ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––
TRƯƠNG MẠNH TIẾN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ
ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI
HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––
TRƯƠNG MẠNH TIẾN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ
ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI
HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy. Các kết quả nghiên cứu là trung
thực, một phần đã được công bố trên Tạp chí Khoa học và công nghệ - Đại học
Thái Nguyên với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại
chưa được ai công bố ở bất cứ công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019
Tác giả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Trương Mạnh Tiến
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy,
khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo,
hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,
truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban
giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cô các phòng ban
chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT
Số 3 Bảo Thắng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập.
Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã
luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em.
Luận văn là sản phẩm của Nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ có mã số B2018-
TNA-04-GEN do PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo
dục sinh học làm chủ nhiệm.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019
Tác giả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Trương Mạnh Tiến
MỤC LỤC
Lời cam đoan ........................................................................................................ i
Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ......................................................................................... iv
Danh mục các bảng .............................................................................................. v
Danh mục các hình ............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Cây Bảy lá một hoa ...................................................................................... 3
1.1.1. Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại ............................ 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa ........................................ 4
1.1.3. Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa......................................................... 5
1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa ........................................................... 6
1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ...................................................... 9
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 9
1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử ........................................................ 12
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 22
2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 22
2.1.1. Vật liệu thực vật....................................................................................... 22
2.1.2. Vật liệu nhân gen matK, ITS .................................................................... 22
2.1.3. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 23
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.2.1. Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa .... 23
2.2.2. Phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen .............. 24
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 25
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 26
3.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa ....... 26
3.1.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái .............................................. 26
3.1.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm giải phẫu.............................................. 27
3.2. Đặc điểm đoạn gen matK và vùng gen ITS của mẫu cây Bảy lá một hoa ........ 30
3.2.1. Đặc điểm đoạn gen matK ........................................................................ 31
3.2.2. Đặc điểm vùng gen ITS ........................................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 37
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 39
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BLAST : Basic Local Aligment Search Tool
DNA : Deoxyribose nucleic acid
: Đồng tác giả đtg
: Internal Transcribed Spacer ITS
: Kilobase kb
: Maturase K matK
NCBI : The National Center for Biotechnology Information
PCR : Polymerase Chain Reaction
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
rpoC1 : RNA polymerase beta' subunit
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam ..................... 8
Bảng 1.2. Một số thông tin về gen matK của chi Paris .................................... 14
Bảng 1.3. Một số thông tin về vùng ITS của chi Paris ..................................... 16
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong
phân loại thực vật ............................................................................. 17
Bảng 1.5. Mã vạch DNA trong định danh cây Bảy lá một hoa tại Thái Nguyên .. 20
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR ..... 22
Bảng 3.1. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
tại Bắc Sơn- Lạng Sơn dựa trên trình tự đoạn gen matK ................ 33
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tại Bắc Sơn - Lạng Sơn dựa trên trình tự vùng gen ITS .................. 35
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa ........................ 4
Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam ............................. 8
Hình 1.3. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS ......................................... 15
Hình 2.1. Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn .............. 22
Hình 3.1. Hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng
Sơn trồng trong vườn trường Đại học Sư phạm .............................. 26
Hình 3.2. Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu cây Bảy lá một hoa .................... 28
Hình 3.3. Hình ảnh giải phẫu thân cây Bảy lá một hoa ................................... 29
Hình 3.4. Hình ảnh giải phẫu rễ cây Bảy lá một hoa ....................................... 30
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả tách chiết DNA tổng số trên gel agarose 1% ...... 31
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK
từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ........... 31
Hình 3.7. Kết quả phân tích gen matK bằng BLAST trong NCBI ................. 32
Hình 3.8. Trình tự đoạn gen matK của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ...... 32
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên đoạn gen matK
của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn ............ 33
Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS từ
mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ............... 34
Hình 3.11. Kết quả phân tích bằng BLAST trình tự nucleotide vùng gen
ITS trong NCBI ................................................................................ 34
Hình 3.12. Trình tự vùng gen ITS của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ... 35
Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
của các mẫu nghiên cứu ................................................................... 36
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bảy lá một hoa là tên gọi chung thông dụng ở Việt Nam của nhiều loài
thuộc chi Paris. Bảy lá một hoa còn gọi là củ rắn cắn, hưu túc nhiều lá, hưu túc
vân nam, trọng lâu hải nam … thuộc loại dược liệu quý hiếm có nguy cơ tuyệt
chủng cần bảo vệ ở Việt Nam. Theo Nguyễn Tâp (2004, 2007), nhiều loài
thuộc chi Paris nằm trong sách đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN
(International Union for Conservation of Nature) ở mức nguy cấp (tiếng
Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếng Anh: Vulnerable, viết
tắt VU) [20], [21]. Cây Bảy lá một hoa có khả năng chữa trị nhiều bệnh từ các
bệnh thông thường như sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữa ho…đến các bệnh nan
y như: rắn độc cắn, ung thư… Vì vậy, Bảy lá một hoa là đối tượng nghiên cứu
của nhiều nhà khoa học.
Trên thế giới, chi Paris có 22 loài và nhiều thứ [56]. Ở Việt Nam cây được
tìm thấy chủ yếu ở các vùng núi phía Bắc, như một số tỉnh: Lào Cai, Hà Giang,
Lai Châu, Cao Bằng, Hòa Bình... Cây sống trong điều kiện núi cao, nhiệt độ
lạnh, sống dưới tán rừng. Mỗi năm cây chỉ ra hoa 1 lần vào khoảng tháng 4 -6,
tạo quả vào khoảng tháng 7-11 sau đó lụi đi, thời gian ủ đông của cây khá lâu.
Các loài trong chi Paris khá đa dạng và có sự tương đồng cao về hình thái.
Năm 2016, Nguyen Quynh Nga và đtg đã được thiết lập khóa phân loại bằng
việc mô tả hình thái, giải phẫu của 8 loài (species) và 2 thứ (varieties) ở Việt
Nam [43].
Có thể nhận diện thực vật bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các
phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hình
thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu này đã thành công trên
một số đối tượng cây trồng như Hà thủ ô đỏ [9], Sóng rắn [28], Phong lữ thảo
[6]… Tuy nhiên, phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả nếu như cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
không còn nguyên vẹn.
Công nghệ sinh học hiện đại phát triển đã bổ sung vào hệ thống phân loại
phương pháp nhận diện dựa vào các chỉ thị phân tử. Trong đó, mã vạch DNA
được lựa chọn là một trong các phương tiện nhận biết mới. Một số mã vạch
DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược
liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong
lục lạp được xác định mang lại những thành tựu nhất định trong nhận diện cây
trồng [37],… Vùng gen ITS nằm trong nhân tế bào, bao gồm trình tự ITS1-
5.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều trong định danh thực vật.
Các nghiên cứu xác định mối quan hệ của các loài thực vật dựa trên trình tự
vùng gen ITS ở cây gỗ Sưa, gỗ Trắc, gỗ Cẩm lai [18], hay các các chi Erica
[45], Scrophularia [48], Potamogeto [55] và nhiều thực vật khác là minh chứng
cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng [34], [53]…
Huyện Bắc Sơn là huyện miền núi của tỉnh Lạng Sơn, thuộc vùng Đông
Bắc Việt Nam. Phía Tây của huyện Bắc Sơn giáp huyện Võ Nhai của tỉnh Thái
Nguyên. Ở đây có nhiều núi cao từ 500 m đến hơn 1000 m so với mặt nước
biển, được phát hiện có sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [57], [59]. Xuất phát
từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình
thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS của cây Bảy lá một hoa thu
tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mô tả được đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS
của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa thu
thập được ở Bắc Sơn - Lạng Sơn
3.2. Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS, đoạn gen matK từ mẫu cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây Bảy lá một hoa
1.1.1. Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại
Paris là tên gọi chung của một chi của thực vật có hoa, được mô tả bởi
Linnaeus từ năm 1753 [12]. Đến nay, việc phân loại chi Paris vẫn chưa có sự
thống nhất. Dưới dây là 3 cách phân loại đang được sử dụng:
(1) Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi
Paris thuộc phân giới thực vật bậc cao; ngành Ngọc lan (Magnoliophyta); lớp
Hành (Liliopsida); phân lớp Loa kèn (Lilidae); bộ Củ nâu (Dioscoreales); họ Bảy
lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae), chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris) [4].
(2) Thực vật chí Trung Quốc (năm 2000) đã mô tả hình thái và xếp chi
Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài (species) và 16 thứ (variety-var.)
trong đó có 12 loài đặc hữu [40].
(3) Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III - Angiosperm Phylogeny
Group - (năm 2009) dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử, chi Paris (chi
Trọng lâu) được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae) với tổng số 26 loài
và 13 thứ [56].
Chi Paris phân bố chủ yếu ở châu Âu và châu Á, đặc biệt tập trung nhiều
ở Trung Quốc. Theo tạp chí “Flora of China” (2000), chi Paris được mô tả gồm
22 loài với nhiều thứ khác nhau.
Trong chi Paris, Paris polyphylla Smith là loài được tìm thấy sớm nhất
(năm 1813). Loài này hiện được công bố chi tiết có tới 10 thứ [40].
Mười thứ (variety) thuộc chi Paris gồm:
1) Paris polyphylla var polyphylla (tên tương ứng Daiwa polyphylla Sm.);
2) Paris polyphylla var yunanensis;
3) Paris polyphylla var chinensis;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
4) Paris polyphylla var nana;
5) Paris polyphylla var alba;
6) Paris polyphylla var stenophylla;
7) Paris polyphylla var minor;
8) Paris polyphylla var latifolia;
9) Paris polyphylla var pseudothibetica;
10) Paris polyphylla var kwantungensis
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa là cây thân cỏ một năm. Một cây Bảy lá một hoa hoàn
chỉnh sẽ gồm các phần: rễ, thân củ, thân thảo, lá, hoa/quả [12], [21], [40], [43].
