intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Nghiên cứu điều kiện tối ưu nuôi cấy thu nhận bào tử Bacillus S5 bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST
Báo xấu
55
lượt xem 5
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này nhằm lựa chọn các điều kiện và môi trường lên men phù hợp cho sự sinh trưởng và tạo bào tử của chủng Bacillus S5 để ứng dụng trong sản xuất probiotic cho nuôi trồng thủy sản. Mật độ tế bào OD550nm trong dịch nuôi cấy là thông số được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện lên men. Tối ưu các điều kiện lên men được sử dụng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu điều kiện tối ưu nuôi cấy thu nhận bào tử Bacillus S5 bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NUÔI CẤY THU NHẬN BÀO TỬ Bacillus S5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT (RSM) Võ Hồng Phượng1*, Đặng Ngọc Thùy1, Nguyễn Thị Lan Chi1, Nguyễn Thanh Trúc1, Chu Quang Trọng1, Phạm Thị Huyền Diệu2 TÓM TẮT Chủng vi khuẩn Bacillus S5 là được phân lập từ bùn ao nuôi tôm quảng canh có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND - acute hepatapancreatic necrosis disease) trong điều kiện thí nghiệm. Nghiên cứu này nhằm lựa chọn các điều kiện và môi trường lên men phù hợp cho sự sinh trưởng và tạo bào tử của chủng Bacillus S5 để ứng dụng trong sản xuất probiotic cho nuôi trồng thủy sản. Mật độ tế bào OD550nm trong dịch nuôi cấy là thông số được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện lên men. Tối ưu các điều kiện lên men được sử dụng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM). Môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối Bacillus S5 sau 48 giờ lên men đạt giá trị OD550nm 11,36 tương ứng 4,3x109 CFU/mL là: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L và tốc độ lắc 170 vòng/phút. Ngoài ra, 0,5 g/L ion Ca2+ được bổ sung sau 30 giờ lên men có thể kích thích trên 90% tế bào dinh dưỡng Bacillus S5 chuyển thành bào tử. Từ khóa: Sinh khối Bacillus S5, bào tử Bacillus S5, tối ưu các điều kiện nuôi cấy. I. ĐẶT VẤN ĐỀ và ctv., 1965), thành phần muối khoáng cao, Khả năng kháng kháng sinh của các tác pH môi trường nuôi cấy trung tính và nhiệt độ nhân gây bệnh đã thúc đẩy phát triển nhiều công môi trường nuôi phù hợp với từng loài vi khuẩn trình nghiên cứu các giải pháp thay thế kháng (Bernlohr và Leitzmann, 1969). Bào tử Bacillus sinh trong trị bệnh do vi khuẩn gây ra (Gauri và sp. được hình thành sau pha tăng trưởng (log ctv., 2011). Các chủng Bacillus được xem là đối phage) của tế bào sinh dưỡng. Trong điều kiện tượng hàng đầu và được nhiều nhà nghiên cứu lý tưởng, hiệu quả chuyển thành bào tử của vi khoa học quan tâm nhằm ứng dụng và sản xuất khuẩn Bacillus sp. mật độ 108 tế bào ml-1 trong probiotic với một số đặc tính như sản sinh một khoảng 30-100% (Nicholson và Setlow, 1990). số enzyme ngoại bào, tạo bào tử bền với nhiệt Ngoài ra, muối được đưa vào môi trường lên thuận lợi trong quá trình sản xuất, bảo quản và men cũng tăng khả năng tạo bào tử của nhóm sử dụng (Duc và ctv., 2004). Lên men chìm được Bacillus, nhưng với nồng độ ion kim loại nặng xem là phương pháp hữu hiệu và được ứng dụng cao có thể ảnh hưởng đáng kể đến quá trình tạo rộng rãi trong công nghiệp sản xuất probiotic bào tử (Cho và ctv., 2009). Sáu ion kim loại, nhờ khả năng kiểm soát các thông số được dễ Mn2+, Fe3+, Fe2+, Ca2+, Mg2+ và Zn2+ được xem dàng (Nguyễn Văn Thanh và ctv., 2009). là những yếu tố quan trọng kích thích bào tử Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương, (Kolodziej và Slepecky, 1964, Granger và ctv., khả năng tạo bào tử chúng được xem như là 2011). Đến nay, có nhiều công trình nghiên cứu những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực được báo cáo giá trị tối đa tạo bào tử của B. công nghiệp (Harwood, 1992). Thể bào tử subtilis trong lên men chìm dao động 109 bào tử của B. subtilis được kích thích mạnh khi mật ml-1 đến 7,4 x109 bào tử ml-1(Monteiro và ctv., độ tế bào vi khuẩn cao (Grossman và Losick, 2005). Sự điều chỉnh các chỉ số tạo bào tử trong 1988), sự thiếu hụt về dinh dưỡng (Schaeffer quá trình lên men thường được giám sát chặt 1 Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 2 Trường Đại học Sư phạm, Tp. HCM. *Email: vohongphuong@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 45
