiết từ mẫu đất

thu ở các lô thí nghiệm :

Bảng 3. 3: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở điều kiện nitơ khác nhau.

STT AMF Xuất hiện trong mẫu

N0 N150 N350 N500

+ 1 Acaulospora longula (#AJ306439)

+ + + 2 Acaulospora minuta (#FR869690)

+ + 3 Acaulospora rogusa (#LN881566)

+ + + 4 Acaulospora spinosa (#JX461237)

+ 5 Acaulospora spinose (#KC193264)

+ 6 Entrophospora infrequens (#U94713)

+ 7 Diversispora sp. (#MH286006)

+ + 8 Diversispora sp. (#MH286031)

+ 9 Diversispora sp. (#MH286014)

10 Diversispora sp. (#KP756538) + +

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

+ + + 11 Diversispora sp. (#KP 756476.1)

+ + 12 Gigaspora albida (#AF004705)

+ + 13 Gigaspora gigantean (#AJ539242)

14 Gigaspora sp. (#MF599215) +

15 Gigaspora sp. (#AF396820) +

16 Gigaspora sp. (#MF599209) +

+ + + 17 Scutellospora calospora (#KU136421)

+ 18 Scutellospora heterogama (#AF004692.1)

+ + 19 Scutellospora pellucia (#AY035663.1)

+ + + 20 Scutellospora sp. (#AF396813)

+ 21 Glomus claroideum (#AJ567810)

22 Glomus cubense (#JF692725) + + +

+ + 23 Glomus etunicatum (#AJ239125)

+ + + 24 Glomus geosporum (#AJ319786)

25 Glomus indicum (#GU059543) + + + +

+ + + 26 Glomus microaggregatum (#HG425991)

+ + + + 27 Glomus mosseae (#AM423117)

+ + + 28 Glomus occultum (#AF005481.1)

29 Glomus sp. (#MF614120) + + +

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

+ 30 Rhizophagus intraradices (#FM865586)

31 Rhizophagus sp. (#KY416592) + +

+ 32 Funneliformis mosseae (#FR750031)

+ + + 33 Funneliformis sp. (#MG008538)

+ + 34 Claroideoglomus luteum (#KP144302)

N150

N350

N500

0 Mẫu đất N0

Loài

Chi

35 Paraglomus sp. (#MG076805) + +

Biểu đồ 3. 2: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất vùng rễ ở điều kiện bón nitơ khác nhau

Kết quả đọc trình tự cho thấy các trình tự đều có mức độ tương đồng

100% với các trình tự của Ngân hàng gen (Genbank). Các mẫu đất vùng rễ

cây nghệ vàng đều xuất hiện các loài AM với số lượng và thành phần khác

biệt. Ở điều kiện bón nitơ:150kg/ha/năm cho số lượng loài AM lớn nhất đạt

33 loài thuộc 10 chi khác nhau. Trong khi đó, với với hàm lượng nitơ:

500kg/ha/năm số lượng loài AM rất thấp (3 loài thuộc 2 chi). Điều kiện không

bón nitơ và bón nitơ 350kg/ha/năm không khác biệt nhiều về tổng số loài và

chi, nhưng thành phần loài có sự thay đổi. VD loài Diversispora sp.,

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Paraglomus sp. chỉ xuất hiện khi bón nitơ với hàm lượng 350kg/ha/năm. Với

kết quả thu được, chúng tôi cho rằng hàm lượng nitơ có ảnh hưởng rất lơn đến

khu hệ nấm AM vùng rễ, có thể ức chế phát triển thành phần loài trong khu hệ

và kích thích tăng sinh số lượng loài AM trong khu hệ nấm vùng rễ khi hàm

lượng nitơ tối ưu. Chứng tỏ chế độ canh tác, mùa vụ, là nguyên nhân dẫn đến

thay đổi kích thước và thành phần khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ.

3.4. Phân lập các chủng nấm vùng rễ khác

Bên cạnh nấm nội cộng sinh vùng rễ có vai trò ảnh hưởng vô cùng lớn

đến sinh trưởng và phát triển của cây nghệ. Chúng tôi tiếp tục khảo sát đa

dạng các chủng nấm vùng rễ có khả sinh enzyme ngoại bào, phân giải các hợp

chất khó tan trong đất góp phần bổ sung các chất dinh dưỡng cho cây. Trong

nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân lập và sàng lọc các hoạt tính

enzyme ngoại bào.

