Nghiên cứu định lượng amantadin hydrochlorid bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG AMANTADIN HYDROCHLORID<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN<br /> Nguyễn Văn Thịnh*; Vũ Thị Thanh Hằng*; Nguyễn Phương Dung**<br /> Vũ Bình Dương*; Phan Đình Châu**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến<br /> (UV-VIS) để định lượng amantadin hydrochlorid (AM) trong môi trường thử độ hòa tan. Đối tượng<br /> và phương pháp: khảo sát, lựa chọn các điều kiện của phản ứng tạo phức bromophenol blue (BB)<br /> với amantadin. Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng với các chỉ tiêu: độ đặc hiệu,<br /> độ chính xác, độ đúng, đường chuẩn và khoảng tuyến tính theo hướng dẫn của ICH. Kết quả:<br /> đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp cho quy trình định lượng như: pH dung dịch đệm,<br /> nồng độ dung dịch BB, thời gian phản ứng và số lần chiết dẫn xuất tạo thành. Phương pháp<br /> định lượng đã được thẩm định với khoảng tuyến tính ở nồng độ 20 - 250 µg/ml. Độ chính xác<br /> trong ngày và khác ngày lần lượt nhỏ hơn 5,12% và 5,31%. Độ đúng của phương pháp trong<br /> khoảng 95,96 - 102,96%. Kết luận: đã xây dựng phương pháp phù hợp để định lượng AM trong<br /> phép thử độ hòa tan.<br /> * Từ khóa: Amantadin hydrochlorid; Bromophenol blue; UV-VIS; Phương pháp thử độ hoà tan.<br /> <br /> Study on Spectrophotometric Method for Determination of Amantadine<br /> Hydrochloride<br /> Summary<br /> Objectives: To develop and validate an UV-VIS method for determination of amantadine<br /> hydrochloride (AM) in drug dissolution testing. Materials and methods: Factors of complex reaction<br /> of amantadine with bromophenol blue (BB) were investigated and adapted. Validation of the<br /> method was conducted with criteria of specificity, precision, accuracy, linearity and calibration curve,<br /> according to ICH guidelines. Results: The appropriate procedure for the quantitation was adopted<br /> with regard to such factors as pH of buffer, concentration of BB, reaction time, and number of<br /> extraction. The quantitative method was validated with a linear range from 20 to 250 µg/mL.<br /> Intra- and inter-day precision were less than 5.12% and 5.31%, respectively. The accuracy was<br /> from 95.96% to 102.96%. Conclusion: The developed method is suitable for determination of<br /> AM in dissolution testing.<br /> * Key words: Amantadine hydrochloride; Bromophenol blue; UV-VIS; Drug dissolution testing.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Năm 1966, Cục Quản lý Thực phẩm và<br /> Dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận amantadin<br /> là một thuốc dự phòng cúm và điều trị virut<br /> <br /> cúm A ở người lớn. Năm 1969, thuốc được<br /> sử dụng trong điều trị giảm các triệu chứng<br /> của bệnh Parkinson, hội chứng ngoại tháp<br /> do thuốc và chứng ngồi nằm không yên<br /> (akathisia).