Xây dựng quy trình định lượng germacron trong viên nén bao phim chứa cao chiết từ thân rễ cây sâm đá (Curcuma singularis) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xây dựng quy trình định lượng germacron trong viên nén bao phim chứa cao chiết từ thân rễ cây sâm đá (Curcuma singularis) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được tiến hành với mục tiêu xây dựng quy trình định lượng germacron trong viên nén bao phim chứa cao chiết thân rễ cây sâm đá ở cỡ lô nghiên cứu 100 viên, làm tiền đề cho việc lựa chọn công thức trong nghiên cứu bào chế và kiểm tra chất lượng thành phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình định lượng germacron trong viên nén bao phim chứa cao chiết từ thân rễ cây sâm đá (Curcuma singularis) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Xây dựng quy trình định lượng germacron trong viên nén bao phim chứa cao chiết từ thân rễ cây sâm đá (Curcuma singularis) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Nguyễn Việt Cường3*, Trần Thị Kim Vương4 Lê Thành Long1,2, Hoàng Nghĩa Sơn 1,2, Đoàn Chính Chung1,2 1 Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2 Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3 Khoa Dược, Trường Đại học Lạc Hồng 4 Sở Khoa học và Công nghệ Gia Lai Summary Germacrone, one of the major bioactive component found in Curcuma singularis rhizome extract, has been reported with hepatoprotective, anti-inflammatory, and anti-cancer activities. This study aimed to determine germacrone content in film-coated tablet containing Curcuma singularis rhizome extract using the validated HPLC method. The analysis was performed using an reverse-phase C18 column on the HPLC-DAD system with an isocratic mobile phase of acetonitrile and water (48.5: 51.5, v/v), and a flow rate of 1 ml/min for 50 min at UV 214 nm. The regression equations are linear (r2 > 0.9999) over a range between 1.8 - 5.4 mcg/ml. The intra- and inter-day relative standard deviation and relative error are less than 0.893 % and 0.981 %, respectively. All the recoveries are greater than 98.0 %. All data proved the proposed method was suitable for determination of germacrone in film-coated tablet containing Curcuma singularis rhizome extract. Keywords: Curcuma singularis, sâm đá, germacron, HPLC. Đặt vấn đề bổ thận, hạn chế suy nhược cơ thể và hỗ trợ Cây sâm đá có tên khoa học là Curcuma điều trị một số bệnh. Một số hợp chất đang singularis, thuộc chi Nghệ (Curcuma), họ Gừng được chú ý phát hiện thấy trong cây sâm đá như (Zingiberaceae), bộ Gừng (Zingiberales). Cây camphor (25,83 %), germacron (8,00 %), sâm đá thuộc cây thảo nhỏ, phân bố chủ yếu ở caryophyllen oxid (4,48 %), terpinen-4-ol (3,84 %) Tỉnh Gia Lai và Kon Tum. Thân rễ của cây sâm và germacron-4,5-epoxid (3,84 %) [1]. Gần đây, đá được ghi nhận có tác dụng bồi bổ sức khỏe, một nghiên cứu khác cũng cho thấy cao chiết cường gân, bổ cốt, tăng sinh lực, trị phong thấp, thân rễ cây sâm đá có chứa 3 hợp chất sesquiterpen, gồm germacron, ar-turmeron và curcumol [2]. Trong đó, germacron là hợp chất Chịu trách nhiệm: Nguyễn Việt Cường đáng chú ý được tìm thấy nhiều trong cây sâm Email: nguyenvietcuong.shin@gmail.com Ngày nhận: 14/12/2021 đá [1,2,3]. Một số hoạt tính sinh học của Ngày phản biện: 16/12/2021 germacron đã được chứng minh như bảo vệ Ngày duyệt bài: 24/02/2022 gan, kháng viêm hay kháng ung thư. Nghiên 34 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 42 - THÁNG 2/2022