3.4.1. Phân lập mẫu rễ

Mẫu rễ cây nghệ được rửa sạch dưới vòi nước, làm sạch lại bằng cồn

70% trước khi đưa vào phân lập. Các mẫu được cắt nhỏ, khử trùng bề mặt

mẫu bằng cồn 70% trong 3 phút sau đó chuyển sang cốc nước vô trùng trong

1 phút. Mẫu khử trùng xong, được đặt trên giấy thấm đã vô trùng. Tiến hành

cắt nhỏ mẫu (0,5 -1cm) và cấy lên bề mặt thạch sao cho vị trí cắt được tiếp

xúc với bề mặt thạch nhiều nhất, tiến hành nuôi trong tủ ấm điều kiện 28°C

đến 30°C, chọn khuẩn ty riêng rẽ, để tạo chủng thuần khiết. Kết quả thu được

19 chủng nấm khác nhau về màu sắc hệ sợi:

Bảng 3. 4: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ rễ cây nghệ

Stt Kí hiệu chủng

Màu sắc khuẩn lạc

Sắc tố tiết ra từ môi trường

1 NB01

Trắng, khuẩn ty đều, bông

Không

2 NB02

Trắng, khuẩn ty đều, mịn,

Không

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 NB03

Trắng, sợi bông, dày

Nâu

4 NB04

Trắng, bông

Không

5 NB05

Trắng, mịn, sợi không đều

Không

6 NB06

Nâu xanh, sợi ngắn, bông

Tím

7 NB07

Vàng, bông, sợi ngắn

Không

8 NB08

Trắng, sợi bông

Vàng nhạt

9 NB09

Trắng, sợi mảnh, đều

Không

10 NB10

Hồng, khuẩn ty mịn, đều

Không

11 NB11

Trắng sợi mịn

Không

12 NB12

Không

Màu trắng khuẩn ty thành đám, bề mặt cứng

13 NB13

Vàng, khuẩn ty đều, mịn

Vàng

14 NB14

Nâu, sợi bông, đều

Không

15 NB15

Nâu, khuẩn ty đều, mịn

Nâu đen

16 NB16

Vàng, khuẩn ty không đều, bông

Vàng

17 NB17

Trắng, khuẩn ty bông, không đều

Không

18 NB18

Nâu, mọc thành đám, bông

Không

19 NB19

Trắng, khuẩn ty mịn, không đều

Không

3.4.2. Phân lập mẫu đất vùng rễ

Mẫu đất trước khi phân lập cần loại bỏ các vật lạ, trộn đều trong hộp

nhựa vô trùng. Cân 10g đất cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô

trùng, đặt lên máy lắc trong 10 phút, sau đó để 1 phút cho lắng các hạt lớn. Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-4, ở mỗi nồng độ dùng pipet hút 0,1ml dịch lên

môi trường đĩa thạch có bổ sung kháng sinh kháng khuẩn, nuôi trong điều

kiện 28°C đến 30°C, sau 48h đến 72h tiến hành cấy chuyển các hệ sợi và tinh

sạch. Kết quả thu được 20 chủng nấm với đặc điểm khác nhau về màu sắc hệ

sợi, thời gian phát triển.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Bảng 3. 5: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ cây nghệ.