Một số cơ quan của cây Bảy lá một hoa được mô tả trên hình 1.1.
a. Hoa
d. Quả và hạt
b. Lá
e. Thân củ
f. Rễ c. Thân
cỏ
Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa
(Hình ảnh là sản phẩm của nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ GD-ĐT giai đoạn 2016-2019)
Thân cỏ là phần thân nằm trên mặt đất, thường lụi đi vào cuối thu. Kiểu
thân cỏ sẽ không có cấu tạo thứ cấp [17]. Thân cỏ của cây Bảy lá một hoa cao
hàng chục cm đến hàng trăm cm (Paris dunniana cao 1,5-3 m). Thân cỏ thon
dài, trơn nhẵn, mọng nước, không có cành, phía gốc có một số lá thoái hoá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thành vẩy, bao lấy thân. Giữa thân có một tầng lá mọc vòng khoảng 3 đến 12
lá, đa số các loài có từ 4 đến 6 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình
mác, hình trứng, bầu dục… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt
trên màu xanh đậm, mặt dưới màu nhạt hơn [40].
Mỗi cây chỉ có một hoa mọc trên đỉnh cây. Mỗi hoa đều có cuống dài
hàng chục cm. Hoa có đầy đủ các phần đài, tràng, nhị, nhụy.
Quả của cây Bảy lá một hoa là quả đơn, có một mầu duy nhất. Vỏ quả
màu xanh, khi quả chín vỏ có màu xám- đen. Quả chín sẽ tự mở vỏ để cho hạt
thoát ra ngoài. Hạt của cây bảy lá một hoa thuộc kiểu hạt có nội nhũ. Hạt gồm
có vỏ màu đỏ bao bọc phôi và nội nhũ (hình 1.1 d). Về mặt lý thuyết, ở những
hạt kiểu này, phôi thường nhỏ, đôi khi còn chưa có sự phân hóa hoàn toàn [17].
Thân củ là phần nằm dưới mặt đất. Thân củ của cây Bảy lá một hoa có
chứa chất dự trữ để cây sử dụng khi ra hoa, tạo quả, mọc chồi [17]. Thân củ
phình to, thường nằm ngang, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu
xám đen. Trên thân củ có những mắt mang các sẹo của lá thoái hóa, trong nách
các sẹo đó có các chồi nách.
Cây Bảy lá một hoa có kiểu rễ của “cây có rễ phụ” [17]. Rễ phụ mục ra
từ thân củ. Các rễ tương đối đồng đều về kích thước, thường màu nâu và có
hình trụ.
Cây Bảy lá một hoa thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độ
cao trên 600m và ưa bóng, hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn. Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cm
mới thấy có hoa, quả [30].
1.1.3. Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa
Theo y học cổ truyền, cây Bảy lá một hoa có công dụng trong điều trị một
số bệnh nan y như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô.
Thân rễ Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, có tác dụng
lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc, chữa sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ho… [23], [30].
Ở Ấn Độ và Nê-pan, thân rễ Bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uống
bột thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong 2 ngày. Để trị mụn
nhọt và nhọt độc, hằng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ Bảy lá một hoa một
cách đều đặn. Ngoài ra, thân rễ Bảy lá một hoa còn được sử dụng để chống co
thắt, dễ tiêu hóa ở dạ dày, dùng làm thuốc long đờm, giải độc rắn cắn và dùng
để làm giảm ảnh hưởng của thuốc mê [12].
Một số bài thuốc quý được tuyên truyền phổ biến trong dân gian để chữa
bệnh bằng cây Bảy lá một hoa [58].
* Chữa rắn độc cắn bằng cách kết hợp thuốc uống và đắp ngoài. Theo đó,
sử dụng thân và rễ cây khoảng 4 - 8 g, Thanh mộc hương 4 g, nhai sống uống
với nước đun sôi để nguội. Đắp ngoài bằng cách dùng thuốc giã với dấm đắp
lên vùng rắn cắn.
* Trị ung nhọt, áp xe vú, quai bị, lao hạch cổ: Dùng thân rễ 8g, Bồ công
anh 40 g sắc lấy nước uống và phần bã đắp bên ngoài vết thương.
* Trị viêm phế quản mạn tính: Dùng thân rễ nghiền thành bột, mỗi lần
uống 3 g với nước, ngày uống 2 lần.
Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại còn cho thấy các thành phần trong
cây Bảy lá một hoa có Saponin được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh ung thư
[38], [41], chống các chất oxy hóa [49]. Cơ chế chống ung thư của các dược
chất trong cây Bảy lá một hoa còn chưa rõ ràng, tuy nhiên theo hướng các
saponin kích thích tế bào chết theo chương trình (apoptosis) [41]. Bên cạnh
saponin là dược chất quan trọng, trong thân rễ của cây Bảy lá một hoa người ta
cũng phát hiện thấy 1 glucoside được gọi là paristaphin. Khi thuỷ phân
paristaphin sẽ cho glucose và một glucoside mới gọi là paridin, thuỷ phân
paridin, ta lại được glucose và một chất nhựa gọi là paridol [12].
1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa
Cây Bảy lá một hoa có những đòi hỏi riêng biệt về điều kiện sống. Theo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
đó, kết quả nghiên cứu cho thấy đa số các loài được phát hiện mọc hoang ở
những khe núi ẩm ướt, có độ cao so với mặt nước biển hàng trăm mét và ưa
bóng. Ngoài ra, cây còn mọc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn, cây không chịu được úng. Phần thân trên mặt đất lụi đi hàng năm,
thường vào cuối thu. Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa đông và
mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau. Cây chưa được trồng trên quy mô lớn
mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc tại một số địa phương theo phương
thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ. Theo đó, hàng năm vào
khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo trong vườn ươm
hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo. Mỗi cây chỉ có một hoa,
mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao, tuy nhiên
đây vẫn là hình thức chính để cây tái sinh trong tự nhiên. Thân rễ Bảy lá
một hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng. Thời
vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [30].
Ở Ấn độ, kế hoạch bảo tồn Paris polyphylla đã được thiết lập. Theo nhóm
nghiên cứu ở Ấn Độ, lượng mưa là yếu tố chi phối khu phân bố của Paris
polyphylla, và nhiệt độ thích hợp với Paris polyphylla là 19OC [42].
Nghiên cứu của Y Teerawatsakul và đtg (2014) việc nuôi cấy chồi đỉnh
của Paris polyphylla chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, trong đó nuôi cấy chóp rễ
với nhiệt độ thấp hơn 14OC và cao hơn 18OC đều không làm biến đổi mẫu cấy.
Nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy chồi đỉnh (shoot tip) là 14-160C, trong
khoảng nhiệt độ này sau 45 ngày nuôi cấy mẫu tăng hơn 7,5 cm [54].
Việc đánh giá và phân hạng các cây thuốc thuộc diện quý hiếm có nguy
cơ bị tuyệt chủng, cần bảo vệ ở Việt Nam được Nguyễn Tập đề cập đến trong
các năm 2004, 2007 [20], [21]. Theo đó, ở Việt Nam chi Paris thuộc họ Trọng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
lâu (Trilliaceae) có các loài trong danh lục đỏ cần bảo vệ trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam
STT
Tên khoa học
Tên Việt Nam
Phân hạng theo IUCN, 1994
1
Trọng lâu lá dài
Tài liệu tham khảo [20]
EN.A1c,d EN.A1c,d
2
Củ rắn cắn, Bảy lá một hoa
Paris delavayi Franch Paris fargesii Franch (Paris petiolata Baker ex Wight var. ramembnaceae Wight)
[15]
3
Paris hainanensis Merr
Trọng lâu hải nam
4
Paris polyphylla Smith
Bảy lá một hoa
5
Paris yunnanensis Franch.
Trọng lâu vân nam
6
Paris chinensis Franch.
Trọng lâu tàu
VU.B2a,b (ii,iii,v) EN.B2a,b (ii,iii,v) EN.B2a,b (ii,iii,v) VU.B2a,b (ii,iii,v)
P. vietnamensis [52]
P. fargesii [25]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam (Hình ảnh thuộc sản phẩm của nhóm nghiên cứu, trong nhiệm vụ quỹ GEN cấp bộ giai đoạn 2016-2019)
Cây Bảy lá một hoa được tìm thấy ở một số tỉnh thành của Việt Nam như
Sapa- Lào Cai, Cúc Phương- Ninh Bình, Đại Từ- Thái Nguyên, Tam Đảo - Phú
Thọ... và đã được xếp vào Sách Đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN ở
mức nguy cấp (tiếng Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếng
Anh: Vulnerable, viết tắt VU) [4], [10], [12], [20], [21]. Hiện nay tại một số địa
phương miền núi phía Bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn đã thành lập Ban
chỉ đạo dự án trên cơ sở phân tích các điều kiện khí hậu, đối chiếu với đặc
điểm sinh thái cây trồng nhằm đánh giá mức độ thích nghi của một số cây dược
liệu đối với điều kiện khí hậu. Từ đó kết hợp với đánh giá tác động môi trường
và phân tích chi phí lợi ích để đưa ra những định hướng quy hoạch mở rộng
diện tích một số cây dược liệu trong vùng, trong đó có thảo dược Bảy lá một
hoa [2],[19], [57].
1.2. Một số phương pháp định danh thực vật
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu
Trong lịch sử phát triển thực vật học thì hình thái, giải phẫu thực vật phát
triển tương đối sớm. Từ những năm 371-286 TCN, Theophraste được gọi là
người sáng lập môn thực vật học. Ông đã công bố các dẫn liệu hình thái giải
phẫu của cơ thể thực vật trong các tác phẩm “Lịch sử thực vật”, “Nghiên cứu
về cây cỏ” [9].