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II chẽ nhằm kích thích tạo bào tử tốt nhất (Rao và và ion khoáng khác nhau đến khả năng hình ctv., 2007). thành và tạo bào tử của chủng Bacillus S5, được Chủng Bacillus S5 được phân lập từ mẫu xem là chủng probiotic tiềm năng để ứng dụng bùn ao nuôi quảng canh tại Cà Mau, có khả trong công nghiệp nuôi trồng thủy sản nhằm năng tạo vòng kháng Vibrio parahaemolyticus giảm thiểu thiệt hại do bệnh AHPND trên tôm. gây bệnh gan tụy cấp tính trên tôm (AHPND) II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP với đường kính 15 mm ở điều kiện in vitro và 2.1. Vật liệu ổn định trong 24 giờ khảo sát. Bên cạnh đó, mật độ ban đầu của Bacillus S5 ở giá trị 105 Chủng vi khuẩn Bacillus S5 được phân lập CFU/mL và 106 CFU/mL có khả năng ức chế từ bùn ao nuôi tôm quảng canh tại Cà Mau có hoàn toàn V. parahaemolyticus (mật độ ban đầu khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus tương ứng 104 và 105 CFU/mL) từ thời điểm 12 gây bệnh AHPND thuộc phạm vi của đề tài giờ khảo sát. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) trên tôm sú và “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng tôm thẻ tương ứng đạt 61,8% và 50,1%. Kết quả Vibrio spp. gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên định danh sinh hóa bằng test kit API 50 CHB/E tôm sú và tôm thẻ chân trắng”. cho thấy chủng Bacillus S5 thuộc loài Bacillus Chủng Bacillus S5 được làm giàu trong subtilis (Võ Hồng Phượng và ctv., 2018). erlen 250 mL chứa 150 mL môi trường dinh Nhiều kỹ thuật đã được sử dụng trong việc dưỡng lỏng (Nutrient broth- NB) bổ sung 1,5% tối ưu các yếu tố trong quá trình lên men nhằm NaCl và pH môi trường 7,2±0,2 trong thời gian tạo sinh khối tế bào cao nhất, như phân tích yếu 18-24 giờ, nhiệt độ ủ 300 C đến khi đạt mật độ tố đơn, quy hoạch thực nghiệm (thống kê toán 108 CFU/mL. Sau đó, 2% chủng giống được cấp học). Thiết kế đơn từng yếu tố là phương pháp vào các erlen 100 ml chứa 50 mL nguồn dinh cổ điển dễ sử dụng đối với mô hình thí nghiệm dưỡng cần khảo sát. ít yếu tố và không xét đến sự tương tác qua lại 2.2. Phương pháp sàng lọc đơn nguồn giữa các yếu tố lên sinh khối của vi sinh vật dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh khối lên men. Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi sử Bacillus S5 dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để tối Sàng lọc sáu nguồn nitơ và sáu nguồn ưu hóa giá trị các yếu tố đang được nghiên cứu. carbon, thành phần môi trường lên men bao Trong các thiết kế thí nghiệm như thiết kế thí gồm 1,5% muối NaCl và pH môi trường nghiệm theo Plackett- Burman (PBD) (Plackett 7,2±0,2. Bảng 1 thể hiện nồng độ và các nguồn và Burman, 1946) và thiết kế cấu trúc tại tâm dinh dưỡng khảo sát. Mỗi công thức môi trường Central Composite Design (CCD), được biết được lặp lại 2 lần. Giống vi khuẩn Bacillus S5 đến là một trong những phương pháp đáp ứng được cung cấp với mật độ ban đầu 103 CFU/ bề mặt (RSM), là thiết kế hữu ích nhằm tối ưu mL. Các erlen được ủ lắc ở nhiệt độ 300C, 200 các điều kiện dinh dưỡng và nuôi cấy trong quá vòng/ phút, sau 48 giờ xác định giá trị mật độ trình lên men (Xiao và ctv., 2007). vi khuẩn thông qua chỉ số OD550nm (1 OD550nm Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tương đương 3,8x108 CFU/mL giá trị xây dựng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để khảo sát đường chuẩn trong nghiên cứu này). ảnh hưởng của các nguồn carbon, nguồn nitơ, 46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 1. Thành phần và nồng độ nguồn dinh dưỡng khảo sát đơn lên men Bacillus S5 Nồng độ Nguồn Nồng độ Nguồn Nitơ Ghi chú Ghi chú (g/L) Carbon (g/L) Cao nấm men Glucose Pepton Xylose 5-15 Glucose 5 g/L Pepton 5 g/L Bột đậu nành Dextrose Casein Lactose 5-15 NaNO3 Bổ sung Pepton Manitol 0,5 -2 5 g/L, Glucose 5 NH4Cl g/L Furtose 2.3. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng chính trong đó có 3 thí nghiệm lặp lại tại tâm. Mỗi yếu đến sự phát triển của Bacillus S5 tố được khảo sát ba mức giá trị là mức cao (+1), 2.3.1. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến mức thấp (-1) và giá trị trung bình (0). Nguồn việc tạo sinh khối Bacillus S5 trên ma trận carbon và nguồn nitơ sẽ được lựa chọn trong thí Plackett- Burman (PB) nghiệm khảo sát yếu tố đơn. Bên cạnh đó, một số Thiết kế Plackett- Burman (PBD) dựa trên chất khoáng, điều kiện nuôi cấy như tốc độ lắc, mô hình tuyến tính bậc nhất Y = β0 +Σ βi Xi là nhiệt độ cũng được xem như là các yếu tố cần cách hiệu quả để sàng lọc các thông số chính thiết đánh giá mức ảnh hưởng quá trình lên men trong một lượng lớn các yếu tố của quá trình vi sinh vật (Bảng 2). Thí nghiệm được thiết kế tối ưu (Plackett và Burman, 1946). Trong đó Y trong erlen 100mL và thể tích khảo sát 50 mL. là hàm đáp ứng (mật độ vi khuẩn), β0 là hệ số Sau thời gian 48 giờ thu mẫu và đo mật độ quang chặn và βi là hệ số tuyến tính và Xi là biến độc (OD). Kết quả mật độ quang (OD550nm) được lập. Sàng lọc 11 yếu tố với tổng số thí nghiệm phân tích bằng chương trình “Design Expert® được thiết lập theo thiết kế này là 15 thí nghiệm 7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA. Bảng 2. Các yếu tố và mức ảnh hưởng trong thiết kế Plackett-Burman (PB) đối với Bacillus S5 Mức khảo sát Mức ảnh hưởng Yếu tố Đơn vị Ký hiệu Thấp Cao Trung tâm Ảnh Prob>F (-1) (+1) (0) hưởng Pepton g/L X1 10 40 25 0,01b 0,762 Bột đậu nành g/L X2 10 40 25 0,35a 0,007 Cao nấm men g/L X3 5 20 12,5 0,87a 0,001 Glucose g/L X4 15 35 25 0,28a 0,011 Lactose g/L X5 5 30 17,5 0,41a 0,005 Dextrose g/L X6 15 35 25 0,09b 0,083 CaCl2 g/L X7 0,5 2 1,25 -0,18a 0,026 KH2PO4 g/L X8 0,5 2 1,25 -0,06b 0,177 MgSO4 g/L X9 0,5 2 1,25 -0,27a 0,012 Nhiệt độ ủ 0 C X10 30 37 33,5 -0,10b 0,075 vòng/ Tốc độ lắc X11 100 200 150 4,48a < 0,0001 phút Ghi chú: a khác biệt đáng kể α = 0,05; b không khác biệt đáng kể α = 0,05 -1, 0 và +1 là mã hóa giá trị khảo sát tương ứng mức thấp, trung bình và mức cao TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 47
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 2.3.2. Kiểm định các yếu tố ảnh hưởng 2.4. Tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính sau khi loại bỏ các yếu tố không ảnh chính đến quá trình lên men bằng phương hưởng pháp đáp ứng bề mặt với kiểu tâm phức hợp Sau quá trình sàng lọc 11 yếu tố ảnh hưởng (RSM-CCD) đến khả năng tạo sinh khối Bacillus S5, kết quả Thí nghiệm PB sàng lọc các yếu tố ảnh ghi nhận có 5 yếu tố ảnh hưởng chính và 6 yếu hưởng lớn đến sinh khối của các chủng khảo tố không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng âm. Thí sát. Sau đó, tiến hành thí nghiệm với ma trận nghiệm kiểm định nhằm đánh giá lại 5 yếu tố thực nghiệm RSM-CCD tối ưu các yếu tố với trên có thật sự ảnh hưởng đến hàm mục tiêu năm mức khảo sát (-α, -1, 0, +1, +α) trong (sinh khối Bacillus S5) sau khi loại bỏ các yếu đó α =2, số thí nghiệm tại tâm (0) thực hiện tố không ảnh hưởng. Để tiết kiệm thời gian và 6 lần lặp và thiết kế 13 thí nghiệm dựa theo chi phí, kiểm định các yếu tố được thực hiện qua Castillo E Del (2007). Tính toán, lập phương thiết kế nhân tố từng phần (Fractional factorial trình hồi quy, chọn điểm tối ưu của các yếu designs). Thiết kế dựa vào chương trình “Design tố cho hàm đáp ứng là mật độ OD550nm bằng Expert® 7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA phần mềm Design expert 7.0® của Atat-Ease (Bảng 5). Mỗi công thức được thực hiện 2 lần Inc. USA, từ đó áp dụng vào thực nghiệm. Mỗi lặp lại. thí nghiệm trong ma trận được bố trí 2 lần lặp lại, thể tích môi trường khảo sát 50 mL và thời gian thu mẫu 48 giờ. Bảng 3. Thiết kế thí nghiệm và kết quả mật độ quang tối ưu khi kết hợp các yếu tố khảo sát theo phương pháp thiết kế cấu trúc tại tâm (CCD) Các yếu tố tối ưu Mật độ quang Thí OD550nm nghiệm Bột đậu nành Cao nấm men Glucose (g/L) Tốc độ lắc (g/L) (g/L) (vòng/phút) 48 giờ (X1) (X2) (X3) (X4) 1 28,5 [0]a 15 [0] 25 [0] 155 [-α]a 9,35 2 45,5 [+α] a 15 [0] 25 [0] 185 [0] 9,75 3 11,5 [-α] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 9,53 4 20 [-1] a 20 [+1] a 15 [-1] 170 [-1] 8,73 5 20 [-1] 20 [+1] 15 [-1] 200 [+1] 8,45 6 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,56 7 20 [-1] 20 [+1] 35 [+1] 170 [-1] 10,59 8 20 [-1] 20 [+1] 35 [+1] 200 [+1] 9,45 9 28,5 [0] 25 [+α] 25 [0] 185 [0] 9,79 10 28,5 [0] 5 [-α] 25 [0] 185 [0] 9,84 11 37 [+1] 10 [-1] 35 [+1] 170 [-1] 9,92 12 37 [+1] 20 [+1] 35 [+1] 200 [+1] 10,15 13 37 [+1] 20 [+1] 35 [+1] 170 [-1] 11,65 14 37 [+1] 10 [-1] 15 [-1] 170 [-1] 8,42 15 20 [-1] 10 [-1] 15 [-1] 200 [+1] 9,44 16 20 [-1] 10 [-1] 35 [+1] 200 [+1] 9,86 17 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,54 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 18 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,36 19 37 [+1] 20 [+1] 15 [-1] 170 [-1] 8,75 20 37 [+1] 10 [-1] 35 [+1] 200 [+1] 10,31 21 20 [-1] 10 [-1] 15 [-1] 170 [-1] 7,87 22 28,5 [0] 15 [0] 45 [+α] 185 [0] 9,93 23 37 [+1] 20 [+1] 15 [-1] 200 [+1] 8,52 24 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,65 25 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 215 [α] 9,66 26 28,5 [0] 15 [0] 5 [-α] 185 [0] 7,15 27 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,68 28 20 [-1] 10 [-1] 35 [+1] 170 [-1] 9,70 29 37 [+1] 10 [-1] 15 [-1] 200 [+1] 9,55 30 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,56 Ghi chú: số liệu được mã hóa [+1], [-1], [0], [+α], [-α] tương ứng với mức cao, thấp, trung bình a và mức mở rộng biên cao và thấp. 2.5. Đánh giá khả năng lên men giữa môi III. KẾT QUẢ trường tối ưu và