<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại học Bách khoa Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thịnh (thinhnguyenmp@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/08/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016<br /> <br /> 74<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br /> Hiện nay, trên thị trường có một số chế<br /> phẩm chứa AM như amazolon (Sawai);<br /> mantadan (Boehringer, Ing.); mantadin<br /> (DuPont Pharma); mantadix (DuPont<br /> Pharma); symmetrel (DuPont Pharma).<br /> Việc định lượng các thuốc này gặp nhiều<br /> khó khăn vì amantadin không hấp thụ tia<br /> UV, cũng như không có khả năng phát<br /> bức xạ huỳnh quang. Trên thế giới, đã có<br /> một số nghiên cứu về phương pháp định<br /> lượng AM bằng đo quang phổ hấp thụ,<br /> quang phổ huỳnh quang [1], phương<br /> pháp HPLC [2], TLC [3], GC-MS [4]...<br /> Phương pháp định lượng dựa trên các<br /> phản ứng tạo dẫn xuất có khả năng bức xạ<br /> UV hoặc bức xạ huỳnh quang. Các chất<br /> phản ứng tạo dẫn xuất được sử dụng gồm<br /> iod [1], 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol<br /> [2], 2,3-diphenylquinolizinium bromid [5].<br /> Nghiên cứu này, chúng tôi trình bày<br /> kết quả: Nghiên cứu xây dựng và thẩm<br /> định phương pháp định lượng AM bằng<br /> phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS<br /> có sử dụng chất tạo dẫn xuất có khả năng<br /> hấp thụ ánh sáng tại 408 nm. Phương pháp<br /> xây dựng được có độ đúng và chính xác<br /> cao, đơn giản, phù hợp cho các phép thử<br /> độ hòa tan trong bào chế viên nén và<br /> nghiên cứu định lượng khác.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> kali dihydrophosphat, natri dihydrophosphat<br /> axít boric, axít chlohydric, natri hydroxyd.<br /> * Thiết bị nghiên cứu:<br /> - Máy đo quang phổ hấp thụ UV-VIS<br /> (Biochrom Ltd, Anh).<br /> - Máy đo pH (Mettler - Toledo group,<br /> Thụy Sỹ).<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Xây dựng quy trình định lượng dựa<br /> vào phản ứng giữa AM và BB:<br /> Vì độ hấp thụ của dẫn xuất tạo thành<br /> của phản ứng giữa AM và BB quyết định<br /> đến độ đúng, độ chính xác của phương<br /> pháp nên cần khảo sát các yếu tố ảnh<br /> hưởng đến hiệu suất phản ứng gồm: pH<br /> môi trường phản ứng, nồng độ thuốc thử,<br /> thời gian thực hiện phản ứng, cũng như<br /> phương pháp chiết xuất dẫn chất thu<br /> được sau phản ứng. Để tiến hành khảo<br /> sát, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch sau:<br /> - Chuẩn bị dung dịch chuẩn: pha các<br /> dung dịch chuẩn có nồng độ 250 µg/ml,<br /> 200 µg/ml, 150 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml,<br /> 20 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc.<br /> - Pha dung dịch đệm: pha các dung dịch<br /> đệm có nồng độ 0,1 M gồm: đệm phosphat<br /> H3 PO 4/KH2 PO 4 có pH 2,5; đệm acetat<br /> CH3COOH/CH3COONa có pH 3,5, 4,5; 5,5;<br /> đệm KH2PO4/Na2HPO4 có pH 7,5, đệm borat<br /> NaOH/H3BO3 có pH 9,5; 10,5.<br /> <br /> AM chuẩn (Wako Pure Chemical Industries,<br /> Ltd., Nhật Bản, số lô: AWF0974), thuốc<br /> thử BB (Merck, Đức).<br /> <br /> - Pha dung dịch thuốc thử BB: cân<br /> 0,15 g BB vào bình định mức 100 ml,<br /> thêm 10 ml dung dịch NaOH 0,05 M. Lắc<br /> trong 5 phút tới tan hoàn toàn. Thêm nước<br /> cất tới vạch định mức, thu được dung dịch<br /> BB có nồng độ 0,15%.