Nghiên cứu định lượng curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ<br /> PIPERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương*<br /> Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương**<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và<br /> piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm<br /> và tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Cả 2 chất đã được tách hoàn toàn trong thời gian 10 phút. Giới hạn<br /> định lượng của curcumin và piperin là 0,06 và 0,08 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các chất có<br /> mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Phương pháp có độ chính xác cao,<br /> độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi cả 2 chất từ 93 - 100%. Phương pháp này được sử<br /> dụng để định lượng curcumin và piperin trong chế phẩm chứa curcumin và piperin.<br /> * Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng.<br /> <br /> SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND<br /> PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC<br /> SUMMARY<br /> A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements<br /> was validated. Using acetonitrile and buffer KH2PO4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase,<br /> Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin<br /> and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes. The quantitation limits of curcumin<br /> and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml. The calibration curve of each analyte had a correlation<br /> coefficient close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were<br /> 93 - 100% for both curcumin and piperine.<br /> * Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Curcumin là hoạt chất chính của Nghệ<br /> vàng (Curcuma longa L.) [1]. Curcumin có<br /> tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế sự<br /> phát triển của khối u, tăng khả năng miễn<br /> dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa một<br /> <br /> số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn,<br /> chống viêm… Curcumin rất kém tan trong<br /> nước (độ tan 0,001%) và sinh khả dụng đạt<br /> 2 - 3%. Các nghiên cứu cho thấy: piperin<br /> làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/07/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 28/07/2014<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> 20 lần [2, 3]. Hiện nay, trên thị trường Việt<br /> Nam đã xuất hiện những sản phẩm kết hợp<br /> curcumin và piperin (tỷ lệ khoảng 100:1)<br /> nhưng vẫn chưa có phương pháp định<br /> lượng đồng thời 2 chất trên. Vì vậy, chúng<br /> tôi thực hiện nghiên cứu nhằm: Xây dựng<br /> quy trình định lượng đồng thời curcumin<br /> và piperin bằng phương pháp HPLC.<br /> NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ<br /> PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên<br /> cứu.<br /> * Hóa chất, nguyên liệu:<br /> - Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%,<br /> Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin<br /> chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich).<br /> - Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin và<br /> piperin.<br /> - Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn<br /> HPLC (Merck).<br /> - Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4,<br /> H3PO4, nước cất… đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br /> phân tích.<br /> * Thiết bị và dụng cụ phân tích:<br /> - Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D,<br /> 4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có<br /> buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc<br /> ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).<br /> - Cân phân tích Sartorius độ chính xác<br /> ± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH,<br /> các dụng cụ thủy tinh, bình định mức,<br /> pipet có độ chính xác phù hợp.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> - Khảo sát quy trình định lượng.<br /> + Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu<br /> [5, 6], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý<br /> mẫu như sau:<br /> <br /> 8<br /> <br /> Cân chính xác lượng bột tương đương<br /> với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng<br /> 40 ml MeOH, lắc đều. Chiết siêu âm trong<br /> 20 phút. Để nguội, chuyển toàn bộ dịch<br /> chiết vào bình định mức 50 ml. Thêm<br /> MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc lấy<br /> dịch lọc. Lấy 1 ml dịch lọc đem bốc hơi ở<br /> nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn trong<br /> 10 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45 µl<br /> trước khi phân tích bằng HPLC.