các môi trường dinh dưỡng 3.1. Sàng lọc đơn nguồn dinh dưỡng ảnh Thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá hưởng đến sinh khối Bacillus S5 sự phát triển của Bacillus S5 trong môi trường Chủng Bacillus S5 có khả năng tạo sinh tối ưu, môi trường Brain heart infusion broth khối cao đáng kể khi lên men bằng nguồn cao (BHIB) and Nutrient broth (NB), Luria broth nấm men (OD550nm tại thời điểm 48 giờ tăng từ (LB). Một khuẩn lạc Bacillus S5 (sau 24 giờ 7,0 đến 7,8 khi nồng độ cao nấm men tăng từ 5 ủ trên đĩa thạch nutrient agar (NA) có bổ sung đến 15 g/L). Đối với pepton và bột đậu nành mật 1,5% NaCl) được huyền phù vào trong các erlen độ S5 đạt giá trị OD550nm 7,0 khi pepton hoặc bột 250 ml có chứa 150 mL công thức môi trường đậu nành ở nồng độ 15 g/L. Trong khi đó, các cần khảo sát. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần cho nguồn nitơ có nguồn gốc khác như axit amin mỗi công thức môi trường và thu dịch nuôi cấy tổng hợp, nitơ vô cơ thì sinh khối S5 đạt giá trị đo OD550nm mỗi sáu giờ và kéo dài trong 48 giờ thấp nhất OD550nm nhỏ hơn 2 (Hình 1). khảo sát. Nguồn carbon khác nhau cũng ảnh hưởng 2.6. Khảo sát thời điểm bổ sung khoáng đến mật độ trong quá trình lên men của chủng kích thích tạo bào tử S5. Trong số các nguồn carbon được trình bày Dựa vào đường cong tăng trưởng của Hình 1, lactose được xem như nguồn carbon Bacillus S5, bổ sung các ion kim loại tại các thời hiệu quả nhất cho quá trình lên men đối với điểm khác nhau: đầu pha log, giữa pha log, đầu chủng Bacillus S5. Sinh khối S5 tăng một cách pha ổn định và giữa pha ổn định (Vũ Thanh Thảo đáng kể (p
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 9 10 a a 8 b b b 9 Mật độ quang OD 550 nm 7 Mật độ quang OD 550 nm 8 b 6 c 7 c c 5 d 6 d e fg f 4 5 g 4 h h 3 e f g gf 3 i 2 h h 1 2 0 1 0 5g/L 5g/L 5g/L 5g/L 2g/L 2g/L 15g/L 15g/L 15g/L 15g/L 0,5g/L 0,5g/L 5g/L 5g/L 5g/L 5g/L 5g/L 5g/L 15g/L 15g/L 15g/L 15g/L 15g/L 15g/L Pepton Cao nấm Bột đậu Casein NaNO3 Nh4Cl men nành Glucose D- xylose Dextrose lactose Manitol Frurtose Nguồn Nitơ Nguồn Carbon HìnhHình 1. độ 1. Mật Mậtquang độ quang OD550nmODchủng 550nm chủng S5 cácS5 các nguồn nguồn nitơ và nitơ và khác carbon carbon khác nhau. nhau. Ghi chú: Ghi a, b, c, chú: a, d, b, e, c, f, d, g, e, h, i thể f, g, h, ihiện sự khác thể hiện biệtbiệt sự khác giữagiữa cáccác cộtcột trong biểu trong đồđồ biểu vớivới mức ý nghĩa mức ý nghĩa α=0,05 α=0,05 3.2. 3.2. ĐánhĐánh giágiá cáccác yếu yếu tốtốảnh ảnhhưởng hưởngđến đếnsinhTwo level)của trưởng sauBacillus khi loại bỏ S5các yếu tố ảnh hưởng sinh trưởng của Bacillus S5 âm hoặc không ảnh hưởng đến công thức môi 3.2.1. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 bằng ma trận PB 3.2.1. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến trường. Mỗi yếu tố ảnh hưởng trên được khảo Kết Bacillus sinh khối qua xử lýS5ANOVA bằng ma(Bảngtrận PB 2) cho thấy, sát năm yếumức ở ba tố có độ:giá mứctrị độ ảnhthấp hưởng (-1),dương mức độ vàcaocó ý nghĩaKếtthốngquakê xửđến mật độ tế lý ANOVA bào 2) (Bảng chủng Bacillus(+1) cho thấy, S5 và bao mứcgồmđộ trung tốc độ tâmlắc(0)(4,48), được thể caohiện nấmBảngmen năm yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và có 4. Như vậy, nhiệt độ không ảnh hưởng trong (0,87), lactose (0,41), bột đậu nành (0,35) và đường glucose (0,28) (p < 0,05). Hơn nữa, theo giá trị ý nghĩa thống kê đến mật độ tế bào chủng sàng lọc PBD nên trong các thí nghiệm tiếp OD 550nm của Bacillus S5 chủng bao gồm S5tốcdaođộđộng từ 3,82cao lắc (4,48), đếnnấm chúng 9,84 khi nồng tôiđộ duycáctrìyếu nhiệt độ ủ đổi tố thay ở mức trong C±20thức 30công 0 C, thímen (0,87), lactose (0,41), bột đậu nành (0,35) pH môi trường dao động trong khoảng 7-7,5. nghiệm. và đường glucose (0,28) (p < 0,05). Hơn nữa, Kết quả kiểm định mức ảnh hưởng của năm Hàm hồi quy mô tả ảnh hưởng giá trị OD550nm của chủng S5 dao động từ 3,82 yếu tố của các yếu tốsàng có dạng phương lọc trong cho thấytrình cácđường yếu tố thẳng: bột đậu Y đến 9,84 (OD)= 7,09 khi+ nồng 0,18Xđộ2+các yếu3tố 0,43X thay đổi + 0,14X 4+ trong nành, cao 0,2X5+ 2,24X nấm men, glucose, tốc độ lắc có giá trị 11. Trong đó, Y là hàm mục tiêu (mật độ công thức thí nghiệm. p < 0,0001 và mức ảnh hưởng dương, chứng tỏ quang OD550nm), X2, X3, X4, X5, X11 lần lượt là các yếu tố bột đậu nành, cao nấm men, glucose, Hàm hồi quy mô tả ảnh hưởng của các sự có mặt của các yếu tố này là có ý nghĩa trong lactose yếu tốvà cótốcdạngđộ phương lắc. Ngoài trìnhra,đường khi phânthẳng: phương tíchY phương saitrình cho hồi thấy,quy. giáTrong đó, tốccủa trị p-value độ lắc môvẫnhình (OD)= 7,09 + 0,18X là yếu tố ảnh