<br /> <br /> Các hóa chất tinh khiết khác:<br /> dichloromethan, natri acetat, axít phosphoric,<br /> <br /> - Khảo sát quy trình định lượng trong:<br /> lấy chính xác 1 ml mẫu thử đã pha loãng<br /> <br /> 1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị.<br /> * Nguyên liệu, hóa chất:<br /> <br /> 75<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> về khoảng nồng độ định lượng vào bình<br /> gạn, thêm 5 ml dung dịch BB 0,15% và<br /> 4 ml đệm acetat pH 3,5. Lắc trong 3 phút.<br /> Thêm 10 ml CH2Cl2, lắc, gạn lấy phần<br /> dung dịch CH2Cl2, đem đo lại bước sóng<br /> tại 408 nm. Khảo sát lựa chọn các điều<br /> kiện thích hợp về pH dung dịch đệm,<br /> nồng độ dung dịch BB, thời gian lắc phản<br /> ứng, số lần chiết với CH2Cl2.<br /> * Thẩm định quy trình định lượng AM:<br /> Thẩm định phương pháp định lượng<br /> đã xây dựng được theo hướng dẫn của<br /> ICH Q2(R1) theo các chỉ tiêu: độ đặc hiệu,<br /> độ đúng, độ chính xác, đường chuẩn và<br /> khoảng tuyến tính [6].<br /> <br /> pH của phản ứng tạo phức ảnh hưởng<br /> rất lớn tới độ hấp thụ của sản phẩm sau<br /> phản ứng. Khoảng pH từ 2,5 - 4,5 cho kết<br /> quả độ hấp thụ cao. Với pH > 4,5 độ hấp<br /> thụ giảm mạnh. Ở pH 3,5, độ hấp thụ cao<br /> nhất.<br /> * Khảo sát nồng độ BB:<br /> Pha các mẫu thuốc thử BB có nồng độ<br /> khác nhau từ 0,05 - 0,2%. Thực hiện phản<br /> ứng với dung dịch AM nồng độ 250 µg/ml<br /> và xử lý mẫu theo quy trình trên.<br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ dung<br /> dịch BB tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3).<br /> Số thứ tự<br /> <br /> Nồng độ BB (%)<br /> <br /> Độ hấp thụ<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,050<br /> <br /> 0,332 ± 0,015<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,075<br /> <br /> 0,639 ± 0,032<br /> <br /> 1. Kết quả xây dựng quy trình định<br /> lượng.<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,100<br /> <br /> 0,945 ± 0,028<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,125<br /> <br /> 1,257 ± 0,039<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0,150<br /> <br /> 1,299 ± 0,036<br /> <br /> 6<br /> <br /> 0,175<br /> <br /> 1,310 ± 0,045<br /> <br /> 7<br /> <br /> 0,200<br /> <br /> 1,297 ± 0,031<br /> <br /> * Khảo sát pH của dung dịch đệm trong<br /> phản ứng giữa AM và BB tới độ hấp thụ:<br /> Pha các dung dịch đệm có pH trong<br /> khoảng 2,5 - 10,5. Thực hiện phản ứng<br /> tạo dẫn xuất với dung dịch AM 250 µg/ml<br /> và dung dịch BB 0,15% theo quy trình<br /> trên. Đo độ hấp thụ của mẫu thu được.<br /> Bảng 1: Ảnh hưởng của pH dung dịch<br /> đệm tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3).