Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI<br />
CALOPHYLLOLID VÀ CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U –<br />
NGHỆ BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC<br />
Nguyễn Hoàng Thảo My*, Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Võ Thị Bạch Huệ*<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Mở đầu – Mục tiêu: Chế phẩm Dầu Mù u kết hợp với Nghệ (Dầu Mù u – Nghệ) l| hướng nghiên cứu kế<br />
thừa từ những dữ liệu khoa học đã được chứng minh về tác dụng tương hỗ của dầu Mù u và Nghệ v|ng cũng<br />
như giới thiệu và tiêu chuẩn hóa dạng sản phẩm mới.<br />
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo s{t c{c điều kiện để xây dựng và thẩm định phương ph{p HPLC để<br />
định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I trong dầu Mù u – Nghệ.<br />
Đối tượng nghiên cứu: calophyllolid và curcumin I.<br />
Phương pháp nghiên cứu: khảo sát quy trình xử lý mẫu v| c{c điều kiện sắc ký để xây dựng và thẩm định<br />
quy trình định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I trong mẫu dầu Mù u – Nghệ bằng phương ph{p<br />
HPLC.<br />
Kết quả: Quy trình xử lý mẫu: calophyllolid và curcumin trong mẫu thử được chiết bằng dung môi hòa tan<br />
và xử lý bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE). Điều kiện sắc ký: Cột C18 Waters (250 x 4,6 mm; 5 m); pha động: kỹ<br />
thuật rửa giải gradient với chương trình dung môi acetonitril acid formic 0,1%; nhiệt độ cột: 40 oC; tốc độ dòng:<br />
1 ml/phút; thể tích tiêm: 10 μl; bước sóng phát hiện: 270 nm. Kết quả thẩm định: Quy trình đã được thẩm định<br />
với các chỉ tiêu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính (curcumin I: y = 17386x, R2 = 0,9996, khoảng nồng độ khảo sát 1,0<br />
– 16,0 ppm và calophyllolid: y = 29309x, R2 = 0,9998, khoảng nồng độ khảo sát 5,0 – 80,0 ppm), độ lặp lại<br />
(curcumin I RSD% = 2,00 v| calophyllolid RSD% = 1,79), độ chính xác trung gian (curcumin I RSD% = 1,98 và<br />
calophyllolid RSD% = 1,31) v| độ đúng (tỷ lệ phục hồi của curcumin I v| calophyllolid đều từ 98 – 102%;<br />
curcumin I RSD% = 1,34; calophyllolid RSD% = 1,28) với các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu của một quy trình<br />
định lượng.<br />
Kết luận: Quy trình ph}n tích HPLC định lượng được đồng thời calophyllolid v| curcumin I đạt các yêu<br />
cầu thẩm định, l| cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm của dầu Mù u – Nghệ.<br />
Từ khóa: dầu Mù u – Nghệ, calophyllolid, curcumin I, HPLC, SPE, Ho C<br />
<br />
ABSTRACT<br />
QUANTITATIVE DETERMINATION OF CALOPHYLLOLIDE AND CURCUMIN I IN TAMANU –<br />
TURMERIC OIL BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD<br />
Nguyen Hoang Thao My, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue<br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:229 - 234<br />
Background – Objectives:The combination of Calophyllum inophyllum seed oil and Curcuma longa (also<br />
called tamanu – turmeric oil) is a study based on proven scientific data on the synergistic effects of tamanu oil and<br />
turmeric as well as introduce and standardize new product types. The objectives of this study, we researched some<br />
conditions for development and validation the determination of calophyllolide and curcumin I in tamanu –<br />
turmeric oil by HPLC method.<br />
*Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br />