ST

Kí hiệu

Màu sắc khuẩn lạc

Sắc tố tiết ra từ môi trường

1 NB20

Đen, khuẩn ty đều

Không

2 NB21

Vàng, bông, sợi ngắn

Không

3 NB22

Trắng nhạt, sọi mảnh, thưa

Không

4 NB23

Trắng, vàng, mảnh, bông

Không

5 NB24

Trắng, khuẩn ty đều, mịn,

Không

6 NB25

Trắng sợi ngắn

Vàng

7 NB26

Hồng, khuẩn ty mịn, đều

Không

8 Màu vàng đậm

Màu vàng

NB27

9 NB28

Sợi mảnh khuẩn ty màu đen

Không

10 NB29

Nâu xanh, sợi ngắn, bông

Tím

11 NB30

Màu trắng sợi, đám

Không

12 NB31

Không

Màu trắng, khuẩn ty thành đám, bề mặt cứng

13 NB32

Không

Trắng mọc tụ lại thành đám, mịn

14 NB33

Trắng vàng mảnh, bông

Không

15 NB34

Xanh, bông, không đều

Không

16 NB35

Trắng, đều, thưa

Nâu

17 NB36

Xanh, đều, mịn

Không

18 NB37

Vàng

Vàng, khuẩn ty không đều, bông

19 NB38

Trắng, mọc thành đám, bông

Không

20 NB39

Vàng, bông, đều

Vàng

Dựa trên kết quả phân lập đánh giá sơ bộ hình thái, màu sắc khuẩn lạc,

chúng tôi nhận thấy những chủng nấm vùng rễ rất đa dạng về màu sắc, chúng

có thể thuộc chi, họ rất khác nhau. Màu sắc khuẩn lạc của 39 chủng nấm phân

lập được bao gồm các nhóm màu: Trắng, đen, vàng, nâu, xanh, hồng. Trong

đó đặc trưng nhất khuẩn lạc màu trắng: 20 chủng (51%). Từ các kết quả trên,

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

chứng tỏ khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ rất đa dạng, rễ cây nghệ là chủ thể cho

một số loài nấm rễ khác nhau sinh sống. 39 chủng nấm được tiến hành đánh

giá hoạt tính sinh enzyme ngoại bào, qua đó đánh giá ảnh hưởng khu hệ nấm

đến sinh trưởng phát triển của cây nghệ.

3.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào

39 chủng nấm được lên men trên môi trường dịch thể sau 3 tuần tiến

hành thu dịch nuôi cây dùng để đánh giá hoạt tính sinh enzyme ngoại bào theo

phương pháp khuếch tán đĩa thạch có chứa cơ chất đặc trưng (mục 2.1.5). Kết

quả được trình bày trong bảng 3.6:

Hoạt tính enzyme (D-d, mm)

STT Nguồn gốc phân lập

Ký hiệu chủng

Amylase

Phosphatase

Xenllulase

Rễ

NB01

NB02

NB03

NB04

NB05

NB06

NB07

NB08

NB09

NB10

NB11

NB12

NB13

NB14

NB15

NB16

NB17

NB18

Bảng 3. 6: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

NB19

Đất

NB20

NB21

NB22

NB23

NB24

NB25

NB26

NB27

NB28

NB29

NB30

NB31

NB32

NB33

NB34

NB35

NB36

NB37

NB38

NB39

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Biểu đồ 3. 3: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập

Hình 3. 2: Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Từ các kết quả thông biểu đồ 3.3 cho thấy từ mẫu rễ phân lập được các

chủng nấm cho hoạt tính cao hơn phân lập từ đất. 15 chủng phân lập từ rễ và

củ có ít nhất 2 hoạt tính sinh enzyme ngoại bào chiếm 38% trong khi đó từ

mẫu đất có 10 chủng (25%). Đặc biệt chúng tôi quan sát thấy: Các chủng có

khuẩn ty màu vàng nghệ khi sống ở vùng rễ cây nghệ đều biểu hiện hoạt tính

enzyme.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Đánh giá bảng 3.4, bảng 3.5 và biểu đồ 3.3 nhận thấy một số chủng nấm

phân lập từ rễ và củ, tương đồng với chủng phân lập từ đất về đặc điểm khuẩn

lạc, sắc tố tiết ra môi trường, hoạt tính enzyme ngoại bào (NB02 - NB24,

NB06 - NB29, NB07 - NB21, NB16 - NB37). Kết quả càng củng cố thêm

tính đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng.

CHƯƠNG IV

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết Luận

 Từ mẫu đất vùng rễ cây nghệ vàng (Curcumin longa L.) thu tại thời điểm

sau khi cấy 1 tháng (N1t) và 11 tháng (N11t), Phân lập bào tử AM cho tổng số

bào tử trong 100g đất N1t: 19  1bào tử và N11t: 94  1 bào tử.