<br /> Số thứ tự<br /> <br /> pH<br /> <br /> Độ hấp thụ<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2,5<br /> <br /> 0,810 ± 0,025<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3,5<br /> <br /> 1,279 ± 0,035<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4,5<br /> <br /> 0,774 ± 0,021<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5,5<br /> <br /> 0,087 ± 0,023<br /> <br /> 5<br /> <br /> 7,5<br /> <br /> 0,037 ± 0,013<br /> <br /> 6<br /> <br /> 9,5<br /> <br /> 0,005 ± 0,002<br /> <br /> 7<br /> <br /> 10,5<br /> <br /> 0,005 ± 0,002<br /> <br /> 76<br /> <br /> Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng<br /> nồng độ BB, độ hấp thụ tăng. Từ nồng độ<br /> 0,125%, độ hấp thụ tăng không đáng kể,<br /> lượng BB đã đủ dư cho phản ứng tạo dẫn<br /> xuất. Dựa vào kết quả của bảng 2, chúng<br /> tôi lựa chọn nồng độ 0,15% để thực hiện<br /> phản ứng tạo dẫn xuất.<br /> * Ảnh hưởng của thời gian phản ứng<br /> đến độ hấp thụ:<br /> Thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất của<br /> dung dịch AM 250 và BB 0,15% theo quy<br /> trình xử lý trên. Lắc kỹ trong các khoảng<br /> thời gian khác nhau. Sau đó chiết với<br /> CH2Cl2 và đo quang tại bước sóng 408 nm.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br /> Bảng 3: Ảnh hưởng của của thời gian<br /> phản ứng đến độ hấp thụ.<br /> <br /> CH2Cl2 vào bình gạn, lắc kỹ trong 3 phút.<br /> Tách lấy phần dung dịch CH2Cl2 và đo độ<br /> hấp thụ tại bước sóng 408 nm. Từ quy<br /> trình đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành<br /> thẩm định phương pháp để định lượng AM.<br /> <br /> Số thứ tự<br /> <br /> Thời gian<br /> <br /> Độ hấp thụ<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2 phút<br /> <br /> 1,285 ± 0,025<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3 phút<br /> <br /> 1,293 ± 0,048<br /> <br /> 2. Thẩm định phương pháp định lượng.<br /> <br /> 3<br /> <br /> 5 phút<br /> <br /> 1,304 ± 0,022<br /> <br /> * Độ đặc hiệu, chọn lọc:<br /> <br /> 4<br /> <br /> 10 phút<br /> <br /> 1,296 ± 0,011<br /> <br /> Phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra nhanh,<br /> giá trị độ hấp thụ đo được không khác<br /> biệt nhiều giữa các khoảng thời gian phản<br /> ứng. Dựa vào kết quả đo được, chúng tôi<br /> lựa chọn khoảng thời gian thực hiện phản<br /> ứng là 3 phút.<br /> <br /> Tiến hành pha dung dịch chuẩn AM.<br /> Cho dung dịch này phản ứng và chiết xuất<br /> theo quy trình trên.<br /> <br /> a<br /> <br /> * Khảo sát hiệu suất chiết trong quy<br /> trình định lượng:<br /> Thực hiện đo quang phổ các mẫu được<br /> xử lý theo quy trình đã lựa chọn. Chiết 4<br /> lần các mẫu đo bằng 10 ml CH2Cl2.<br /> Bảng 4: Hiệu suất chiết dẫn xuất tạo<br /> thành trong phản ứng (n = 3).<br /> b<br /> Số thứ tự<br /> <br /> Độ hấp thụ<br /> <br /> Hiệu suất chiết (%)<br /> <br /> Lần chiết 1<br /> <br /> 1,326 ± 0,050<br /> <br /> 85,23 ± 4,09<br /> <br /> Lần chiết 2<br /> <br /> 0,182 ± 0,064<br /> <br /> 11,73 ± 3,88<br /> <br /> Lần chiết 3<br /> <br /> 0,041 ± 0,021<br /> <br /> 2,65 ± 1,27<br /> <br /> Lần chiết 4<br /> <br /> 0,006 ± 0,002<br /> <br /> 0,39 ± 0,13<br /> <br /> Kết quả cho thấy trong lần chiết 1,<br /> phần lớn dẫn xuất tạo thành đã được<br /> chiết khỏi dung dịch phản ứng (85,23%).<br /> Từ kết quả của các khảo sát trên, chúng<br /> tôi lựa chọn quy trình định lượng như<br /> sau: lấy 1 ml mẫu thử bằng pipet chính<br /> xác vào bình gạn, thêm 5 ml dung dịch<br /> BB 0,15% và 4 ml đệm acetat pH 3,5,<br /> lắc trong 3 phút. Thêm chính xác 10 ml<br /> <br /> Hình 1: Phổ hấp thụ của mẫu trắng (a) và<br /> mẫu thử (b).