Phương pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về thực vật vẫn là quan sát, so
sánh trên cơ sở các dữ kiện ngoài thiên nhiên, sau đó tiến hành giải phẫu trong
phòng thí nghiệm, so sánh các mẫu thu thập khác đã được lưu giữ, cuối cùng là
phân tích, tổng hợp và rút ra nhận xét. Để phân biệt các loại tế bào hay thành
phần cấu tạo các loại mô trong cơ quan, thường các lát cắt được nhuộm màu và
tùy theo yêu cầu quan sát phần nào mà sẽ nhuộm màu gì cho phù hợp. Trong
phòng thí nghiệm thực vật, để nhận biết tế bào có vách bằng celulose sẽ nhuộm
đỏ bằng carmin, tế bào có vách tẩm mộc tố sẽ được nhuộm xanh với lục iod,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nhân tế bào được nhuộm bằng hematoxylin…[17].
Ở Việt Nam, dưới thời Pháp đô hộ chỉ có công trình nghiên cứu về giải
phẫu gỗ của H Lecomte và sau khi miền Bắc được giải phóng năm 1954 thì
việc nghiên cứu và giảng dạy hình thái giải phẫu được chú ý nhiều ở các trường
phổ thông và đại học. Hiện nay ngày càng có nhiều công trình đi sâu tìm hiểu
về hình thái và giải phẫu của các loài thực vật, nhất là những loài thực vật có
giá trị làm thuốc và những loài suy giảm nghiêm trọng về số lượng, cần được
bảo tồn.
Năm 2015, trong “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu loài Hà
thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) ở Việt Nam” của Phạm
Thanh Huyền và đtg đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu khóa
phân loại và các bản mô tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa học của
các mẫu Hà thủ ô đỏ [9]. Theo đó, nghiên cứu trên 37 mẫu Hà thủ ô đỏ -
Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson thu tại 10 địa điểm thuộc 8 tỉnh thành,
nhóm nghiên cứu đã xác định được ở Việt Nam hiện có 3 thứ của loài Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson gồm: F. multiflora var. multiflora (Thunb.)
Haraldson; F. mutiflora var. angulata (S.Y. Liu) H. J. Yan, Z. J. Fang & S. X.
Yu và F. multiflora var. ciliinervis (Nakai) Yonek. & H.Ohashi. Nghiên cứu về
hình thái đã giúp các tác giả xây dựng được khóa phân loại cho các thứ của loài
này ở Việt Nam. Đã mô tả được chi tiết đặc điểm hình thái loài Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson, cũng như các thứ của loài, cùng với đặc điểm
giải phẫu các bộ phận rễ, thân, lá. Kết quả thu được là những dẫn liệu bổ sung
cho các tài liệu trong nước về loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson,
đồng thời đây cũng là dẫn liệu khoa học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và
phát triển loài Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson để tạo
nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc ở Việt Nam [9].
Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Phong lữ thảo (Pelargonium
hortorum L. H. Bailey) của Tạ Lê Mai Hậu và đtg (2016) lần đầu tiên đã mô tả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
đầy đủ các đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu của loài Phong lữ thảo ở Việt
Nam, góp phần bổ sung thêm bộ cơ sở dữ liệu về lý lịch loài nghiên cứu, làm
cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng từ loài cây này [6].
Sóng rắn là một loài cây thuốc được trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ở
tỉnh Thái Nguyên. Loài cây này đã được sử dụng như một vị thuốc y học dân
gian để chữa một số bệnh như zona và các bệnh ngoài da phổ biến. Với mục
đích làm rõ đặc điểm và nâng cao giá trị sử dụng của loài cây này, nhóm nghiên
cứu của Nông Thị Anh Thư và đtg (2017) tại trường Đại học Y dược, Đại học
Thái Nguyên đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần
hóa học và tác dụng giảm đau, chống viêm của dược liệu Sóng rắn thu hái tại
Thái Nguyên”. Nhóm nghiên cứu đã thu thập, xác định tên khoa học của cây
Sóng rắn thu ở Thái Nguyên là Albizia myriophylla Benth., thuộc họ Trinh nữ
(Mimosaceae), trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, giải phẫu thực vật
của cây Sóng rắn ở Thái Nguyên, giúp tránh được việc nhầm lẫn trong thu hái
loài cây này làm dược liệu [28].
Việc sử dụng phương pháp so sánh hình thái đã hỗ trợ trong các nghiên
cứu để định loài. Trong nghiên cứu của Đỗ Văn Hài và đtg (2017) về chi Bạch
hạc (Rhinacanthus Nees) ở Việt Nam đã mô tả đặc điểm nhận biết chi, xây
dựng khóa định loại 2 loài là Rh. calcaratus - Kiến cò móc và Rh. nastusus -
Kiến. Nghiên cứu cũng đã cung cấp các thông tin tóm tắt về phân bố, sinh học
và sinh thái, mẫu nghiên cứu và hình vẽ của các loài thuộc chi này ở Việt Nam
[5]. Hay với nghiên cứu của Bùi Hồng Quang và đtg (2017) đã bổ sung thêm
một loài vào khóa phân loại các loài thuộc chi Ngân hoa (Silvianthus) ở Việt
Nam. Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), Nguyễn Tiến Bân (2005), ở Việt Nam chi
Silvianthus có 1 loài là Silvianthus tonkinensis (Gagnep.) Ridsdale. Trong quá
trình nghiên cứu các mẫu vật của chi này ở Việt Nam, loài Silvianthus
bracteatus Hook. f. trước đây được ghi nhận có ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc
(Vân Nam), nay được nhóm nghiên cứu phát hiện có phân bố Thanh Hóa (Khu
BTTN Pù Hu), Nghệ An (VQG Pù Mát), Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
định được 1 loài bổ sung thêm vào hệ thực vật Việt Nam [16].
Bảy lá một hoa (Paris) cũng là loài được các nhà nghiên cứu quan tâm
và có các công trình nghiên cứu về đặc điểm hình thái giải phẫu, giúp bước đầu
phân biệt các loài trong chi Paris. Phải kể đến đầu tiên là bộ sách “Cây cỏ Việt
Nam” năm 1999 của Phạm Hoàng Hộ đã có những mô tả sơ bộ về hình thái của
một số loài thuộc chi Paris ở Việt Nam bằng hình vẽ [7]. Đến năm 2016, với đề
tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây Bảy lá một hoa ở Việt
Nam” đã mô tả chi tiết đặc điểm cấu tạo giải phẫu của các bộ phận thân khí
sinh, lá, thân rễ, rễ, và bột của thân rễ bảy lá một hoa. Đây là báo cáo lần đầu
tiên về cấu tạo giải phẫu của cây Bảy lá một hoa - Paris chinensis Franch [22].
Nghiên cứu của Nguyễn Tiến Dũng và đtg (2018) về loài Bảy lá một hoa Việt
Nam - Paris vietnamensis (Takht.) H.Li đã xác định được điểm đặc trưng giúp
phân biệt với các loài khác thuộc chi Paris là nhị có trung đới kéo dài hình trụ
ngắn 1 - 1,5mm; cánh hoa dài hơn đài 1,2 - 2 lần; lát cắt ngang qua bầu hình
sao, cánh bầu lõm sâu, nhụy có vòi nhụy (phần hợp) rất ngắn; hạt có áo hạt màu
đỏ [3]. Đặc biệt trong nghiên cứu của Nguyen Quynh Nga và đtg (2016) đã mô
tả đặc điểm hình thái và xây dựng khóa định loại cho 8 loài và 2 thứ thuộc chi
Paris ở Việt Nam [43].
1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,
một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành
và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên
các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của
chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa
chọn các gen khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen để làm căn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
cứ phân loại sinh vật [35].
1.2.2.1. Mã vạch DNA
Khái niệm mã vạch DNA được biết đến rộng rãi từ những năm đầu thế kỉ
XXI. Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Paul Hebert tại Đại học Guelph đề xuất
"mã vạch DNA" (DNA barcode) như là một cách để xác định loài, giống như
cách máy quét trong các siêu thị sử dụng các sọc đen của mã vạch UPC
(Universal Product Code) để xác định các giao dịch mua hàng [44]. Năm 2005,
Savolainen và đtg cho rằng mã vạch DNA bao gồm một chuỗi DNA ngắn (400,
800 bp) được chuẩn hóa về nguyên tắc nên dễ dàng tạo ra và đặc trưng cho tất
cả các loài trên hành tinh [46].
Đối với thực vật việc lựa chọn mã vạch DNA cần phải quan tâm đến các
yếu tố như: (i) khuếch đại PCR mang tính tổng thể, thành công trên nhiều loại
cây, (ii ) phạm vi đa dạng phân loại, sử dụng được cho nhiều loài khác nhau,
(iii) có sự sai khác, đặc trưng phân loại các loài, (iv) sử dụng công cụ tin sinh
học trong phân tích và ứng dụng [35]. Sau khi kiểm tra rộng rãi các vùng gen
trong hệ gen của ty thể, lục lạp và nhân thì bốn đoạn gen/vùng gen chính là
rbcL , matK, trnH - psbA và ITS thường được thống nhất là mã vạch DNA tiêu
chuẩn được lựa chọn cho thực vật [31], [36], [37], [39], [47], [51].
Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dạng
đòi hỏi hai bước cơ bản: (1) xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đã biết
và (2) so sánh mã vạch DNA của một mẫu chưa biết với thư viện mã vạch DNA.
1.2.2.2. Nghiên cứu trên thế giới sử dụng mã vạch DNA
Các mã vạch DNA đã được phát triển, thử nghiệm và sử dụng để giải
quyết các câu hỏi cơ bản về hệ thống, sinh thái, sinh học tiến hóa và bảo tồn,
bao gồm lắp ráp cộng đồng, mạng lưới tương tác loài, khám phá phân loại và
đánh giá các lĩnh vực ưu tiên bảo vệ môi trường.
Gen matK nằm trong hệ gen lục lạp, có chiều dài hơn 150000 bp, mã hóa
cho maturase K- là những enzyme có kích thước khoảng 498-515 amino acid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(bảng 1.2) [60].
