Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu bán chi liên (scutellaria barbata D.don) bằng phương pháp điện di mao quản (CE)

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG DƯỢC LIỆU<br /> BÁN CHI LIÊN (SCUTELLARIA BARBATA D.DON)<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE)<br /> Ngô Thị Thanh Diệp*, Nguyễn Thị Huyền Thương*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng phương pháp điện di<br /> mao quản CE.<br /> Đối tượng và phương pháp: Đối tượng nghiên cứu là apigenin có trong dược liệu Bán chi liên. Nghiên<br /> cứu được thực hiện trên 5 mẫu Bán chi liên thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ<br /> Chí Minh. Tiến hành khảo sát các thông số cho quy trình định lượng. Từ đó, xây dựng và thẩm định quy trình<br /> định lượng apigenin và áp dụng quy trình này để xác định hàm lượng apigenin trong các mẫu thu thập được.<br /> Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng apigenin bằng phương pháp điện di mao quản với<br /> các thông số: Bước sóng phát hiện268 nm, Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện thế 15<br /> kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt độ cột mao quản 25 0C, thời gian điện di 15 phút. Quy trình định lượng đạt tính<br /> đặc hiệu, tính phù hợp của hệ thống với RSD của mẫu chuẩn và mẫu thử sau 6 lần tiêm mẫu lần lượt là 3,11%<br /> và 2,96%, khoảng tuyến tính của apigenin ở nồng độ 20 – 150 μg/ml (R2 = 0,9995), độ lặp lại của phương pháp<br /> với RSD = 3,71%, độ đúng với tỷ lệ phục hồi cao. Sử dụng quy trình đã xây dựng xác định hàm lượng apigenin<br /> trong 5 mẫu dược liệu được thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ Chí Minh thu<br /> được kết quả lần lượt là 1,82 mg/g, 0,60 mg/g, 2,74 mg/g, 3,07 mg/g, 2,85 mg/g.<br /> Kết luận Hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi liên khá cao khoảng từ 1,80 – 3,10 mg/g, trong đó đặc<br /> biệt thấp ở mẫu Nghệ An (chỉ khoảng 0,60 mg/g).<br /> Từ khóa: Bán chi liên, apigenin, điện di mao quản.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE DETERMINATION OF APIGENIN IN THE HERBAL BAN CHI LIEN (SCUTELLARIA<br /> BARBATA D. DON) BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS<br /> Ngo Thi Thanh Diep, Nguyen Thi Huyen Thuong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 144 - 149<br /> Objective: Quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis method<br /> Materials and methods: Object in the study is apigenin in the herbal Ban chi lien. The study was made on<br /> 5 Ban chi lien samples purchased in Hanoi city, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak province and Ho Chi Minh city.<br /> Since then, development and evaluation of quantitative procedure apigenin is conducted by capillary<br /> electrophoresis methods. Using established and evaluated method for determination quantitative of apigenin in<br /> collected Ban chi lien samples.<br /> Results: Developed and evaluated the quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis<br /> methods with parameters: wavelength detection 268 nm, buffer solution alkaline borate pH = 8.8, buffer<br /> concentration 40 mM, voltage 15 kV, sample injection time 2 s, capillary column temperature 25 0C, developed<br /> time 15 minutes. Quantitative procedure has specificity,compatibility of CE system with RSD of the standard<br /> * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: DS.Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 01226671588<br /> <br /> 144<br /> <br /> Email: thanhdiep73@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> sample and samples are respectively 3.110% and 2.957%, linearity of apigenin is 20 –150 μg/ml (R2 = 0.9995),<br /> repeatability of the parameters of the method with RSD = 3.71%, the recovery rate was good. Applying the<br /> developed procedure to determine apigenin in 5 samples purchased at Hanoi City, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak<br /> province and Ho Chi Minh City, obtained results are respectively 1.82 mg/g, 0.60 mg/g, 2.74 mg/g, 3.07 mg/g,<br /> 2.85 mg/g.<br /> Conclusion: Apigenin concentrations in the samples Ban chi lien are quite high in range from 1.80 to 3.10<br /> mg/g, but the one in Nghe An province is specially low (only about 0.60 mg/g).<br /> Keywords: Scutellaria barbata D. Don, apigenin, capillary electrophoresis.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ:<br /> Bán chi liên Scutellaria barbata D. Don là một<br /> loại cây thân thảo thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae).<br /> Cây thuốc này có mặt trong nhiều bài thuốc dân<br /> gian với tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu<br /> tiêu sưng, giảm đau và chống khối u tân sinh.<br /> Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy<br /> sự có mặt của flavon apigenin – một flavon có<br /> tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống ôxy hoá<br /> cao trong dược liệu Bán chi liên với hàm lượng<br /> đáng kể.<br /> Ở nước ta, Bán chi liên được nhân dân sử<br /> dụng nhiều nhưng nguồn dược liệu này chủ yếu<br /> vẫn nhập từ Trung Quốc, chưa có tiêu chuẩn<br /> kiểm tra chất lượng cho dược liệu.Vì vậy, mục<br /> tiêu của đề tài này là xây dựng quy trình định<br /> lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên để<br /> góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm soát chất lượng<br /> dược liệu này. Phương pháp điện di mao quản<br /> được lựa chọn do có tính chọn lọc cao cho phép<br /> xác định được chính xác hàm lượng của<br /> apigenin trong dược liệu.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng<br /> 5 mẫu dược liệu Bán chi liên được thu mua<br /> tại các địa phương: Hà nội (BCL1), Nghệ An<br /> (BCL 2), Đắc lắc (BCL 3),Bình định (BCL 4),<br /> Tp.HCM (BCL 5). Mất khối lượng do làm khô (h)<br /> của các mẫu dược liệu được xác định lần lượt là<br /> 12,45%; 12,14%; 12,02%; 12,25%; 12,77%.<br /> <br /> Hóa chất, dung môi<br /> Chất đối chiếu: Apigenin độ tinh khiết 95%<br /> do BM Dược liệu, khoa Dược, ĐH Y Dược TP.<br /> HCM cung cấp.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Ethanol, ethyl acetat(TQ), methanol, natri<br /> hydroxyd, kali clorid, acid boric (Merck).<br /> <br /> Thiết bị<br /> Máy điện di mao quản, đầu dò UV Aligent<br /> CE 7100 (Đức), bể siêu âm Elma (Đức), cân phân<br /> tích Satorius TE 412, cân xác định độ ẩm Satorius<br /> MA 45.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu:<br /> Tiến hành khảo sát các điều kiện để tiến<br /> hành điện di mao quảnnhư pH và nồng độ của<br /> dung dịch đệm, điện thế tiến hành điện di, thời<br /> gian tiêm mẫu, nhiệt độ cột mao quản, thời gian<br /> điện di để tìm ra các điều kiện thích hợp nhất.