 Bằng phương pháp phân tích metagenomics các mẫu đất thu được:

- Đã đánh giá ảnh hưởng thời gian thu mẫu tới thành phần khu hệ nấm AM

vùng rễ. Xác định thời gian thu mẫu tối ưu nhất là khi thu hoạch (11

tháng).

- Xác định ảnh hưởng, tác động của nhân tố nitơ đến khu hệ nấm AM, hàm

lượng nitơ 150kg/ha/năm là điều kiện tối ưu nitơ tốt nhất cho khu hệ nấm

AM vùng rễ cây nghệ vàng.

 Từ mẫu rễ, đất vùng rễ cây nghệ vàng (Curcumin longa L.) đã phân lập

và phân nhóm được 39 chủng nấm vùng rễ với các màu sắc khuẩn lạc đa dạng,

trong đó khuẩn lạc màu trắng đặc trưng nhất.

- Xác định được khả năng sinh enzyme sinh ngoại bào của các chủng phân

lập được.

- Một số chủng nấm tương đồng màu sắc khuẩn lạc, hoạt tính sinh enzyme

ngoại bào (NB02 - NB24, NB06 - NB29, NB07 - NB21, NB16 - NB37) .

4.2. Kiến nghị

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy nghiên cứu khu hệ nấm vùng rễ là hướng

nghiên cứu có tiềm năng rất lớn. Đặc biệt là trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên

nhằm tìm ra những hợp chất mới và trong lĩnh vực y học và nông nghiệp. Vì

vậy nên chúng tôi đề nghị được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về khu hệ nấm

vùng rễ cây nghệ vàng (Curcumin longa L.) bằng phương pháp phân lập cổ điển

và kỹ thuật metagenomics.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Thị Kim Liên, Lê Thị Thủy, Nguyễn Viết Hiệp, Nguyễn Huy

Hoàng, Nghiên cứu đa dạng hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza

trong đất và rễ cam tại Quỳ Hợp, Nghệ An, Tạp chí sinh học, 34(4)

(2012) 441.

2. Lê Quốc Huy, Nguyễn Minh Châu, 2004. Công nghệ nấm rễ ứng dụng

keo lai và keo tai tượng vườn ươm và rừng trồng. Tạp chí KH & CN, Bộ

NN&PTNT 3, tr. 400-404.

3. Phạm Quang Thu, Đặng Như Quỳnh (2008), “Đặc điểm sinh trưởng của

hệ sợi và sự hình thành rễ nấm của một số loài nấm ngoại cộng sinh với

bạch đàn trong nuôi cấy thuần khiết”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển

nông thôn 12, tr.84-90.

4. Phạm Quang Thu, Đặng Như Quỳnh, (2007), “Thành phần nấm ngoại

cộng sinh với bạch đàn và thông”. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn, số 18 tháng 11/2007.

5. Tăng Thị Chính, Bùi Văn Cường, (2007). “Nghiên cứu sự đa dạng nấm

cộng sinh Arbuscular mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ đất ô nhiễm chì”. Báo

cáo khoa học về Sinh thái và Tài nguyên sinh vât, Hội nghị khoa học toàn

quốc lần thứ hai, Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, 1, tr:216-221.

6. Trần Thị Dạ Thảo, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến (2007), “Ảnh hưởng

của phân lân đến sinh trưởng, năng suất, sự tồn lưu dinh dưỡng và mật độ

nấm cộng sinh của bắp (Zea mays L.) trên vùng đất xám tỉnh Tây Ninh vụ

Đông Xuân năm 2004-2005”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông Lâm

Nghiệp (1&2), tr. 82-87.

7. Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Nguyễn Đình Luyện, Posta

Katalin, Lê Mai Hương, Phân lập, nhân nuôi lưu giữ và định tên một số

nấm rễ nội cộng sinh trên cây lúa và cà chua ở Bắc Việt Nam, Tạp chí

Khoa học và Công nghệ 50 (4) (2012) 521.

8. Trần Văn Mão (2004), “Ứng dụng nấm cộng sinh và sinh vật phòng trừ

sâu hại”, Sử dụng vi sinh vật có ích tập 2.

9. Võ Văn Chi (1997), “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, Nxb. Y học, Hà Nội,

tr 267-270.

TIẾNG ANH

10. Allen EE and Banfield JF (2005). Community genomics in microbial

ecology and evolution. Nat Rev Microbiol 3: 489-498.