Bảng 1.2. Một số thông tin về gen matK của chi Paris
Loài, thứ Mã số trên GENBANK Mã số protein và số amino acid Năm công bố Kích thước đoạn mã hóa MatK (bp)
MK488085 Paris nitida 2019 1497 QBF52262, 498
(1683..3230)
MF495705 Paris marmorata 2018 AXY95438, 515
1548
MF417768 Paris luquanensis 2018 1548 AXY95352, 515
(1677..3224)
KX784050 Paris vietnamensis 2017 APS88082, 515
1548
(1646..3193)
KX784046 Paris mairei 2017 APS87746, 515 1548
(1651..3198) KX784045 Paris luquanensis 2017 APS87662, 515
1548
(1651..3198)
KX784041 Paris cronquistii 2017 APS87326, 515
1548
KR233272 Paris_fargesii 2015 1497 498
Paris polyphylla var. KM242788 2015 1497 498 yunnanensis
Paris polyphylla var. KM242787 2015 1497 498 stenophylla
KM242778 Paris delavayi 2015 1497 498
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Paris polyphylla var. KM242785 2015 1497 AIW53094, 498 chinensis (Korea)
Gen matK thường được sử dụng trong việc định danh, phân loại ở các
loài thực vật hạt kín, là loài chiếm đa số trong các hệ sinh thái hiện nay.
Layhaye và đtg (2008) đã lựa chọn gen matK là một mã vạch ưa thích trong
phân loại thực vật. Nghiên cứu của Lahaye và đtg (2008) chỉ ra rằng mã vạch
DNA thực vật có thể được sử dụng để đánh giá nhận dạng loài trong các điểm
nóng đa dạng sinh học giúp bảo tồn cũng như áp dụng giả thuyết để giám sát
thương mại quốc tế trong các loài Lan đang bị đe dọa [37].
Nhóm nghiên cứu do Savolainen và đtg (2005) sử dụng gen matK để
nhận dạng 1600 loài Lan. Trong quá trình thực hiện, họ phát hiện một loại
trước đây được cho là Lan thực ra lại là hai loài tách biệt. Loài này sống trên
những dốc khác nhau trên núi và có hoa hình dạng khác nhau để thích nghi với
những loài côn trùng thụ phấn khác nhau [50].
ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn đệm nằm giữa gen của tiểu
phần nhỏ và tiểu phần lớn của ribosome (vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2,
hình 1.3).
Hình 1.3. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS
Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá trình tổng hợp
rRNA. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và
nhanh chóng phân hủy. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locut riêng
biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S. Một số thông tin về vùng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ITS của chi Paris được trình bày trên bảng 1.3.
Bảng 1.3. Một số thông tin về vùng ITS của chi Paris [60]
ITS1-5,8S-ITS2 Mã số trên Năm Loài, thứ GENBANK công bố (bp)
2016 661 KX146531 Paris polyphylla var. chinensis
2016 661 KX146530 Paris polyphylla var. chinensis
2016 661 KX146539 Paris polyphylla var. polyphylla
758 MK350326 Paris polyphylla var. pseudothibetica 2019
2003 674 AY192025 Paris cronquistii
2018 705 MK309858 Paris nitida
2009 659 DQ663678 Paris axialis
2019 712 MK350325 Paris delavayi var. delavayi
2019 744 MH711038 Paris fargesii
2019 747 MK346921 Paris fargesii var. brevipetalata
Vùng ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa
dạng di truyền của các loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc
tính di truyền của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho
việc khuếch đại và xác định trình tự DNA ribosome. Trình tự nucleotide vùng
gen ITS đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới khá
phong phú và đa dạng, thuận lợi cho việc phân tích so sánh.
Vùng gen ITS được chứng minh đặc biệt hữu ích trong việc làm sáng tỏ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
mối quan hệ ở các loài trong bảng 1.4 dưới đây:
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS
trong phân loại thực vật
Cấp độ
Đối tượng phân loại phân Năm Tài liệu tham khảo
loại
Phân tông Saccharinae (Poaceae) 2002 Hodkinson và đtg [34] Chi
Chi Plantago (Plantaginaceae) 2002 Ronsted và đtg [35] Loài
Chi Tsuga (Pinaceae) 2008 Havill và đtg [33] Loài
Họ Brassicaceae Tông 2010 Warwick và đtg [53]
Chi Erica (Ericaceae) 2011 Pririe và đtg [45] Loài
Chi Scrophularia (Scrophulariacea) 2014 Scheunert và đtg [48] Loài
Chi Potamogeton (Potamogetonaceae) Loài 2016 Yang và đtg [55]
Một ví dụ về sự khác biệt giữa Schisandra chinensis - Ngũ vị tử bắc với
các loài khác trong chi Schisandra. Li và đtg (2013) đã thấy sự sai khác tại vị
trí 86 bp trên vùng gen ITS, qua sát thấy C → thay A trong các quần thể hoang
dã khi so sánh với quần thể người dân trồng. Vùng ITS2 còn phân biệt rõ ràng
Schisandra chinensis với Schisandra sphenanthera [39].
Một nghiên cứu khác nhằm xác định chi Hoàng kỳ (Astragalus) gồm
nhiều loài có sự tương đồng về hình thái. Trong nghiên cứu này của Gao và đtg
(2009), bốn gen mã hóa (trnH-psbA, rpoC1, rbcL, matK) và hai vùng gen
không mã hóa (ITS, ITS2) được so sánh giữa 319 loài. Mã vạch ITS2 và ITS có
hiệu quả cao hơn đối với việc phân biệt loài [32].
1.2.2.3. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA ở Việt Nam
Việt Nam cũng đã bắt kịp xu hướng khi sử dụng mã vạch DNA vào công
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
cuộc giám định thực vật phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen các loài thực
vật quý hiếm. Những năm gần đây các công trình nghiên cứu sử dụng các đoạn
gen/vùng gen làm mã vạch DNA trong việc phân tích quan hệ di truyền, phân
loại thực vật ngày càng phổ biến.
Năm 2011, Dương Văn Tăng và đtg đã phân lập và xác định trình tự đầy
đủ vùng gen ITS thuộc hệ gen nhân của ba loài gỗ quý Trắc (D.
cochinchinensis), Cẩm lai (D. oliveri) và Sưa (D. tonkinensis) ở Việt Nam và
bổ sung cho Ngân hàng trình tự DNA gen quốc tế. Qua việc phân tích quan hệ
di truyền sử dụng trình tự ITS cho thấy: Sưa (D. tonkinensis) có họ hàng gần
nhất với D. sisso và nằm trong một nhóm lớn với các loài D. frutescens, D.
decipularis, D. brasiliensis và D. congestiflora. Loài Trắc (D. cochinchinensis)
họ hàng gần nhất với Cẩm lai (D. oliveri) [18].
Năm 2014, Nguyễn Thị Phương Trang và đtg đã sử dụng kết hợp 3 vùng
gen lục lạp rbcL, matK, trnH-psbA để nghiên cứu đặc điểm di truyền ba loài
Sao (Hopea) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam gồm Sao hòn gai (Hopea
chinensis), Sao hải nam (H. hainanensis) và Sao mặt quỷ (H. mollissima). Mức
độ khác biệt di truyền rất thấp từ 0,2 đến 0,6 giữa cặp loài nghiên cứu, dùng để
nhận biết và so sánh với các loài khác trên thế giới [29].
Phan Kế long và đtg (2014) cũng sử dụng kết hợp 2 vùng gen matK và ITS
trong việc phân tích mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu
trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide 2 vùng gen đã chọn. Kết quả nghiên cứu
đã giải mã được 1485 nucleotide vùng gen matK và 588 nucleotide vùng gen
ITS-rDNA cho tổng số 17 cá thể của 2 loại Sâm ở Lai Châu bao gồm sâm Lai
Châu (P. vietnamensis var. fuscidiscus) và Tam thất trắng (P. stipuleanatus).
Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA chỉ ra các
loài Sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa. Hai thứ sâm Lai Châu
(P. vietnamensis var. fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha &
Grushv. var. vietnamensis) của loài sâm Việt (P. vietnamensis Ha & Grushv.)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
có quan hệ chị em [11].
Trà hoa vàng Tam Đảo được biết đến là loài đặc hữu của Việt Nam, được
mệnh danh là “vàng xanh” của vùng đất Tam Đảo bởi những lợi ích y học và
kinh tế to lớn mà loài dược liệu này đem lại. Ở Việt Nam có 24 loài thì Vườn
quốc gia Tam Đảo đã có 8 loài trà hoa vàng được tìm thấy. Trong nghiên cứu
của Hà Văn Huân và Nguyễn Văn Phong (2015) đã xác định đoạn mã vạch
DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis). Đoạn gen matK
được nhân bản thành công và xác định trình tự nucleotide với kích thước 951
bp. Trình nucleotide của đoạn gen matK xác định được từ cây Trà hoa vàng
Tam Đảo được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số
KP241692 [8].
Vùng gen rpoC1 (RNA polymerase beta' subunit) được Lý Thị Bôn và đtg
(2017) nghiên cứu sử dụng làm mã vạch DNA trong việc định loại loài Hồng
trầu (Capparis versicolor Griff.). Bằng kỹ thuật PCR, vùng gen rpoC1 đã được
phân lập thành công từ DNA lục lạp có kích thước 527 nucleotide, mã hóa 175
amino acid. Từ kết quả so sánh và phân tích trình tự DNA vùng gen rpoC1 có
thể xác định chính xác mẫu nghiên cứu thuộc chi Capparis, và tạm thời xác
định thuộc loài Capparis versicolor Griff. [1].
Năm 2017, Nguyễn Thị Hồng Mai và đtg đã nghiên cứu đặc điểm phân tử
vùng gen rpoC của loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) và Sưa đỏ
(Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam và ứng dụng phân loại. Chỉ số tương
đồng của vùng gen rpoC từ 2 mẫu nghiên cứu với trình tự tương đồng từ hai
loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis tham khảo là 99%.
Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy vùng gen rpoC có khả năng dùng trong
phân loại các loài của chi Sưa (Dalbergia). Đoạn gen rpoC dài 600 bp của hai
loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis của Việt Nam đã
được đăng ký tại Genbank với mã số lần lượt là KY287755 và KY287750 [13].