cứu của Claeson (1993) đã chứng minh rằng sâm đá đạt tiêu chuẩn cơ sở (theo DĐVN V). germacron có tác dụng kháng viêm, chống lại Viên nén bao phim chứa cao chiết thân rễ chứng phù chân sau ở chuột do carrageenan sâm đá được bào chế tại Phòng Bào chế - Công gây ra [4]. Nghiên cứu của Morikawa (2002) cho nghiệp Dược, Khoa Dược, Đại học Lạc Hồng và thấy germacron có tác dụng bảo vệ gan chuột bị Phòng Nghiên cứu và Phát triển sản phẩm R&D, tổn thương cấp tính bởi D-galactosamin/ Công ty Cổ phần Dược phẩm Savi. Nghiên cứu lipopolysaccharit hay nhân tố gây hoại tử khối u lựa chọn hàm lượng 200 mg cao đặc (tương TNFα gây ra [5]. Germacron ức chế sự tăng sinh ứng hàm lượng germacron không dưới 4 mg) một số dòng tế bào ung thư gan HepG2, ung trong công thức cho 1 viên nén. thư dạ dày AGS thông qua việc hoạt hoá quá Dung môi hóa chất trình apoptosis của tế bào [2,6]. Nghiên cứu khác Chất đối chiếu: Germacron (TRC, Canada). cho thấy hiệu quả cộng hợp giữa germacron và Dung môi sử dụng đạt tiêu chuẩn sử dụng thuốc điều trị ung thư (methotrexat và cho HPLC: Acetonitril (Merck, Hoa Kỳ). 5-fluorouracil) trong việc tiêu diệt tế bào ung thư Dung môi sử dụng đạt tiêu chuẩn phân tích: vú MCF7 [7]. Nhóm nghiên cứu cũng đã xây Dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ). dựng được quy trình định lượng chuẩn hàm Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu lượng germacron trong cao chiết từ thân rễ cây Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent sâm đá bằng phương pháp HPLC [3]. Do vậy, 1260 Quaternary pump G1311, Standard dựa trên cơ sở này, nhóm tác giả tiếp tục Autosampler G1329, Diode Array and Multiple nghiên cứu bào chế viên nén bao phim chứa Wavelength Detector G1315. Cột phân tích cao chiết thân rễ sâm đá nhằm sử dụng bồi bổ Phenomenex Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). sức khoẻ hay hỗ trợ điều trị cho các bệnh nhân Cân phân tích Sartorius Practum 224-1S độ ung thư. Nghiên cứu được tiến hành với mục chính xác ± 0,1 mg. Bể siêu âm Elma S180H. tiêu xây dựng quy trình định lượng germacron Bình định mức, pipet và các dụng cụ thủy tinh trong viên nén bao phim chứa cao chiết thân rễ có độ chính xác phù hợp. cây sâm đá ở cỡ lô nghiên cứu 100 viên, làm Phương pháp nghiên cứu tiền đề cho việc lựa chọn công thức trong Điều kiện sắc kí nghiên cứu bào chế và kiểm tra chất lượng Cột sắc kí pha đảo Phenomenex Gemini C18 thành phẩm. (250 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 25 ºC, Nguyên liệu và phương pháp thể tích tiêm mẫu 50 µl, đầu dò DAD phát hiện ở Nguyên liệu bước sóng 214 nm. Pha động đẳng dòng Cây sâm đá được thu nhập tại Huyện Kbang, acetonitril - nước (48,5: 51,5), tốc độ dòng Tỉnh Gia Lai tại các thời điểm khác nhau 1 ml/phút. (5/2019, 10/2019 và 3/2020). Định danh thực vật Chuẩn bị mẫu đối chiếu học được tiến hành bởi TS. Đặng Văn Sơn, Cân chính xác khoảng 45 mg chất chuẩn Viện Sinh học Nhiệt đới. Mẫu định danh (ITB- germacron, hòa tan trong bình định mức 100 ml 2019-002) được lưu giữ tại Viện Sinh học Nhiệt với dung môi dimethylsulfoxid. Lấy chính xác đới. Thân rễ cây sâm đá được rửa sạch, cắt lát, 1 ml dung dịch thu được pha loãng trong bình sấy khô và tạo bột dược liệu. Cao chiết cây sâm định mức 50 ml với dung môi pha động của điều đá được thu nhận theo quy trình được công bố kiện sắc kí. Tiếp tục pha lấy chính xác 10 ml gần đây của chúng tôi [2]. Cao chiết thân rễ cây dung dịch vừa thu được cho vào bình định mức TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 42 - THÁNG 2/2022 35