Tác giả liên lạc: Nguyễn Hữu Lạc Thủy<br />
ĐT: 091.551.7890<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
Email: nguyenhuulacthuy@gmail.com<br />
<br />
229<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
Methods: Finding out the sample processing and the suitable chromatographic conditions for determination<br />
of calophyllolide and curcumin I by HPLC method, after that it was validated in system suitability, selectivity,<br />
linearity range, precision and accuracy.<br />
Results: The sample was processed by solid phase extraction (SPE). The suitable chromatographic conditions<br />
for separation of calophyllolide and curcumin I were obtained using: a stainless steel column (250 x 4.6 mm),<br />
packed with octadecylsilane bonded to porous silica (5 m); mobile phase: a mixture of acetonitrile and formic<br />
acide 0.1% with gradient elution technique; flow rate 1 ml per minute; injection volume 10 µl; column<br />
temperature 40 oC; 270 nm PDA detector. The method were validated selectivity and showed linearity range of<br />
calophyllolide (5.0 – 80.0 ppm; ŷ = 29309x; R2 = 0.9998) and curcumin I (1.0 – 16.0 ppm; ŷ=17386x; R2 =<br />
0.9996), respectively of calophyllolide and curcumin I, precision of both calophyllolide and curcumin I with RSD ≤<br />
2.0%; accuracy with recovery ratio in 98 – 102 %.<br />
Conclusions: HPLC method was succeessfully determinated calophyllolide and curcumin I as well as<br />
validated this process, which is databased to construct the analytical standards of tamanu – turmeric oil.<br />
Keywords: tamanu – turmetic oil, calophyllolide, curcumin I, HPLC, SPE<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Dầu Mù u – Nghệ là sự phối hợp của dầu<br />
Mù u với dầu Nghệ tạo dạng thành phẩm<br />
mang hoạt tính điều trị tốt hơn nhờ vào tác<br />
dụng tƣơng hỗ củ h i dƣợc liệu này. Các<br />
nghiên cứu định lƣợng calophyllolid trong<br />
Mù u hay curcumin I trong Nghệ(1) đã đƣợc<br />
một số tài liệu công bố, tuy nhiên hiện nay vẫn<br />
chƣ có c ng trình n|o c ng bố phƣơng ph{p<br />
định lƣợng đồng thời 2 hoạt chất này trong<br />
thành phẩm dầu Mù u – Nghệ.<br />
Calophyllolid là một marker trong dầu<br />
Mù u với hoạt tính kháng viêm, kháng<br />
khuẩn và giúp mau lành vết thƣơng (2,4) .<br />
Curcumin I là nhóm hoạt chất mang tác<br />
động kháng viêm (5) và chống oxi hóa (3) . Vì<br />
vậy, mục tiêu đề tài là xây dựng và thẩm<br />
định phƣơng ph{p định lƣợng đồng thời<br />
calophyllolid và curcumin trong thành<br />
phẩm dầu Mù u – Nghệ bằng sắc ký lỏng<br />
hiệu năng c o HPLC , từ đó đề nghị giới<br />
hạn h|m lƣợng của hai hoạt chất này trong<br />
chế phẩm.<br />
<br />
ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br />
Đối tƣợng nghiên cứu<br />
<br />
Nguyên vật liệu<br />
Chất đối chiếu calophyllolid (94,90%) và<br />
curcumin I (92,93%) do nhóm nghiên cứu<br />
phân lập.<br />
Mẫu nghiên cứu<br />
Thành phẩm dầu Mù u – Nghệ do nhóm<br />
nghiên cứu điều chế.<br />
Thiết bị chính<br />
HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA; cột<br />
C18 Waters (250 x 4,6 mm; 5 µm) và một số thiết<br />
bị kh{c đã đƣợc hiệu chuẩn định kỳ theo quy<br />
định.<br />
Dung môi - hóa chất<br />
Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn HPLC<br />
Merck ; nƣớc cất 2 lần dùng cho sắc ký lỏng.<br />