11. Bi Guochang, Zang Mu, Guo Xiuzhen (1989), “Distribution of

ectomycorrhizal fungi under several chief forest types in alpine coniferou

region of northwestern yunnan”, Scientia Silvae Sinicae, 25(1), pp. 33-39.

12. Cathy L. Cripps and Leslie H. Eddington (2005) Distribution of

Mycorrhizal Types among Alpine Vascular Plant Families on the

Beartooth Plateau, R°Cky Mountains, U.S.A., in Reference to Large-

Scale Patterns in Arctic–Alpine Habitats. Arctic, Antarctic, and Alpine

Research, 37, (2), 2005, pp. 177–188

13. Chen K and Patcher L (2005). Bioinformatics for whole-genome shortgun

sequencing of microbial communities. PLoS Comput Biol 1: 24.

14. Douds D.D., and Millner P.D., (1999). “Biodiversity of arbuscular

mycorrhizal fungi in agroecosystems”. Agr Eco Env, 74, pp. 77-99.

15. Douds D.D., and Millner P.D., (1999). “Biodiversity of arbuscular

mycorrhizal fungi in agroecosystems”. Agr Eco Env, 74, pp. 77-99.

16. Gallo M.B.C., Guimarase D. O., Luciano da S. Momesso, Monica T.

Pupo (2008), “Natural Products from Endophytic Fungi”, Microbial

Biotechnology, pp. 139-168.

17. González-Chávez, C., D’Haen, J., Vangronsveld, J., Dodd, J.C., (2002).

“Coper sorption and accumulation by the extraradical mycelium

ofdifferent Glomus spp. (arbuscular mycorrhizal fungi) isolated from the

same polluted soil”. Plant and Soil 240, pp. 287 – 297

18. Guhardja E., “Rainforest ecosystems of East Kalimantan” (2000),

Springer, pp. 1130-1154.

19. Gupta, P.K., (2000), “Soil, plant, water and fertilizer analysis”. Vedems

eBooks(P)Ltd(India), chapter 13, pp. 246-255

20. Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM (1998)

Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a

new frontier for natural products. Chem Biol 5(10): 245-249.

21. Healy FG, Ray RM, Aldrich HC, Wilkie AC, ILO and Shanmugam KT

(1995). Direct isolation of functional genes encoding cellulases from the

microbial consortia in a thermophilic, anaerobic digester maintained on

lign°Cellulose. Appl Microbiol Biotechnol 43: 667-674.

22. Iqbal Z, Caccamo M, Turner I, Flicek P and McVean G (2012). De novo

assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn graphs. Nat

Genet 44: 226-232.

23. Jan-Erik Nylund (1978), “The ectomycorrhizal infection zone and its

relation to acids polysaccharides of cortical cell walls”, New Phytologist,

106, pp. 505-516.

24. Julie C. Lee, Emil Lobkovsky, Nathan B. Pliam, Gary Strobel, and Jon

Clardy (1995). Subglutinols A and B: Immunosuppressive compounds from

the endophytic fungus Fusarium subglutinans. 60 (22), pp 7076–7077

25. Luciano Avio, Maurizio Castaldini, Arturo Fabiani, Stefano Bedini,

Cristiana Sbrana, Alessandra Turrini, Manuela Giovannetti (2013).

Impact of nitrogen fertilization and soil tillage on arbuscular mycorrhizal

fungal communities in a Mediterranean agroecosystem, Soil Biology and

Biochemistry 67, P 285-294

26. Lussier FX, Chambenoit O, Côté A, Hupé JF, Denis F, Juteau P, Beaudet

R and Shareck F (2011). Construction and functional screening of a

metagenomic library using a T7 RNA polymerase-based expression

cosmid vector. J Ind Microbiol Biotechnol 38 (9): 1321-1328.

27. Mei-ling XU, Jiao-jun ZHU, Hong-zhang KANG, Jin-xin Zhang, Feng-

qin Li (2008), “Optimun conditions for pure culture of major

ectomycorrhizal fungi obtained from Pinus Sylvestris var. Mongolica

plantation in southeastern Keerpin sandy lands, China”, Journal of

Forestry Research, Springer, pp. 113-118.