<br /> + Điều kiện sắc ký [5, 6]:<br /> Cố định các điều kiện: cột Gemini C18<br /> (250 x 4,6 mm, 5 µm); detector PDA;<br /> thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng<br /> 0,8 ml/phút. Khảo sát pha động với hệ dung<br /> môi MeOH:nước và đệm KH2PO4:ACN.<br /> - Thẩm định quy trình định lượng.<br /> Thẩm định quy trình định lượng theo<br /> hướng dẫn của Bộ Y tế [4] gồm các chỉ<br /> tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc<br /> ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng<br /> độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn<br /> định lượng, độ chính xác, độ đúng.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Khảo sát quy trình định lƣợng.<br /> Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo<br /> sát điều kiện sắc ký và ghi sắc ký đồ.<br /> Phân tích kết quả và lựa chọn được điều<br /> kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời<br /> curcumin và piperin như sau: cột sắc ký:<br /> cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),<br /> detector PDA, ghi phổ ở 340 nm. Pha<br /> động: hỗn hợp dung môi acetonitril và<br /> dung dịch đệm KH2PO4 50 mM (điều chỉnh<br /> đến pH = 3,5 bằng axít phosphoric) tỷ lệ<br /> 60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể<br /> tích bơm mẫu 50 µl, thời gian phân tích:<br /> 10 phút.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> 2. Thẩm định quy trình định lƣợng.<br /> - Tính tương thích hệ thống sắc ký:<br /> Tiến hành sắc ký 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất curcumin và piperin<br /> đều có nồng độ 10 µg/ml theo điều kiện đã lựa chọn. Kết quả về thời gian lưu và diện<br /> tích pic được trình bày trong bảng 1.<br /> Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.<br /> STT<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> Spic(µV.s)<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> Spic(µV.s)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 8,155<br /> <br /> 523508<br /> <br /> 8,931<br /> <br /> 1374756<br /> <br /> 2<br /> <br /> 8,156<br /> <br /> 526881<br /> <br /> 8.973<br /> <br /> 1375616<br /> <br /> 3<br /> <br /> 8,149<br /> <br /> 534524<br /> <br /> 8,948<br /> <br /> 1372662<br /> <br /> 4<br /> <br /> 8,154<br /> <br /> 523406<br /> <br /> 8,961<br /> <br /> 1378233<br /> <br /> 5<br /> <br /> 8,144<br /> <br /> 521094<br /> <br /> 8,950<br /> <br /> 1375421<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8,143<br /> <br /> 520245<br /> <br /> 8,950<br /> <br /> 1375634<br /> <br /> X<br /> <br /> 8,150<br /> <br /> 524943<br /> <br /> 8,950<br /> <br /> 1375387<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,07<br /> <br /> 0,99<br /> <br /> 0,15<br /> <br /> 0,13<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của cả 2 chất đều < 2%,<br /> chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích 2 chất<br /> trên trong các mẫu.<br /> - Độ chọn lọc - đặc hiệu:<br /> Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của curcumin, piperin đều có nồng độ 10 µg/ml,<br /> mẫu trắng và mẫu thử.<br /> <br /> (a)<br /> <br /> PI<br /> CUR<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> CUR<br /> PI<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của curcumin và<br /> piperin trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c).<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của curcumin và<br /> piperin không xuất hiện các pic như ở mẫu chuẩn. Các pic của chất phân tích trong<br /> mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ<br /> đặc hiệu cao.<br /> - Khoảng nồng độ tuyến tính:<br /> Pha một dãy dung dịch chuẩn curcumin có nồng độ khoảng 10 - 200 µg/ml, piperin<br /> có nồng độ khoảng 0,5 - 10 µg/ml và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.<br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của curcumin<br /> và piperin.<br /> (µg/ml)<br /> <br /> Diện tích pic (μV.s)<br /> <br /> 610060<br /> <br /> 3120758<br /> <br /> 6203550<br /> <br /> Phương trình hồi quy: y = 59798 x + 976,88<br /> Piperin.