Phƣơng pháp nghiên cứu<br />
<br />
Khảo sát điều kiện xử lý mẫu<br />
Khảo sát dung môi hòa tan mẫu: methanol<br />
và acetonitril, chọn dung m i hò t n đƣợc<br />
c lophyllolid v| curcumin; đƣờng nền trên sắc<br />
ký đồ HPLC ổn định.<br />
Xử lý mẫu: dùng dung m i hò t n đã khảo<br />
s{t để chiết curcumin I và calophyllolid từ dầu<br />
mẫu thử, tiếp tục xử lý bằng kỹ thuật chiết pha<br />
rắn (SPE). Khảo sát các dung môi rửa giải qua<br />
SPE, dịch rửa giải qu SPE đƣợc phân tích bằng<br />
<br />
Calophyllolid và curcumin I.<br />
<br />
230<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
HPLC. Chọn ph}n đoạn thu đƣợc curcumin và<br />
calophyllolid với tỷ lệ phục hồi trên 98%.<br />
Các khảo sát về phƣơng ph{p ph}n tích để<br />
lựa chọn điều kiện sắc ký cho sắc ký đồ đạt yêu<br />
cầu về độ phân giải giữ c{c pic định lƣợng và<br />
các pic lân cận, cũng nhƣ c{c yêu cầu thông số<br />
pic sắc ký nhƣ độ bất đối, độ tinh khiết pic.<br />
<br />
Khảo sát các điều kiện sắc ký tách đồng thời<br />
calophyllolid và curcumin I bằng HPLC<br />
C{c điều kiện dự kiến: tốc độ dòng 1<br />
mL/phút, bƣớc sóng 270 nm, nhiệt độ cột 40 oC.<br />
Khảo s{t ph động (pH và tỷ lệ dung môi) và kỹ<br />
thuật rửa giải đẳng dòng, gradient).<br />
Dung môi khảo sát gồm acetonitril hoặc<br />
meth nol đƣợc phối hợp với acid formic.<br />
<br />
Thẩm định quy trình phân tích HPLC<br />
Thẩm định theo hƣớng dẫn chung về thẩm<br />
định quy trình: khảo sát tính phù hợp hệ thống,<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
KẾT QUẢ<br />
Kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu<br />
Trên sắc ký đồ HPLC, mẫu thử chiết bằng<br />
meth nol cho đƣờng nền ổn định và hệ số<br />
phân giải giữa các pic hiệu quả hơn mẫu thử<br />
chiết bằng acetonitril.<br />
<br />
Xử lý mẫu<br />
Cân chính xác khoảng 1,0 g dầu cho vào<br />
bình định mức 50 ml, hò t n v| điền đầy<br />
bằng methanol. Để yên 30 phút, dung dịch<br />
tách thành 2 lớp, lấy chính xác 10 ml lớp dịch<br />
bên trên, cho b y hơi hết dung m i đến cắn.<br />
Cho toàn bộ cắn này vào cột SPE, loại tạp bằng<br />
5 ml hỗn hợp methanol – nƣớc (50 : 50); tiếp<br />
tục rửa giải bằng 5 ml dung môi methanol –<br />
nƣớc (60 : 40), cho toàn bộ dịch chiết vào bình<br />
định mức 10 ml, điền dung m i đến vạch.<br />
Tỷ lệ phục hồi đƣợc khảo sát trên mẫu chuẩn<br />
<br />
tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác,<br />
<br />
trƣớc và sau khi xử lý qua SPE (bảng 1, hình 1).<br />
<br />
độ đúng<br />
<br />
Bảng 1: Tỷ lệ phục hồi của hỗn hợp mẫu chuẩn trước<br />
và sau khi qua SPE.<br />
<br />
S u khi quy trình đạt các yêu cầu về thẩm<br />
định, áp dụng phƣơng ph{p lên 3 mẫu sản xuất<br />
<br />
Nồng độ chuẩn<br />
<br />
thử nghiệm, đề nghị giới hạn định lƣợng<br />
<br />
Curcumin (40<br />
ppm)<br />
Calophyllolid<br />
(250 ppm)<br />
<br />
curcumin I và calophyllolid cho sản phẩm.<br />
<br />
Mẫu chuẩn curcumin I v| calophyllolid chưa xử lý qua<br />
SPE<br />
<br />
S Chưa qua SPE S Qua cột SPE Tỷ lệ phục<br />
hồi (%)<br />
(µV x giây) S (µV x giây)<br />
788130<br />
<br />
772529<br />
<br />
98,02<br />
<br />
7496766<br />
<br />
7465498<br />
<br />
99,58<br />
<br />
Mẫu chuẩn curcumin I và calophyllolid sau khi xử lý<br />
qua SPE<br />
<br />
Hình 1: Sắc ký đồ hỗn hợp mẫu chuẩn trước và sau khi xử lý qua SPE<br />
<br />