25 ml, thêm dung môi pha động, lắc đều. Lọc Sc: Diện tích pic của germacron trong dung qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch đối chiếu có dịch đối chiếu; nồng độ khoảng 3,6 mcg/ml. Dt: Độ pha loãng mẫu thử; Chuẩn bị mẫu thử Dc: Độ pha loãng mẫu đối chiếu; Bóc bỏ màng bao phim, xác định khối lượng C %: Hàm lượng chất chuẩn germacron; trung bình của 20 viên nén trần không bao phim. mc: Khối lượng đối chiếu (mg); Nghiền mịn và cân chính xác một lượng bột viên mt: Khối lượng cao cồn để pha mẫu thử (mg); khoảng 120 mg cao chiết từ cây sâm đá cho vào mtb: Khối lượng trung bình viên nén trần bình định mức 50 ml, thêm khoảng 40 ml không bao phim. dimethylsulfoxid, siêu âm không gia nhiệt trong Thẩm định quy trình phân tích 20 phút, thêm dung môi dimethylsulfoxid đến Quy trình phân tích vừa xây dựng được thẩm vạch, lắc đều. Lấy chính xác 5 ml dung dịch thu định tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, độ được cho vào bình định mức 20 ml, thêm dung đúng, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác môi pha động của điều kiện sắc kí đến vạch, lắc trung gian) và khoảng tuyến tính theo hướng đều. Dung dịch mẫu thử được lọc qua màng lọc dẫn của ICH [8]. 0,45 µm. Kết quả nghiên cứu Hàm lượng (mg) germacron trong một viên Thẩm định quy trình phân tích tính theo công thức: Tính tương thích hệ thống Tiến hành sắc kí 6 lần liên tiếp mẫu hỗn hợp đối chiếu ở nồng độ 100% nồng độ khảo sát theo điều kiện đã chọn. Kết quả thời gian lưu và Trong đó: diện tích pic được trình bày trong bảng 1. X: Hàm lượng (mg) germacron có trong một viên; St: Diện tích pic của germacron trong dung dịch thử; Bảng 1. Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống STT tR (phút) Spic (µAU.s) Hệ số đối xứng Số đĩa lý thuyết 1 47,530 399,341 0,902 15919 2 47,530 398,421 0,907 15868 3 47,532 396,679 0,912 15802 4 47,545 399,941 0,915 15687 5 47,544 400,840 0,911 15907 6 47,544 397,702 0,903 16012 TB 47,538 398,821 SD 0,008 1,523 RSD % 0,016 0,382 Kết quả thẩm định cho thấy thời gian lưu và như số đĩa lý thuyết đạt yêu cầu. Vậy quy trình diện tích pic của germacron ở 6 lần sắc kí khác định lượng đạt tính tương thích hệ thống. nhau có RSD < 2 % và có hệ số đối xứng cũng 36 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 42 - THÁNG 2/2022
Hình 1. Sắc kí đồ mẫu dung môi (1), mẫu đối chiếu (2), mẫu thử (3) và phổ UV của germacron Độ đặc hiệu hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng Kết quả cho thấy sắc ký đồ của mẫu đối với pic đối chiếu. Sắc ký đồ của mẫu thử thêm chiếu germacron và mẫu thử cho pic có thời đối chiếu cho pic có thời gian lưu tương tự với gian lưu tương tự nhau (hình 1). Phổ UV của pic pic của mẫu đối chiếu và mẫu thử nhưng có trong mẫu germacron đối chiếu và mẫu thử có diện tích pic lớn hơn. Như vậy quy trình có tính hình dạng và các đỉnh hấp thu cực đại tương tự đặc hiệu. nhau. Sắc ký đồ của mẫu dung môi không xuất Bảng 2. Thông số sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử Diện tích Chiều cao pic Mẫu tR (phút) Purity N As pic (mAU*s) (mAU) Mẫu chuẩn 47,544 398,521 17,580 999,991 15868 0,915 Mẫu thử 47,530 400,740 17,580 999,984 15867 0,912 Khoảng tuyến tính 125 %, 150 % so với nồng độ khảo sát ở bảng Chuẩn bị các dung dịch germacron đối chiếu 3. Tiến hành sắc kí các mẫu hỗn hợp đối chiếu có nồng độ tương ứng 50 %, 75 %, 100 %, trên. Bảng 3. Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính Nồng độ germacron đối chiếu (mcg/ml) Diện tích pic (µAU.s) 1,8 198,128 2,7 296,192 3,6 399,285 4,5 495,300 5,4 595,369 Sử dụng trắc nghiệm thống kê F cho thấy có phương trình hồi quy tuyến tính y = 110,4x. sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ đối chiếu Độ lặp lại và diện tích pic thu được trên sắc kí đồ với hệ Tiến hành sắc ký 06 mẫu thử được chuẩn bị số tương quan R2 = 0,9999. Trắc nghiệm t cho theo quy trình định lượng thu được kết quả theo thấy hệ số tự do trong phương trình hồi quy bảng 4. không có ý nghĩa thống kê (α = 0,01). Vậy TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 42 - THÁNG 2/2022 37
Bảng 4. Kết quả thẩm định độ lặp lại Khối lượng Hàm lượng germacron STT Diện tích pic ((µAU.s) cân mẫu thử (g) trong một viên (mg) 1 0,2698 360,558 4,336 2 0,2692 362,958 4,375 3 0,2699 367,015 4,412 4 0,2690 359,465 4,336 5 0,2692 356,963 4,302 6 0,2690 358,912 4,329 Trung bình 4,348 SD 0,039 RSD % 0,893 Kết quả cho thấy RSD % của giá trị hàm hành bởi một người thực hiện khác ở một ngày lượng germacron khi tiến hành sắc kí 6 mẫu thử khác. Kết quả độ chính xác trung gian thể hiện riêng biệt nhỏ hơn 2 %. Quy trình định lượng đạt theo bảng 5. yêu cầu về độ lặp lại. Độ chính xác trung gian Tiến hành sắc kí sáu mẫu thử khác được tiến Bảng 5. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian Người phân tích 1: Trung Long Người phân tích 2: Việt Cường Ngày phân tích: 10/01/2021 Ngày phân tích: 12/01/2021 Khối lượng Hàm lượng Khối lượng Hàm lượng Diện tích Diện tích STT cân mẫu germacrone cân mẫu germacrone pic (µAU.s) pic (µAU.s) thử (g) trong cao (mg) thử (g) trong cao (mg) 1 0,2698 360,558 4,336 0,2702 361,307 4,339 2 0,2692 362,958 4,375 0,2705 366,063 4,391 3 0,2699 367,015 4,412 0,2705 367,011 4,402 4 0,2690 359,465 4,336 0,2701 358,805 4,310 5 0,2692 356,963 4,302 0,2699 363,945 4,375 6 0,2690 358,912 4,329 0,2706 358,682 4,301 Trung bình: 4,348 mg Trung bình: 4,353 mg SD: 0,039 SD: 0,043 RSD: 0,893 % RSD: 0,981 % Kết quả của cả hai kiểm nghiệm viên Trung bình: 4,35 mg RSD: 0,937 % Trắc nghiệm thống kê cho thấy kết quả hàm trình định lượng đạt yêu cầu độ chính xác trung lượng các chất thu được ở hai lần thực hiện gian. khác nhau không có ý nghĩa (α = 0,01). Quy 38 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 42 - THÁNG 2/2022
Bảng 6. Kết quả thẩm định độ đúng Nồng độ đối Lượng đối chiếu Lượng đối chiếu Tỷ lệ hồi phục Diện tích pic (µAU.s) chiếu thêm vào thêm vào (mg) tìm thấy (mg) (%) 2,700 293,967 2,654 98,28 2,700 294,867 2,662 98,58 75 % 2,700 297,667 2,687 99,52 Trung bình 98,791 SD 0,645 RSD % 0,653 3,600 398,835 3,600 100,00 3,600 396,906 3,583 99,52 100 % 3,600 401,046 3,620 100,56 Trung bình 100,027 SD 0,519 RSD % 0,519 4,500 492,762 4,448 98,84 4,500 490,863 4,431 98,46 125 % 4,500 491,060 4,433 98,50 Trung bình 98,603 SD 0,209 RSD % 0,212 Độ đúng đúng. Tiến hành sắc ký các mẫu placebo thêm đối Ứng dụng quy trình định lượng chiếu ở các mức nồng độ 75 %, 100 % và germacron trong một số mẫu viên 125 %, mỗi nồng độ thực hiện ba mẫu riêng Quy trình định lượng sau khi được thẩm định biệt. Kết quả độ đúng được thể hiện theo bảng được áp dụng để xác định hàm lượng 6. Kết quả cho thấy tỷ lệ hồi phục của chín mẫu