<br /> <br /> 9380402<br /> <br /> 12407214<br /> <br /> R² = 0,9999<br /> <br /> Nồng độ (µg/ml)<br /> <br /> 0,52<br /> <br /> 1,04<br /> <br /> 2,08<br /> <br /> 5,2<br /> <br /> 10,4<br /> <br /> Diện tích pic (μV.s)<br /> <br /> 29006<br /> <br /> 52082<br /> <br /> 96523<br /> <br /> 219847<br /> <br /> 452053<br /> <br /> Phương trình hồi quy: y = 42572 x + 6084,1; R² = 0,9994<br /> <br /> Hình 2: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của curcumin.<br /> <br /> Hình 3: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của piperin.<br /> Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ piperin<br /> và curcumin trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ 1.<br /> - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:<br /> Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn<br /> phát hiện và giới hạn định lượng của curcumin và piperin. Tiến hành pha thử 4 - 5<br /> nồng độ quanh điểm dự kiến. Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của curcumin là<br /> 0,01 µg/ml và piperin là 0,02 µg/ml; giới hạn định lượng dưới của curcumin là 0,04 µg/ml<br /> và piperin là 0,08 µg/ml.<br /> <br /> 10<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> - Độ chính xác:<br /> Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB và nghiền thành bột mịn.<br /> Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin (tiến hành lặp lại<br /> 6 lần). Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, kết quả được thể hiện trong bảng 3.<br /> Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC.<br /> <br /> (mg)<br /> <br /> DiÖn tÝch pic<br /> (μV.s)<br /> <br /> Hµm l-îng t×m thÊy<br /> (mg/viên)<br /> <br /> DiÖn tÝch pic (μV.s)<br /> <br /> Hµm l-îng t×m thÊy<br /> (mg/viên)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 125,6<br /> <br /> 5205871<br /> <br /> 171,86<br /> <br /> 23014<br /> <br /> 1,34<br /> <br /> 2<br /> <br /> 124,8<br /> <br /> 5058579<br /> <br /> 168,94<br /> <br /> 22635<br /> <br /> 1,31<br /> <br /> 3<br /> <br /> 125,6<br /> <br /> 5247484<br /> <br /> 175,25<br /> <br /> 22887<br /> <br /> 1,33<br /> <br /> 4<br /> <br /> 124,9<br /> <br /> 4996609<br /> <br /> 166,87<br /> <br /> 22761<br /> <br /> 1,32<br /> <br /> 5<br /> <br /> 125,1<br /> <br /> 5064267<br /> <br /> 169,13<br /> <br /> 221295<br /> <br /> 1,27<br /> <br /> X<br /> <br /> 169,89<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 1,85<br /> <br /> 1,31<br /> 1,89<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối đều < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt,<br /> đáp ứng yêu cầu phân tích.<br /> - Độ đúng:<br /> Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB, và nghiền thành bột mịn.<br /> Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin với 6 lần cân<br /> khác nhau. Thêm 100 µl dung dịch chất chuẩn piperin có nồng độ 1.000 µg/ml, và 10 mg<br /> chuẩn curcumin, trộn đều, để khô tự nhiên. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký.<br /> Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp HPLC.<br /> C h Ê t<br /> <br /> Curcumin<br /> <br /> pepirin<br /> <br /> STT<br /> <br /> l - î n g<br /> <br /> 1<br /> <br /> 10<br /> <br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> <br /> mg)<br /> <br /> L - î n g<br /> <br /> (mg)<br /> <br /> T û<br /> <br /> 9,58<br /> <br /> 95,8<br /> <br /> 10,1<br /> <br /> 9,41<br /> <br /> 93,2<br /> <br /> 10,2<br /> <br /> 10,12<br /> <br /> 99,2<br /> <br /> 10<br /> <br /> 9,67<br /> <br /> 96,7<br /> <br /> 5<br /> <br /> 9,9<br /> <br /> 9,42<br /> <br /> 95,2<br /> <br /> 6<br /> <br /> 10,3<br /> <br /> 10,12<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,097<br /> <br /> 97<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,095<br /> <br /> 95<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,093<br /> <br /> 93<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,094<br /> <br /> 94<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,097<br /> <br /> 97<br /> <br /> 6<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,095<br /> <br /> 95<br /> <br /> (%)<br /> <br /> X = 96,41<br /> SD = 2,1<br /> RSD = 2,2%<br /> <br /> X = 95<br /> SD = 1,6<br /> RSD = 1,7%<br /> <br /> Tỷ lệ thu hồi của curcumin và piperin từ 93 - 99% nằm trong giới hạn cho phép<br /> (92% - 100%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao.<br /> <br /> 11<br /> <br />