Kết quả khảo sát các điều kiện sắc ký tách<br />
đồng thời calophyllolid và curcumin I bằng<br />
HPLC<br />
<br />
hợp đối chiếu: calophyllolid và curcumin I nồng<br />
<br />
Mẫu trắng: dung môi pha mẫu. Mẫu hỗn<br />
<br />
- Các hệ ph động đã khảo sát bao gồm<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
độ tƣơng ứng 20 v| 3,5 µg/mL đƣợc pha trong<br />
ph động.<br />
<br />
231<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
acetonitril phối với acid formic 0,1% với các tỷ lệ<br />
(65 : 35), (60 : 40), (57 : 43) và (55 : 45).<br />
Kết quả khảo sát cho thấy: tỷ lệ dung môi<br />
acetonitril - acid formic (60 : 40) cho kết quả<br />
SKĐ tối ƣu hơn về thông số độ phân giải. Tuy<br />
nhiên, các khảo sát với kỹ thuật isocratic trên<br />
đều chƣ đạt yêu cầu về độ tinh khiết, vì vậy<br />
các khảo sát tiếp theo đƣợc thực hiện nhằm cải<br />
thiện thông số độ tinh khiết của 2 pic<br />
calophyllolid và curcumin I.<br />
- Thử nghiệm tiếp theo đƣợc khảo sát trên<br />
một vài tỷ lệ ph động của acetonitril – dung<br />
dịch acid formic 0,1 % với kỹ thuật rửa giải<br />
gradient.<br />
<br />
Bảng 3: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên<br />
dung dịch hỗn hợp đối chiếu<br />
Chất phân<br />
tích<br />
<br />
Giá trị Thời gian Diện tích<br />
thống lưu (phút) pic (µVxs)<br />
kê<br />
TB<br />
6,55<br />
60087<br />
Curcumin I<br />
RSD<br />
0,09%<br />
1,39 %<br />
TB<br />
28,28<br />
627097<br />
Calophyllolid<br />
RSD<br />
0,09 %<br />
0,61%<br />
<br />
Hệ số Độ<br />
bất phân<br />
đối giải<br />
1,4<br />
<br />
3,7<br />
<br />
1,1<br />
<br />
3,7<br />
<br />
Bảng 4: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên<br />
mẫu thử dầu Mù u – Nghệ<br />
Chất phân<br />
tích<br />
<br />
Giá trị Thời gian Diện tích<br />
thống lưu (phút) pic (µVxs)<br />
kê<br />
TB<br />
6,53<br />
61031<br />
Curcumin I<br />
RSD<br />
0,22%<br />
1,97%<br />
TB<br />
27,96<br />
656984<br />
Calophyllolid<br />
RSD<br />
0,36%<br />
0,54%<br />
<br />
Hệ số Độ<br />
bất phân<br />
đối giải<br />
1,3<br />
<br />
3,7<br />
<br />
1,0<br />
<br />
3,3<br />
<br />
Kết quả cho thấy tại bƣớc sóng 270 nm có pic<br />
curcumin I và calophyllolid tách hoàn toàn khỏi<br />
các pic lân cận v| đạt độ tinh khiết theo yêu cầu<br />
sắc ký.<br />
<br />
Như vậy, RSD thời gi n lƣu v| diện tích<br />
của 2 pic khảo s{t đều < 2 %, hệ số bất đối<br />
trong khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải giữa 2 pic<br />
> 1,5: quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.<br />
<br />
Nhƣ vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để<br />
định lƣợng đồng thời calophyllolid và<br />
curcumin I: cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), tốc độ<br />
dòng 1 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µL, bƣớc<br />
sóng phát hiện 270 nm, nhiệt độ cột 40 oC.<br />
<br />
Thẩm định quy trình<br />
<br />
Ph động là hệ dung môi acetonitril – dung<br />
dịch cid formic 0,1 % pH 3,5 theo chƣơng<br />
trình gr dient đƣợc trình bày ở bảng 2.<br />
Bảng 2: Chương chình dung môi<br />
Thời gian (phút) Tỉ lệ acetonitril – acid formic 0,1% (pH<br />
3,5)<br />
0<br />
60 : 40<br />
10<br />
55 : 45<br />
25<br />
65 : 35<br />
35<br />
60 : 40<br />
<br />
Điều kiện n|y đã t{ch ho|n to|n 2 pic khảo<br />
sát, có thể tiến hành các thử nghiệm khảo sát<br />
tính phù hợp hệ thống và thẩm định quy<br />