hưởng nhất (2,31), tiếp theo là cao bằng 0,0004 ứng với2+các 0,43X yếu3tố+ 0,14X ảnh hưởng 4 + 0,2Xchính 5 + (main effects), do đó ảnh hưởng của các yếu tố 2,24X11. Trong đó, Y là hàm mục tiêu (mật độ nấm men (0,85), glucose (0,72), bột đậu nành làquang có ý nghĩa thống kê. OD550nm), X2, X3, X4, X5, X11 lần lượt là (0,51). Khi phân tích ANOVA đối với mức ảnh hưởng của lactose thì ở mức khảo sát 15 g/L 3.2.2. các yếuKiểm tố bộtđịnh đậu các nành, yếucaotốnấm ảnhmen,hưởng chính sau khi loại bỏ các yếu tố không ảnh hưởng glucose, lactose và tốc độ lắc. Ngoài ra, khi phân tích đến 30 g/L, lactose không ảnh hưởng đến sinh Năm yếu tố được chọn lọc và kiểm định lại bằng thiết kế từng phần (Fractional factorial phương sai cho thấy, giá trị p-value của mô khối của chủng Bacillus S5 (p = 0,136 > 0,05). Two hìnhlevel) sau khiứng bằng 0,0004 loạivớibỏcáccácyếu yếutốtốảnhảnh hưởng Ngoài hưởng âm hoặc ra, khi phânảnh không tíchhưởng mức độ phùcông đến hợp thức của mômôi chính (main effects), do hưởng đó ảnhtrên hưởng củakhảo hình thử nghiệm đạt p < 0,0001 các sát ở ba mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao và giá trị sự trường. Mỗi yếu tố ảnh được không tương thích (lack of fit) có p = 0,0509 yếu tố là có ý nghĩa thống kê. (+1) và mức độ trung tâm (0) được thể hiện Bảng> 4. 0,05, Nhưđiềuvậy,nàynhiệt cho độthấykhông mô hìnhảnhhồi quy phù hưởng trong 3.2.2. Kiểm định các yếu tố ảnh hưởng chính hợp nhưng giá trị vùng cực trị còn xa so với giá sàng lọc loại sau khi PBDbỏnên các trong yếu tố các khôngthí ảnh nghiệm hưởng tiếp theo chúng tôi duy trì nhiệt độ ủ ở mức 300C±20C, trị đang khảo sát. pH môi Năm yếu dao trường tố được độngchọntronglọc và kiểm khoảng định 7-7,5. lại bằng thiết kế từng phần (Fractional factorial 7 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 4. Kiểm định mức ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 của các yếu tố bằng thiết kế từng phần (Fractional factorial Two level) Mức khảo sát Mức ảnh hưởng Ký Yếu tố Đơn vị Thấp Cao Trung Ảnh Prob>F hiệu (-1) (+1) tâm (0) hưởng (p-value) Bột đậu nành g/L X2 10 40 25 0,51a 0,0003 Cao nấm men g/L X3 5 10 12,5 0,85a < 0,0001 Glucose g/L X4 15 35 25 0,72a < 0,0001 Lactose g/L X5 15 30 22,5 0,16b 0,1360 Tốc độ lắc vòng/phút X11 100 200 150 2,31a < 0,0001 Mô hình mẫu (significant) < 0,0001 Sự không tương thích (not significant) 0,0509 R2 0,982 Ghi chú: a Có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05; b Không có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05 3.3. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng chính kê với độ tin cậy 99,99% (pF Mô hình 10,56 < 0,0001a X2X3 0,18 0,0018a Bột đậu nành (X1) 0,15 0,0015a X2X4 -0,40 < 0,0001a Cao Nấm men (X2) 0,046 0,2515b X3X4 -0,27 < 0,0001a Glucose (X3) 0,73 < 0,0001a X12 -0,21 < 0,0001a Tốc độ lắc (X4) 0,029 0,4614b X22 -0,17 0,0003a X1X2 0,033 0,5057b X32 -0,49 < 0,0001a X1X3 0,10 0,0441a X42 -0,25 < 0,0001a X1X4 Sự không tương 0,0755b -0,033 0,5025b thích mô hình Ghi chú: Có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05; Không có ý nghĩa ở độ tin cậy α=0,05 a b TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 51
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Từ các giá trị phân tích có ý nghĩa trên, 12 giá trị hàm mong đợi được phần mềm Expert Mật độ quang OD 550nm 10 Design 7.0 biểu diễn theo phương trình: 8 Y (mật độ quang OD550nm) 6 =10,56+0,15X 1+0,73X 3+0,1X 1X 3+0,18X 2X 3- 4 0,40X2X4-0,27X3X4-0,21X12-0,17X22-0,49X32- 2 0,25X42. 0 Trong đó X1, X2, X3, X4 là giá trị mã hóa hàm 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 30h 36h 42h 48h lượng bột đậu nành, cao nấm men, glucose, tốc Thời gian khảo sát độ lắc. Môi trường tối ưu LB BHI NB Từ kết quả kiểm tra thực nghiệm các giá trị tối ưu cho 4 biến khảo sát được xácHình định2. như Đường congHình tăng 2. Đường trưởng cong tăng của Bacillus trưởng S5 trong của các môi Bacillus trường nuôi cấy khác nhau sau: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20 S5 trong các môi trường nuôi cấy khác nhau 3.4.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của khoáng đến sự hình thành bào tử của Bacillus S5 g/L, glucose 35 g/L và tốc độ lắc 170 vòng/phút, 3.4.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng giá trị OD550nm là 11,36 tương ướng 4,2x10 Theo9số liệu đường của khoángcong tăng đếntrưởng của Bacillus sự hình thành S5 bào trong tử môi của trường tối ưu, các m CFU/mL. thời điểm bổ sungBacillus S5chọn là 12 giờ, 21 giờ, 30 giờ, 36 giờ tương ứng với đầu pha tă khoáng được 3.4. Khảo sát các loại khoáng và thời Theo số liệu đường cong tăng trưởng của điểm bổ sung khoáng kích thích tạotrưởng, bào tửgiữa pha tăng trưởng, đầu pha ổn định và giữa pha ổn định. Bacillus S5 trong môi trường tối ưu, các mốc 3.4.1. Đường cong tăng trưởng chủng Khả năng thời chuyển từ tếbổ điểm bàosung dinh khoáng dưỡng sang bào chọn được tử của làchủng Bacillus S5 ảnh hưở 12 giờ, 21 giờ, 30 giờ, 36 giờ tương ứng với đầu pha Bacillus S5 trong môi trường tối ưu.