Cây Bảy lá một hoa là đối tượng nghiên cứu của nhiệm vụ quỹ GEN trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
các năm từ 2016 đến nay do Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học
chủ trì và thực hiện có những nghiên cứu về mã vạch DNA được trình bày
trong bảng 1.5.
Bảng 1.5. Mã vạch DNA trong định danh cây Bảy lá một hoa tại Thái Nguyên
Đặc điểm Tài liệu tham khảo Loại gen Vật liệu nghiên cứu
Đoạn gen dài 558 bp; Vũ Thị Thu Thủy và Mẫu cây 5 lá thu Tương đồng với Paris đtg [24] rpoC1 thập tại Bình Gia- verticillata (KJ433485) Lạng Sơn 99%
Đoạn gen dài 558 bp; Vũ Thị Thu Thủy và Mẫu cây 7 lá thu Tương đồng với Paris đtg [27] rpoC1 thập tại Sapa- Lào verticillata (KJ433485) Cai 99,1%
Đoạn gen dài 808 bp; Vũ Thị Thu Thủy và
Mẫu cây 6 lá, thu Tương đồng với Paris đtg [26], LT745891 matK tại Sapa- Lào Cai Polyphylla var. [60]
yunanensis
Đoạn gen dài 806 bp; Vũ Thị Thu Thủy và
Mẫu cây 7 lá, thu Tương đồng với Paris đtg [26], LT745892 matK tại Sapa- Lào Cai polyphylla var. [60]
yunanensis
Đoạn gen dài 787 bp; Vũ Thị Thu Thủy và Mẫu cây 7 lá thu Tương đồng với Paris đtg [52], matK thập tại Sapa- Lào vietnamensis LT853583 [60] Cai (KX784050) 96%
Đoạn gen dài 787 bp; Vu Thi Thu Thuy và
Mẫu thu tại Pù Tương đồng với Paris đtg [52], matK Luông- Thanh Hóa vietnamensis LT853584 [60]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(KX784050) 96%
Đặc điểm Tài liệu tham khảo Loại gen
Vật liệu nghiên cứu Mẫu cây 5 lá thu Đoạn gen dài 870 bp; Vũ Thị Thu Thủy và
matK thập tại Sapa - Lào Tương đồng với các loài đtg [25]
Cai thuộc chi Paris trên 98%
Mẫu cây 7 lá thu Đoạn gen dài 675 bp; Vũ Thị Thu Thủy và
ITS thập tại Sapa - Lào Thuộc loài Paris đtg [24], LT853586
Cai vietnamensis 96% [60]
Đoạn gen dài 675 bp; Vũ Thị Thu Thủy và
Mẫu thu tại Pù Thuộc loài Paris đtg [Error!
ITS Luông - Thanh vietnamensis 96% Reference source
not found.], Hóa
LT853587 [60]
Mẫu cây 5 lá thu Đoạn gen dài 675 bp; LT853585 [60]
ITS thập tại Sapa - Lào
Cai
Như vậy, Bảy lá một hoa gồm nhiều loài, phân bố ở nhiều nơi trên thế
giới và nhiều khu vực đặc biệt ở Việt Nam. Cây Bảy lá một hoa thuộc loại thảo
dược có giá trị có thể chữa được cả các bệnh thông thường và các bệnh được
cho là nan y. Cây đang có nguy cơ bị thu hẹp về số lượng. Sự đa dạng về hình
thái và các đặc điểm sinh học khác là những gợi ý để chúng tôi tiếp tục khai
thác thông tin về cây Bảy lá một hoa làm căn cứ để nhận diện và bảo tồn nguồn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
gen cây thảo dược này.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Bắc Sơn - Lạng Sơn trong giai
đoạn còn non, được chuyển về vườn thực nghiệm của khoa Sinh học làm vật
liệu nghiên cứu của đề tài.
Hình 2.1. Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn
(vị trí thu mẫu 21O52’46’’B và 106O12’33’’Đ)
2.1.2. Vật liệu nhân gen matK, ITS
Các cặp mồi nhân gen matK, ITS do phòng Công nghệ tế bào thực vật,
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR
Trình tự nucleotide 5’->3’ Loại mồi Ký hiệu mồi Kích thước dự kiến (bp)
matK-F CGATCTATTCATTCAATATTTC matK 790 matK-R TCTAGCACACGAAGTCGAAGT
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ITS-F ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG ITS 700-800 ITS-R TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC
2.1.3. Hóa chất và thiết bị
Đề tài sử dụng hóa chất của các hãng có uy tín và đảm bảo độ tin cậy
như Merck, Invitrogen,... Một số hóa chất chính có sử dụng trong đề tài như:
xanh methylene, phèn chua, carmín (Trung Quốc), chloroform, isoamy alcohol
(Merck), mồi nhân gen, đệm PCR, Taq polymerase (Invitrogen)...
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu giải phẫu cây là những thiết bị mới,
hiện đại và có độ chính xác cao thuộc phòng thí nghiệm Khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên.
Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử như máy ly tâm (Nhật Bản), máy
điện di (Mỹ), pipet (Eppendorf - Đức), máy đo quang phổ (Đức), máy PCR, kính
hiển vi điện tử Kruss (Đức)... cùng các trang thiết bị khác thuộc Viện Công nghệ
sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 8 năm 2019.
Các thí nghiệm phân tích hình thái, giải phẫu được thực hiện tại Khoa
Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.
Phân lập đoạn gen matK, vùng gen ITS được thực hiện tại Viện Công
nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Luận văn được hoàn thành tại trường Đại học Sư phạm - Đại học
Thái Nguyên.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa
- Nhận diện mẫu cây Bảy lá một hoa dựa vào đặc điểm hình thái được
tiến hành theo Nguyen Quynh Nga và đtg (2016) [43], tài liệu ‘Cây cỏ Việt
Nam’ [7], tài liệu ‘Paris Linaeus” [40].
Các chỉ số nhận diện chính gồm:
Chiều cao thân chính của cây, màu sắc thân cây;
Số lượng lá, hình dạng lá, kích thước lá;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình dạng, màu sắc, số lượng của đài, tràng, nhị, nhụy hoa.
- Phân tích cấu tạo giải phẫu các cơ quan dinh dưỡng (cuống hoa, thân
cây, rễ cây) bằng phương pháp làm tiêu bản theo hướng dẫn của Hoàng Thị Sản
và Nguyễn Thị Phương Nga (2008) [17].
Các bước làm tiêu bản gồm:
+ Cắt ngang thân, rễ, cuống lá thành các lát mỏng, tẩy sạch bằng nước
javen, rồi rửa thật sạch bằng nước thường.
+ Nhuộm kép tiêu bản: nhỏ dung dịch xanh methylen lên đĩa đồng hồ có
chưa mẫu vật để trong vòng 30 phút sau đó rửa lại thật sạch bằng nước thường.
Tiếp đó dùng dung dịch carmin nhỏ vào mẫu vật vừa nhuộm, để trong vòng 30-
45 phút rồi rửa lại thật sạch bằng nước thường.
+ Lên kính: nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, đặt mẫu vật lên trên giọt nước
và đậy lamen.
+ Quan sát, chụp ảnh, và phân tích kết quả thu được.
2.2.2. Phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen
- Tách chiết DNA tổng số bằng bằng quy trình mini-CTAB và kit
DNeasy® Plant Mini Kit của hãng Qiagen;
- Phản ứng PCR được thực hiện để nhân đoạn gen matK với thành phần
gồm: master mix (2X) - 7,5 μl, matK-F (10 pmol/μl) - 0,5 μl, matK-R (10
pmol/μl) - 0,5μl, DNA khuôn (10 ng/μl)- 0,5 μl, H2O - 6 μl. Tổng thể tích phản
ứng là 15 μl.
Chu trình nhiệt nhân bản gen matK: 94OC/4 phút; lặp lại 35 chu kì với
(94OC/30giây, 54OC/40giây, 72OC/40 giây); 72OC/10 phút và giữ ở 4OC.
- Phản ứng PCR được thực hiện để nhân vùng gen ITS có thành phần
gồm: master mix (2X) - 12,5 μl, ITS-F (10 pmol/μl) - 1,0 μl, ITS-R (10
pmol/μl) - 1,0 μl, DNA khuôn (10 ng/μl)- 1,0 μl, H2O - 9,5 μl. Tổng thể
tích phản ứng là 25 μl.
Chu trình nhiệt nhân bản vùng gen ITS: 94OC/4 phút; lặp lại 30 chu kì với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(94OC/30giây, 56OC/30giây, 72OC/45 giây); 72OC/10 phút và giữ ở 4OC.
- Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra gel agarose 1% với sự có mặt
thang DNA chuẩn 1 kb, nhuộm bản gel trong ethydium bromide 5-10 phút, rửa
lại bằng nước và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
- Trình tự nucleotide của đoạn gen matK, của vùng gen ITS được xác định
bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng
bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu.
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Trình tự gen được phân tích, so sánh và xây dựng cây phát sinh chủng loại
bằng các chương trình BLAST (Basic Local Aligment Search Tool), Bioedit và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DNAstar theo hướng dẫn của Chu Hoàng Mậu và đtg (2019) [14].
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa
3.1.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái
Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn trồng
trong vườn thực nghiệm trường Đại học Sư phạm được trình bày ở hình 3.1.
b a
d c
Hình 3.1. Hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn
trồng trong vườn trường Đại học Sư phạm
a: Mẫu cây Bảy lá môt hoa nghiên cứu hoàn chỉnh;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
b: Hình thái hoa c,d: Hình thái lá
Theo hình 3.1 a, cây ở thời điểm nghiên cứu hình thái đang trong thời kì
sinh trưởng, chiều cao thân chính từ đất lên đến tầng cuống lá đạt 40 cm. Thân
cây có màu tím, đậm dần từ gốc lên đỉnh thân. Thân chính mang một tầng lá
mọc vòng gồm 5 lá. Các lá đơn nguyên, mép lá trơn, hơi lượn sóng. Cuống lá
có màu tím, hình trụ, hơi lõm ở phía trên, dài 2,5 cm.