<br /> Xây dựng quy trình định lượng apigenin<br /> trong dược liệu:<br /> Chất đối chiếu:<br /> Cân chính xác 10 mg apigenin chuẩn, cho<br /> vào bình định mức 50 ml, hòa tan và điền đến<br /> vạch bằng MeOH, thu được dung dịch chuẩn C0<br /> có nồng độ 200 µg/ml.<br /> Từ dung dịch chuẩn C0pha thành dung dịch<br /> chuẩn có nồng độ 100 µg/ml.<br /> Chuẩn bị mẫu thử:<br /> Cân chính xác 1 g dược liệu cho vào bình<br /> nón 250 ml, thêm chính xác 100 ml dung môi<br /> ethanol 50% và cân chính xác bình nón đến 0,01<br /> g. Đun hồi lưu ở nhiệt độ 80 – 90 0C trong60<br /> phút. Để nguội và cân, điều chỉnh khối lượng<br /> erlen đến khối lượng ban đầu bằng dung môi.<br /> Lắc đều và lọc nhanh qua giấy lọc khô. Bỏ 10 ml<br /> dịch lọc đầu, thu được dung dịch T.<br /> Lấy chính xác 50 ml dung dịch T, cô đến cắn.<br /> Hòa cắn vào 20 ml nước, siêu âm 10 phút, cho<br /> <br /> 145<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> vào bình lắng gạn lắc với 60 ml EtOAc (chia làm<br /> 3 lần, mỗi lần 20 ml). Gộp các dịch EtOAc, bốc<br /> hơi đến cắn khô. Hòa tan cắn vào MeOH, cho<br /> vào bình định mức 10 ml, điền đầy đến vạch<br /> bằng MeOH, siêu âm trong 5 phút. Lọc qua<br /> màng lọc 0,45 µm cho vào lọ đựng mẫu, siêu âm<br /> 3 phút trước khi cho vào máy.<br /> <br /> chiều dài hiệu lực 56 cm, đường kính trong 50<br /> µm (Aligent).<br /> Phát hiện apigenin ở bước sóng 268 nm.<br /> Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8<br /> Nồng độ đệm 40 mM<br /> Điện thế 15 kV<br /> Thời gian tiêm mẫu 2 s<br /> <br /> Điều kiện điện di:<br /> <br /> Nhiệt độ cột mao quản 25 0C<br /> <br /> Máy điện di mao quản đầu dò UV Aligent<br /> CE 7100<br /> <br /> Thời gian điện di 15 phút.<br /> <br /> Mao quản silicagel nung chảy 64,5 cm có<br /> Hàm lượng apigenin (mg/g) trong dược liệu khô được tính theo công thức:<br /> <br /> X=<br /> <br /> Cc × CorrA t ×10 ×100 ×100<br /> 3<br /> <br /> CorrA c × 50 ×10 × (100 − h)<br /> <br /> =<br /> <br /> 2 × Cc × CorrA t<br /> CorrA c × m × (100 − h)<br /> <br /> Trong đó: CorrAc và CorAt lần lượt là diện tích đỉnh đã được chuẩn hóa của mẫu chuẩn và mẫu thử; Cc là nồng độ của<br /> mẫu chuẩn (μg/ml) và m là khối lượng dược liệu (g), h là mất khối lượng do làm khô của dược liệu (%).<br /> <br /> Quy trình định lượng sau khi xây dựng được<br /> thẩm định theo ICH về tính phù hợp của hệ<br /> thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp<br /> lại và độ đúng.<br /> Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm<br /> định để xác định hàm lượng apigenin trong các<br /> mẫu Bán chi liên đã thu thập đươc.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Bước sóng phát hiện: Phổ UV tại thời gian di<br /> chuyển của pic apigenin trong mẫu đối chiếu có<br /> bước sóng hấp thụ cực đại tại 268 nm. Do đó, lựa<br /> chọn 268 nm là bước sóng phát hiện (hình 1,2)<br /> <br /> DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 05-29-22\010-0101.D)<br /> mAU<br /> 3<br /> <br /> Apigenin<br /> 9.858<br /> <br /> chuan<br /> 2.5<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1.5<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0.5<br /> <br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8<br /> <br /> 10<br /> <br /> 12<br /> <br /> 14<br /> <br /> min<br /> <br /> Hình 1: Điện di đồ của mẫu đối chiếu apigenin<br /> <br /> 