28. Pace NB and Delong EF (1991). Analysis of a marine picoplankton

community by 16S rRNA gene cloning and sequencing. Journal of

Bacteriology 173 (14): 4371-4378.

29. Pace NB, Stahl DA, Lane DJ and Olsen GJ (1985). Analyzing natural

microbial populations by rRNA sequences. ASM News 51: 4-12.

30. Rai M.K., Varma A. (2005). ”Arbuscular mycorrhiza like biotechnological

potential of piriformospora indica, which promotes the growth of Adhatpda

vasica Nees”. Elect. J. Biotechnol. Chile, 8, pp. 107-112

31. Riesenfeld CS, Goodman RM and Handelsman J (2004). Uncultured soil

bacteria are a reservoir of new antibiotic resistance genes. Environ

Microbiol 6: 981-989

32. Russell J., Rodriguez Regina S. Redman Joan M. Henson (2005),

“Symbiotic Lifestyle Expression by Fungal Endophytes and the

Adaptation of Plants to Stress: UNBaveling the Complexities of

Intimacy”, Taylor & Francis Group, LLC 34, pp. 683-695.

33. S.E Smith. and D.J. Read (1997), “Mycorrhizal Symbiosis” (2nd Edition).

Academic Press: London, UK, 2, pp. 605.

34. Stein JL, Marsh TL, Wu KY, Shizuya H, DeLong EF (1996).

Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a

40- kilobase-pair genome fragment front a planktonic marine

archaeon. J Bacteriol 178: 591-599

35. Taylor T. N, Remy W, Hass A, and Kerp H. (1995). Fossil arbuscular

mycorrhizae from the Early Devonian. Mycologia 87, pp. 560 – 573.

36. Tringe SG, Von Mering C, Kobayashi A, Salamov AA, Chen K, Chang

HW, Podar M, Short JM, Mathur EJ and Detter JC (2005). Comparative

metagenomics of microbial communities. Science 308: 554557.

37. Turmel. M.S.,(2004). “Exposing the Mycorrhizaes in Agriculture”

University of Manitoba, Winnipeg, MB R3T 2N2.

38. Tyson GW, Chapman J, Hugenholtz P, Allen EE, Ram RJ, Richardson

PM, Solovyev VV, Rubin EM, Rokhsar DS and Banfield JF (2004).

Community structure and metabolism through reconstruction of

microbial genomes from the environment. Nature 428: 37-43.

39. Vanden B.D.A., Vlietlinck A.J.,(1991), “Methods in Plant Biochemistry”,

Academic press , NewYork.

40. Venter JC; Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D, Eisen

JA, Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson W, FOTUs DE, Levy S, Knap

AH, Lomas MW, Nealson K, White O, Peterson J, Hoffman J, Parsons R,

Baden-Tillson H, Pfannkoch C, Rogers Y, Smith HO (2004).

Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea.

Science 304 (5667): 66-74.

41. Vestberg M., Saari K., Kukkonen S., Hurme T., (2005). ”Mycotrophy of

crops in rotation and soil amendment with peat influence the abundance

and effectiveness of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi in field

soil”. Mycorrhiza 15(6), pp. 447-458.

42. X Hardeman F and S Sjoling (2007). Metagenomic approach for the

isolation of a novel low-temperature-active lipase from uncultured

bacteria of marine sediment. FEMS Microbiol Ecol 59: 524-53

TÀI LIỆU WEBSIDE

43. httf://mycorrhizas.info/vam.html

44. https.//invam.wvu.edu

45. httf://invam.caf.wvu.edu/index.html

46. https://en.wikipedia.org/wiki/Ectomycorrhiza

47. https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Endomycorrhizal_fungi

48. http://vtvcantho.vn/cach-trong-va-cham-soc-cay-nghe-vang-6604.html

PHỤ LỤC

Hình ảnh một số chủng nấm phân lập được

STT Kí hiệu Đặc điểm khuẩn lạc

1 NB01

2 NB02

3 NB03

4 NB04

5 NB05

6 NB06

7 NB07

8 NB08

9 NB09

10 NB10

11 NB11

12 NB12

13 NB13

15 NB15

16 NB16

20 NB20

21 NB21

22 NB29

23 NB34