Trục phát hoa tính từ tầng sinh lá đến đế hoa dài 46 cm. Hoa gồm đầy đủ
các phần: đài, tràng, nhị, nhụy. Đài hoa mẫu 5 (bằng với số lá), màu xanh lá
cây, hình mác, kích thước 5,0 (-5,2) × 3,8 (-4) cm. Tràng hoa có màu vàng-
xanh, thẳng hẹp, dài hơn so với lá đài, rộng 1-1.5 (-5) mm. Nhị hoa nhiều, mẫu
16; chỉ nhị 4 mm; bao phấn 6 mm; phần tự do của chỉ nhị 2 mm. Buồng trứng
hình cầu, có gờ nổi lên, có 1 ngăn. Vòi nhụy ngắn, chân đế mở rộng, màu tím.
Đầu nhụy sẻ thùy 5 (hình 3.1 b).
Phiến lá mỏng, có hình xoan ngược, chiều rộng 15,6 cm, chiều dài 26 cm,
chóp lá có mũi 1,5 cm. Lá có màu xanh hơi vàng. Trên phiến lá nổi lên 5 gân
lá, kiểu gân hình cung (hình 3.1 c, d).
Phần củ mọc ngầm dưới đất mang nhiều rễ phụ, các rễ dài khoảng 5 - 7
cm. Củ sần sùi, chia làm nhiều đốt (hình ảnh không báo cáo).
Đối chiếu với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (1999) [7] và mô tả của Liang và
đtg (2000) [40] về mặt hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại huyện
Bắc Sơn, Lạng Sơn thuộc loài Paris polyphylla var chinensis.
3.1.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm giải phẫu
Phương pháp nhuộm kép tiêu bản thực vật được sử dụng để nghiên cứu
đặc điểm giải phẫu các bộ phận (rễ, thân, lá) của mẫu cây Bảy lá một hoa [17].
Giải phẫu cuống lá
Theo hình 3.2, lát cắt giải phẫu cuống lá của cây Bảy lá một hoa thu tại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Băc Sơn- Lạng Sơn có ba loại mô chính: biểu bì, mô mềm, hệ mạch dẫn. Theo
đó, biểu bì là lớp tế bào mỏng ở ngoài cùng. Các tế bào biểu bì hình chữ nhật,
xếp sít nhau. Sau lớp biểu bì là mô mềm. Các tế bào mô mềm có hình hơi tròn
hoặc đa giác tròn ở góc, các tế bào mô mềm chiếm diện tích lớn trong cuống lá.
Trong cùng là một hệ mạch dẫn. Cuống lá của các mẫu cây Bảy lá một hoa
nghiên cứu đều chỉ có một bó dẫn. Các bó dẫn đều có phần mạch gỗ ở trên,
dạng hình cung mà mặt lõm quay lên trên, mạch libe ở dưới. Khi nhuộm màu
Bó dẫn
Mô mềm
Biểu bì
hệ mạch gỗ bắt màu xám, hệ mạch libe bắt màu hồng.
Hình 3.2. Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu cây Bảy lá một hoa
(độ phóng đại 100)
Giải phẫu thân cây
Hình 3.3. mô tả lát cắt ngang của thân cây Bảy lá một hoa. Theo hình
3.3, thân cây Bảy lá một hoa gồm các phần: biểu bì, mô mềm và các bó dẫn
(mạch gỗ và libe). Biểu bì là lớp tế bào mỏng ở ngoài cùng có chức năng bảo
vệ các mô bên trong. Mô mềm là những tế bào hình đa giác tròn đầu, các tế bào
mô mềm ở lớp ngoài có kích thước lớn hơn những tế bào nằm phía trong. Thân
cây Bảy lá một hoa gồm nhiều bó dẫn. Các bó dẫn nằm rải rác trong lớp mô
mềm. Các bó dẫn ở thân kiểu dẫn kín, mạch gỗ thường ở bên trong, mạch libe ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
bên ngoài.
Biểu bì
Mô mềm
Bó dẫn
Hình 3.3. Hình ảnh giải phẫu thân cây Bảy lá một hoa
(độ phóng đại 100)
Giải phẫu rễ cây
Hình 3.4. mô tả lát cắt ngang của rễ cây Bảy lá một hoa. Đối chiếu với tài
liệu của Hoàng Thị Sản và Nguyễn Phương Nga [17] thì phần rễ được chia làm
hai phần lớn gồm phần vỏ và phần trung trụ. Trong mỗi phần lại chia thành
nhiều lớp nhỏ hơn.
(i) Phần vỏ gồm: Biểu bì thường chỉ gồm một lớp tế bào và vỏ sơ cấp. Vỏ
sơ cấp gồm ngoại bì, mô mềm vỏ và nội bì. Ngoại bì có cấu tạo bởi nhiều lớp tế
bào nằm dưới biểu bì, có màng ngoài dày hóa bần; mô mềm vỏ gồm các tế bào
hình đa giác tương đối đều nhau, ở các góc có khoảng gian bào, nằm ở phía
trong của ngoại bì; nội bì là lớp trong cùng của vỏ sơ cấp, cấu tạo bởi một lớp
tế bào, trên vách xuyên tâm có khung hóa bần (đai Caspari);
(ii) Trung trụ cũng gồm có 4 phần (hình 3.2.3-d): phần vỏ trụ, bó gỗ, bó
libe và mô mềm ruột. Theo đó, vỏ trụ gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật đều
nhau nằm sát nội bì, các góc có những chỗ dày hóa gỗ. Bó libe và bó gỗ xếp
luân phiên, nằm sát ngay dưới lớp vỏ trụ. Mô mềm ruột là phần trong cùng của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trụ giữa, gồm những tế bào hình đa giác, có kích thước tương đối lớn.
Biểu bì
Vỏ trụ
Ngoài bì
Gỗ
Mô mềm
Libe
Nội bì
Mô mềm
ruột
Trung trụ
Lát cắt ngang rễ cây Trung trụ của rễ cây
Hình 3.4. Hình ảnh giải phẫu rễ cây Bảy lá một hoa
(độ phóng đại 100)
Các kết quả nghiên cứu về cơ quan dinh dưỡng của cây Bảy lá một hoa
thu thập tại Bắc Sơn Lạng Sơn phù hợp với công bố của Hoàng Thị Sản và
Nguyễn Thị Phương Nga (2003) khi giải phẫu cây một lá mầm [17].
3.2. Đặc điểm đoạn gen matK và vùng gen ITS của mẫu cây Bảy lá một hoa
Nghiên cứu đặc điểm của đoạn gen matK và vùng gen ITS của tất cả các
mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập được đều thực hiện theo quy trình gồm các
bước: (1) Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số; (2) Nhân gen bằng kỹ thuật
PCR với cặp mồi được thiết kế dùng chung cho thực vật bặc cao, sản phẩm
PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker; (3) Tinh sạch
sản phẩm PCR và xác định trực tiếp trình tự nucleotide trên máy xác định trình
tự tự động; (4) Sử dụng phần mềm BLAST trên NCBI để xác định đúng loại
gen nghiên cứu; (5) Sử dụng phần mềm Bioedit để thu đoạn gen mong muốn;
(6) Trình tự gen được phân tích, so sánh và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
bằng các chương trình Bioedit và DNAstar.
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả tách chiết DNA tổng số trên gel agarose 1%
(1,2: kết quả các lần tách DNA)
3.2.1. Đặc điểm đoạn gen matK
Sau khi tách chiết DNA tổng số và kiểm tra độ tinh sạch, thí nghiệm nhân
bản đoạn gen matK từ DNA hệ gen bằng PCR với cặp mồi matK-F / matK-R
(bảng 2.1) được thực hiện. Kết quả kiểm tra phản ứng PCR bằng điện di trên
gel agarose 1 % thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 800 bp như đã dự
kiến (Hình 3.6). A B
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ
mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn
(A: marker 1kb, B sản phẩm PCR của mẫu nghiên cứu)
Gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn
được tinh sạch và xác định trình tự trực tiếp trên máy tự động. Sử dụng phần
mềm BLAST trên NCBI để so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
định danh gen phân lập được, kết quả BLAST được trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7. Kết quả phân tích gen matK bằng BLAST trong NCBI
Theo hình 3.7, đoạn gen matK của cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn được so sánh với 5 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 97,37 % . Kết quả so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn matK thuộc chi Paris.
Sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích trình tự nucleotide đoạn bảo thủ của gen, chúng tôi thu được đoạn có chiều dài 772 nucleotide, được trình bày ở hình 3.8.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.8. Trình tự đoạn gen matK của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn
Dựa trên trình tự nucleotide của gen matK, bằng phần mềm DNAstar
chúng tôi thiết lập bảng tỉ lệ tương đồng và tỉ lệ phân ly ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 trình bày về mức độ tương đồng và mức độ phân ly dựa trên
trình tự nucleotide của gen matK. Theo đó, trình tự nucleotide của gen
matK của mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn có độ tương đồng với các loài thuộc chi
Paris từ 45,1 % đến 99,9 %. Loài có độ tương đồng lớn nhất với mẫu Bắc
Sơn- Lạng Sơn đạt 99,9 % là Paris polyphylla var chinensis (mẫu có mã số
trên Genbank KM242785).
Bảng 3.1. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại
Bắc Sơn- Lạng Sơn dựa trên trình tự đoạn gen matK
Mối quan hệ di truyền về trình tự nucleotide của gen matK thể hiện trên sơ
đồ hình cây 3.9 theo phương pháp Neighbor-Joining trên phần mềm MEgAlign.
Kết quả biểu diễn trên hình 3.9 cho thấy sự phân bố của gen matK của mẫu cây
Bảy lá một hoa nằm trong cùng nhánh với Paris polyphylla var. chinensis (mẫu
có mã số trên Genbank KM242785).