146<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> *DAD1, 9.785 (3.0 mAU, - ) Ref=0.005 & 14.998 of 010-0101.D<br /> mAU<br /> 5<br /> <br /> 4.5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3.5<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2.5<br /> <br /> 2<br /> 220<br /> <br /> 240<br /> <br /> 260<br /> <br /> 280<br /> <br /> 300<br /> <br /> 320<br /> <br /> 340<br /> <br /> 360<br /> <br /> nm<br /> <br /> 380<br /> <br /> Hình 2: Phổ UV tại thời gian di chuyển của pic apigenin trong mẫu đối chiếu<br /> các điều kiện thích hợp là: pH dung dịch đệm:<br /> Lần lượt thay đổi một trong các điều kiện<br /> 8,8; Nồng độ dung dịch đệm: 40 mmol; Điện thế<br /> điện di (các điều kiện khác được cố định) như<br /> 15 kV; Thời gian tiêm mẫu 2 s; Nhiệt độ cột mao<br /> pH dung dịch đệm, nồng độ dung dịch đệm,<br /> quản 25 0C; Thời gian điện di 15 phút.<br /> điện thế, thời gian tiêm mẫu để xác định các điều<br /> kiện thích hợp cho quy trình. Kết quả cho thấy<br /> DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 06-26-49\010-0101.D)<br /> mAU<br /> 4<br /> <br /> Apigenin<br /> 9.788<br /> <br /> 3.5<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2.5<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1.5<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0.5<br /> <br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6<br /> <br /> 10<br /> <br /> 12<br /> <br /> 14<br /> <br /> min<br /> <br /> Hình 3: Điện di đồ của mẫu thử thu mua tại Tp.HCM với các điều kiện đã thiết lập.<br /> có sự tăng diện tích pic.Mặt khác điện di đồ mẫu<br /> Quy trình định lượng với các điều kiện điện<br /> trắng không có pic nào khác trùng với pic<br /> di đã được xác định trên được thẩm định các<br /> apigenin trong điện di đồ mẫu chuẩn.Từ đó cho<br /> thông số sau:<br /> thấy quy trình có tính đặc hiệu.<br /> Tính tương thích của hệ thống: Sau khi bơm<br /> 6 lần 1 mẫu đối chiếu, 1 mẫu thử qua hệ thống,<br /> RSD của thời gian di chuyển thu được lần lượt là<br /> 0,70% và 0,79%, RSD của diện tích pic là 3,11%<br /> và 2,96%.<br /> Tính đặc hiệu: Ở điện di đồ của mẫu thử và<br /> mẫu chuẩn đều có pic apigenin với cùng thời<br /> gian di chuyển. Điện di đồ của mẫu thử thêm<br /> chuẩn ở cùng thời gian di chuyển của apigenin<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Khoảng tuyến tính: Từ dung dịch chuẩn<br /> C0pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng<br /> 20 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml, 150<br /> µg/ml trong MeOH. Tiến hành điện di dung<br /> dịch chuẩn ở điều kiện đã khảo sát, thu được<br /> diện tích của pic apigenin tương ứng với từng<br /> nồng độ. Xử lý dữ liệu bằng Excel 2007 cho thấy<br /> có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và<br /> <br /> 147<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> diện tích đỉnh được chuẩn hóa của các dung dịch<br /> chuẩn theo phương trình y = 0,0119x+0,0023. Sử<br /> dụng trắc nghiệm t cho thấy hệ số 0,0023 không<br /> có ý nghĩa thống kê, như vậy phương trình hồi<br /> quy được rút gọn y = 0,0119x; R2 = 0,9995 trong<br /> khoảng nồng độ apigenin từ 20 – 150 µg/ml.<br /> <br /> khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng apigenin<br /> trong mẫu thử.Kết quả độ phục hồi thu được ở<br /> các mức chuẩn thêm vào đều ở khoảng 93,39 –<br /> 96,06% cho thấy quy trình có độ đúng phù hợp.