đáng kể đến loại khoáng sử dụng và thời điểm bổ sung loại khoáng đó. Trong nghiệm thức Từ một khuẩn lạc S5 ban đầu khi cho tăng trưởng, giữa pha tăng trưởng, đầu pha ổn chứng (Bảng 6) cho thấy tỷ lệ tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%). Trong khi vào các môi trường khảo sát khác nhau, cho định và giữa pha ổn định. khả năng thấy tại thời điểm 15 giờ đầu nuôi cấy khôngkích thích tạoKhả bào tửnăng của cácchuyển từ Fe ion kim loại tế2+,bào Mn2+,dinh Ca2+, Mg 2+ dưỡng có xu hướng tăng d có sự khác biệt giữa môi trường tối ưu và các sang bào tử của chủng Bacillus S5 ảnh hưởng khi kích thích S5 ở các giai đoạn từ pha tăng trưởng đến pha ổn định. Tỷ lệ chuyển bào tử S5 môi trường thương mại như LB, BHI, NB. đáng kể đến loại khoáng sử dụng và thời điểm Tuy nhiên, sau thời điểm từ 15 giờ nhấtđến (93,09%) 48 và bổcó ýsung nghĩa loại khác khoáng biệt so vớiđó. các Trong ion kim nghiệm loại khác và nghiệm thức đối thức đối chứng giờ khảo sát thì mật độ S5 tăng dầnsử và dụngkhác ion Ca2+ bổchứng (Bảng sung sau 30 giờ6)lêncho men.thấy tỷ lệ tạo bào tử sau biệt có ý nghĩa với ba môi trường còn lại 48 giờ nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%). Trong (p
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 6. Tỷ lệ chuyển bào tử của chủng Bacillus S5 tại các thời điểm khác nhau và bổ sung các loại khoáng khác nhau. Thời điểm Khảo sát sau 48 giờ Khảo sát sau 48 giờ Danh Danh bổ sung mục Tổng tế Bào Tỷ lệ bào mục Tổng tế Bào Tỷ lệ bào khoáng khoáng bào* tử* tử (%) khoáng bào* tử* tử (%) (giờ) Fe2+ 3,65 0,94 25,72 Ca2+ 3,00 1,00 33,27 12 Mn2+ 2,69 0,50 18,58 Mg 2+ 0.94 0,20 21,39 Fe2+ 3,24 0.90 27,77 Ca 2+ 2,67 1,20 44,85 21 Mn2+ 3,34 0.70 20,92 Mg 2+ 1,67 0.67 40,00 Fe2+ 3,83 2,05 53,45 Ca 2+ 3,11 2,90 93,09 30 Mn2+ 3,66 1,09 29,78 Mg 2+ 2,54 1,22 47,83 Fe2+ 3,43 2,55 74,23 Ca 2+ 3,45 3,10 89,85 36 Mn2+ 3,65 2,40 65,75 Mg 2+ 3,24 2,05 63,27 Đối chứng 3,85 1,30 33,80 Ghi chú: x10 CFU/mL; Đối chứng: môi trường tối ưu không bổ sung khoáng kích thích bào tử *: 9 IV. THẢO LUẬN mật độ bào tử 6,5 x1010 CFU/mL (Khardziani Các nghiên cứu về điều kiện môi trường lên và ctv., 2017). Ngoài ra, nồng độ glucose giữ men lên sinh khối của nhóm Bacillus đã được vai trò quan trọng trong quá trình tạo bào tử của thực hiện bởi nhiều nhóm tác giả, trong đó Trần Bacillus. Nồng độ glucose trong môi trường Vũ Đình Nguyên (2014) đã công bố mật độ tế lên men gia tăng là nguyên nhân dẫn đến giảm bào của chủng Bacillus B3.10.2 bị ảnh hưởng lượng bào tử Bacillus. Nồng độ glucose đạt 5 bởi nguồn nitơ thử nghiệm như bột đậu nành, g/L có thể tăng tế bào dinh dưỡng và bào tử amoni sulfat, pepton. Trong đó, pepton được B. subtilis MB 24. Mặt khác, nồng độ glucose xem là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh trưởng tăng trên 5 g/L sẽ ức chế hiệu quả tạo bào tử của Bacillus B3.10.2. Ngoài ra Bacillus B3.10.2 của chúng (Monteiro và ctv., 2005, Khardziani còn phát triển tốt khi môi trường được cung cấp và ctv., 2017). Tuy nhiên, trong thí nghiệm của thêm nguồn glucose hoặc mật rỉ đường. Hơn nữa, chúng tôi, nồng độ glucose có mối tương quan Dong và ctv., (2010) đã tìm ra môi trường phù thuận đến sinh khối của Bacillus S5 và lượng hợp đạt sinh khối cao của B. licheniformis khi sinh khối này ảnh hưởng đến số lượng bào tử sử dụng nguồn nitơ là pepton hoặc cao thịt bò và thu được sau thời gian lên men 48 giờ. nguồn carbon là sucrose, glucose hoặc lactose. Các ion kim loại giữ vai trò quan trọng Có nhiều công trình nghiên cứu được thực trong việc hoạt hóa hệ thống enzyme cần thiết hiện để tìm ra môi trường thích hợp tăng cường cho quá trình hình thành bào tử (Kolodziej và khả năng tạo bào tử của các chủng Bacillus. Slepecky, 1964). Ren và ctv., (2018) thử nghiệm Trong đó đáng chú ý với hai công thức môi trong sáu ion kim loại thì có ba ion Mn2+, Fe2+ trường như sau: công thức 1 bao gồm 16,18 và Ca2+ với nồng độ theo thứ tự 1,0 mM, 3,0 g/L bột bắp, 17,53 g/L bột đậu nành và 8,14 g/L mM, 2,1 mM tạo bào tử B. amyloliquefaciens cao nấm men có khả năng tạo mật độ bào tử B. với mật độ 8,05x109, cao gấp 8,8 lần so với môi subtilis là 1,52x1010 CFU/mL sau 40 giờ (Chen trường không bổ sung các ion kim loại này. và ctv., 2010); công thức 2 bao gồm bột vỏ quýt Ngoài ra, nghiên cứu của Phương Thị Hương 40g, pepton 8,0g, KH2PO4 1,0g, MgSO4.7H2O và Vũ Văn Hạnh (2018) cho thấy với tỷ lệ cấp 0,5 g, polypropylene glycol 5 mL hòa tan trong giống 7%, pH 7, nhiệt độ lên men 370C, tốc độ 1L nước bột phô mai và lên men sau 97 giờ đạt lắc 200 vòng/phút và thành phần môi trường TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 53