germacron có trong viên nén bao phim ở những đều nằm trong khoảng 98-102 % và RSD nhỏ một số mẫu viên khác nhau (bảng 7). hơn 2 %. Quy trình định lượng đạt yêu cầu độ Bảng 7. Kết quả định lượng germacron trong các mẫu cao khác nhau Khối lượng Hàm lượng germacrone Mẫu viên Diện tích pic (µAU.s) cân mẫu thử (g) trong viên (mg) 0,2698 360,558 4,336 0,2692 362,958 4,375 0,2699 367,015 4,412 001 Trung bình 4,374 SD 0,038 RSD% 0,869 0,2702 361,307 4,339 0,2705 366,063 4,391 0,2705 367,011 4,402 002 Trung bình 4,377 SD 0,034 RSD % 0,769 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 42 - THÁNG 2/2022 39
0,2699 363,945 4,375 0,2692 362,958 4,375 0,2701 358,805 4,310 003 Trung bình 4,353 SD 0,038 RSD % 0,862 Kết luận 3. Nguyễn Việt Cường, La Thị Hồng Lan, Lê Nghiên cứu này đã xây dựng được quy trình Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn, Đoàn Chính định lượng germacron trong viên nén bao phim Chung (2021), “Xây dựng quy trình định lượng từ cao chiết thân rễ cây sâm đá. Quy trình được germacron trong cao chiết từ rễ củ cây sâm đá thẩm định theo hướng dẫn của ICH cho kết quả (Curcuma singularis) bằng phương pháp sắc kí phù hợp với yêu cầu. Quy trình sẵn sàng ứng lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Y Dược học, 20, tr. dụng vào việc lựa chọn công thức trong nghiên 32–36. cứu bào chế cũng như kiểm tra chất lượng 4. Claeson P., Panthong A., Tuchinda P., thành phẩm viên nén bao phim cuối cùng được Reutrakul V., Kanjanapothi D., Taylor W. C., bào chế. Santisuk T. (1993), “Three non-phenolic Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài hợp diarylheptanoids with anti-inflammatory activity tác giữa Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ from Curcuma xanthorrhiza”, Planta Med., 59 Việt Nam (VAST), mã số: UDNGDP.02/20-21 và (5), pp. 451–454. Sở Khoa học và Công nghệ Tỉnh Gia Lai, mã số: 5. Morikawa T., Matsuda H., Ninomiya K., KHGL-05-19. Yoshikawa M. (2002), “Potent protective effects Tài liệu tham khảo of sesquiterpenes and curcumin from Zedoariae 1. Nguyen M. C., Vu T. H., Pham N. K., Doan rhizoma on liver injury induced by T. V., To D. C., Tran T. H., Dinh T. T. T., Nguyen D-galactosamine/lipopolysaccharide or tumor P. H., Tran Q. T., Nguyen Q. C., Nguyen T. T., necrosis factor-alpha”, Biol. Pharm. Bull., 25 (5), Nguyen Q. B. (2017), “Chemical compositions pp. 627–631. and antimicrobial activity of essential oil from the 6. Liu Y., Wang W., Fang B., Ma F., Zheng rhizomes of Curcuma singularis growing in Q., Deng P., Zhao S., Chen M., Yang G., He G. Vietnam”, Am. J. Essent. Oil., 5, pp. 20–25. (2013), “Anti-tumor effect of germacron on 2. Doan C. C., Le T. L., Ho N. Q. C, La T. H. human hepatoma cell lines through inducing L., Nguyen V. C., Le V. D., Nguyen T. P. T, G2/M cell cycle arrest and promoting apoptosis”, Hoang N. S. (2011), “Bioactive chemical Eur. J. Pharmacol., 698 (1-3), pp. 95–102. constituents, in vitro anti-proliferative activity and 7. Lim M. S., Choung S. Y., Jeong K. W. in vivo toxicity of the extract of Curcuma (2016), “Germacron inhibits estrogen receptor singularis Gagnep rhizomes”, J. α-mediated transcription in MCF-7 breast cancer Ethnopharmacol., 284, pp. 114803. cells”, Phytother. Res., 30 (12), pp. 2036–2043. 8. ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and methodology. Q2R1. 40 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 42 - THÁNG 2/2022