<br /> Sử dụng quy trình đã thẩm định trên để xác<br /> định hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi<br /> liên thu mua được, kết quả thu được thể hiện ở<br /> bảng 2 cho thấy hàm lượng apigenin trong các<br /> mẫu BCL1, BCL3, BCL4, BCL5 khá cao (khoảng<br /> 1,80 – 3,10 mg/g). Mẫu BCL2 (thu mua tại Nghệ<br /> An) có hàm lượng apigenin rất thấp so với các<br /> mẫu BCL còn lại, chỉ khoảng 0,60 mg/g.<br /> Bảng 2: Kết quả xác định hàm lượng apigenin trong<br /> các mẫu BCL<br /> Mẫu<br /> <br /> Hình 4:Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính<br /> giữa nồng độ và diện tích đỉnh được chuẩn hóa của<br /> các dung dịch mẫu chuẩn<br /> Độ lặp lại: Tiến hành xác định hàm lượng<br /> apigenin trong 6 mẫu thử riêng biệt của mẫu<br /> dược liệu Bán chi liên thu mua tại TP.HCM<br /> (BCL5) có mất khối lượng do làm khô h=12,77%.<br /> Mẫu chuẩn được tiến hành song song có nồng<br /> độ thực tế là Cc = 95 µg/ml với CorrAc = 1,1525.<br /> Kết quả thu được thể hiện ở bảng 1 cho thấy quy<br /> trình có độ lặp lại tốt với RSD < 5%.<br /> <br /> BCL2<br /> <br /> BCL3<br /> <br /> BCL4<br /> <br /> BCL5<br /> <br /> Bảng 1: Kết quả khảo sát độ lặp lại<br /> Stt Khối lượng Diện tích<br /> Hàm<br /> Kết quả xử lý<br /> dược liệu<br /> đỉnh đã<br /> lượng<br /> thống kê<br /> (g)<br /> chuẩn hóa Apigenin<br /> CorrA<br /> (mg/g)<br /> 1<br /> 1,0005<br /> 1,3744<br /> 2,5962<br /> n=6<br /> 2<br /> 1,0003<br /> 1,4579<br /> 2,7545<br /> = 2,7696<br /> 3<br /> 1,0004<br /> 1,4814<br /> 2,7986<br /> 4<br /> 1,0005<br /> 1,4826<br /> 2,8006<br /> SD = 0,1028<br /> 5<br /> 1,0004<br /> 1,5419<br /> 2,9129<br /> RSD =<br /> 6<br /> 1,0002<br /> 1,4579<br /> 2,7548<br /> <br /> 3,71%<br /> Độ đúng: Được khảo sát trên mẫu BCL5 đã<br /> dùng khảo sát độ lặp lại. Thêm vào các mẫu<br /> lượng chất đối chiếu apigenin tương ứng với<br /> <br /> 148<br /> <br /> BCL1<br /> <br /> Khối lượng Diện tích Hàm lượng<br /> apigenin<br /> dược liệu<br /> đỉnh đã<br /> (g)<br /> chuẩn hóa, thu được<br /> (mg/g)<br /> CorrA<br /> 1,0005<br /> 0,8679<br /> 1,8444<br /> 0,9997<br /> 0,8918<br /> 1,9018<br /> 1,0004<br /> 0,8058<br /> 1,7126<br /> 1,0004<br /> 0,2560<br /> 0,5422<br /> 1,0005<br /> 0,3223<br /> 0,6826<br /> 1,0000<br /> 0,2686<br /> 0,5691<br /> 1,0005<br /> 1,3427<br /> 2,8394<br /> 1,0002<br /> 1,2538<br /> 2,6522<br /> 0.9998<br /> 1,2893<br /> 2,7284<br /> 1,0003<br /> 1,4938<br /> 3,1679<br /> 0,9996<br /> 1,3967<br /> 2,9640<br /> 1,0000<br /> 1,4505<br /> 3,0770<br /> 1.0002<br /> 1,3769<br /> 2,9377<br /> 1,0004<br /> 1,2893<br /> 2,7502<br /> 1,0005<br /> 1,3379<br /> 2,8536<br /> <br /> Hàm<br /> lượng<br /> trung bình<br /> (mg/g)<br /> 1,8179 ±<br /> 0,0949<br /> 0,5979 ±<br /> 0,0745<br /> 2,7400 ±<br /> 0,0941<br /> 3,0696 ±<br /> 0,1021<br /> 2,8472 ±<br /> 0,0938<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Sau thời gian tiến hành đề tài chúng tôi thu<br /> được một số kết quả sau:<br /> Xây dựng được quy trình định lượng<br /> apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng<br /> phương pháp điện di mao quản CE.<br /> Thẩm định quy trình đã xây dựng<br /> Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm<br /> định để xác định hàm lượng của apigenin trong<br /> một số mẫu Bán chi liên thu mua được.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br />