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên đoạn gen matK của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn
3.2.2. Đặc điểm vùng gen ITS
Thí nghiệm nhân bản vùng gen ITS từ DNA hệ gen được thực hiện như
mô tả ở mục 2.2.2 và kiểm tra trên gel agarose 1 % thu được đoạn DNA có kích
thước khoảng 800 bp như đã dự kiến (Hình 3.10).
Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS từ mẫu
cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn
(M: marker 1kb, 1,2, ký hiệu của mẫu nghiên cứu)
Vùng gen ITS của mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn được tinh sạch và xác định
trình tự trực tiếp trên máy tự động. Sử dụng phần mềm BLAST trên NCBI thu
được kết quả trình bày ở hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả phân tích bằng BLAST trình tự nucleotide vùng gen ITS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trong NCBI
Theo hình 3.11, vùng gen ITS của cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn được so sánh với 15 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 98,34% đến 98,94%. Kết quả so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn ITS thuộc chi Paris, trong đó độ tương đồng lớn nhất với mẫu Paris polyphylla var. chinensis (mẫu có mã số trên Genbank KX146531) ở mức 98,94%.
Sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích trình tự nucleotide đoạn bảo thủ của gen, chúng tôi thu được đoạn có chiều dài 661 nucleotide, được trình bày ở hình 3.12.
Hình 3.12. Trình tự vùng gen ITS của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn
Dựa trên trình tự nucleotide của gen ITS, bằng phần mềm DNAstar chúng
tôi thiết lập bảng tỉ lệ tương đồng và tỉ lệ phân ly (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Bắc Sơn - Lạng Sơn dựa trên trình tự vùng gen ITS
Theo kết quả bảng 3.2, trình tự nucleotide của vùng gen ITS của mẫu Bắc
Sơn- Lạng Sơn có độ tương đồng với các loài thuộc chi Paris rất cao, từ 98,3%
đến 98,9%. Loài có độ tương đồng lớn nhất với mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn đạt
98,9% là Paris polyphylla var chinensis (KX146530).
Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS của
các mẫu nghiên cứu
Mối quan hệ di truyền về trình tự nucleotide của gen matK thể hiện
trên sơ đồ hình 3.13. Kết quả biểu diễn trên hình 3.13 cho thấy sự phân bố
của mẫu thu thấp tại Bắc Sơn nằm cùng nhánh nhỏ và gần nhất với hai mẫu
Paris polyphylla var chinensis (mẫu có mã số trên Genbank KX146531 và
KX146530).
Kết hợp các đặc điểm nghiên cứu về hình thái, giải phẫu và trình tự nucleotide
của đoạn gen matK, vùng gen ITS có thể nhận diện mẫu cây Bảy lá một hoa thu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn là giống Paris polyphylla var chinensis.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. Kết luận
1. Về hình thái, giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc
Sơn - Lạng Sơn
1.1. Về mặt hình thái, cây có chiều cao thân chính 40 cm, lá hình soan
ngược, chóp lá có mũi 1,5 cm. Đài hoa mẫu 5, hình mác. Tràng hoa màu vàng-
xanh. Nhị hoa mẫu 16. Buồng trứng hình cầu, có 1 ngăn. Vòi nhụy ngắn, chân
đế mở rộng, màu tím. Đầu nhụy sẻ thùy 5.
1.2. Về mặt giải phẫu, (i) Cuống lá có 3 phần biểu bì, mô mềm và một bó
dẫn dạng hình cung- mặt lõm hướng lên trên; (ii) Thân cây có biểu bì ở ngoài
cùng, bên trong gồm mô mềm và nhiều bó dẫn nằm rải rác; (iii) Rễ cây có phần
vỏ và phần trung trụ, các bó dẫn của trung trụ xếp luân phiên tròn đều trong mô
mềm. Cấu tạo giải phẫu của mẫu là điển hình của cây một lá mầm.
2. Về đặc điểm của gen matK, ITS của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập
tại Bắc Sơn - Lạng Sơn.
2.1. Đoạn gen matK được nhân lên có chiều dài 772 bp, độ tương đồng
với 5 loài thuộc chi Paris ở mức 99,37%.
2.2. Vùng gen ITS có chiều dài 661 bp, độ tương đồng với 15 loài và dưới
loài thuộc chi Paris từ 98,34 % đến 98,94%.
3. Kết hợp các đặc điểm nghiên cứu về hình thái, giải phẫu và trình tự
nucleotide của đoạn gen matK, vùng gen ITS có thể nhận diện mẫu cây Bảy lá một
hoa thu thấp tại Bắc Sơn - Lạng Sơn là giống Paris polyphylla var chinensis.
II. Kiến nghị
Nên sử dụng phương pháp phân loại thực vật bằng hình thái, giải phẫu,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
đoạn gen matK, vùng gen ITS để nhận diện các loài thuộc chi Paris.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
Hoàng Phú Hiệp, Trương Mạnh Tiến, Lương Thị Thúy Vân, Phạm Thị Thanh
Vân, Nguyễn Thị Thu Hà, Vũ Thị Thu Thủy*, 2019, ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,
GIẢI PHẪU CỦA LOÀI Paris polyphylla var chinensis VÀ TÍNH CHẤT ĐẤT TRỒNG
TẠI BẮC SƠN, LẠNG SƠN - Tạp chí KH và CN Đại học Thái Nguyên, 207 (14): 53-59.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Lý Thị Bôn, Nguyễn Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Thu Ngà, Sỹ Danh Thường,
2017, Sử dụng mã vạch DNA trong việc định loại loài Hồng trâu (Capparis
versicolor Griff.), Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên
Sinh vật lần thứ VII: 62-66.
2. Lê Trần Chấn, Trần Ngọc Ninh, Trần Thị Thúy Vân, 2013, Đa dạng sinh
học và giải pháp bảo vệ, phát triền bền vững vùng núi đá vôi ở tỉnh Hà
Giang, Hội thảo khoa học và diễn đàn đầu tư “Vì Hà Giang phát triển”,
115-120.
3. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Quỳnh Nga, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Thị Thu,
Ninh Thị Phíp, Đoàn Thị Thanh Nhàn, Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Nhật
Linh, 2018, Đặc điểm hình thái và mã vạch DNA của loài cây Bảy lá một
hoa, Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học Nông
nghiệp Việt Nam, 16 (4), 282-289.
4. Nguyễn Thị Đỏ, 2007, Thực vật chí Việt Nam 8, Khoa học và kỹ thuật, 311-321.
5. Đỗ Văn Hài, Chang Young Lee, Hà Minh Tâm, 2017, Đặc điểm hình thái và
phân loại chi Bạch hạc - Rhinacanthus Nees (họ Ô rô Acanthaceae) ở Việt
Nam, Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần
thứ VII, 140-144.
6. Tạ Lê Mai Hậu, Phạm Văn Minh, Hà Vân Oanh, Chử Thị Thanh Huyền,
Đào Thị Thanh Hiền, Đỗ Thị Hà, 2016, Nghiên cứu đặc điểm thực vật của
cây phong lữ thảo (Pelargonium hortorum L. H. Bailey), Tạp chí Dược học,
56 (6), 73-76.
7. Phạm Hoàng Hộ, 1999, Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ Thành phố Hồ Chí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Minh, 473-475.
8. Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong, 2015, Xác định đoạn mã vạch DNA cho
Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis): Loài cây đặc hữu của Việt
Nam, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 5: 123-130.
9. Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Quỳnh Nga, Phan Văn Trưởng, Hoàng Văn
Toán, Nguyễn Xuân Nam, Phạm Thị Ngọc, Phạm Thị Vân Anh, 2015,
Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu loài hà thủ ô đỏ (Fallopia
multiflora (Thunb.) Haraldson) ở Việt Nam, Hội nghị Khoa học Toàn quốc
về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VI, 166-172.
10. Lê Thị Thanh Hương, Trần Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Ngọc Yến, Nguyễn
Trung Thành, Nguyễn Nghĩa Thìn, 2012, Thực trạng các loài cây quý hiếm thu
thập tại tỉnh Thái Nguyên, Tạp chí KHTN và CN - ĐHQGHN, 28: 173-194.
11. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, 2014, Mối
quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình
tự nucleotide vùng matK và ITS - rDNA, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12
(2), 327-337.
12. Đỗ Tất Lợi, 2004, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Y Học,
13. Nguyễn Thị Hồng Mai, Nguyễn Mạnh Cường, Ngũ Trường Nhân, Nguyễn
Phương Đại Nguyên, Nguyễn Thị Phương Trang, 2017, Đặc điểm phân tử
vùng gen rpoC của loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) và Sưa đỏ
(Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam và ứng dụng phân loại, Hội nghị
Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VII, 814-817.
14. Chu Hoàng Mậu, Hoaàng Phú Hiệp, Nguyễn Hữu Quân, 2019, Giáo trình
Tin sinh học, Nxb: Đại học Thái Nguyên,
15. Nguyễn Kim Phụng, 2007, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, Nxb Đại học
quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,
16. Bùi Hồng Quang, Trần Thế Bách, Đỗ Văn Hài, Dương Thị Hoàn, Nguyễn
Thị Thanh Hương, Lê Ngọc Hân, Trần Đức Bình, Doãn Hoàng Sơn, Vũ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Anh Thương, Sangmi Eum, Vũ Tiến Chính, 2017, Bổ sung một loài thuộc
chi Ngân hoa - Silvianthus bracteatus Hook. f. Họ Cạt man
(Carlemanniceae) ở Việt Nam, Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái
và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VII, 324-327.
17. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga, 2008, Hình thái - Giải phẫu học Thực
vật, Nxb Đại học Sư phạm.
18. Dương Văn Tăng, Nguyễn Quốc Bình, Đinh Thị Phòng, 2011, Trình tự
nucleotide vùng ITS nhân và mối quan hệ di truyền của 3 loài gỗ quý Việt
Nam: Trắc (Dalbergia cochinchinensis), Cẩm lai (Dalbergia oliveri) và Sưa
(Dalbergia tonkinensis), Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài
nguyên Sinh vật lần thứ VII, 1296-1300.