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II chứa 1,5% glucose, 1% pepton và Ca2+ 50 mM, TÀI LIỆU THAM KHẢO sinh khối của chủng B. subtilis BSVN 15 đạt Tài liệu tiếng Việt 6,3 x 1011 CFU/mL. Tương tự trong nghiên Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông và Trần Thu cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv., (2018), môi Hoa, 2009. Công nghệ Sinh học Dược, NXB trường thích hợp để sản xuất sinh khối của B. Giáo Dục. subtilis KP3 (4,46x109 CFU/mL) bao gồm 10 Phương Thị Hương và Vũ Văn Hạnh, 2018. Lựa g/L glucose, 19,75 g/L đậu không dầu, amoni chọn điều kiện lên men cho sự sinh trưởng chủng citrate 1,7 g/L, mật rỉ 7,2 g/L, pepton từ thịt Bacillus subtilis BSVN 15 ứng dụng chế phẩm 11,13 g/L, MnCl2 16,58 mM, KH2PO4 4,58 g/L, probiotic trong chăn nuôi, Tạp chí Công Nghệ CaCl2 0,01 g/L, NaCl 4,04 g/L, FeSO4.7H2O 1 Sinh học 16(1): 167-172V. µM, MgSO4.7H2O 0,38 g/L, sau 8 giờ bổ sung Võ Hồng Phượng, Lê Hồng Phước, Nguyễn Thị CaCl2 0,5 g/L và FeSO4.7H2O 35 µM có khả Ngọc Tĩnh và Đặng Ngọc Thùy, 2018. Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp. năng kích thích mật độ bào tử tăng lên gấp 3 gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm sú và tôm lần. Ngoài ra, Yu và ctv., (1998) cho rằng mỗi thẻ chân trắng, Báo cáo tổng kết năm 2018. loại vi khuẩn khác nhau sẽ thích hợp với tỷ lệ Vũ Thanh Thảo, Phan Cảnh Trình, Nguyễn Thị Linh C/N trong môi trường sống nhất định Giang, Lê Văn Thanh và Trần Cát Đông, 2018. Ion Ca2+ là thành phần chủ yếu của lõi bào Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thu nhận bào tử tử và có khả năng gắn kết với thành phần đặc Bacillus subtilis KP3, Y học TpHCM, Phụ bản biệt bào tử gọi là DPA (dipicolinic acid) giúp Tập 22(1): 453-459. bào tử có khả năng chịu đựng được nhiệt độ cao Tài liệu tiếng Anh (Levinson và ctv., 1961). Ngoài ra, Ca2+ tương Bernlohr, R. W. và Leitzmann, C., 1969. Control of tác với các enzyme chịu trách nhiệm cho việc sporulation London: Academic Press. tạo ra các kết nối giữa các protein bề mặt với Castillo E Del (2007), Process Optimization A thành tế bào vi khuẩn, do đó ảnh hưởng đến khả Statistical Approach., Springer Science. New năng bám dính của vi khuẩn (Thomas và Rice, York, USA, 118-122. 2014). Chen, Z. M., Li, Q., Liu, H. M., Yu, N., Xie, T. J., Yang, M. Y., Shen, P. và Chen, X. D., 2010. Greater V. KẾT LUẬN enhancement of Bacillus subtilis spore yields in Trong điều kiện lên men quy mô phòng thí submerged cultures by optimization of medium nghiệm thể tích 50mL, thành phần môi trường composition through statistical experimental được lựa chọn nhằm tối ưu sinh khối của chủng designs, Appl Microbiol Biotechnol, 85(5): 1353-60. Bacillus S5 đã được xây dựng theo mô hình Placket- Burman và phương pháp đáp ứng bề Duc, L. H., Hong, H. A., Barbosa, T. M., Henriques, A. O. và Cutting, S. M., 2004. Characterization mặt RSM bao gồm bột đậu nành 34,9 g/L, cao of Bacillus probiotics available for human use, nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L, tốc độ lắc 170 Applied and environmental microbiology, 70(4): vòng/phút, pH môi trường 7,0 và nhiệt độ lên 2161-2171. men 300C, sau 48 giờ nuôi cấy giá trị OD550nm Granger, A. C., Gaidamakova, E. K., Matrosova, V. đạt 11,36 tương ứng với mật độ 4,3x109 CFU/ Y., Daly, M. J. và Setlow, P., 2011. Effects of Mn mL. Ngoài ra, bổ sung Ca2+ 0,5g/L sau 30 giờ and Fe levels on Bacillus subtilis spore resistance lên men, tế bào dinh dưỡng Bacillus S5 có khả and effects of Mn2+, other divalent cations, năng chuyển 93% sang dạng bào tử. orthophosphate, and dipicolinic acid on protein resistance to ionizing radiation, Appl Environ Microbiol, 77(1): 32-40. Cho, J.-H., Kim, Y.-B. và Kim, E.-K., 2009. Optimization of culture media for Bacillus species by statistical experimental design methods. 54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