trình.<br />
Khảo sát tính phù hợp hệ thống<br />
Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch hỗn hợp<br />
đối chiếu (bảng 3) và mẫu thử (bảng 4).<br />
<br />
232<br />
<br />
Tính đặc hiệu<br />
Kết quả khảo s{t tính đặc hiệu: sắc ký đồ<br />
mẫu trắng không có tín hiệu pic tại thời gian<br />
lƣu của các pic trong mẫu đối chiếu tƣơng<br />
ứng. Dung dịch thử: sắc ký đồ có các pic tách<br />
nhau hoàn toàn và thời gi n lƣu của hai pic<br />
cần định lƣợng trong mẫu thử tƣơng đƣợng<br />
với trong mẫu đối chiếu.<br />
Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu,<br />
chiều cao và diện tích của pic curcumin I và<br />
c lophyllolid tăng lên so với mẫu thử; phổ Uv<br />
– Vis của 2 pic hoạt chất cần định lƣợng trong<br />
mẫu thử tƣơng ứng với phổ Uv – Vis trong<br />
mẫu đối chiếu.<br />
Sử dụng chức năng kiểm tr độ tinh khiết<br />
cho thấy các pic khảo s{t đều đạt yêu cầu.<br />
Như vậy, quy trình đạt yêu cầu về độ đặc hiệu<br />
(Hình 2).<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br />
<br />
Sắc ký đồ (SKĐ) mẫu trắng<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
SKĐ hỗn hợp mẫu đối chiếu<br />
<br />
SKĐ mẫu thử dầu Mù u – Nghệ<br />
<br />
SKĐ mẫu đối chiếu + thử<br />
<br />
Hình 2: SKĐ độ đặc hiệu của quy trình định lượng<br />
định lƣợng đồng thời calophyllolid và curcumin<br />
Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính, độ đúng,<br />
I đạt các yêu cầu về thẩm định.<br />
độ chính xác<br />
Kết quả dữ liệu thống kê cho thấy quy trình<br />
Bảng 5: Kết quả các thử nghiệm theo yêu cầu thẩm định quy trình<br />
Curcumin I<br />
<br />
Calophyllolid<br />
<br />
Phương trình hồi quy<br />
<br />
ŷ = 17386 x<br />
<br />
Hệ số tương quan<br />
<br />
R = 0,9996<br />
<br />
ŷ = 29309 x<br />
R = 0,9998<br />
<br />
Khoảng tuyến tính<br />
<br />
1, 0 – 16,0 µg/mL<br />
<br />
5 – 80 µg/mL<br />
<br />
Độ chính xác (n=6)<br />
- Độ lặp lại<br />
<br />
RSD 2,00% ≤ 2%<br />
<br />
RSD 1,79% < 2%<br />
<br />
- Độ chính xác trung gian<br />
<br />
RSD 1,98% ≤ 2%<br />
<br />
RSD 1,31% < 2%<br />
<br />
Độ đúng (n = 9)<br />
<br />
Tỷ lệ phục hồi 98,0 – 101,1%<br />
<br />
Tỷ lệ phục hồi 98,12 – 101,95 %<br />
<br />
Mẫu thử thêm đối chiếu (50%, 100% và 150%)<br />
<br />
RSD 1,34 %<br />
<br />
RSD 1,28 %<br />
<br />
Quy trình đƣợc ứng dụng để x{c định hàm<br />
lƣợng hoạt chất của mẫu thử từ 3 lô dầu Mù u –<br />
Nghệ sản xuất thử:<br />
Hàm lượng TB curcumin I (%)<br />
Hàm lượng TB calophyllolid (%)<br />
<br />
Lô 1<br />
0,031<br />
0,22<br />
<br />
Lô 2<br />
0,031<br />
0,23<br />
<br />
Lô 3<br />
0,030<br />
0,22<br />
<br />
Từ kết quả định lƣợng trên 3 lô sản xuất thử,<br />
kiến nghị về giới hạn h|m lƣợng của hai hoạt<br />
chất này trong dầu Mù u – Nghệ:<br />
H|m lƣợng C% của curcumin I trong dầu<br />
Mù u – Nghệ phải ≥ 0,03%.<br />
<br />
Chuyên Đề Dƣợc<br />
<br />
H|m lƣợng C% của calophyllolid trong dầu<br />
Mù u – Nghệ ≥ 0,20%.<br />
<br />
BÀN LUẬN<br />
Kết quả thực nghiệm minh chứng cho quy<br />
trình định lượng đồng thời calophyllolid và<br />
curcumin I đạt các yêu cầu của một quy trình<br />
định lượng.<br />
Mẫu thử nghiệm là mẫu có thành phần<br />
phức tạp nên công đoạn xử lý mẫu qua SPE là<br />
cần thiết. Kết quả cùa việc xử lý mẫu ảnh<br />
<br />
233<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