19. Nguyễn Thị Tần, 2013, Cây dược liệu - lợi thế để người dân vùng cao Lào
Cai thoát nghèo, Tạp chí kinh tế kỹ thuật Lào Cai, 24: 590.
20. Nguyễn Tập, 2004, Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam, Viện dược liệu, 14-15.
21. Nguyễn Tập, 2007, Cẩm nang cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam, Mạng lưới
lâm sản ngoài gỗ Việt Nam, 49-50, 71-72.
22. Nguyễn Thị Thu, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Đắc Bình
Minh, Đào Thùy Dương, Nguyễn Thị Duyên, 2016, Nghiên cứu đặc điểm
thực vật và vi học của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam, Tạp chí Dược liệu,
21 (4), 242-247.
23. Vũ Thị Thu Thủy, 2017, Đặc điểm sinh học và giá trị dược học của cây Bảy
lá một hoa thuộc chi Paris, Tạp chí khoa học & Công nghệ- Đại học Thái
Nguyên, 171 (11), 49-54.
24. Vũ Thị Thu Thủy, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Thị Thu Ngà, Chu Hoàng
Mậu, 2016, Đặc điểm của trình tự gen rpoC1 phân lập từ cây Thất diệp nhất
chi hoa (Paris polyphylla Sm.) thu tại Lạng Sơn, Việt Nam, Tạp chí khoa
học & Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 168 (08), 165-168.
25. Vũ Thị Thu Thủy, Lục Văn Dương, Ngô Thùy Linh, Hoàng Phú Hiệp,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Nguyễn Thị Thu Ngà, Chu Hoàng Mậu, 2018, Một số đặc điểm hình thái,
giải phẫu và trình tự đoạn gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu
thập tại Lào Cai, Báo cáo Hội nghị CNSH toàn quốc 2018, Nxb KHTN và
CN, 1665-1671.
26. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Thu Ngà, Hoàng Phú Hiệp, Chu Hoàng
Mậu, 2016, Sử dụng mã vạch DNA trong việc định loại loài cây dược liệu
Thất diệp nhất chi hoa ở Việt Nam (Paris Polyphylla Sm.), Tạp chí khoa
học & Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 171 (11), 49-54
27. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Thu Ngà, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Thị
Thúy Lan, Nông Lệ Thùy, Chu Hoàng Mậu, 2016, Sưu tập và phân tích đặc
điểm trình tự đoạn gen rpoC1 của cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla
sm.), Kỷ yếu Hội thảo sinh viên và cán bộ trẻ các trường Sư phạm toàn
quốc, Nxb ĐHSP Thành phố Hồ Chí Minh, 2016: 971-978.
28. Nông Thị Anh Thư, Nguyễn Quý Thái, Nguyễn Thị Minh Thúy, Đào Thanh
Hoa, 2017, Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng
giảm đau, chống viêm của dược liệu Sóng rắn thu hái tại Thái Nguyên, Tạp
chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 17 (6), 10-12.
29. Nguyễn Thị Phương Trang, Trần Thu Hương, Ludwig Triest, Nguyễn Minh
Tâm, 2014, Đặc điểm di truyền ba loài Sao (Hopea) đang bị đe dọa tuyệt
chủng ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 36 (3), 316-322.
30. Viện dược liệu, 2003, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb:
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 182-184.
II. Tài liệu tiếng Anh:
31. Chase MW, Salamin N, Wilkinson M, Dunwell JM, Kesanakurthi RP,
Haider N, V. S, 2005, Land plants and DNA barcodes:Short-term and long-
term goals, Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological
Sciences, 360 1889-1895.
32. Gao T, Pang X H, Chen S L, 2009, Authentication of plants in Astragalus
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
by DNA barcoding technique, Plant Med, 75 (9), PB21.
33. Havill, Nathan P., Campbell, Christopher S., Vining T F, LePage, Ben,
Bayer, Randall J., Donoghue, Michael J., 2008, Phylogeny and
Biogeography of Tsuga (Pinaceae) Inferred from Nuclear Ribosomal ITS
and Chloroplast DNA Sequence Data, Systematic Botany, 478-479.
34. Hodkinson, Trevor R., Chase W, Lledo M, Dolores M., Salamin, Nicolas,
Renvoize, Stephen A., 2002, Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and
related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA
sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnL intron and
trnL-F intergenic spacers, Journal of Plant Research, 115 (5), 381-392.
35. John Kress W, Erickson D L, 2008, DNA barcodes: Genes, genomics, and
bioinformatics, Proc Natl Acad Sci USA, 105 (8), 2761-2762.
36. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, DH. J, 2005, Use of DNA
barcodes to identify flowering plants, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 102 8369 – 8374.
37. Lahaye R, Bogarin D, Van der Bank M, Warner J, Pupulin F, Gigot G,
Maurin O, Duthoit S, Barraclogh TG, 2008, DNA barcoding the floras of
biodiversity hotspots, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 2923 – 2928
38. Li F. R., Jiao P., Yao S. T., Sang H., Qin S. C., Zhang W., Zhang Y. B., Gao
L. L., 2012, Paris polyphylla Smith extract induces apoptosis and activates
cancer suppressor gene connexin 26 expression, Asian Pac J Cancer Prev,
13 (1), 205-209.
39. Li X, Wang B, Han R, Zheng Y, Yin H Y, Xu L, 2013, Identification of
medicinal plant schisandra chinensis using a potential DNA barcode ITS2,
Acta Soc Bot Pol, 82 283-288.
40. Liang Songyun, Victor G. Soukup, 2000, Paris Linnaeus, Flora of China,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
88-95.
41. Man S., Gao W., Zhang Y., Yan L., Ma C., Liu C., Huang L, 2009,
Antitumor and antimetastatic activities of Rhizoma Paridis saponins,
Steroids, 74 (13:), 1051-1056.
42. Mohd Tariq, Shyamal K. Nandi, Indra D. Bhatt, 2016, Conservation planing
of Paris polyphylla Smith an important medicinan Herb of the Indian
Hymalayan region using predictive ditribution, International Scholary and
Scientific rearch and innovation, 3 (9), 408.
43. Nguyen Quynh Nga, Pham Thanh Huyen, Phan Van Truong, Hoang Van
Toan, 2016, Taxonomy of the genus Paris L.(Melanthiaceae) in Vietnam,
Tạp chí Sinh hoc, 38 (3), 333-339.
44. Paul DN Heberrt, Alina Cywinska, Shelley L. Ball, Jermy R. deWaard,
2003, Biological identications throught DNA barcodes, Proceeding Of The
Royal Society, 313-321.
45. Pirie M, ichael D., Oliver, E. G. H., Bellstedt, Dirk U., 2011, A densely
sampled ITS phylogeny of the Cape flagship genus Erica L. suggests
numerous shifts in floral macro-morphology, Molecular Phylogenetics and
Evolution, 61 (2), 593-601.
46. Savolainen V, Cowan RS, Vogler AP, Roderick GK, 2005, DNA barcoding
of life, Phil Trans R Soc London Ser B, 1805–1811.
47. Savolainen V, Cowan RS, Vogler AP, Roderick GK, 2005, DNA barcoding
of life, Phil Trans R Soc London Ser B, 1805–1811.
48. Scheunert, Agnes, Heubl, Gunther, 2014, Diversification of Scrophularia
(Scrophulariaceae) in the Western Mediterranean and Macaronesia –
Phylogenetic relationships, reticulate evolution and biogeographic patterns,
Molecular Phylogenetics and Evolution, 70 296-313.
49. Shen S, Chen D, Li X, Li T, Yuan M, Zhou Y, Ding C., 2014, Optimization
of extraction process and antioxidant activity of polysaccharides from leaves
of Paris polyphylla, Carbohydrate polymers, 104: 80-86.
50. Vijayan K, Tsoul C.H, 2010, DNA barcoding in plants: taxonomy in new
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
perspective, Current Science, 99 (11), 1530-1538.
51. Vijayan K, Tsoul C.H, 2010, DNA barcoding in plants: taxonomy in new
perspective, Current Science, 1530-1538.
52. Vu Thi Thu Thuy, Nguyen Thi Ngoc Lan, Dinh Thi Huyen, Hoang Phu
Hiep, Tran Thi Hong, Nguyen Thi Thu Nga, Sy Danh Thuong, Nguyen Huu
Quan, Mau C H, 2018, Identification of Paris species from Sa Pa and
Puluong in Viet Nam using DNA barcodes, The 5th Academic Conference
on Natural Science for Young Scientists, Master and PhD Students from
Asean Countries, Publishing House for Science and Technology, 190-196.
53. Warwick, Suzanne I., Mummenhoff, Klaus, Sauder, Connie A., Koch,
Marcus A., Al-Shehbaz, Ihsan A., 2010, Closing the gaps: phylogenetic
relationships in the Brassicaceae based on DNA sequence data of nuclear
ribosomal ITS region, Plant Systematics and Evolution, 209-232.
54. Y Teerawatsakul, S Dheeranupattana, K Sringarm, 2014, Effect of
temperature on shoot tip culture of Paris polyphylla var. chinensis (Franch.)
Hara,, Planta Med, 80 - P82O10. DOI: 10.1055/s-0034-1395004.
55. Yang, Tao, Zhang, Tian-lei, Guo, You-hao, Liu, Xing, 2016, Identification
of hybrids in Potamogeton: Incongruence between plastid and ITS regions
solved by a novel barcoding marker PHYB, PLOS ONE, 11 (11), e0166177.
III. Tài liệu mạng:
56. http://vi.wikipedia.org/wiki/chi_trong_lau,
57. http://khoahocphattrien.vn/Dia-phuong/lang-son-cay-duoc-lieu-bay-la-mot-
hoatrien-vong-nang-cao-thu-nhap/20190513030811704p1c937.htm,
58. https://amp.thaythuoccuaban.com/vithuoc/thatdiepnhatchihoa.htm,
(21/8/2019),
60. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/xxx.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
59. https://vi.wikipedia.org/wiki/Bắc_Sơn, (20/8/2018),
![Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250807/kimphuong1001/135x160/50321754536913.jpg)