  11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Dong, W., Zhang, D., Zhang, J., Li, H. và Jin, Y. A. E., 2005. A procedure for high-yield spore Optimization of the Growth Culture Medium production by Bacillus subtilis, Biotechnol Prog, with Traditional Chinese Herbs and Conditions 21(4): 1026-31. of Bacillus Licheniformis SH003. 2010 4th Nicholson, W. L. và Setlow, P., 1990. Sporulation, International Conference on Bioinformatics and germination, and outgrowth, Chichester, Biomedical Engineering, 18-20 June 2010 2010. England: John Wiley & Sons Ltd. . 1-5. Plackett, R. L. và Burman, J. P., 1946. The Design Gauri, S. S., Mandal, S. M., Pati, B. R. và Dey, S., of Optimum Multifactorial Experiments, 2011. Purification and structural characterization Biometrika. of a novel antibacterial peptide from Bellamya Rao, Y., Tsay, K.-J., Wu, W.-S. và Tzeng, Y.-M., bengalensis: activity against ampicillin and 2007. Medium optimization of carbon and chloramphenicol resistant Staphylococcus nitrogen sources for the production of spores epidermidis, Peptides, 32(4): 691-6. from Bacillus amyloliquefaciens B128 using Grossman, A. D. và Losick, R., 1988. Extracellular response surface methodology. control of spore formation in Bacillus subtilis, Ren, H., Su, Y. T. và Guo, X. H., 2018. Rapid Proceedings of the National Academy of optimization of spore production from Bacillus Sciences of the United States of America, 85(12): amyloliquefaciens in submerged cultures based 4369-4373. on dipicolinic acid fluorimetry assay, AMB Harwood, C. R., 1992. Bacillus subtilis and its Express, 8(1): 21. relatives: molecular biological and industrial Schaeffer, P., Millet, J. và Aubert, J. P., 1965. workhorses, Trends Biotechnol, 10(7): 247-56. Catabolic repression of bacterial sporulation, Khardziani, T., Kachlishvili, E., Sokhadze, K., Proceedings of the National Academy of Sciences Elisashvili, V., Weeks, R., Chikindas, M. L. và of the United States of America, 54(3): 704-711. Chistyakov, V., 2017. Elucidation of Bacillus Thomas, K. J., 3rd và Rice, C. V., 2014. Revised subtilis KATMIRA 1933 Potential for Spore model of calcium and magnesium binding to the Production in Submerged Fermentation of Plant bacterial cell wall, Biometals, 27(6): 1361-70. Raw Materials, Probiotics Antimicrob Proteins, 9(4): 435-443. Xiao, Z. J., Liu, P. H., Qin, J. Y. và Xu, P., 2007. Statistical optimization of medium components Kolodziej, B. J. và Slepecky, R. A., 1964. Trace for enhanced acetoin production from molasses Metal Requirements for Sporulation of Bacillus and soybean meal hydrolysate, Appl Microbiol Megaterium, J Bacteriol, 88(821-30. Biotechnol, 74(1): 61-8. Levinson, H. S., Hyatt, M. T. và Moore, F. E., Yu, X., G Hallett, S., Sheppard, J. và Watson, A., 1961. Dependence of the heat resistance of 1998. Effects of carbon concentration and bacterial spores on the calcium: Dipicolinic acid carbon-to-nitrogen ratio on growth, conidiation, ratio, Biochemical and Biophysical Research spore germination and efficacy of the potential Communications, 5(6): 417-421. bioherbicide Colletotrichum coccodes. Monteiro, S. M., Clemente, J. J., Henriques, A. O., Gomes, R. J., Carrondo, M. J. và Cunha, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 55
  12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II FERMENTATION CONDITIONS FOR OPTIMIZATION OF SPORE PRODUCTION IN BACILLUS S5 USING RESPONSE SURFACE METHOD (RSM) Vo Hong Phuong1*, Dang Ngoc Thuy1, Nguyen Thi Lan Chi1, Nguyen Thanh Truc1, Chu Quang Trong1, Pham Thi Huyen Dieu2 ABSTRACT Bacillus S5 strain was isolated from the soil of an extensive shrimp pond which can inhibit V. parahaemolyticus causing AHPND in experimental conditions. This research aimed to determine the medium composition and fermentation parameters for the optimal growth and spore formation in Bacillus S5 strain which was proved to be a potential probiotic for aquaculture. The optical density (OD550nm) of culture suspension was the parameter that can be used to assess the effectiveness of fermentation conditions. Response surface method (RSM) was used to optimize the fermentation parameters. The results showed that the optimal fermentation medium for producing highest Bacillus S5 biomass after 48h (with OD550nm value 11,36 which corresponded a density of 4.3 x 109 CFU/mL) should have the following composition: soybean flour 34.9 g/L, yeast 20g/L, glucose 35 g/L and shaking speed 170 rpm. In addition, 0.5 g/L of calcium ion added after 30h of fermentation can stimulate a spore-forming ratio of over 90%. Keywords: Bacillus S5 biomass, Bacillus S5 spores, fermentation condition optimization. Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh Ngày nhận bài: 20/5/2019 Ngày thông qua phản biện: 22/6/2019 Ngày duyệt đăng: 26/6/2019 1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2. 2 HCMC University of Education. *Email: vohongphuong@yahoo.com 56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2