<br /> Kết quả cho thấy phổ hấp thụ của mẫu<br /> thử sau quá trình xử lý mẫu có cực đại tại<br /> 408 nm. So với các mẫu trắng, không có<br /> đỉnh cực đại tại bước sóng này. Do đó, có<br /> thể dựa vào bước sóng này để định<br /> lượng AM trong các mẫu thử.<br /> 77<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> * Đường chuẩn và khoảng tuyến tính:<br /> Pha dung dịch AM chuẩn có nồng độ trong khoảng 20 - 250 µg/ml. Tiến hành xử lý<br /> mẫu như điều kiện đã chọn.<br /> Bảng 5: Đường chuẩn và khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng.<br /> Nồng độ (µg/ml)<br /> <br /> Độ hấp thụ<br /> <br /> Độ đúng (%)<br /> <br /> 250<br /> <br /> 1,296<br /> <br /> 98,23<br /> <br /> 200<br /> <br /> 1,053<br /> <br /> 98,65<br /> <br /> 150<br /> <br /> 0,820<br /> <br /> 100,66<br /> <br /> 100<br /> <br /> 0,570<br /> <br /> 101,30<br /> <br /> 50<br /> <br /> 0,317<br /> <br /> 102,05<br /> <br /> 20<br /> <br /> 0,160<br /> <br /> 99,11<br /> <br /> Kết quả khảo sát cho thấy: độ hấp thụ (A) và nồng độ (C, µg/ml) của mẫu đo có sự<br /> tương quan tuyến tính với hệ số tương quan R là 0,999. Phương trình đường chuẩn<br /> được xây dựng: A = 0,005043C + 0,06026.<br /> Độ đúng của các điểm nồng độ trong đường chuẩn được xác định từ 98,23 102,05%. Như vậy, phương pháp định lượng có độ tuyến tính cao giữa độ hấp thụ và<br /> nồng độ từ 20 - 250 µg/ml với độ đúng 98,23 - 102,05%.<br /> * Độ chính xác:<br /> Xác định bằng cách đo dung dịch chuẩn AM tại 3 nồng độ 50, 100, 150 µg/ml. Mỗi điểm<br /> nồng độ làm lặp lại 6 lần. Xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn. Thực hiện phân tích<br /> các mẫu trong ngày và khác ngày để xác định độ chính xác trong ngày (độ lặp lại) và độ<br /> chính xác khác ngày (độ chính xác trung gian).<br /> Bảng 6: Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày.<br /> Trong ngày<br /> Mẫu<br /> <br /> Nồng độ<br /> ( X ± SD)<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> Khác ngày<br /> Độ đúng<br /> <br /> Nồng độ<br /> <br /> ( X %)<br /> <br /> ( X ± SD)<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> Độ đúng<br /> ( X %)<br /> <br /> LQC (µg/ml)<br /> <br /> 50,38 ± 2,58<br /> <br /> 5,12<br /> <br /> 100,99<br /> <br /> 49,90 ± 2,65<br /> <br /> 5,31<br /> <br /> 100,01<br /> <br /> MQC (µg/ml)<br /> <br /> 102,73 ± 3,46<br /> <br /> 3,37<br /> <br /> 102,96<br /> <br /> 101,92 ± 3,64<br /> <br /> 3,57<br /> <br /> 102,14<br /> <br /> HQC (µg/ml)<br /> <br /> 143,62 ± 4,35<br /> <br /> 3,03<br /> <br /> 95,96<br /> <br /> 144,39 ± 4,98<br /> <br /> 3,45<br /> <br /> 96,47<br /> <br /> Tại cả 3 nồng độ (50; 100 và 150 µg/ml), phương pháp đều cho độ đúng tốt (96,96 103,96%) và độ lặp lại khác ngày với giá trị RSD < 10% (3,45 - 5,31%), chứng tỏ<br /> phương pháp định lượng có độ đúng, độ chính xác, đảm bảo yêu cầu cho phân tích<br /> định lượng trong mẫu thử độ hòa tan và những nghiên cứu định lượng khác.<br /> 78<br /> <br />